Thiết kế đầu dò AND cho kỹ thuật LAI DOT BLOT

Thiết kế đầu dò AND cho kỹ thuật LAI DOT
BLOT
Nguyễn Thị Thu Hường
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS Chuyên ngành: Di truyền học; Mã số 60 42 01 21
Người hướng dẫn: PGS.TS. Võ Thị Thương Lan
Năm bảo vệ: 2013

Abstract. Nghiên cứu cấu trúc phân tử ADN, nguyên tắc của kỹ thuật lai axit nucleic,
đầu dò, một số kỹ thuật lai axit nucleic, các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật lai pha rắn,
ứng dụng của các kỹ thuật lai axit nucleic. Trình bày một số phương pháp sử dụng
trong nghiên cứu như: Thiết kế đầu dò; Phương pháp PCR; Quá trình lai điểm; Quá
trình lai điểm ngược; Tách ADN từ mẫu bệnh phẩm; Tách plasmid; Tinh sạch sản
phẩm PCR bằng kit High pure PCR cleanup micro; Phương pháp điện di. Đưa ra các
kết quả nghiên cứu đạt được: Kết quả khuếch đại và đánh dấu đầu dò M; So sánh hiệu
quả đánh dấu với biotin và DIG; Chuẩn bị trình tự đích và trình tự đối chứng; Kết quả
lai điểm phân biệt trình tự đích và trình tự đối chứng; Sàng lọc một số đột biến trên
gen β-globin; Chuẩn bị và đánh dấu trình tự đích cho quy trình lai điểm ngược; Kết
quả lai điểm ngược phát hiện đột biến trên gen β-globin.
Keywords. Di truyền học; Đầu dò; AND; Kỹ thuật lai.


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

MỞ ĐẦU
Ngày nay, chúng ta đƣợc sống trong thời kỳ với nền y học phát triển nhanh
chóng. Sự tiến bộ của y học hiện đại luôn song hành mối liên hệ khăng khít giữa tri
thức y học và sự phát triển vƣợt trội trong công nghệ hỗ trợ cận lâm sàng. Điều này
giúp chúng ta có cái nhìn tổng quan hơn về bệnh lý cùng những am hiểu sâu rộng về
cơ sở phân tử của bệnh. Trong đó, những hiểu biết về bệnh ở mức độ phân tử hỗ trợ
đắc lực trong việc chẩn đoán, phòng ngừa bệnh và có ý nghĩa đặc biệt trong nghiên

cứu các thế hệ thuốc mới - thuốc điều trị đích. Nền tảng về cơ sở học phân tử của
bệnh là yếu tố thúc đẩy những kỹ thuật di truyền phân tử phát triển không ngừng và
ngƣợc lại. Xu hƣớng trong chẩn đoán phân tử hiện nay nhắm tới những kỹ thuật
phát hiện nhanh, đồng thời nhiều trình tự đích với số lƣợng mẫu phân tích lớn nhƣ:
PCR đa mồi, lai ADN (Southern blot, dot blot, line blot) và giải trình tự gen. Đáng
chú ý trong số đó phải kể đến kỹ thuật lai điểm (dot blot) - một trong những phát
triển của phƣơng pháp lai ADN. Đây là một kỹ thuật kinh điển nhƣng vẫn đƣợc sử
dụng khá phổ biến nhờ vào những ƣu điểm vƣợt trội nhƣ thao tác đơn giản, nhanh
chóng, chi phí thấp, có thể xác định đồng thời nhiều đột biến với số lƣợng mẫu lớn
và đặc biệt phù hợp với các nƣớc đang phát triển. Ở nƣớc ta hiện nay kỹ thuật lai
điểm đã đƣợc ứng dụng trong định type virus HPV (Human Papillomavirus) liên
quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung. Tuy nhiên ứng dụng của kỹ thuật này trong việc
xác định những đột biến di truyền vẫn còn rất ít hoặc chƣa đƣợc công bố. Do đó,
chúng tôi tiến hành đề tài "Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot" với
mục tiêu thiết lập quy trình lai nhằm phát hiện những sai khác ở mức độ nucleotide
trong các bệnh lý di truyền. Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y,
Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự
sống và Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
1


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1.

Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào,

Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.

Nguyễn Chấn Hùng (2004), Ung thư học nội khoa, Nhà xuất bản Y học Thành
phố Hồ Chí Minh.

3.

Nguyễn Thị Tuyết Vân, Nguyễn Hoàng Quân, Cao Minh Nga (2010), "Nhiễm
các type Human Papillomavirus ở phụ nữ tuối sinh đẻ", Y học TP. Hồ Chí
Minh, Tập 14 (1), tr. 504-508.

