Nghiên cứu quy trình chuyển gen chống chịu hạn vào cây đậu tương giống DT84

Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đậu tương là cây trồng ngắn ngày có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế lớn.
Với thành phần hóa học chứa 38-45% prôtein , 18 – 23% lipit, đậu tương được sử
dụng làm thức ăn giàu đạm và chất béo cho người, chế biến thức ăn gia súc và cung
cấp nguyên liệu cho ngành chế biến dầu thực vật [54]. Ngoài ra, cây đậu tương còn
đóng vai trò cải tạo đất, nhờ các vi khuẩn nốt sần cố định đạm làm tăng độ phì cho
đất. Trên thế giới có nhiều nước đang sản xuất và phát triển cây đậu tương, trong đó
các nước có diện tích và sản lượng đậu tương lớn là Mỹ, Brazin, Achentina, Trung
Quốc [51]... Ở Việt Nam, cây đậu tương là cây truyền thống và được gieo trồng ở
nhiều vùng trong cả nước. Nhưng những năm gần đây do tập quán canh tác và đặc
biệt là do năng suất đậu tương đạt thấp, hiệu quả kinh tế sản xuất đậu tương không
cao cho nên đậu tương chưa được chú ý phát triển trên cả nước. Hiện nay, với tiến
bộ kỹ thuật về công tác tạo giống đậu tương cho năng suất cao, phẩm chất tốt, thích
hợp với các cơ cấu xen canh, tăng vụ… đã làm cho sản xuất đậu tương ở nước ta
từng bước phát triển. Tuy nhiên sản lượng đậu tương trong nước mới chỉ đáp ứng
đủ cho khoảng 15% nhu cầu tiêu dùng. Hàng năm nước ta phải nhập khoảng 400500.000 tấn đậu tương để chế biến dầu ăn và thức ăn gia súc [53]. Hạn là nguyên
nhân chính dẫn đến làm giảm năng suất của cây đậu tương. Các vùng trồng chuyên
canh đậu tương ở nước ta, đặc biệt các vùng cao thường xảy ra thiếu nước. Bởi vậy,
chọn tạo giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, thích ứng với vùng sinh thái
bất lợi bằng công nghệ sinh học giúp tăng năng suất, giảm giá thành đậu tương là
mục tiêu hàng đầu cho các nhà khoa học trong nước.
Ngoài các phương pháp chọn giống truyền thống, chuyển gen ở thực vật là
phương pháp hiệu quả nhất để tạo các dòng, giống mang tính trạng mong muốn.
Trong đó chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium là phương pháp hữu hiệu dùng
để chuyển gen ở thực vật. Phương pháp này dùng Ti plasmid của A.tumefaciens
hoặc Ri plasmid của A. rhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào. T-ADN là thành

1


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

phần của Ti plasmid, nó có thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, do đó
có thể gắn gen muốn chuyển nạp vào T-ADN để đưa vào tế bào thực vật.
DT84 là giống đậu tương cho năng suất cao, hiện nay được trồng rất phổ
biến trong nước, nhưng khả năng chống chịu hạn còn kém. Với mục tiêu nghiên
cứu tạo cơ sở ban đầu cho việc chuyển gen tạo giống đậu tương có khả năng
chống chịu hạn cao, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu quy trình chuyển gen
chống chịu hạn vào cây đậu tương giống DT84”
2. Mục đích đề tài
 Tối ưu hóa quy trình tái sinh cây đậu tương DT84 thông qua đa chồi từ nách
lá mần hạt chín.
 Thiết kế vector mang gen P5CS đột biến (P5CSM) phục vụ tạo cây đậu
tương chuyển gen chống chịu hạn thông qua A. tumefaciens.
3. Nội dung đề tài
 Tối ưu hóa quy trình tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tương DT84 thông
qua đa chồi.
 Thiết kế vector chuyển gen mang gen chịu hạn P5CSM, tạo chủng
Agrobacterium chứa gen P5CSM.
 Chuyển gen chịu hạn P5CSM vào giống đậu tương DT84.
4. Đối tượng nghiên cứu
4.1. Thực vật
 Giống đậu tương DT84 do Trung tâm Nghiên cứu Phát triển cây đậu đỗ,
Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm cung cấp .

 Giống thuốc lá Nicotiana tabacum L. K326 đang nuôi cấy trong điều kiện
in vitro do Phòng Công nghệ Tế bào thực vật-Viện Công nghệ sinh học
cung cấp.
4.2. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens và các vector
 Chủng A. tumefaciens EHA 101 mang vector pPTN289 chứa gen gus
intron và gen chọn lọc bar kháng ppt do Đại học Tổng hợp Nebraska, Hoa
Kỳ cung cấp.

2


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

 Chủng A. tumefaciens Cv58C1 mang plasmid pGV2260, chủng vi khuẩn E.
coli DH5α do Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học
cung cấp.
 Plasmid pBT mang gen P5CSM, vector pBI121 do Phòng Công nghệ Tế bào
thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.
5. Phương pháp nghiên cứu
 Phương pháp nuôi cấy in vitro.
 Phương pháp sinh học phân tử.
6. Giả thuyết khoa học
 Tạo được chủng Agrobacterium mang vector chuyển gen chứa gen P5CSM
mã hóa cho protein liên quan đến tính chống chịu hạn.
 Xây dựng được quy trình chuyển gen P5CSM chịu hạn cho giống đậu tương
DT84 có hiệu quả cao.

3

Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX L. MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ
VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây đậu tương được xem là một cây trồng truyền thống, nó là một trong
những loài cây trồng được biết đến từ rất sớm. Các bằng chứng về lịch sử, địa lý và
khảo cổ học chỉ ra rằng đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc. Vào khoảng thế kỉ
XVII trước công nguyên cây đậu tương được thuần hóa và trồng làm cây thực phẩm
ở Trung Quốc. Đến khoảng thế kỷ thứ VIII, cây đậu tương được truyền bá sang
Nhật Bản, và du nhập vào nhiều nước Châu Á khác như: Indonesia, Philippin, Thái
Lan, Ấn Độ, Việt Nam,… vài thế kỷ sau đó. Cây đậu tương được trồng ở Châu Âu
vào thế kỷ XVII và ở Hoa Kỳ thế kỷ XVIII .
Cây đậu tương thuộc bộ Phaseoleae, họ đậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm
Papilionoideae, chi Glycine với tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill. Căn cứ
vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể thì Hymowit
và Newell (1984) cho rằng ngoài chi Glycine còn có chi phụ Soja. Chi Glycine
được chia thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong đó có loài
đậu tương trồng Glycine max L. Merrill (Ngô Thế Dân và đtg, 1999) [3], (Trần
Văn Điền, 2007) [4].
1.1.2. Đặc điểm sinh học
Đậu tương là cây hai lá mầm, thân thảo. Thân cây có nhiều lông nhỏ, khi còn
non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển màu nâu nhạt. Màu sắc của thân
cây cho ta biết màu của hoa sau này, nếu thân có màu xanh hoa sẽ có màu trắng,

nếu thân có màu tím thì sau hoa sẽ có màu tím đỏ, chiều cao của thân từ 0,3 - 1m
tùy theo giống.
Cây đậu tương có ba loại lá: lá mầm, lá đơn, lá kép. Mỗi lá kép thường có
3 thuỳ (lá chét), lá kép mọc so le, trên phiến lá có nhiều lông tơ. Hình dạng của
lá thay đổi theo giống, những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt, nhưng cho

