NGHIÊN cứu TUYỂN CHỌN VI KHUẨN MALOLACTIC và ỨNG DỤNG TRONG sản XUẤT rượu VANG

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................3
1.1 Giới thiệu chung về rƣợu vang .......................................................................3
1.1.1 Vài nét về rượu vang ...................................................................................3
1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang ..................................................................4
1.2 Vi khuẩn lactic .................................................................................................7
1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang .............10
1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni .......................................................................11
1.3 Quá trình lên men malolactic .......................................................................12
1.3.1 Bản chất của quá trình lên men malolactic ..............................................12
1.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic .................................................14
1.3.3 Ảnh hưởng của quá trình lên men malolactic đến thành phần và chất
lượng rượu vang ................................................................................................15
1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic ......................18
1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic ............................................................18
1.4.2 Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic ...............19
1.4.3 Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza trong
sản xuất vang .....................................................................................................20
1.5 Các phƣơng pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao
chất lƣợng rƣợu vang ..........................................................................................21
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............25
2.1 Nguyên liệu, chủng vi sinh và hóa chất .......................................................25
2.1.1 Nguyên liệu ...............................................................................................25
2.1.2 Vi sinh vật ................................................................................................25
2.1.3 Môi trường phân lập vi sinh vật ...............................................................25
2.1.4 Hóa chất ...................................................................................................26
2.1.5 Dụng cụ máy móc, thiết bị ......................................................................26
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................26

2.2.1 Phương pháp công nghệ ...........................................................................26
2.2.2 Phương pháp vi sinh vật ...........................................................................27
2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa ..................................................................28
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................31
3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rƣợu
vang 31
3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn malolactic tại Ninh Thuận ......................31
3.1.2 Xác định khả năng lên men malolactic của các chủng vi khuẩn phân lập ........33
3.1.3 Xác định khả năng chịu SO2 của 02 chủng vi khuẩn malolactic phân lập được36
3.2 Nghiên cứu quá trình lên men malolactic của Chủng NT9 và Chủng
NT12 trên môi trƣờng rƣợu vang non ...............................................................37
3.3 Nghiên cứu khả năng tạo chất thơm của các chủng vi khuẩn malolactic 42
3.4 Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ƣu quá trình lên men malolactic
O.oeni NT12..........................................................................................................44
3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất dinh dưỡng bổ sung đến quá trình lên
men malolactic. ..................................................................................................44
3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men malolactic ......................47
3.4.3 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang .49
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................56


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân tích rượu vang đỏ trước và sau ên men ma o actic .........................15
Bảng 3.1. Đặc tính sinh ý của c c chủng vi khuẩn actic phân ập được ................31
Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất của c c chủng vi khuân actic phân ập được ........34
Bảng 3.3 Khả n ng ên men ma o actic của 8 chủng vi khuẩn phân ập được .........35
Bảng 3.4 Hàm ượng axít ma ic và axít actic trước và sau ên men Ma o actic trên
môi trường nước nho axít (AG) được su phit hóa với hàm ượng K2S2O5. bổ sung
etano tới nồng độ 14%v/v ........................................................................................37

Bảng 3.5 Hàm ượng axít ma ic trước và sau qu tr nh ên men ma o actic của 2
chủng vi khuẩn ma o actic trên môi trường rượu vang non ......................................38
Bảng 3.6 Hàm ượng axít actic trước và sau qu tr nh ên men ma o actic của 2
chủng vi khuẩn ma o actic trên môi trường rượu vang non ......................................39
Bảng 3.7 Hàm ượng axít axetic trước và sau ên men ma o actic của 2 chủng vi
khuẩn malolactic .......................................................................................................40
Bảng 3.8 Hàm ượng diaxety trước và sau ên men ma o actic của 2 chủng vi khuẩn
malolactic ..................................................................................................................41
Bảng 3.9 Một số chất bay hơi tạo thành sau qu tr nh ên men ma o actic của 02 chủng .....43
Bảng 3.10 Thành phần dịch vang non sau khi ên men rượu ....................................45
Bảng 3.11 Hàm ượng axít ma ic (g/ ) được phân giải trong qu tr nh tàng trữ có bổ
sung dinh dưỡng kh c nhau theo thời gian ...............................................................46
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhi t độ đến s chuyển hóa axít ma o aic thành axít
actic trong qu tr nh ên men ma o actic ..................................................................48
Bảng 3.13 Thành phần của rượu vang sau khi kết thúc qu tr nh ên men ma o actic .......49
Bảng 3.14 Thời gian ên men và hàm ượng axít malic, axít lactic sau qu tr nh ên
men malolactic ở c c thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic kh c nhau .........................51
Bảng 3.15 Rượu etano được tạo thành và hàm ượng đường sót sau qu tr nh ên
men malolactic ..........................................................................................................52
Bảng 3.16 S tạo thành 1 số chất bay hơi được tạo thành sau qu tr nh ên men
malolactic ..................................................................................................................53


DANH MỤC CÁC HÌNH
H nh 1.1 H nh dạng chuỗi của chủng O.oeni. ...........................................................10
H nh 1.2. Qu tr nh trao đổi chất của c c vi khuẩn actic ên men dị h nh ...............13
H nh 1.3. Cơ chế của qu tr nh ên men ma o actic ................................................133
H nh 1.4 C c yếu tố ảnh hưởng đến qu tr nh ên men ma o actic ..........................17
H nh 2.1 Sơ đồ phân ập vi khuẩn ma o actic từ nguồn nguyên i u quả và

nho .27

H nh 3.1 So s nh hàm ượng axít ma ic trước và sau qu tr nh ên men ma o actic
của 2 chủng vi khuẩn ma o actic trên môi trường rượu vang non ............................38
H nh 3.2. So s nh hàm ượng axít actic trước và sau qu tr nh ên men ma o actic
của 2 chủng vi khuẩn ma o actic trên môi trường rượu vang non ............................39
H nh 3.3 So s nh hàm ượng axít axetic trước và sau ên men ma o actic của 2
chủng vi khuẩn malolactic ........................................................................................41
H nh 3.4 So s nh hàm ượng diaxety trước và sau ên men ma o actic của 2 chủng
vi khuẩn malolactic ...................................................................................................42
H nh 3.5 So s nh hàm ượng axit axetic tạo thành sau qu tr nh ên men ma o actic
của 2 chủng................................................................................................................43
H nh 3.6 Hàm ượng axít ma ic được phân giải trong qu tr nh tàng trữ có bổ sung
dinh dưỡng kh c nhau theo thời gian. .......................................................................46
H nh 3.7 So s nh s tạo thành rượu etano sau qu tr nh ên men malolactic ..........52
H nh 3.8 So s nh s tạo thành 1 số chất bay hơi sau qu tr nh ên men ma o actic .53