4.

Võ Thị Thƣơng Lan (2009), Giáo trình Sinh học phân tử tế bào và ứng dụng,
Nhà xuất bản Giáo dục.

Tiếng Anh
5.

Amann R., Ludwig W. (2000), "Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes
for studies in microbial ecology", FEMS Microbiology Reviews, 24, pp. 555565.

6.

An S. F., Franklin D., Fleming K. A. (1992), "Generation of digoxigeninlabelled double-stranded and single-stranded probes using the polymerase
chain reaction", Moleculer and Cellular Probes, 6, pp. 193-200.

7.

Barbu V. (2007), "Molecular hybridization techniques of nucleic acids",
Innovative Romanian Food Biotechnology, 1, pp. 1-12.

8.

Bottari B., Santarelli M., Neviani E., Gatti M. (2010), "Natural whey starter
for Parmigiano Reggiano: culture-independent approach", Journal of Applied
Microbiology, 108, pp. 1676-1684.

9.

Boussiou M., Karababa P., Sinopoulou K., Tsaftaridis P., Plata E., LoutradiAnagnostou A. (2008), "The molecular heterogeneity of β-thalassemia in
Greece", Blood Cells, Molecules, and Diseases, 40, pp. 317-319.

10. Braissant O., Wahli W. (1998), "A simplified in situ hybridization protocol
using non-radioactively labeled probes to detect abundant and rare mRNAs on
tissue sections", Biochemia, 1, pp. 10-16.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
63


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

11. Chan V., Yam I., Chen F. E., Chan T. K. (1999), " A reverse dot blot method
for rapid detection of non-deletion α thalassaemia", British Journal of
Haematology, 104, pp. 513-515.
12. Clement G., Benhattar J. (2005), "A methylation sensitive dot blot assay (MSDBA) for the quantitative analysis of DNA methylation in clinical samplas", J
Clin Pathol, 58, pp. 155-158.

13. Colah R., Gorakshakar A., Nadkarni A, Phanasgaonkar S., Surve R., Sawant
P., Mohanty D., Ghosh K. (2009), "Regional heterogeneity of β-thalassemia
mutations in the multi ethnic Indian population", Blood Cells, Molecules, and
Diseases, 42, pp. 241-246.
14. Dawson D. B. (1990), "Use of nucleic acid probes in genetic tests", Clin
Biochem, 23, pp. 279-285.
15. Dessauer H. C., Reeder T. W., Cole C. J., Knight A. (1996), "Rapid screening
of DNA diversity using dot-blot technology and allele-specific
oligonucleotides: Maternity of hybrids and unisexual cones of hybrid origin
(Lizards, Cnemidophorus)", Molecular Phylogenetics and Evolution, 6, pp.
366-372.
16. Dianandis E. P., Christopoulos T. K. (1991), "The biotin-(strept)avidin
system: Principles and applications in biotechnology", Clinical chemistry, 37,
pp. 625-636.
17. Dooki M. E., Akkhavan-Niaki H., Juibary A. G. (2011), "Detecting common
CFTR mutations by reverse dot blot hybridization method in cystic fibrosis
first report from Northern Iran", Iran I Pediatr, 21, pp. 51-57.
18. Fernandez J., Sandino A., Yudelevich A., Avendano L. F., Venegas A.,
Hinrichsen V., Spencer E. (2009), "Rotavirus detection by dot blot
hybridization assay using a non-radioactive synthetic oligodeoxynucleotide
probe", Epidemiol. Infect., 108, pp. 175-184.
19. Forslund O., Hansson B. G., Bjerre B. (1994), "Typing of human
papillomaviruses by consensus polymerase chain reaction and a nonradioactive reverse dot blot hybridization", Journal of Virological Methods,
49, pp. 129-140.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
64