4


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

năng suất thấp, những giống lá to thường cho năng suất cao hơn nhưng cũng chịu
hạn kém hơn.
Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa mọc
thành chùm, mỗi chùm thường có từ 3 - 5 hoa. Hoa lưỡng tính nên đậu tương là cây
tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chỉ chiếm 0,5 - 1%.
Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2 - 7cm. Mỗi quả thường có 2 - 3
hạt. Hạt đậu tương có hình tròn, bầu dục…, những giống có hạt màu vàng có giá trị
thương phẩm cao. Khối lượng 1000 hạt dao động trung bình từ 100 - 200g. Hình
dạng và màu sắc của rốn hạt đặc trưng cho mỗi giống.
Bộ rễ đậu tương gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ có rất nhiều nốt sần, đó là
kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Nốt sần có thể
dài 1cm, đường kính 5 - 6mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát
triển tốt nhất nốt sần có màu hồng. Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 0
- 20cm, có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm từ nitơ không khí, với lượng
đạm cung cấp cho cây khoảng 30 - 60 kg/ha.
Dựa vào thời gian sinh trưởng, đậu tương được chia thành các loại: chín rất
sớm: thu hoạch sau 80-90 ngày; chín sớm: thu hoạch sau 90 - 100 ngày; chín trung

bình: thu hoạch sau 100 - 110 ngày; chín muộn trung bình: thu hoạch sau 110 - 120
ngày; chín muộn: thu hoạch sau 130 - 140 ngày; chín rất muộn: thu hoạch sau 140 150 ngày (Ngô Thế Dân và đtg, 1999) [3], (Trần Văn Điền, 2007) [4].
1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương
Đậu tương là cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, sản phẩm của nó
được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công
nghiệp, làm hàng xuất khẩu và là loài cây cải tạo đất trồng rất tốt.
Giá trị về mặt thực phẩm: Hàm lượng protein trong đậu tương cao hơn trong
cá, thịt và cao gấp 2 lần các loại đậu đỗ khác, protein trong hạt đậu chiếm khoảng
35 - 50% (phụ thuộc vào giống và điều kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa hơn thịt và
không có thành phần tạo cholesterol. Đậu tương còn được xem là cây cung cấp dầu
thực vật quan trọng, lipit đậu tương chứa thành phần các axit béo không no cao,

5


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

tổng số chất béo chiếm khoảng 18%. Trong hạt đậu tương còn chứa nhiều loại
vitamin, đáng kể là các vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, nó
còn chứa sắt, canxi, photpho và các thành phần giúp ích cho sức khỏe con người
như phytosterol, lecithin, isoflavon, phytoestogen và những sản phẩm ức chế phân
hủy protein [4]
Giá trị về mặt công nghiệp: Hiện nay trên thế giới, đậu tương là cây đứng
đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% dầu thực vật,
dầu đậu tương khô chậm, chỉ số iốt cao 120 - 127, nhiệt độ ngưng tụ -15 đến -18°C
và từ dầu người ta có thể làm nến, xà phòng, nilon,…Đậu tương còn là nguyên liệu
của nhiều ngành công nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo,
tơ nhân tạo, chất đốt lỏng,…

Giá trị về mặt nông nghiệp: Toàn bộ cây đậu tương cả khi tươi và khô đều có
thể dùng làm thức ăn cho gia súc. Đậu tương có vai trò quan trọng trong cải tạo đất
trồng, một ha đậu tương nếu sinh trưởng và phát triển tốt sẽ để lại trong đất 30 - 60
kg nitơ, thân và lá với hàm lượng đạm cao có thể dùng để bón cho đất thay cho
phân hữu cơ. Việc luân canh đậu tương với cây trồng khác có thể xem là biện pháp
cải tạo đất trồng hữu hiệu.
1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam
Trên thế giới: Nhận thấy với những giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao của cây
đậu tương, nên đây được xem là một trong những loại cây trồng quan trọng bậc nhất
ở nhiều quốc gia với vị trí chỉ đứng sau lúa, ngô và lúa mì. Do có khả năng thích
nghi rộng với các điều kiện khí hậu và sinh thái khác nhau nên đậu tương được
trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ, tiếp đến là
Châu Á. Bình quân hàng năm trên thế giới có khoảng 91 triệu ha đậu tương được
gieo trồng với năng suất bình quân khá cao 22-23 tấn/ha. Mỹ là nước có diện tích
gieo trồng cũng như sản lượng đậu tương lớn nhất thế giới, tiếp theo là Brazil,
Achentina, Trung Quốc [51]. .
Ở Việt Nam: Đậu tương được gieo trồng từ rất sớm, nó được trồng trước cây
đậu xanh và đậu đen. Tuy nhiên với các phương pháp canh tác truyền thống, bộ

6


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

giống năng suất thấp, sản xuất nhỏ lẻ, giá thành cao, lãi suất thấp, giá thành đậu
tương trong nước không có khả năng cạnh tranh với đậu tương nhập khẩu là nguyên
nhân khiến cho nông dân không mặn mà với cây đậu tương. Vì vậy, diện tích và sản
lượng đậu tương của nước ta phát triển chậm.

Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ năm 2003 đến 2010 [52]
Năm
2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

Chỉ tiêu
Diện tích (1000 ha)

165,6 183,8 204,1 185,6 187,4 192,1 146,2 197,8

Năng suất (tạ/ha)

13,3

13,3

14,3

13,9

14,7

14,0

14,6

15,0

Sản lượng (1000 tấn) 219,7 245,9 292,7 258,1 275,2 267,6 213,6 296,9
(Nguồn: Tổng cục thống kê, 2011)
Về diện tích, đậu tương được gieo trồng trên diện tích chỉ chiếm 1 tỉ lệ
rất thấp khoảng 1,5-1,6 %, xét về tốc độ thì diện tích gieo trồng vẫn tăng qua
các năm. Năm 1980, diện tích trồng đậu tương là 48,8 nghìn ha, như vậy tính
đến năm 2010, diện tích đã tăng lên gấp 4,05 lần. Về năng suất: năng suất bình
quân của đậu tương ở nước ta là rất thấp, chỉ bằng 50% - 70% năng suất đậu
tương của thế giới.
Mặc dù sản lượng và diện tích canh tác đậu tương tăng theo từng năm, nhưng
vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng ngày càng cao ở nước ta.Sản lượng đậu
tương mỗi năm chỉ đạt khoảng 0,3 triệu tấn, đáp ứng được khoảng 15% nhu cầu và
hiện đang ngày càng phụ thuộc vào lượng đậu tương nhập khẩu. Lượng đậu tương
nhập khẩu này, ¾ dành cho sản xuất thức ăn chăn nuôi, ¼ còn lại sản xuất sản phẩm
phục vụ con người.
Để nâng cao năng suất của đậu tương đáp ứng nhu cầu tiêu dùng thì cần phải
có các biện pháp đồng bộ trong việc chọn tạo giống đậu tương cho năng suất cao,
chống chịu tốt, đặc biệt là chống chịu hạn là định hướng phát triển chiếm lược cây
đậu tương trong những năm tới ở Việt Nam.

7


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

1.2. CƠ CHẾ SINH LÝ, HÓA SINH VÀ PHÂN TỬ CỦA ĐẬU TƯƠNG
TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN
Tính chịu hạn ở thực vật là sự thích nghi có bản chất di truyền được thể hiện
ra trong các thích nghi đa dạng về mặt hình thái và sinh lý. Điều đó được biểu hiện
ở thực vật chịu hạn bằng cách giảm thiểu sự thoát hơi nước nhờ có lớp cutin dày,
khí khổng nằm sâu, hình thành các protein sốc có tác dụng bảo vệ bộ gen khỏi tác
động gây hư hại và sử dụng nước một cách có hiệu quả nhất bằng cách tiến hành
quang hợp theo con đường CAM. Các cơ chế này khá đa dạng nhưng có thể chia
thành ba cơ chế chính bao gồm: cơ chế trốn thoát điều kiện hạn (drought escape), cơ
chế tránh hạn (drought avoidance) và cơ chế chống chịu hạn (drought tolerance).
Đối với cơ chế tránh hạn thì các giống đậu tương sẽ có các cơ chế để duy trì lượng
nước trong cơ thể trong giai đoạn hạn thông qua việc tăng khả năng hấp thu nước từ
rễ hoặc giảm quá trình thoát hơi nước ở các bộ phận khác nhau của cây. Ở các
giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, thì cây có thể duy trì sức căng của các
mô và tế bào, chính vì thế các quá trình trao đổi chất có thể diễn ra bình thường
trong điều kiện lượng nước bên ngoài môi trường xuống rất thấp. Sức căng của các
mô và tế bào của cây được duy trì thông qua việc tổng hợp mạnh các chất chống áp
suất thẩm thấu, các chất trao đổi (Nguyen và đtg, 2007) 33.
1.2.1. Sự biến đổi của bộ rễ
Ở đậu tương sự thích nghi với điều kiện hạn hán có thể bằng cách phát
triển rễ trụ dài hơn, hệ thống lông rễ lớn có thể tìm nước ở các lớp đất phía dưới
ẩm hơn và hút dinh dưỡng như kali. Một trong các yếu tố chính ảnh hưởng đến độ
đâm sâu của hệ rễ đậu tương là tỉ lệ kéo dài rễ. Rễ trụ là dạng rễ đầu của đậu

tương, xác định kiểu hình của rễ trụ dưới điều kiện không stress có thể cho phép
xác định khả năng đâm sâu của rễ. Kaspar và cs đã lấy ra 105 kiểu hình khác nhau
của đậu tương từ các nhóm có tính trưởng thành khác nhau. Độ dài của rễ trụ trong
mỗi nhóm trưởng thành biến thiên vào khoảng 1,3 cm/ngày. Các kết quả trên cho
thấy nhóm các giống có tỉ lệ kéo dài rễ nhanh hơn thường có thể hút nước trong
đất ở sâu 120 cm dưới bề mặt. Dưới điều kiện hạn, số lượng rễ mới trên một đơn

8


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

vị chiều dài rễ trụ tăng lên đáng kể, nhưng không tăng chiều dài hay đường kính rễ
trụ. Bởi vì, sự sinh trưởng rễ và sự phân phối nước là quyết định để duy trì chức
năng trong các điều kiện môi trường khác nhau, đặc tính mềm dẻo của rễ là yếu tố
quyết định khả năng tìm được các nguồn nước. Stress nước hướng tới sự gia tăng
sinh khối của rễ, gia tăng tỉ lệ rễ : thân. Các cây không được tưới nước cho thấy sự
gia tăng kích thước rễ khi so sánh với cây được tưới nước, xuất hiện tương quan
đặc trưng giữa sức chịu đựng hạn với các đặc điểm đa dạng của rễ như khối lượng
khô, kích thước toàn bộ hệ rễ, khối lượng và số lượng rễ phụ [28]. Phân tích
proteomic của rễ cây đậu tương xử lý hạn, phát hiện 35 protein được tạo ra và có
nhiều thay đổi quan trọng ở vùng rễ bị stress mất nước khi so sánh với điều kiện
bình thường. Số lượng của một số protein gia tăng, như là ferritin, trong khu vực
kéo dài của rễ bị xử lý stress, có vai trò quan trọng bảo vệ tế bào chống lại các
dạng oxy hoạt hoá. Thông tin từ proteomic đã cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa
sinh tổng hợp phenylpropanoid và sinh trưởng của rễ trong điều kiện thế nước
thấp, như sự gia tăng lớn của lượng isoflavon và các bức vách phenolic, bao gồm
lignin lần lượt ở vùng chóp rễ và vùng cơ bản [37].

1.2.2. Khả năng cố định đạm trong điều kiện hạn
Khả năng cố định đạm của cây họ đậu rất nhạy cảm với hàm lượng nước
trong đất. Trong điều kiện hạn, cây đậu tương không chỉ bị mất cân bằng lượng CO2
tích lũy và làm giảm sự phát triển diện tích lá, mà lượng nitơ liên kết cũng không
còn được giữ vững. Đất khô làm giảm hàm lượng nitơ cho quá trình tạo ra protein,
làm giảm năng suất cây trồng và chất lượng hạt giống. Một vài yếu tố liên quan đến
ức chế nitơ liên kết trong điều kiện hạn bao gồm: hạn chế lượng oxy đi vào; giảm
dòng cacbon đến nốt sần; giảm hoạt động tổng hợp đường trong nốt sần; đồng thời
tăng tích lũy urê và các amino acid tự do [28], [37]. Hoạt động của nitrogenase cho
thấy giảm 70% trong 4 ngày đầu gây hạn, trong khi quang hợp chỉ giảm 5%, điều
này cho thấy stress nước tạo một tác động đến hoạt động của nitrogenase, mà không
phụ thuộc tỉ lệ quang hợp. Nó cũng cho thấy sự thiếu nước tác động đến hoạt động
của nốt sần thông qua sự gia tăng khả năng chịu đựng sự khuếch tán oxy đến