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AG

Acid Grape - Nước nho axít

CoA

Coenzyme A

CFU

Colony forming unit - Đơn vị h nh thành khuẩn lạc

HDL

High density lipoprotein - Lipoprotein có tỷ trọng cao

LAB

Lactic acid bacteria - Vi khuẩn lactic

MRS

De Man, Rogosa and Sharp - Môi trường MRS

NAD+

Nicotinamit Adenin Dinucleotide

NADH

Nicotinamit Adenin Dinucleotide Hydrogen

EO

Chế phẩm Essentia oenos

OD

Optical density - Mật độ quang

MLF

Melolactic fermentaeion - Lên men ma o actic


MỞ ĐẦU
Rượu vang à đồ uống có cồn được sản xuất từ qu tr nh ên men dịch quả
nói chung mà phổ biến nhất à từ quả nho. Do nho à oại quả có thành phần ho học
thích hợp cho nấm men ph t triển và có hương thơm đ p ứng được những yêu cầu
cho sản xuất rượu vang chất ượng cao. Trải qua ịch sử h nh thành và ph t triển âu
đời, rượu vang nho với nồng độ rượu vừa phải từ 10-14%v à đồ uống có ợi cho
sức khỏe của con người với gi trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon rất được ưa
chuộng ở khắp nơi trên thế giới. Từ nhiều n m nay, rượu vang nho đã trở thành thức
uống phổ biến ở nước ta. Thị trường rượu vang trong nước rất ph t triển, tuy nhiên
vẫn chưa đ p ứng được yêu cầu cả về chất và ượng. Theo số i u của Tổng cục
thống kê, kể từ n m 2010 đến nay, rượu vang nhập khẩu đã t ng khoảng 25%/ n m.
Trong đó, Ninh Thuận được biết đến à vùng trồng nho chính có sản ượng ớn nhất
cả nước, hi n trồng chủ yếu à giống nho Red Cardinal thường dùng để n tươi hơn
à để ên men rượu v cho màu sắc nhạt, không hấp dẫn. Do vậy, chất ượng rượu
vang Vi t Nam hi n nay chưa thật cao khi so s nh với rượu vang nhập khẩu do
hương và vị sản phẩm chưa đạt tiêu chuẩn, màu sắc dễ bị nâu ho , sản phẩm bị ắng
cặn…Với tiềm n ng về thị trường ớn như ở nước ta, vi c cải tiến công ngh để sản
xuất rượu vang nho à vấn đề đang rất được quan tâm.
Nhiều nước trên thế giới đã giải quyết được vấn đề này bằng những nghiên
cứu hoàn thi n công ngh sản xuất rượu vang nho đi sâu àm rõ c c cơ chế như: s
chuyển hóa c c thành phần trong nho thành c c chất thơm trong rượu vang, t c
động của điều ki n môi trường đến s

sinh trưởng và ph t triển của vi khuẩn

ma o actic trong qu tr nh ên men ma o actic[26, 27]…Qu tr nh ên men rượu

vang à qu tr nh ên men th c hi n chủ yếu nhờ nấm men và một phần bởi vi khuẩn
actic có mặt trên quả nho hoặc trên thiết bị àm rượu. Nấm men sử dụng h enzym
của m nh để chuyển hóa g ucoza và một số đường kh c thành rượu và c c sản phẩm
phụ kh c (rượu bậc cao, este, c c axít hữu cơ...), trong khi đó vi khuẩn actic chuyển
hóa axít ma ic thành axít actic và CO2 bằng qu tr nh ên men ma o actic. Lên men
ma o actic đóng vai trò quan trọng trong sản xuất rượu vang đỏ và 1 số oại vang

1


trắng, đây à một qu tr nh không thể thiếu trong vi c àm biến đổi c c thành phần
hóa học, mang ại cho rượu vang những hương vị đặc trưng. Với điều ki n, công
ngh sản xuất rượu vang của Vi t Nam hi n nay, vi c phân ập và tuyển chọn một
số chủng vi khuẩn actic để tối ưu hóa qu tr nh ên men ma o actic à rất cần thiết.
Điều này đã giúp c c nhà sản xuất rượu vang kiểm so t qu tr nh sản xuất rượu
vang được tốt hơn, giảm rủi ro tạo ra c c sản phẩm hỏng hoặc có chất ượng không
ổn định, đồng thời àm đa dạng c c chủng oại rượu vang phục vụ cho nhu cầu
người tiêu dùng. Từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới cho công ngh sản xuất rượu
vang nho chất ượng cao của Vi t Nam giải quyết những vấn đề th c tiễn của ngành
sản xuất rượu vang trong nước.V vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển
chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang”.

2


CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu chung về rƣợu vang
1.1.1 Vài nét về rượu vang
Rượu vang à thức uống có cồn được sản xuất bằng phương ph p ên men
không chưng cất từ dịch nho. Nhờ t c nhân ên men ( ên men một giai đoạn) hoặc

nhờ nấm men và vi khuẩn actic ( ên men hai gian đoạn) đã tạo cho rượu vang có
hương vị đặc trưng, cũng như gi trị dinh dưỡng cao hơn hẳn c c oại rượu kh c.
Thuật ngữ “Rượu vang”- tiếng a tinh à “vinum”, được bắt nguồn từ chữ “vinea”,
có nghĩa à cây nho. Trước tiên vi c sản xuất rượu vang được tiến hành bằng c ch
ép ấy dịch quả nho, sau đó ên men hoàn toàn t nhiên trong c c hang đ . Người La
Mã có công truyền b nghề trồng nho àm rượu sang Ph p Marsei es từ thế kỉ II,
sau đó à vùng Champagne và Monse e Va ey vào khoảng thế kỉ IV. Ph p bắt đầu
xuất khẩu rượu vang sang Anh và Đức vào thế kỉ XII. Vào n m 1857, ần đầu tiên
trong ịch sử, Louis Pasteur công bố những nghiên cứu về qu tr nh ên men, x c
định rõ vai trò quan trọng của nấm men trong qu tr nh ên men rượu và s biến đổi
ho sinh trong qu tr nh ên men của nấm men [8]. Đến nay đã có hàng tr m oại
rượu vang kh c nhau đ p ứng được nhu cầu đa dạng của người tiêu dùng. Phân oại
rượu vang được d a trên màu sắc: vang màu và vang trắng, trong c c oại vang màu
th rượu vang đỏ có gi trị cao nhất. Ngày nay nguyên i u chế biến rượu vang được
mở rộng ra c c oại nguyên i u quả kh c nhau, phong phú về màu sắc và chất ượng.
Trải qua nhiều thế kỷ, rượu vang đã khẳng định vai trò của nó với sức khỏe
con người. Louis Pasteur đã nhiều ần khẳng định: “Rượu vang à oại đồ uống rất
v sinh và rất có ợi cho sức khoẻ”. Khoa học hi n nay đã ph t hi n trong rượu
vang đỏ có chứa chất trans-resveratro à một chất chống oxi hóa, gặp trong vỏ của
quả nho đỏ (vỏ mỗi quả chứa khoảng 2µg trans-resveratrol). C c po ypheno trong
Chất này có t c dụng trung hòa c c t c nhân oxi hóa, chẳng hạn c c gốc t do được
tạo thành trong qu tr nh trao đổi chất b nh thường của tế bào. C c gốc t do này sẽ
gây hư hại mô nếu không nhanh chóng được oại bỏ. Chính t c dụng nói trên của