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

20. Fox J. L., Hsu P. H., Legator M. S., Morrison L. E., Seelig S. A. (1995),
"Fluorescence in situ hybridization: Powerful molecular tool for cancer
prognosis", Clin. Chem, 41, pp. 1554-1559.
21. Gall J. G., Pardue M. L. (1969), "Formation and detection of ARN-ADN
hybrid molecular in cytological preparations", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63,
pp. 378-383.
22. Gong Y., Sweet W., Duh Y., Greenfield L., Fang Y., Zhao J., Tarco E.,
Symmans W. F., Isola J., Sneige N. (2009), "Chromogenic in situ
hybridization is a reliable method for detecting HER2 gene status in breast
cancer", Am J Clin Pathol, 131, pp. 490-497.
23. Gonzalez M. P., Sanchez X., Ganga M. A., Lopez-Lastra M., Jashes M.,
Sandino A. M. (1997), "Detection of the infectious hematopoietic necrosis
virus directly from infected fish tissues by dot blot hybridization with a nonradioactive probe", Journal of Virological Methods, 65, pp. 273-279.
24. Gupta D., Middleton L. P., Whitaker M. J., Abrams J. (2003), "Comparison of
Fluorescence and Chromogenic in situ hybridization for detection of HER2/neu oncogen in breast cancer", Am J Clin Pathol, 119, pp. 381-387.
25. Hammermueller J. D., Krell P. J., Derbyshire J. B., Nagy E. (1991), "An
improved dot-blot method for virus detection in chicken embryo fibroblast
cultures", Journal of Virological Methods, 31, pp. 47-56.
26. Harris M. R. (1991), "Non-radioactive techniques for the labelling of nucleic
acids", Biotech. adv, 9, pp. 185-196.
27. Hassan S., Ahmad R., Zakaria Z., Zulkafli Z., Abdullah W. Z. (2013),
"Detection of β-globin gene mutations among β-thalassaemia carriers and
patients in Malaysia: Application of Multiplex Amplification Refractory
Mutation System–Polymerase Chain Reaction", Malays J Med Sci., 20, pp. 1320.
28. Heitzler J., Marechal-Drouard L., Dirheimer G., Keith G. (1992), "Use of a
dot blot hybridization method for identification of pure tRNA species on
different membranes", Biochimica et Biophysica Acta, 1129, pp. 273-277.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013

65


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

29. Hopp H. E., Hain L., Almonacid F. B., Tozzini A. C., Orman B., Arese A. I.,
Ceriani M. F., Saladrigas M. V., Celnik R., Vas M., Mentaberry A. N. (1991),
"Development and application of a nonradioactive nucleic acid hybridization
system for simultaneous detection of four potato pathogens", Journal of
Virological Methods, 31, pp. 11-30.
30. Hsu Y. C., Yeh T. J., Chang Y. C. (2005), "A new combination of RT-PCR
and reverse dot blot hybridization for rapid detection and identification of
potyviruses", Journal of Virological Methods, 128, pp. 54-60.
31. Juan M., Qin-sheng G. U., Shi-ming L., Peng B., Li-feng L., Yan-bing T., Li
L. (2007), "Dot-blot hybridization for detection of five cucurbit viruses by
digoxigenin- labelled cDNA probes", Agricultural Sciences in China, 6, pp.
1450-1455.
32. Kafatos F. C., Jones C. W., Efstratiadis A. (1979), "Determination of nucleic
acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization
procedure", Nucleic Acids Research, 7, pp. 1541-1552.
33. Kessler C. (1994), "Non-radioactive analysis of biomolecules", Journal of
Biotechnology, 35, pp. 165-189.
34. Lahtinen S., Gueimonde M., Ouwehand A., Reinikainen J., Salminen S.
(2005), "Probiotic bacteria may become dormant during storage", Applied and
Environmental Microbiology, 71, pp. 1662-1663.
35. Landry M. L. (1990), "Nucleic acid hybridization in viral diagnosis", Clin
Biochem, 23, pp. 267-277.
36. Leary J., Brigati D. J., Ward D. C. (1983), "Rapid and sensitive colorimetric
method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA
immobilized on nitrocellulose: Bio-blots”, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 80, pp.

4045-4049.
37. Li D., Liao C., Xie X., Huang Y., Zhong H., Wei J. (2006), "Prenatal
diagnosis of β-thalassemia in Southern China", European Journal of
Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 128, pp. 81–85.
38. Lin M., Zhu J. J., Wang Q., Xie L. X., Lu M., Wang J. L., Wang C. F., Zhong
T. Y., Zheng L., Pan M. C., Wu J. R., Wen Y. F., Liu G. R., Zhan X. F., Lin
Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
66