9


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

bacteriod. Khả năng chống lại sự khuếch tán oxy được tăng cường; giảm hô hấp
nitrogenase liên kết và hoạt động các enzyme; tích lũy các chất nền hô hấp và lipid
bị oxy hóa; điều tiết ngược các gen chống lại oxy hóa; cùng với hoạt động tập trung
hô hấp của bacteriod bị làm suy yếu trong điều kiện hạn, và sự hư hại oxy hóa xảy
ra trong nốt sần trước khi đến tác động nào tới sinh tổng hợp đường hay
leghemoglobin. Đất khô thường điều khiển sự tích lũy của urê trong lá cây đậu
tương và được biết tới như một nhân tố hạn chế sự tạo nốt sần [37].
1.2.3. Sự biến đổi về hình thái lá
Hệ thống lông tơ của lá là một đặc điểm chung của các loài thực vật chịu

hạn, trong đó có đậu tương. Thông thường, độ dày lông tơ lá gia tăng hệ số phản xạ
từ lá, dẫn đến giảm nhiệt độ của lá trong điều kiện chiếu sáng cao. Độ dày lông tơ lá
là đặc điểm thích ứng quan trọng cho cây đậu tương dưới điều kiện hạn. Lông tơ
dày đặc được tăng cường sức sinh trưởng, rễ dày đặc hơn và mở rộng xuống sâu
hơn. Sự gia tăng độ dày lông tơ lá có thể làm tăng lớp ranh giới chống lại stress lên
hơn 50%, giảm nhiệt độ của lá, hạn chế thoát hơi nước và tăng cường quá trình
quang hợp. Hơn nữa, sự gia tăng độ dày lông tơ có thể làm giảm đi đáng kể phạm vi
ảnh hưởng bệnh khảm virus của đậu tương [37].
1.2.4. Sự biến đổi trong đặc điểm sinh lý của thân
Một trong những đặc điểm sinh lý liên quan đến thân có thể tác động đến khả
năng chịu hạn là sự suy giảm lượng nước sử dụng trong toàn bộ cơ thể thực vật khi
đất bị thiếu nước. Khi sự mất nước ở đất gia tăng, thực vật phải chịu đựng một thời
kỳ chuyển tiếp từ trạng thái bão hòa nước, khi mà lượng nước toàn bộ cơ thể thực
vật sử dụng không phụ thuộc vào lượng nước trong đất; sang trạng thái thứ hai khi
mà nước sử dụng liên quan trực tiếp tới lượng nước dùng được trong đất. Việc
chuyển trạng thái này được kết hợp với sự giảm chỉ số dẫn truyền trung bình ở khí
khổng, và có thể xảy ra phụ thuộc lượng nước trong đất khác nhau, trong nhiều loài
khác nhau. Tính dẫn truyền của khí khổng tác động quan trọng đến sự thay đổi sự
trao đổi khí của lá và thoát hơi nước. Các tác động của hạn đến sinh trưởng của lá,
sự dẫn truyền của khí khổng và mối quan hệ với lượng nước trong cây đã được

10


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

nghiên cứu trong cây đậu tương. Nó cho thấy rằng hạn làm giảm tương đối tỉ lệ mở
rộng của lá, sự dẫn truyền của khí khổng và sức căng của lá, trong khi đó nó tăng

cường lượng abscisis acid trong lá và mạch xylem. Sự giảm tính dẫn của khí khổng
xảy ra đồng thời với sự gia tăng abscisis acid trong xylem và xảy ra trước bất cứ sự
thay đổi quan trọng nào về sức căng của lá, nó chỉ ra rằng các dấu hiệu hóa học
(abscisis acid - nguồn gốc từ rễ) điều khiển hoạt động khí khổng ở trạng thái mất
nước vừa phải [7], [37].
1.2.5. Áp suất thẩm thấu trong điều kiện hạn
Áp suất thẩm thấu có thể duy trì cường độ thoát hơi nước của khí khổng và
quá trình quang hợp trong các trường hợp thế năng nước thấp. Trong điều kiện hạn,
áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu được các phân tử nước hiếm hoi có
trong đất nhờ vậy thực vật có thể vượt qua tình trạng hạn cục bộ. Khi tế bào mất
nước, các chất hoà tan sẽ được tích luỹ nhằm chống lại việc giảm mất nước, tăng
khả năng giữ nước của nguyên sinh chất và chúng có thể thay vị trí nước nơi xảy ra
các phản ứng sinh hoá, tương tác với lipid hoặc protein trong màng ngăn chặn sự
phá huỷ của màng và các phức protein. Các chất hoà tan có khả năng tạo áp suất
thẩm thấu cao bao gồm các ion K +, proline, acid hữu cơ, các loại đường. Khi bắt
đầu mất nước, hàm lượng proline và abscisic acid tăng, tăng tổng hợp protein,
nhưng nếu hạn kéo dài sẽ xảy ra hiện tượng thuỷ phân protein. Quá trình thuỷ phân
các hydratcacbon dự trữ cũng là nguồn cung cấp chất tan cho quá trình điều chỉnh
áp suất thẩm thấu.
Abscisic acid (ABA) được tạo ra dưới stress mất nước và đóng vai trò
quan trọng trong việc chống chịu đối với hạn hán. Trong trường hợp có mặt
ABA quá trình đóng mở lỗ khí được điều chỉnh làm hạn chế sự thoát hơi nước.
Hầu hết gen cảm ứng stress hạn cũng được gây ra bởi tác động ABA (Shinozaki
và Yamaguchi-Shinozaki năm 1997, 2000). Tuy nhiên, trong các thể đột biến
Arabidopsis aba (thiếu ABA) hoặc abi (không nhạy cảm với ABA) có một số
gen khác đã được gây ra bởi hạn hán, muối và lạnh. Điều này cho thấy một số