3


trans-resveratro đã góp phần àm giảm nguy cơ tử vong do b nh nhồi m u cơ tim ở
người [30].
1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang [7, 8, 12]

Lên men à một qu tr nh trao đổi chất dưới t c dụng của c c enzyme tương
ứng. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau qu tr nh ên men mà người ta chia c c kiểu ên
men kh c nhau. Có hai h nh thức ên men chính à ên men yếm khí và ên men hiếu
khí. Lên men rượu à qu tr nh ên men yếm khí với s có mặt của nấm men, chúng
sẽ chuyển hóa đường thành ethano và CO2. Th c chất đây à qu tr nh oxi ho khử có mặt c c enzyme của nấm men. N ng ượng sinh ra phục vụ cho hoạt động
sống của nấm men hoặc bị tiêu hao dưới dạng nhi t [7]. S thay đổi nhi t độ trong
qu tr nh ên men có thể dẫn tới sốc nhi t àm ảnh hưởng tới hoạt tính của nấm men.
Do vậy giữ nhi t độ ổn định trong qu tr nh ên men à một yếu tố quan trọng giúp
qu tr nh ên men được hoàn thành. Nấm men nhạy cảm nhất với nhi t độ trong giai
đoạn đầu ph t triển và nhân ên và nó trở nên chống chịu tốt hơn trong giai đoạn
sau. Do vậy đối với ên men rượu vang th giai đoạn đầu của qu tr nh ên men nên
duy tr ở nhi t độ 18-22oC và sau đấy cho phép t ng dần ên [7, 12]. Nhi t độ ên
men ban đầu qu cao có thể à nguyên nhân gây ra hi n tượng ở cuối qu tr nh ên
men.
Qu tr nh ên men rượu chia àm hai thời kỳ chính:
- Thời kỳ ph t triển sinh khối: giai đoạn này với s có mặt của oxy, tế bào nấm
men ph t triển sinh khối.
- Thời kỳ ên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men
hấp thụ c c chất dinh dưỡng và sử dụng c c enzyme sẵn có của m nh th c hi n xúc
t c sinh học trong qu tr nh trao đổi chất để duy tr s sống, tạo thành rượu và CO2.
Sản phẩm thu hồi của qu tr nh ên men rất phức tạp. Ngoài ethano còn
nhiều chất kh c như este, rượu bậc cao, c c axit hữu cơ, g ycero , dầu fuse ... Tỷ
c c sản phẩm phụ này phụ thuộc vào điều ki n của môi trường ên men.

4


Trong qu tr nh này, nấm men chuyển hóa đường thành rượu và giải phóng
CO2 dưới t c dụng xúc t c của enzyme do nấm men tạo ra theo con đường Eno pyruvat [7].

Nho đỏ
Nghiền/chà t ch cuống
SO2

Cuống

Su fite hóa
Ngâm
T ch dịch nho rỉ
T ch cặn

Nấm men

Hi u chỉnh thành phần
dich nho

Hoạt hóa nấm men

Lên men

Vi khuẩn actic

Lên ma o actic

Cặn

Ủ rượu
Ổn định rượu
Làm trong
Rót sản phẩm

Rượu Vang

5

Cặn


Sơ đồ: 1.1 Quy trình công nghệ sản xuất rƣợu vang đỏ trên thế giới.
Trong quả nho và nhiều oại quả kh c, hầu như chỉ có đường khử glucoza,
fructoza. V vậy nếu sử dụng dịch ên men hoàn toàn từ dịch ép quả th qu tr nh ên
men rất thuận ợi. Sản phẩm thu hồi của qu tr nh ên men rất phức tạp. Ngoài
etano , còn có nhiều c c hợp chất kh c như este, rượu bậc cao, c c axít hữu cơ,
glyxerol...
Este: C c este được cho à có ý nghĩa ớn nhất đối với s h nh thành hương

vị rượu vang [40]. Mùi quả đặc trưng của vang chủ yếu nhờ vào một hỗn hợp của
hexyl axetat, etyl caprilat. Este có mặt nhiều nhất trong rượu vang à ety axetat. Nó
được h nh thành trong qu tr nh ên men và trong qu tr nh ưu giữ ở thùng gỗ sồi.
Ngưỡng cảm nhận của ety axetat à 160 mg/ [41]. Trên ngưỡng này, nó ảnh hưởng
xấu đến hương vị của rượu nhưng ở nồng độ thấp hơn th nó ại đóng góp tích c c
vào gi trị cảm quan của vang.
Rượu bậc cao: Rượu bậc cao được h nh thành trong qu tr nh ên men rượu
và đạt tới nồng độ từ 150-550 mg/ [41]. Rượu bậc cao và c c este của nó đóng vai
trò quan trọng đến vi c tạo hương cho rượu. C c rượu bậc cao chủ yếu à c c
isobuty và c c amy a coho . Ở nồng độ thấp hơn 300 mg/ , nó tạo hương rất tốt
cho rượu nhưng ở nồng độ cao hơn, hương của nó không chấp nhận được.
C c axít hữu cơ: C c axít hữu cơ có t c dụng àm bền và nâng cao gi trị
cảm quan của rượu, đặc bi t à rượu vang trắng [31]. Đặc tính bảo quản của nó cũng
àm t ng độ bền hóa ý và vi sinh vật của rượu vang. C c axít hữu cơ chủ yếu được

h nh thành trong qu tr nh ên men à axít actic, axít sucxinic, axít axetic, ngoài ra
còn có một ượng nhỏ axít butyric, axít formic và propionic,... nhưng nhiều hơn cả
à axít actic và axít axetic. C c axít hữu cơ có t c dụng àm giảm pH môi trường
trong qu tr nh ên men. Chúng ít ảnh hưởng đến thành phần hương của rượu trừ
axít axetic tạo ra mùi dấm chua. Không thể sản xuất ra rượu mà không có ít axít
axetic nào. Hàm ượng trung b nh của nó trong rượu vang bàn à nhỏ hơn 0,4g/