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

F., Yang L. Y. (2012), "Development and evaluation of a reverse dot blot
assay for the simultaneous detection of common alpha and beta thalassemia in
Chinese", Blood Cells, Molecular, and Diseases, 48, pp. 86-90.
39. Liu Y., SunB., Wang X., Zheng C., Zhou G. (2007), "Three digoxigeninlabeled cDNA probes for specific detection of the natural population of Barley
yellow dwarf viruses in China by dot-blot hybridization", Journal of
Virological Methods, 145, pp. 22-29.
40. Lo Y. M. D., Mehal W. Z., Fleming K. A. (1988), "Rapid production of
vector-free biotinylated probes using the polymerase chain reaction", Nucleic
Acids Research, 16, pp. 8719.
41. Lodish H., Berk A., Zipursky S. L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J.
(2000), Molecular Cell Biology, 4th edition, New York: W. H. Freeman.
42. Lu X., Hua L., Zhang T., Li S., Fan X., Peng Q., Li W., Ye J., Long J., He X.
(2013), "A reverse dot blot assay for the expanded screening of eleven
Chinese G6PD mutations", Clinica Chimica Acta, 418, pp. 45-49.
43. Machado A., Almeida C., Carvalho A., Boyen F., Haesebrouck F., Rodrigues
L., Cerca N., Azevedo N. F. (2013), "Fluorescence in situ hybridization
method using a peptide nucleic acid probe for identification of Lactobacillus
spp. in milk samples", International Journal of Food Microbiology, 162, pp.

64-70.
44. Madrid M. A., Lo R. W. (2004), "Chromogenic in situ hybridization (CISH): a
novel alternative in screening archival breast cancer tissue samples for HER2/neu status", Breast Cancer Research, 6, pp. 593-600.
45. Matsumoto K., Takada T., Shimizu K., Kado Y., Kawakami K., Makino I.,
Yamaoka Y., Hirano K., Nishimura A., Kajimoto O., Nomoto K. (2006), "The
effects of a probiotic milk product containing Lactobacillus casei strain
Shirota on the defecation frequency and the intestinal microfola of sub-optimal
health state volunteers: a randomized placebo-controlled cross-over study",
Bioscience and Microfola, 25, pp. 39-48.
46. Metaferia B., Wei J. S., Song Y. K., Evangelista J., Aschenbach K., Johansson
P., Wen X., Chen Q., Lee A., Hempel H., Gheeya J. S., Getty S., Gomez R.,

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
67


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

Khan J. (2013), "Development of peptide nucleic acid probes for detection of
the HER2 oncogene", Plos One, 8, e58870.
47. Mifflin T. E. (1989), "Use and applications of nucleic acid probes in the
clinical laboratory", Clin, Chem., 35, pp. 1819-1825.
48. Mo Q. H., Li X. R., Li C. F., He Y. L., Xu X. M. (2005), "A novel frameshift
mutation (+G) at codons 15/16 in a β0 thalassaemia gene results in a
significant reduction of β-globin mRNA values", J Clin Pathol, 58, 923-926.
49. Moliaka I., Ovchinnikov I.V., Shlenskii A.B., Korovaitseva G.I., Rogaev E.I.
(1997), "DNA genotyposcoy in determining paternity: use of hybridized
probes", Genetika, 33, pp. 831-835.
50. Nakamura R. M. (1990), "Overview and principles of in situ hybridization",
Clin Biochem, 23, pp. 255-259.

51. Osiowy C., Giles E. (2003), "Evaluation of the INNO-LiPA HBV Genotyping
Assay for determination of Hepatitis B Virus genotype", Journal of Clinical
Microbiology, 41, pp. 5473-5477.
52. Pas S. D., Tran N., Man R. A., Burghoorn-Maas C., Vernet G., Niesters H. G.
M. (2008), "Comparison of reverse hybridization, microarray, and sequence
analysis for genotyping Hepatitis B Virus", Journal of clinical microbiology,
46, pp. 1268-1273.
53. Richards J. C. (1991), "Gene probes", Current Opinion in Biotechnology, 2,
pp. 76-85.
54. Saiki R. K., Walsh P. S., Levenson C. H., Erlich H. A. (1989), "Genetic
analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific
oligonucleotide probes", Genetics, 86, pp. 6230-6234.
55. Sambrook J., Russell D. W. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York.
56. Shawky R. M., Kamal T. M. (2012), "Thalassemia intermedia: An overview",
The Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 13, pp. 245-255.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
68


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

57. Stahl D. A., Kane M. D. (1992), "Methods in microbial identification, tracking
and monitoring of function", Curr. Opin. Biotechnol., 3, pp. 244–252.
58. Strachan T., Read A. P. (2004), Human Molecular Genetics, 3rd edition,
Garland Science.
59. Svasti M. L. S., Tran M. H., Mukongdee T., Winichagoon P., Tran V. B., Tran
V. B., Fucharoen S. (2002), "Molecular analysis of β-thalassemia in south