11

Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

gen lại không yêu cầu ABA cho biểu hiện của chúng dưới các điều kiện mặn,
hạn hán và lạnh [29].
1.2.6. Các nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn
Ở thực vật khi gặp các điều kiện bất lợi như: hạn, mặn và lạnh sẽ làm
giảm lượng nước trong tế bào thực vật ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và
phát triển của cây, có thể dẫn đến chết cây. Gần đây các nghiên cứu đã phát
hiện rằng sự tác động của tác nhân bất lợi có liên quan đến sự biểu hiện và tích
lũy của các gen/protein chống chịu stress. Một số gen được tăng hoạt động và
một số khác bị giảm hoạt động trong cây bị stress hạn. Sự điều chỉnh này xảy
ra ở các mức riêng biệt, từ thời điểm phát hiện stress đến việc sản xuất các
protein hoạt tính sinh học (Shinozaki và Yamaguchi-Shinozaki, 2007). Các gen
mã hóa protein tham gia vào phản ứng của thực vật với các tác nhân stress
được phân thành hai nhóm dựa vào chức năng của các sản phẩm mà chúng mã
hóa [6], [23], [29]
(1) Nhóm protein chức năng : Tham gia trực tiếp đáp ứng điều kiện hạn,
bảo vệ các đại phân tử và màng (protein LEA, osmotin, protein chống đông,
chaperonin và protein liên kết mRNA…) và duy trì nước tự do qua màng
(protein kênh vận chuyển nước và các kênh xuyên màng…); Các enzyme xúc
tác các quá trình sinh tổng hợp các chất thẩm thấu (proline, betain và đường..),
ở đây phải kể đến enzym P5CS (pyroline-5-carboxylase) là một trong những
enzym chức năng, liên quan đến quá trình tổng hợp prolin, một chất đóng vai
trò quan trọng trong quá trình điểu chỉnh áp suất thẩm thấu khi cơ thể thực vật
sống trong các điều kiện bất lợi như hạn, mặn; và các eyme khử độc cho phép
các hoạt động sinh lý trong tế bào hay sự chuyển hóa sinh học duy trì mức bình
thường (glutathinone S-transferase, epoxide hydrolase hòa tan, catalase,
superoxide và ascorbic peroxidase…) [20], [29]. Khả năng chống chịu với hạn

hay mặn có thể được tăng cường bằng cách chuyển gen mã hóa protein LEA,
protein trong tổng hợp hoặc tổng hợp betain…[29].

12


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

(2) Nhóm protein điều khiển sự biểu hiện của các gen chức năng liên
quan đến tính chịu hạn, các nhân tố phiên mã bám vào trình tự DNA đặc hiệu
trên vùng khởi động (promoter) của các gen chức năng tham gia vào tính chịu
hạn và hoạt hóa sự biểu hiện của các gen này và kết quả là tăng cường tính chịu
hạn của thực vật. Các nghiên cứu về gen đã chứng minh vùng khởi động của
nhiều gen chức năng chứa một hoặc nhiều trình tự DNA đặc hiệu là điểm bám
của một nhân tố phiên mã. Điều này chứng tỏ một nhân tố phiên mã có thể hoạt
hóa biểu hiện của nhiều gen chức năng. Các nghiên cứu biểu hiện gen đã chứng
minh nhiều nhân tố phiên mã biểu hiện mạnh trong điều kiện hạn, chứng tỏ
nhóm protein này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế điều hòa và biểu hiện
của các gen tăng cường tính kháng hạn ở thực vật [8]. Sản phẩm gen thuộc
nhóm hai bao gồm các yếu tố phiên mã (bZIP, MYC, MYB và DREB…);
protein kinase (MAP kinase và CDP kinase, protein kinase thụ quan, protein
kinase ribosome và protein kinase liên quan phiên mã…); proteinase
(photphoeterase và phospholipase C…) [29], [38].
1.3. PROLINE VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYME P5CS TRONG CON ĐƯỜNG
SINH TỔNG HỢP PROLINE
1.3.1. Quá trình sinh tổng hợp proline
Sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao có thể được thực hiện qua hai con
đường hoặc từ glutamate hoặc từ ornithine. Proline được tổng hợp từ glutamate

được coi là một trong những chu trình sinh tổng hợp quan trọng nhất của cơ thể
thực vật ở những điều kiện sinh lý nhất định, khi cây bị giới hạn về nguồn nitơ hay
gặp phải những bất lợi về áp suất thẩm thấu (Csonka và đtg, 1988) 18. Trong khi
đó con đường sinh tổng hợp proline thông qua ornithine thường xảy ra khi cây ở
trong các điều kiện thừa nitơ (Delanuney và Verma, 1993) 19. Sinh tổng hợp
proline ở thực vật được minh họa tại hình 1.1.

13


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

Hình 1.1. Chu trình sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao
(Delanuney và Verma, 1993) 19
P5CS là enzyme giữ hai chức năng, thứ nhất enzyme hoạt hóa glutamate trở
thành dạng hoạt động và thứ hai xúc tác cho phản ứng đóng vòng để tạo ra
pyrroline-5-carboxylate. Dẫn xuất này sau đó sẽ bị khử bằng phản ứng xúc tác bởi
enzyme pyroline-5-carboxylate reductase để tạo proline (Hu và đtg, 1992) 24.
Trong quá trình sinh tổng hợp gốc amin của ornithine có thể được chuyển
thành glutamic semialdehyde bởi sự xúc tác của ornithine aminotransferase hoặc
thành keto-aminovalerate bởi sự xúc tác của ornithine aminotransferase. Theo con
đường thứ nhất, glutamic semialdehyde sẽ được đóng vòng để tạo pyroline-5carboxylate do hoạt tính của pyroline-5-carboxylate reductase. Ở con đường thứ hai
keto-aminovalerate được đóng vòn`g tạo pyroline-2-carboxylate do hoạt tính của
pyroline-2-carboxylate reductase (Hình 1.1). Những phân tích về sự biểu hiện của
ornithine aminotransferase ở cây đậu cho thấy gen mã hóa cho enzyme này biểu
hiện rất yếu trong điều kiện bình thường và điều kiện bất lợi, nhưng trong điều kiện
thừa nitơ thì gen này biểu hiện rất mạnh (Armengaud và đtg, 2004) 16. Chính vì lý
do này mà quá trình tổng hợp proline từ ornithine được cho là xảy ra trong các điều

kiện thừa nitơ. Mặc dù vậy, trong một vài trường hợp đặc biệt như ở cây cỏ ngọt và

14


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

lá non của cây Arabidopsis thì hàm lượng mRNA của gen ornithine
aminotransferase tăng lên rất mạnh ở các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu. Vì
vậy, sự tích lũy proline theo chu trình này cũng được coi là có vai trò đối với tính
chống chịu của cây khi gặp các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu.
1.3.2. Điều hòa quá trình trao đổi proline ở thực vật
Mặc dù quá trình trao đổi proline ở thực vật đã được nghiên cứu trên 40 năm,
nhưng kiến thức về cơ chế điều hòa quá trình này còn rất hạn chế. Hình 1.2 mô tả
cơ chế và các tác nhân có vai trò trong quá trình điều hòa trao đổi proline ở thực
vật. Quá trình sinh tổng hợp proline được hoạt hóa và quá trình dị hóa proline bị
hạn chế khi cây bị xử lý bởi hạn, trong khi đó cung cấp nước trở lại cho cây thì các
quá trình này sẽ hoạt động theo hướng ngược lại.