6


trong khi ngưỡng ph t hi n của nó à 3g/ . Nhi t độ ên men ma o actic cao thúc đẩy
s tạo thành axít bay hơi nhiều hơn [27].
Ngoài ra, c c thành phần như a dehyt, g yxero được tạo ra bởi nấm men
trong qu tr nh ên men đều có t c dụng tạo nên hương thơm đặc trưng của rượu
vang. Qu tr nh ên men rượu đã giải phóng 40 kca n ng ượng t do trên một phân
tử đường. Qu tr nh ên men thường chứa khoảng 180g đường/ ít, do đó s giải
phóng nhi t về í thuyết sẽ àm cho nhi t độ ên men t ng từ 20oC ên 45oC [32].
Như vậy, ban đầu à qu tr nh ên men rượu được nấm men Saccharomyces
cerevissiae đảm nhận. Tiếp theo à hoạt động của c c vi khuẩn Leuconostoc oenos,
Lactobacillus, Pediococcus chuyển ho đường sót trong rượu vang non và quan
trọng hơn cả à qu tr nh ên men axít malic thành axít 1 actic và axít xitric thành
axít axetic, axetoin, diaxety , butađio 2-3, góp phần đ ng kể vào s h nh thành
hương vị đặc trưng của rượu vang, “Đây chính à qu tr nh ên men Ma o actic”.
Trong công ngh sản xuất rượu vang, qu tr nh ên men ma o actic được tiến hành
sau khi ên men chính, dịch ên men được gọi à “vang non” được tiến hành ắng
gặn cặn và được chuyển sang bồn hay nồi ên men tiếp theo [4].
1.2 Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn actic à một bộ phận của h vi sinh vật t nhiên trên quả nho,
trong dịch đường và rượu vang. Vi khuẩn actic à những tế bào Gram dương, dị
dưỡng ho n ng hữu cơ, hoạt tính catalaza âm tính và axít lactic được xem à sản

phẩm cuối cùng của qu tr nh trao đổi chất của chúng [4]. Chính pH axít, hàm
ượng êtano và c c thành phần kh c của rượu vang tạo ra p

c chọn ọc đối với

c c vi khuẩn actic. Chỉ có một số oài rất nhỏ có khả n ng t ph t triển trong c c
oại dịch đường và rượu vang. C c oài thường gặp trong sản xuất rượu vang chủ
yếu thuộc c c giống sau: Pediococcus, Leuconostoc, Oenococcus và Lactobacillus.
S xuất hi n của c c oại vi khuẩn actic này trên bề mặt quả nho à rất nhỏ, khoảng
100 tế bào/g quả [43]. Mật độ quần thể vi khuẩn actic phụ thuộc rất nhiều vào điều
ki n khí hậu trong những ngày cuối cùng của qu tr nh chín, độ chín và trạng th i
v sinh của quả nho. C c quần thể vi sinh vật có mặt nhiều hơn trên vỏ quả nho chín

7


hoặc có t nh trạng v sinh kém. Khi qu tr nh chín của quả nho kết thúc bởi một giai
đoạn nóng và ít mưa kéo dài, th c c vi khuẩn actic sẽ xuất hi n nhiều hơn trên bề
mặt quả nho. Tuy nhiên, c c oài vi sinh vật ban đầu này xuất hi n rất ít trong rượu
vang mà phần ớn à c c oại vi khuẩn nhiễm tạp từ c c dụng cụ àm rượu trong c c
giai đoạn kh c nhau diễn ra trong qu tr nh bơm dịch nước nho vào thùng ên men.
Mặc dù người ta có thể bắt gặp trong c c oại rượu vang một số vi khuẩn t nhiên từ
quả nho, nhưng chủ yếu vẫn à c c vi khuẩn có nguồn gốc từ c c thiết bị trong hầm
rượu. Tương t như vậy đối với trường hợp của nấm men. Nấm men t nhiên trên
bề mặt quả t ph t triển sau c c thao t c công ngh kh c nhau diễn ra tiếp sau qu
tr nh thu h i và qu tr nh chuyển bơm dịch nước nho vào thùng ên men, cho tới tận
khi dịch đường nước nho được cấy giống. Tuy nhiên, cũng có thể à có s ph t triển
của c c oại nấm men có nguồn gốc từ c c vật i u tiếp xúc với dịch nước nho. Do
vậy, sau giai đoạn thu hoạch nho, c c nấm men nhanh chóng ph t triển và chiếm
ĩnh hầm rượu. Trên th c tế, người ta vẫn chưa làm s ng tỏ được à con đường nào

trong hai con đường gieo giống t nhiên này à có vai trò quan trọng hơn.
Trong suốt qu tr nh sản xuất rượu vang, c c vi khuẩn actic ph t triển,
không chỉ về số lượng mà còn có cả s thay đổi của c c oài. Vi khuẩn phân ập
được trên vỏ quả nho trước khi thu hoạch thuộc chủ yếu à c c oài Lactobacillus
plantarum, L. hilgardii và L. Casei. Loài Oenococcus oeni trước đây được gọi à
Leuconostoc oenos xuất hi n muộn hơn nhưng ại à quan trọng nhất, rất hiếm khi
chúng có mặt trên

nho, quả nho và chỉ có số ượng rất ít. Trong th c tế, oài này

rất ít xuất hi n ở giai đoạn đầu của qu tr nh ên men. C c oại tr c khuẩn và cầu
khuẩn xuất hi n trên quả nho thường xuyên hơn so với O.oeni. Trong số tất cả c c
oài này nói trên, oài cuối cùng O.oeni được coi là có khả n ng chống chịu cao nhất
đối với c c điều ki n môi trường bất ợi của rượu vang như pH thấp, hàm ượng cồn
và SO2 cao và do vậy chịu tr ch nhi m chính cho qu tr nh ên men ma o actic
trong đa số c c trường hợp[4].
Số ượng tế bào vi khuẩn actic đạt 103 - 104 tế bào/ml sau qu tr nh ép nho
[43]. Dịch nước nho ngay sau khi được đưa đến thùng ên men có chứa một h vi

8


sinh vật rất đa dạng, phần ớn bao gồm c c oài Lactobacillus plantamm, L. casei, L.
hilgardii, L. brevis, Pediococcus dcimnosLis, p. pentosaceus, Leuconostoc
mensenteroides và Oenococcus oeni. Tuy nhiên, trong t nh trạng v sinh kém hoặc
trong c c điều ki n vận chuyển hoặc mức độ sạch của c c thiết bị trons, hầm rượu
không cao, số ượng tế bào vi khuẩn actic có thể ên tới 106 tế bào/ml. Bên cạnh đó,
trong giai đoạn đầu của qu tr nh ên men rượu, c c tế bào nấm men cũng có số
ượng tương t . Điều này rất có thể dẫn đến s nguy cơ cạnh tranh ph p triển giữa
vi khuẩn và nấm men. Hơn nữa pH của dịch nước nho chín kỹ thường rất cao tạo

điểu ki n thuận ợi cho c c vi khuẩn. Đây à t c nhân quyết định chính tới số ượng
của quần thể c c vi khuẩn và đối với s ph t triển của chúng trong giai đoạn đầu
của qu tr nh ên men. Trong qu tr nh sản xuất rượu vang, có ên men ma o actic,
quần thể vi khuẩn t nhiên ph p triển trải qua rất nhiều pha kh c nhau. Trong những
ngày đầu tiên của qu tr nh ên men rượu, c c oại vi khuẩn và nấm men t ph t
triển. Nhưng c c nấm men thích nghi với dịch đường của nho nhiều hơn, t sinh sản
rất nhanh đạt tới c c quần thể rất ớn. Lafon- Lafourcade, 1983 đã bắt gặp, s ph t
triển của c c vi khuẩn actic đồng thời với s ph t triển của c c nấm men trong giai
đoạn đầu của qu tr nh ên men nhưng nó chỉ dừng ại ở giới hạn từ 104 đến 105 tế
bào vi khuẩn actic/mL [43]. S ph t triển này phụ thuộc vào c c điều ki n ho