Vietnam", American Journal of Hematology, 71, pp. 85-88.
60. Sun Y., Perch-Nielsen I., Dufva M., Sabourin D., Bang D. D., Hogberg J.,
Wolff A. (2012), "Direct immobilization of DNA probes on non-modified
plastics by UV irradiation and integration in microfluidic devices for rapid
bioassay", Anal Bioanal Chem, 402, pp. 741-748.
61. Sutcharitchan P., Saiki R., Huisman T. H. J., A. Kutlar, McKie V., Erlich H.,
Embury S. H. (1995), "Reverse dot-blot detection of the African-American βthalassemia mutations", Blood, 86, pp. 1580-1585.
62. Svasti M. L. S., Tran M. H., Munkongdee T., Winichagoon P., Tran V. B.,
Tran V. B., Fucharoen S. (2002), "Molecualr analysis of β-thalassemia in
south Vietnam", American Journal of Hematology, 71, pp. 85-88.
63. Syrjanen S., Andersson B., Juntunen L., Syrjanen K. (1991), "The use of
polymerase chain reaction in generation of biotinylated human papillomavirus
DNA probes for in situ hybridization", Journal of Virological methods, 31, pp.
147-160.
64. Takahashi T., Mitsuda T., Okuda K. (1989), "An alternative nonradioactive
method for labeling DNA using biotin", Analytical biochemistry, 179, pp. 7785.
65. Tenover F. C. (1988), "Diagnostic deoxyribonucleic acid probes for infectious
diseases", Clinical Microbiology Reviews, 1, pp. 82-101.
66. Twomey T. A., Krawetz S. A. (1990), "Parameters affecting hybridization of
nucleic acids blotted onto nylon or nitrocellulose membranes", Biotechniques,
8, pp. 478-482.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
69


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

67. Uhlmann V., Prasad M., Silva I., Luettich K., Grande L., Alonso L., Thisted
M., Pluzek K. L., Gorst J., Ring M., Sweeney M., Kenny C., Martin C.,

Russell J., Bermingham N., O'Donovan M., Sheils O., O'Leary J. J. (2000),
"Improved in situ detection method for telomeric tanddem repeats in
metaphase spreads and interphase nuclei", Mol Pathol, 53, pp. 48-50.
68. Velazquez W. A. C., Hernandez H. C., Marquez C. A., Hernandez A. F. O.,
Rodriquez C. M., Salamanca G. F., Coral V. R. (2008), "Identification of
duchence muscular dystrophy female carriers by fluorescence in situ
hybridization and RT-PCR", Genet Test, 12, pp. 221-223.
69. Ward D. M., Bateson M. M., Weller R., Ruff-Roberts A. L. (1992),
"Ribosomal RNA analysis of micro-organisms as they occur in nature", Adv.
Microb. Ecol., 12, pp. 219–286.
70. Weeks I., Behesti I., McCapra F., Campbell A. K., Woodhead J. S. (1983),
"Acridinum ester as high-specific-activity labels in immunoassay", Clin.
Chem., 29, pp. 1474-1479.
71. Wetmur J. G. (1991), "DNA probes: Applications of the principles of nucleic
acid hybridization", Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology,
26, pp. 227-259.
72. Wang W., Kham S. K. Y., Yeo G., Quah T., Chong S. S. (2003), "Multiplex
minisequencing screen for common Southeast Asian and Indian β-thalassemia
mutations", Clinical Chemistry, 49, pp. 209-218.
73. Yamsri S., Sanchaisuriya K., Fucharoen G., Sae-ung N., Fucharoen S. (2011),
"Genotype and phenotype characterizations in a large cohort of β-thalassemia
heterozygote with different forms of α-thalassemia in northeast Thailand",
Blood Cells, Molecules, and Diseases, 47, pp. 120-124.
74. Yang T., Yuan L., Huang S., Zhao S. (1998), "Screening mutations in
phenylketonuria by means of non-radioactive reverse dot blot hybridization",
Zhonghua Yi Xue Chuan Xue Za Zhi, 15, pp. 307-309.
75. Zakrzewska K., Ciappi S., Azzi A. (1993), "Polymerase chain reaction for
synthesis of digoxigenin-labelled DNA probe: application to parvovirus B19
and to polyomavirus BK", Molecular and Cellular Probes, 7, pp. 55-60.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
70


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

76. Zhang Y., Coyne M. Y., Wil S. G., Levenson C. H., Kawasaki E. S. (1991),
"Single-base mutational analysis of cancer and genetic diseases using
membrane bound modified oligonucleotides", Nucleic acids research, 19, pp.
3929-3933.
Trang web
77. />78. />ay/
79. />-imaging/in-situ-hybridization-ish.html
80. />81. />82. />83. />84. />category_ID=12&product_ID=801#anchor_body

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
71