Hình 1.2. Cơ chế và các tác nhân điều hòa quá trình trao đổi proline ở thực vật
(Szabados và đtg, 2009) 44
Ở thực vật, quá trình sinh tổng hợp proline được kiểm soát bởi hoạt tính
của hai gen mã hóa cho enzyme P5CS. Hai gen này có độ tương đồng rất cao về
trình tự mã hóa nhưng biểu hiện lại rất khác nhau trong những điều kiện khác
nhau. Ở cây Arabidopsis, gen P5CS2 là một gen “giữ nhà” (housekeeping),
hoạt động của gen này chủ yếu ở các mô phân sinh như đầu rễ và đỉnh chồi, ở
hoa và các tế bào nuôi cấy (Székely và đtg, 2008) 45. Cả hai gen P5CS đều
hoạt động ở các mô phân sinh của hoa, chủ yếu để cung cấp proline cho quá

15


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

trình phát triển của hoa (Mattioli và đtg, 2009) 30. Gen P5CS1 của cây
Arabidopsis hoạt động rất mạnh và được cảm ứng bởi các yếu tố bất lợi về
thẩm thấu, mặn và nó cũng được hoạt hóa bởi axit abscisic. Ngoài ra, hoạt động
của gen này và sự tích lũy proline cũng bị kích thích bởi ánh sáng và bị ức chế
bởi các hợp chất brassinosteroid. Trong điều kiện bình thường, enzyme
phospholipase D (PLD) giữ chức năng như một chất điều hòa quá trình tích lũy
proline, trong khi đó calcium và phospholipase C (PLC) kích thích quá trình
phiên mã gen P5CS và sự tích lũy proline khi cây bị bất lợi về mặn. Ở loài cây
chịu mặn Thellungiella halophila, PLD lại là một chất điều hòa có tác dụng
kích thích và PLC được cho là chất điều hòa có tác dụng bất hoạt sự tích lũy
proline trong tế bào. Calcium có chức năng như một chất truyền tín hiệu tương
tác với nhân tố phiên mã MYB2 để hoạt hóa sự phiên mã của gen P5CS1.
Tương tự như cơ chế điều hòa quá trình trao đổi proline thông qua điều hòa
sự phiên mã các gen P5CS, hoạt tính của enzyme P5CS cũng được kiểm soát bởi
quá trình trao đổi. Một trong những ví dụ điển hình đó là sự ức chế ngược hoạt tính
P5CS bởi proline (Zhang và đtg, 1995) 50. Khi enzyme P5CS không bị ức chế bởi
proline thì sự tích lũy axit amin này sẽ tăng rất mạnh trong tế bào. Quá trình chuyển
hóa P5C thành proline không phải là bước giới hạn trong chu trình sinh tổng hợp
proline, chính vì vậy sự điều hòa hoạt tính enzyme P5CR cho thấy sự phức tạp
trong cơ chế điều hòa sự phiên mã của gen này. Khi phân tích promoter của gen
P5CR ở cây Arabidopsis đã xác định được một đoạn trình tự có chiều dài 69
nucleotid qui định hoạt động đặc hiệu mô của gen (Hua và đtg, 1999) 25. Tuy

nhiên, các nhân tố tác động dạng trans liên kết với đoạn trình tự cho đến nay vẫn
chưa được xác định.
Trong khi quá trình sinh tổng hợp proline bị kích hoạt bởi ánh sáng và các
yếu tố bất lợi về áp suất thẩm thấu thì quá trình dị hóa proline lại được hoạt hóa
trong điều kiện không có ánh sáng và trong quá trình cây gặp các tác động bất lợi từ
môi trường. Quá trình này được kiểm soát bởi hai enzyme là PDH và P5CDH (Hình
1.2). Quá trình phiên mã của gen PDH được hoạt hóa bởi proline và khi cây được

16


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

cung cấp đủ nước sau khi bị hạn, nhưng sự phiên mã của gen lại bị ức chế khi cây
gặp điều kiện hạn do đó đảm bảo proline không bị phân giải khi cơ thể gặp các điều
kiện bất lợi từ môi trường. Sự phiên mã của gen PDH1 bị ức chế vào ban ngày và
được hoạt hóa vào buổi tối do đó hoạt động của gen ngược với hoạt động của gen
P5CS1. Phân tích promoter của gen PDH1 đã xác định được nhân tố cảm ứng với
trạng thái thẩm thấu và proline, và nhân tố giữ vai trò rất quan trọng đối với quá
trình hoạt hóa của gen (Satoh và đtg, 2002) 43. Yếu tố phiên mã liên kết với nhân
tố trên là họ protein giàu leucine (Leucine Zipper Protein). Phân tích hoạt động của
gen P5CDH cho thấy gen biểu hiện rất yếu ở các mô của cây Arabidopsis và biểu
hiện của gen tăng lên khi bổ sung proline. Trên promoter của gen phân lập từ
Arabidopsis và lúa, các nhà khoa học cũng xác định được các nhân tố tương tự trên
promoter của gen PDH1. Hoạt động của gen FIS1 mã hóa cho enzyme P5CDH ở
cây lanh bị hoạt hóa khi cây bị nhiễm virus và bị tổn thương. Kết quả phân tích cơ
chế điều hòa hậu phiên mã (post-transcription) cho thấy các đoạn đối mã tồn tại
trong tự nhiên của gen P5CDH tạo ra các cấu trúc ức chế RNA nhỏ (small

interfering RNA) hoạt hóa cho quá trình cắt các phân tử RNA của gen P5CDH, do
vậy làm giảm mức độ phiên mã của gen khi cây gặp các điều kiện bất lợi từ môi
trường. Kết quả này cho thấy cơ chế ức chế hoạt động của gen ở mức độ hậu phiên
mã là rất quan trọng trong việc điều khiển hoạt động của gen P5CDH ở thực vật
(Borsani và đtg, 2005) 17.
1.3.3. Vai trò của sự tích lũy proline đối với tính chống chịu của cây
Proline được xem là một chất thẩm thấu có tác dụng bảo vệ các cấu trúc nội
bào và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu. Tuy
nhiên, sự tích lũy proline có thể ảnh hưởng đến tính chống chịu của cơ thể thực vật
theo nhiều con đường khác nhau. Hình 1.3 khái quát các vai trò của proline đối với
tính chống chịu ở thực vật.