ý

của môi trường và s ph t triển này còn cao hơn khi pH cao và hàm ượng SO2 thấp
[29]. S ph t triển của c c vi khuẩn ac ic trong giai đoạn đầu của qu tr nh ên men
nrợu mang tính chuyển tiếp. Trong giai đoạn hoạt động mạnh nhất của qu tr nh ên
men rượu và tới tận khi hàm ượng đường đã bị cạn ki t, số ượng c c vi khuẩn
giảm xuống nhanh chóng, chỉ còn 102 - 103 tế bào/ml và thậm chí còn thấp hơn do
s cạnh tranh với c c oại nấm men và c c điều ki n môi trường. Trong qu tr nh
ên men rượu, s cạnh tranh của nhiều oài vi khuẩn kh c nhau diễn ra iên tục và
tới cuối qu tr nh ên men rượu th chỉ có những oài chịu được với môi trường
êtano tốt hơn tồn tại được, đặc bi t à c c vi khuẩn O.oeni [35]. Cuối qu tr nh ên
men rượu, sẽ còn khoảng 102 - 103 tế bào/mL vi khuẩn O.oeni. Chính oài này sẽ t
sinh sản ngay sau đó và tạo ra h vi sinh vật chịu tr ch nhi m ên men ma o actic.

9


Cũng có thể có c c đại di n của c c oài kh c còn sống sót với số ượng rất nhỏ sau
qu tr nh ên men, chúng có thể ph t triển nếu như rượu vang không được bảo v

tốt và đây chính à nguyên nhân àm hỏng rượu vang. Liên quan tới qu tr nh
chuyển ho axít ma ic, oài O.oeμni này được khởi động ngay sau khi số ượng qu n
thể đủ ớn để khởi động (thường à 106 tế bào/mL). S ph t triển này có thể kéo dài
trong nhiều ngày hoặc nhiều tuần tuỳ theo c c trường hợp. Lên men ma o actic có
thể hoàn thành ở cuối pha tĩnh hoặc đầu pha suy vong. Nhưng nếu có c c điều ki n
à thích hợp, ên men ma o actic có thể kết thúc ở cuối pha ph t triển. Cuối cùng,
khi kết thúc ên men ma o actic, cần phải Sulfit ho rượu vang để oại bỏ hoàn toàn
c c vi khuẩn còn sống [14].
1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang
C c vi khuẩn actic thuộc nhóm c c vi sinh vật Gram dương và do vậy được
nhuộm mầu bằng phép thử Gram có iên quan tới cấu tạo của thành tế bào. C c vi
khuẩn Leuconostoc và Oenococcus (h nh 1-2) có dạng h nh cầu. Đó à c c tế bào
nhỏ (kích thước từ 0,5 - 1 μm) tròn hoặc hơi dài tạo ra c c cặp hoặc chuỗi.

Hình 1.1 Tế bào dạng chuỗi của chủng O.oeni.
Tuỳ vào s đa dạng của c c sản phẩm trao đổi chất của c c oại đường, c c
vi khuẩn actic được phân bi t thành 2 nhóm:
- Nhóm sinh axít actic (> 85%) từ g ucoza được gọi à ên men đồng h nh như
c c oài thuộc giống Pediococcus và oài Lactobaci us ma i. C c vi khuẩn này phân

10


huỷ g ucoza thành pyruvat theo con đường đường phân truyền thống. Pyruvat tiếp
theo bị khử thành axít D và/hoặc L - actic phụ thuộc vào từng oài bởi c c enzim
actate dehydrogenaza L và/hoặc D. Qu tr nh này cho phép ôxy ho khử c c phân
tử NADH2+ thu được từ qu tr nh đường phân thành NAD+.
- Nhóm mà bên cạnh axít actic, còn sản xuất axít axêtic, ethano và CO2, được
gọi à ên men dị h nh. Người ta phân bi t:
+ C c oài dị h nh nghiêm ngặt như c c oài thuộc giống Leuconostoc và một vài

oài thuộc giống Lactobacillus (L. brevis, L. hilgardii...). Chúng không có enzim
a do aza của hai con đường (đường và pentoza -photphat) phân và do vậy không thể
ên men c c oại đường theo con đường ên men dị h nh của c c pentoza-photphat.
+ C c oài ên men dị h nh tuỳ ti n như O.oeni, Lactobacillus casei và
Lactobacillus plantarum có c c enzym của cả hai con đường (đường phân và
pentoza-photphat) và chúng thích nghi với một trong hai con đường này phụ thuộc
vào điều ki n môi trường [14].
1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni
Mặc dù có rất nhiều oài vi khuẩn ma o actic sử dụng trong sản xuất rượu
vang nhưng O. oeni vẫn à oài vi khuẩn được

a chọn bởi đa số c c nhà sản xuất

rượu vang. O. oeni có tên gọi trước đây à Leuconostoc oenos, à một oài hiếu khí
tùy ti n và có thể sinh trưởng trên môi trường có pH thấp (pH 4,2-4,8) được bổ sung
nước cà chua hoặc nước nho [26]. Ở c c vùng sản xuất rượu nho, nó có mặt trong
dịch hèm cũng như trong rượu vang non. Nguồn cacbon (có nguồn gốc từ c c oại
đường), nitơ (từ c c axit amin t do hoặc c c chuỗi peptit ngắn), c c vitamin (axit
nicotinic, thiamin và uraci ) à toàn bộ nhu cầu cho s sinh trưởng tối ưu của vi
khuẩn này. O.oeni có khả n ng chuyển ho axít L-ma ic thành axít L- actic, ên
men fructoza, g ucoza và treha oza. Qu tr nh ên men g ucoza tạo ra axít D-lactic,
C02, axít axetic và etano . Một số oài thuỷ phân arginin và một số kh c ên men
axít xitric khi có mặt c c oại đường có thế ên men, nhưng c c tính chất này bị mất
đi sau một vài ần cấy iên tiếp [46].
Tế bào O. oeni có h nh cầu và tồn tại ở dạng chuỗi khi sinh trưởng trên môi

11


trường rắn. S sinh trưởng tương đối chậm và có thể mất từ 5-7 ngày để h nh thành

c c khuẩn ạc có thể quan s t được tại nhi t độ từ 20-30°C. Mặc dù trước đây chúng
được xếp vào cùng nhóm với c c oài Lenconostoc, nhưng phân tích ADN đã chỉ ra
chúng à một nhóm t ch bi t hoàn toàn với oài Leuconostoc [46].
O. oeni được coi à ứng viên tốt nhất để tiến hành ên men ma o actic nhờ
s thích nghi của chúng với c c điều ki n khắc nghi t của môi trường, đặc bi t à
điều ki n axít và hàm ượng cồn cao trong rượu. Rượu vang cấy c c chủng O. oeni
đã tuyển chọn cho phép dễ dàng kiểm so t toàn bộ qu tr nh ên men malolactic.
Ngoài ra, vi c

a chọn một chủng o. oeni có thể cho phép c c nhà sản xuất rượu

đảm bảo về c c tính chất được tạo ra trong sản phẩm cuối cùng. Do vậy, rượu vang
tạo ra đặc trưng. Mặc dù, thường chỉ một chủng vi khuẩn được

a chọn, nhưng

trong một số trường hợp thỉ một hỗn hợp c c chủng có thể được sử dụng để cấy
giống. Điều này không chỉ tạo ra c c đặc tính được yêu thích hơn của rượu vang,
mà còn tạo ra khả n ng sống sót cao nhất của vi khuẩn nếu có một th c khuẩn thể
trong rượu [26].
1.3 Quá trình lên men malolactic
1.3.1 Bản chất của quá trình lên men malolactic
Trong ên men rượu vang người ta gọi qu tr nh phân giải axit ma ic và
xitric dưới t c dụng của enzym ma o acticase của O. oeni à qu tr nh ên men
actic, một qu tr nh quan trọng bậc nhất trong giai đoạn ên men phụ của rượu vang
và sâm panh [3, 42]. Vi khuẩn lactic t nhiên uôn có mặt trên vỏ quả nho sau khi
chín với số ượng từ 103 đến 104 CFU/m và đi vào vang non theo dịch nước quả.
Tuy nhiên, số ượng của chúng úc này cũng bị giảm đ ng kể do bị ức chế và tiêu
di t bởi S02 (khoảng 50 mg/m ) ở giai đoạn sunfit ho và nồng độ cồn cao (khoảng
14-15° cồn) sinh ra sau qu tr nh ên men rượu. Do vậy, trong rượu vang non, c c

oại tr c khuẩn và cầu khuẩn lactic bị tiêu di t gần như hoàn toàn và chỉ còn sót ại
số ượng ít ỏi c c tế bào vi khuẩn O. oeni từ 102-103 CFU/m . Tuy nhiêu, đây chính
à t c nhân chính của một qu tr nh quan trọng nhất trong giai đoạn ên men phụ kéo
dài đó à qu tr nh ên men ma o actic.

12


Hình 1.2. Quá trình trao đổi chất của các vi khuẩn lactic lên men dị hình [32]
Đặc trưng cơ bản nhất của qu tr nh này à s chuyển ho hoàn toàn c c
diaxít như malic và xitric có trong dịch quả và một phần sinh ra sau qu tr nh ên
men chính (khoảng 10 g/1) thành c c monoaxít như lactic và axetic bởi c c vi
khuẩn O. oeni [32]. Axit ma ic và xitric chủ yếu vào dịch ên men từ quả và chỉ một
ượng ít được tạo ra từ qu tr nh ên men rượu. Khi axit ma ic và xitric bị phân giải
sẽ àm vang chua dịu hơn và vị hài hoà hơn, một khi rượu vang không còn hai oại
axit th ít có nguy cơ biến đổi độ chua và àm chất ượng vang ổn định hơn. Sản
phẩm của qu tr nh ên men ma o actic từ axit ma ic à axit actic và CO2, còn từ
axit xitric à diaxety , axetoin, 2,3 - butadio đây à những tiền chất tạo nên h nh
thơm đặc trưng cho vang, ngoài ra còn tạo thành axít axêtic.
Cơ chế của qu tr nh ên men ma o actic được tr nh bày tóm tắt theo sơ đồ
dưới đây:

Hình 1.3. Cơ chế của quá trình lên men malolactic

13


Lên men ma o actic à một chuỗi c c phản ứng ho học phức tạp được xúc
t c bởi một h

enzim có trong vi khuẩn L.oenos. Ban đầu à enzim malat

dehydrogenaza chuyển ho axít malic thành axít oxa oaxetic, tiếp theo à phản ứng
decacboxy được xúc t c bởi enzim oxaloaxetat decacboxylaza để tạo thành axít
pyruvic. Sản phẩm trung gian này cuối cùng bị chuyển ho thành axít D hoặc Llactic bởi enzim D hoặc L-lactic dehydrogenaza [12].
1.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic
Những nghiên cứu gần đây cho thấy, rượu vang được trải qua ên men
ma o actic cho chất ượng cao hơn hẳn khi không trải qua giai đoạn này. S biến đổi
chất ượng của vang sau qu tr nh ên ma o actic đã được chỉ ra à v ba í do chủ
yếu sau [3,4,42].
- Để giảm độ chua của vang do axit ma ic (diaxit) được chuyển thành axit
actic (monoaxit), điều này àm giảm độ axit và t ng đọ pH nhờ đó mà vang thay v
vị chua gắt của axit ma ic sẽ trở nên dịu hơn và vị hài hòa hơn.
- Làm t ng tính ổn định sinh học của rượu vang bởi v s ph t triển của vi
khuẩn sẽ àm nghèo nguồn dinh dưỡng và oại khỏi môi trường hai axit hữu cơ quan
trọng à axit ma ic và axít xitric. Đảm bảo giảm tối thiểu qu tr nh ên men chậm
của vi khuẩn lactic khi bảo quản vang trong chai và s ph t triển một c ch t ph t
của c c vi sinh vật không mong muốn gây nên c c b nh cho vang.
- Làm t ng tổ hợp thơm của vang v c c hợp chất diaxety , axetoin và 2,3butanediol tạo ra từ qu tr nh chuyển hóa axit xitric bởi vi khuẩn à c c hợp phần
tạo nên hương thơm cho vang. Những thành phần kh c ảnh hưởng đến hương vị
cũng t ng như axit bay hơi, diety suxinat, một số este bay hơi, ety axetat, npropanol, 2-butanol, n-hexano , ety actate và 2,3 butanedio . Một số thành phần
kh c cũng t ng nhẹ như 3-methy-n-butal axetat, n-hexyl axetat, 2-phenyletyl-axetat
và 2-etyl-n-hexanoat [42,44].

14


1.3.3 Ảnh hưởng của quá trình lên men malolactic đến thành phần và chất
lượng rượu vang
1.3.3.1 Sự giảm độ chua

Mỗi phân tử axit L-ma ic chuyển hóa tạo ra axit L- actic do s mất đi nhóm
cacboxy và àm giảm tương ứng độ axit của rượu vang. Độ giảm axít sau qu tr nh
ên men ma o actic rất kh c nhau phụ thuộc vào nồng độ axít ma ic. Độ giảm này từ
2-3 g/l (H2SO4). Lên men 1 g axít ma ic trong 1 ít rượu vang non sẽ àm giảm axít
tổng số xấp xỉ 0,4 g/1. Trong qu tr nh ên men ma o actic, hàm ượng axít bay hơi
thường xuyên t ng ên, có thể một phần à do s ph hủy của axít xitric. Vi khuẩn
cũng sản xuất axít axetic từ s phân giải đường pentoza. S phân hủy axít ma ic
dường như à không đủ cung cấp n ng ượng cho hoạt động tế bào [28].
Bảng 1.1. Phân tích rƣợu vang đỏ trƣớc và sau lên men malolactic
Trƣớc lên men