17


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

Hình 1.3. Sơ đồ mô tả vai trò của proline đối với tính chống chịu của cây
(Szabados và đtg, 2009) 44
Proline có vai trò như là một chất định hình phân tử (molecular
chaperone) trong việc bảo vệ các cấu trúc protein và nâng cao hoạt tính của
nhiều loại enzyme khác nhau. Các ví dụ điển hình có thể kể đến đó là khả năng
ổn định hoạt tính của M4 lactate dehydrogenase khi có các tác động bất lợi về
nhiệt độ xảy ra; bảo vệ nitrate reductase khi tế bào gặp các tác động bất lợi về
áp suất thẩm thấu và kim loại nặng; ổn định hoạt động của các ribonuclease và
protease trong điều kiện nồng độ arsen ngoài môi trường tăng cao. Nhiều
nghiên cứu đã chứng minh vai trò của proline như một chất chống oxy hóa với
chức năng phân cắt các gốc oxy phản ứng (reactive oxygen residues) và bất

hoạt các gốc oxy tự do (singlet oxygen quencher) (Matysik và đtg, 2002) 31.
Khi xử lý các tế bào nấm men bằng proline cho thấy hàm lượng các gốc oxy
phản ứng giảm, do đó làm chậm quá trình gây chết tế bào theo chương trình
(programmed cell death). Đối với các tế bào người, proline có thể ngăn ngừa
tác động của các chất có khả năng gây ung thư, trong khi đó đối với các tế bào
tảo nuôi cấy ở các điều kiện có nồng độ kim loại cao thì proline có thể làm
giảm quá trình phân giải các hợp chất béo. Dẫn chứng trên cây lúa cho thấy,

18


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

proline làm giảm độc tính của thủy ngân thông qua quá trình phân cắt các gốc
oxy phản ứng như hydro peroxide. Hiệu ứng phá hủy của các gốc oxy tự do đối
với hệ thống quang hóa II có thể bị ức chế bởi proline khi nghiên cứu trên hệ
màng thylakoid. Tác động của tia phóng xạ đến các tế bào tảo và cây thuốc lá
chuyển gen tăng cường tích lũy proline cũng bị giảm thiểu khá mạnh (Szavados
và đtg, 2009) 44.
Sự tích lũy proline đã được chứng minh là có tính đặc hiệu loài, tuy nhiên
liệu sự khác nhau này có liên quan đến tính thích ứng của mỗi loài hay không vẫn
còn là câu hỏi mở đối với các nhà khoa học. Ở hai loài cây chịu mặn có họ hàng với
Arabidopsis là Thellungiella halophila và Lepidium crassifolium, tích lũy proline
mạnh hơn hẳn so với Arabidopsis ở trong điều kiện mặn. Sự tích lũy proline của cây
Thellungiella là kết quả của sự tăng cường hoạt động của gen P5CS và giảm hoạt
động của gen PDH (Taji và đtg, 2004) 47. Hàm lượng proline cao có thể cải thiện
tính chịu mặn ở loài cây ưa mặn Pancratium maritimum thông qua khả năng ổn
định hoạt động của nhiều enzyme khử độc và của bộ máy luân chuyển protein và

kích thích sự tích lũy các protein có chức năng bảo vệ. Hàm lượng proline ở các loài
cây ưa mặn khác như Camphorosma annua và Limonium spp. không cao nhưng
thay vào đó ở các loài này lại tích lũy mạnh nhiều chất thẩm thấu khác như các loại
carbohydrate hay các chất tổng hợp từ betain (Murakeozy và đtg, 2003) 32.
Những nghiên cứu trên đây cho thấy, sự tích lũy proline thường đi kèm với những
đặc tính chống chịu ở các loài cây; vì thế có thể cho rằng, quá trình này là để giúp
tăng cường tính chống chịu, tuy nhiên đây lại không phải là một yếu tố quá cần thiết
cho sự thích ứng của các loài thực vật khác nhau đối với các điều kiện khắc nghiệt
từ môi trường (Szabados và đtg, 2009) 44.
1.3.4. Vai trò của enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase đối với tính
chống chịu của cây trồng
Thuốc lá là cây trồng đầu tiên được chuyển gen P5CS phân lập từ cây
nho được điều khiển bởi promoter 35S. Phân tích các dòng thuốc lá chuyển gen
này cho thấy: hoạt động của enzyme P5CS rất mạnh và hàm lượng proline tích

19


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

lũy tăng lên từ 10-18 lần so với cây đối chứng không chuyển gen. Tăng cường
tích lũy proline ở các dòng thuốc lá này còn kích thích sự phát triển của sinh
khối rễ khi cây bị xử lý mặn trong các điều kiện thí nghiệm tại nhà lưới. Do
hàm lượng proline tăng lên rất mạnh ở các dòng chuyển gen nên kết quả này
cho thấy hoạt tính của enzyme P5CS giữ vai trò quyết định tới quá trình sinh
tổng hợp proline ở cây. Đặc biệt hơn, khi bổ sung thêm nitơ vào môi trường
nuôi cấy các dòng thuốc lá này thì hàm lượng proline tăng lên đáng kể so với
dòng thuốc lá chuyển gen không được bổ sung nitơ. Những nghiên cứu ở

enzyme P5CS tinh sạch từ cây đậu xanh cũng cho thấy, enzyme này bị ảnh
hưởng bởi hiệu ứng ức chế ngược bởi proline và hoạt tính của enzyme này
giảm tới 50% khi bổ sung 50mM proline ngoại bào. Bên cạnh đó, nitơ đóng vai
trò như là cơ chất và cũng là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi proline
và cũng giữ chức năng điều hòa hoạt động của proline. Nghiên cứu trên cây
Arabidopsis, các nhà khoa học đã chứng minh được mối quan hệ chặt chẽ giữa
hoạt động của enzyme P5CS và sự tích lũy proline trong điều kiện cây bị xử lý
mặn; và hiệu ứng ức chế ngược của proline tới hoạt tính của P5CS cũng bị ảnh
hưởng trong các điều kiện bất lợi này. Khi chuyển gen P5CS đã bị gây đột biến
loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược bởi proline vào cây thuốc lá, các nhà khoa học
đã nhận ra rằng các dòng thuốc lá chuyển gen này tăng cường tích lũy proline
nhiều hơn gấp 2 lần so với các dòng thuốc lá được chuyển gen P5CS kiểu dại.
Thêm vào đó, khi xử lý các dòng chuyển gen này với 200mM NaCl thì kích
thích sự tích lũy proline (Hong và đtg, 2000) 21. Những kết quả này là những
dẫn chứng rất rõ ràng rằng hiệu ứng ức chế ngược của enzyme P5CS bởi
proline giữ vai trò rất quan trọng đối với quá trình sinh tổng hợp proline trong
cả điều kiện bình thường và khi cây gặp phải các điều kiện bất lợi về áp suất
thẩm thấu. Ở các loài thực vật tổng hợp mạnh proline thì cây có tính chống
chịu tốt hơn so với các loài thực vật khác trong các điều kiện hạn, mặn… Ví dụ
cây lúa chuyển gen P5CS phân lập từ cây đậu có tính kháng mặn tốt hơn hẳn
các dòng lúa đối chứng không chuyển gen. Tương tự như vậy, khi các nhà khoa