Sau lên men

Axít tổng số

(g/1 H2SO4)
4,9

(g/1 H2SO4)
3,8

Axít bay hơi

0,21

0,28

Axít malic

3,2

0,5

Axít lactic

0,12

1,8

Axít

Lên men ma o actic được thừa nhận à có ảnh hưởng tới s ổn định vi sinh
vật và s phức tạp của hương vị, cần thiết để điều chỉnh độ axít và pH của rượu
vang. S t ng ên của pH đi kèm với ên men ma o actic có thể cũng ảnh hưởng đến
màu sắc của rượu vang.
1.3.3.2 Những thay đổi về hương
C c nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng c c chủng vi khuẩn ma o actic kh c nhau
có thể t ng hoặc giảm cường độ của c c đặc tính hương và vị của rượu vang và
những thay đổi này phụ thuộc vào chủng vi khuẩn. Ngoài ra, hương rượu vang chịu
t c động của ên men ma o actic có thể à mùi bơ, mùi hạt dẻ, mùi nấm men, mùi gỗ

15


sồi, mùi mồ hôi và mùi đất. Lên men ma o actic cũng t c động đến hương hoa và
quả cũng như cảm gi c mềm mại của rượu vang [28,32]. Cơ chế ảnh hưởng của vi
khuẩn ma o actic đến hương rượu vang có thể à:
- Loại bỏ những hợp chất tạo hương có trong rượu vang non bởi s trao đổi
chất và hấp thụ với thành tế bào.
- Tạo ra c c họp chất tạo hương mới từ vi khuẩn nhờ qu tr nh trao đổi chất

của đường, axít amin và c c cơ chất kh c.
- S trao đổi chất và biến đổi c c sản phẩm thứ cấp từ nấm men và nho tới c c
sản phẩm cuối cùng tạo ra t c động ớn hơn hoặc nhỏ hơn đối với gi trị cảm quan
của rượu.
C c chủng vi khuẩn ên men ma o actic có khả n ng tạo ra diaxety có mùi
bơ, mùi hạt dẻ. Mặc dù hàm ượng thấp từ 1-4 mg/1 tạo ra hương bơ đặc trưng cho
rượu vang nhưng hàm ượng vượt qu 5-7 mg/1 có thể ảnh hưởng bất ợi tới chất
ượng rượu vang và gây hỏng rượu [17,39].
S tạo thành diaxety chịu ảnh hưởng bởi c c vi sinh vật, môi trường và c c
yếu tố sản xuất. Ngoài yếu tố chủng vi sinh vật, c c yếu tố sản xuất cũng có một t c
động đ ng kể đến hàm ượng diaxety , bao gồm oại rượu, tương t c giữa cặn nấm
men và vi khuấn, thời gian hoàn thành ên men ma o actic, s tiếp xúc giữa rượu
vang và không khí, s bổ sung S02, hàm ượng axit xitric và đường, nhi t độ và pH.
Một số tiêu chí cho rằng để đạt được hàm ượng diaxety cao trong rượu vang bao
gồm sử dụng một chủng vi sinh vật có khả n ng tạo ra hàm ượng diaxety cao, tỷ
cấy giống vi khuẩn thấp, pH và nhi t độ thấp hơn [11,37].
Hương quả của rượu vang không nhất thiết bị giảm bởi qu tr nh ên men
ma o actic, thậm chí trong một số trường hợp nó có thế còn t ng ên do nó có thể
tạo ra c c este như ety actat và isoamy axetat. Điều thú vị à s t ng ên của
hương quả nhờ qu tr nh ên men ma o actic iên quan tới s giảm đi của mùi rau.
S

giảm đi của mùi rau trong rượu vang Chardonnay sau qu tr nh ên men

ma o actic à oại bỏ mùi tỏi chín và mùi giống ure của 1-octano và -octene-3-ol [32] .

16


1.3.3.3 Ảnh hưởng đến màu sắc của rượu vang đỏ

Lên men ma oactic rượu vang đỏ có thể àm giảm cường độ màu của rượu
vang đỏ. Ví dụ như s t ng ên của pH trong qu tr nh ên men ma o actic có thể t c
động đến s cân bằng phụ thuộc pH của c c chất màu anthocyanin, dẫn tới mất đi
màu đỏ. S giảm màu sắc của rượu vang đỏ t ng ên iên tục bởi s kết tủa của c c
phân tử anthocyanin được giải phóng với c c po ysaccharit. Lên men ma o actic
cũng àm t ng s kết tủa anthocyanin và tannin. Phản ứng này àm ổn định màu của rượu.
Tính chất cảm quan của rượu cũng được t ng ên nhiều. Hương của rượu
trở nên quyến rũ hơn. Rượu trở nên mềm mại hơn do s khử gần như hoàn toàn axit
ma ic thành axít actic. Kết thúc qu tr nh ên men ma o actic, hương và vị của rượu
đầy đủ hơn nhưng ại thanh hơn [7].
1.3.3.4 Các chất ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và quá trình lên
menmalolactic
Thành phần rượu vang, phương ph p sản xuất và mối tương t c giữa vi
khuẩn ma o actic và c c vi sinh vật kh c có thế ảnh hưởng tới s sống sót và sinh
trưởng củavi khuấn ma o actic trong rượu vang và v vậy ảnh hưởng tới qu tr nh
ên menma o actic. Tuy nhiên, c c điều ki n môi trường như pH, nhi t độ, độ cồn,
t nh trạng dinh dưỡng, và S02 cũng chiếm một vai trò đ ng kể (h nh 1.4).
pH

Hình 1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men malolactic [7]
Gi trị pH nhỏ nhất mà tại đó vi khuẩn sinh trưởng được trong rượu vang

17


xấp xỉ 2,9-3,0. S

sinh trưởng của vi khuẩn nhanh hơn và qu tr nh ên men

ma o actic hoàn thành sớm hơn khi pH t ng trên 3,0. Mặc dù pH 6,3 à tối ưu cho

hoạt động của c c enzym ma o actic, nhưng s phân giải axit ma ic ại diễn ra
nhanh nhất tại c c gi trị pH thấp hơn.
Khả n ng chịu cồn à một đặc tính quan trọng của nhiều vi khuẩn
malolactic. Hầu hết c c chủng không có khả n ng ph t triển trong rượu vang có
hàm ượng cồn ớn hơn 15% v/v nhưng một số ại quan s t thấy s sinh trưởng ở độ
cồn 20% v/v.
Nhi t độ sinh trưởng tối ưu đối với phòng thí nghi m vi khuẩn lactic à từ
25-27°C và tỷ

phân giải ma atcao nhất tại nhi t độ gần đó. Tốc độ sinh trưởng

của vi khuẩn ma o actic và tốc độ ên men ma o actic bị ức chế tại nhi t độ thấp.
SO2 có t c dụng ức chế vi khuẩn ma o actic, SO2 còn có t c dụng thúc đẩy
qu tr nh ắng trong dịch nho. Theo Navarre (1994), đó à do s ức chế h vi sinh
vật có trong nguyên i u của SO2 nên không xảy ra hi n tượng ên men t nhiên
trong hỗn hợp nho sau qu tr nh nghiền xé. Nhờ đó mà s kết ắng của c c cấu tử ơ
ửng trong dịch nho sẽ diễn ra nhanh và hi u quả.
S

có mặt của th c khuẩn thể có thể cũng ức chế qu tr nh ên men

malolactic trong rượu vang. C c chủng th c khuẩn thể chống ại c c điều ki n bất
ợi và gây ph n hủy tế bào vi khuẩn ma o actic. Chúng cũng có khả n ng ph vỡ
động học quần thể của qu tr nh ên men ma o actic. Mặc dù s có mặt của c c th c
khuẩn thể có ảnh hưởng nghiêm trọng tới chất ượng của rượu vang, chúng có xu
hướng bị ức chế trong suốt qu tr nh sinh trưởng của vi khuẩn ma o actic và ảnh
hưởng của chúng à rất nhỏ nhờ c c điều ki n đảm bảo thuận ợi cho s sinh trưởng
của c c vi khuẩn ma o actic [7]..
1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic
1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic

Với mục đích khắc phục một c ch hi u quả c c yếu tố bất lợi nói trên người ta
đã sử dụng chủng giống vi khuẩn thuần khiết có khả n ng ên men ma o actic mạnh
trong qu tr nh sản suất rượu vang. Để sử dụng c c chế phấm này một c ch hi u

18


quả, c c nhà sản xuất khuyến c o không nên cấy tr c tiếp chế phẩm vào vang non
mà trước tiên phải nhân giống bằng môi trường có bổ xung dịch nước quả và axít
malic cho vi khuẩn từ từ lấy lại hoạt tính ên men ma o actic rồi sau đó mới cấy vào
rượu vang non, nhờ vậy tỷ l sống của vi khuẩn L.oenos úc này đạt trên 80% so với
khi cấy tr c tiếp chỉ đạt 20%.
Sử dụng cố định tế bào cho quá trình lên men malolactic
Lên men ma o actic iên tục bằng phương ph p cố định tế bào vi khuẩn
L.casei trên ge po yacry amit ần đầu tiên được th c hi n vào n m 1985 bởi Davis
và cộng s . Bên cạnh đó còn có nhiều nghiên cứu về ên men ma o actic bằng cố
định tế bào vi khuẩn L.oenos trong gel aginat ở 25°c trong 24 giờ. Kết quả cho thấy,
trong phương ph p cố định tế bào hoạt tính ên men ma o actic được duy tr âu hơn
so với ên men thông thường, ngay cả trong điều ki n môi trường có độ axít cao và
hàm ượng SO2 lớn[12].
Trong một nghiên cứu kh c, tế bào vi khuẩn Lactobacillussp. 48 đã được cố
định trên ge k-carrageenan khi có hoặc không có mặt Pentagel (bentonit tinh khiết)
có t c d ng àm t ng kích thước lỗ của gel do vậy tạo điều ki n thuận lợi cho qu
tr nh chuyển khối của h thống cố định tế bào. Trong qu tr nh này, tr c khuẩn
Lactobacilli có hoạt tính ên men axít malic, biến đổi pH môi trường, giảm độ chua,
tạo axít lactic tương đương với qu tr nh ên men ma o actic truyền thống [43].
Nếu như sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic để th c hi n qu tr nh ên men
ma o actic th thời gian ên men phụ có thể rút ngắn xuống còn vài th ng so với vài
n m khi ên men theo truyền thống. Tuy nhiên, thời gian ên men phụ để cho qu
tr nh ên men ma o actic diễn ra tri t để chỉ mất có vài ngày, thậm chí à vài giờ khi

tiên hành ên men bằng cố định tế bào. Chính v vậy, ên men ma o actic bằng cố
định tế bào à một giải ph p có nhiều triển vọng để nâng cao chất ượng của rượu vang.
1.4.2 Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic
Cho tới nay, sử dụng chế phẩm enzim ma o actic có thể được coi à một giải
ph p ý tưởng nhất để chuyển ho axít malic. Đã có rất nhiều chế phẩm enzim loại
này được sản suất và thương mại ho , đặc bi t à 5 oại enzym sau: EC 1.1.1.40-

19


enzym malic phụ thuộc NADP, EC 1.1.1.37 - enzym malic dehydrogenaza phụ
thuộc NAD, EC 1.1.1.27- enzyme phụ thuộc NAD, chuyến ho axít pyruvic thành
axít lactic, EC 1.6.1.1- enzyme nicotiamit nucleotit transhydrogenaza, chuyển H từ
NADPH sang NDA và enzim malolactic phụ thuộc NAD, chuyển ho tr c tiếp axít
malic thành axít lactic.
Hervé Vai ant và Pasca Formisyn, 1996, đã sử dụng phương ph p cố định
enzim malolactic tinh sạch từ chủng L.oenos 8406 trên màng Polysulfone nhằm
chuyển ho axít malic thành axít lactic. Kết quả cho thấy nhờ có qu tr nh tinh sạch
mà hoạt l c của enzim ma o actic đã t ng 7,5 ần, tức à từ 1,7 đơn vị/mg ên 12,8
đơn vị/mg protein và khối ượng của enzim này à 131 kDa. Trong điều ki n vang
non có pH à 5.5 th sau 1 tuần có tới 70% ượng axít malic có trong vang bị chuyển
ho thành axít lactic và tỷ l này à 1:1.
1.4.3 Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza trong
sản xuất vang
Để th c hi n qu tr nh ên men ma o actic người ta còn đề cập tới một
phương ph p hoàn toàn mới đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Đó chính à
sử dụng nấm men chuyển gien. Người ta chuyển gien quyết định khả n ng ên men
malolactic của vi khuẩn Leuconostoc oenos vào tế bào nấm men Saccharomyces để
th c hi n đồng thời qu tr nh ên men rượu và qu tr nh ên men malolactic nhằm
rút ngắn qui tr nh sản xuất rượu vang mà vẫn th c hi u đầy đủ c c qu tr nh ên

men. Để có thể nâng cao n ng suất và chất ượng rượu vang, thỏa mãn nhu cầu tiêu
thụ vang ngày càng nhiêu của thị trường.
Có thế nói xu hướng sử dụng chủng nấm men t i tổ hợp vừa có khả n ng
ên men rượu vừa có khả n ng ên men ma o actic đang thu hút được rất nhiều s
quan tâm nghiên cứu của c c nhà khoa học hi n nay. Đã có rất nhiều thành công
trong vi c đưa vào c c chủng nấm men rượu vang S.cerevissiae mang đoạn gen mã
ho cho enzim malolactat decacboxylaza. Bằng c ch sử dụng c c mồi (primer) được
sinh ra từ c c vùng bao thủ của c c đoạn protein của enzim malic, Céci e Labarre và
cộng s , 1996 đã nhận được một đoạn ADN có kích thước 324-bp của L.oenos Lo

20