20


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

học tiến hành chuyển trực tiếp gen P5CS vào hạt phấn của của cây lúa mì và

tiến hành kiểm tra tính kháng trong điều kiện mặn thì cũng cho thấy các kết quả
tương tự như ở cây lúa. Ở cây cà rốt khi được chuyển gen P5CS các dòng cà rốt
có tính kháng muối cao hơn tới 6 lần so với dòng đối chứng. Những kết quả
này không chỉ được chứng minh ở thực vật bậc cao mà còn cả ở loài vi tảo
Chlamydomonas reinhardtii khi được chuyển gen P5CS. Các dòng vi tảo
chuyển gen tích lũy proline cao hơn 80% so với các dòng không chuyển gen.
Những dòng chuyển gen này sinh trưởng nhanh hơn trong môi trường có chứa
100 micromole cadmium và khả năng tích lũy cadmium cao hơn tới 4 lần so với
dòng đối chứng. Gần đây, gen P5CS được phân lập thành công từ cây lúa và
khi được chuyển trở lại lúa nhằm tăng cường hoạt động của gen này các nhà
khoa học đã nhận thấy rằng tính chịu mặn và chịu lạnh được cải thiện rõ rệt.
Promoter của gen P5CS cũng được nghiên cứu khá chi tiết ở cây Arabidopsis
chuyển gen trong điều kiện hạn (Kishor và đtg, 2005) 27. Bảng 1.2 trích dẫn
những loài thực vật đã được chuyển gen P5CS và các đặc điểm quan tâm được
cải thiện.
Bản chất tính kháng muối cũng được các nhà khoa học nghiên cứu trên
đối tượng cây thuốc lá Nicotinana plumbaginifolia đột biến bằng phương pháp
sử dụng đồng vị phóng xạ của carbon. Các nhà khoa học sử dụng glutamate
mang ion carbon 13 làm cơ chất cho sự tổng hợp proline. Trong điều kiện mặn,
các dòng đột biến tích lũy proline mạnh hơn các dòng kiểu dại. Nghiên cứu chỉ
ra, rằng hoạt tính của các enzyme trong chu trình sinh tổng hợp proline từ
ornithine và quá trình dị hóa proline không bị ảnh hưởng và enzyme P5CS cũng
không bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng ức chế ngược bởi proline do đột biến ở các
dòng thuốc lá này.

21


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

Bảng 1.2. Cây chuyển gen P5CS
Tên loài
Thuốc lá

Kiểu hình của cây chuyển gen
Tăng cường sinh khối, lá và hạt phát triển bình thường trong điều
kiện muối

Thuốc lá

Loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngược của enzyme P5CS và tổng hợp
proline nhiều gấp 2 lần

Lúa

Tăng cường sinh khối trong điều kiện hạn và mặn

Arabidopsis

Cây chuyển gen đối mã cho thấy cây dễ bị hạn và hình thái cây
không bình thường trong điều kiện nuôi cấy bình thường

Lúa

Tăng cường tính chống chịu oxy hóa trong điều kiện bất lợi về áp
suất thẩm thấu

Lúa

Rễ sinh trưởng tốt hơn và sinh khối phát triển trong điều kiện
nồng độ NaCl là 200 Mm

Lúa

Cây non chuyển gen biểu hiện tính kháng hạn và mặn tốt hơn

Lúa mì

Cây chuyển gen tổng hợp nhiều proline và chịu mặn tốt hơn

Chlamydomonas Dòng chuyển gen tích lũy nhiều proline hơn tới 80% và chống
chịu kim loại nặng tốt hơn
Nấm men

Sinh trưởng giảm trong điều kiện không xử lý

Carot

Chống chịu mặn tốt hơn

Lúa

Chịu lạnh và muối tốt hơn

Cây chanh

Chống chịu hạn tốt hơn
(Kishor và đtg, 2005) 27

1.4. CHUYỂN GEN VÀ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG NÂNG CAO TÍNH
CHỐNG CHỊU HẠN
Phần lớn cây trồng thuộc nhóm cây trung sinh, khả năng chịu hạn yếu. Do đó
nếu gặp hạn hán năng suất giảm. Để đảm bảo năng suất cây trồng ngay cả trong
trường hợp bị hạn, ngoài các biện pháp chống hạn thì việc nâng cao khả năng chịu
hạn cho cây để cây duy trì hoạt động sống bình thường trong điều kiện hạn là biện
pháp quan trọng.

22


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

Để nâng cao tính chịu hạn của cây có nhiều biện pháp được áp dụng
như: Rèn luyện hạt giống trước khi gieo, lai, gây đột biến,… Ngày nay, với sự phát
triển của công nghệ sinh học, việc tạo ra các cây trồng mang gen chịu hạn được xem
là biện pháp có nhiều triển vọng, đem lại những lợi ích cả về kinh tế lẫn môi trường.
Việc phát hiện ra các gen giúp thực vật chống chịu hạn đã tạo ra một bước tiến quan
trọng, đưa công nghệ sinh học đến gần hơn lĩnh vực bảo vệ thực vật.
1.4.1. Tạo cây chuyển gen
Công nghệ gen mở ra một giai đoạn mới trong lĩnh vực giống cây trồng. Nó
cho phép xác định các gen, các đặc tính mong muốn, có thể cải tiến, nhân và tổng
hợp chúng, chuyển nạp vào cơ thể sinh vật muốn cải tạo, tạo nên giống mới mang
đặc tính mới có định hướng, rút ngắn thời gian tạo giống. Chuyển gen vào thực vật
là một trong những kỹ thuật chủ yếu của công nghệ gen thực vật.
Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể chia
thành hai nhóm phương pháp chính dựa vào cách thức đưa gen vào tế bào thực vật

đó là: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp.
1.4.1.1. Chuyển gen trực tiếp
Theo phương pháp này, gen được chuyển trực tiếp và tế bào thực vật với
sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lý. Chuyển gen trực tiếp gồm:
phương pháp bắn gen, phương pháp vi tiêm, phương pháp dung hợp tế bào trần,
phương pháp dùng xung điện, phương pháp dùng polyethylen glycol (PEG).
Trong những nhóm phương pháp này thì phương pháp bắn gen và chuyển gen
trực tiếp nhờ polyethylen glycol (PEG) được ứng dụng phổ biến và thu được
nhiều kết quả hơn cả [12].
Phương pháp bắn gen: là phương pháp sử dụng các hạt kim loại nặng được
bao bọc DNA bắn vào tế bào. Một số ưu điểm của phương pháp bắn gen là: thao tác
dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào, nguyên liệu để bắn gen đa dạng (hạt phấn,
tế bào nuôi cấy, tế bào của các mô biệt hóa và mô phân sinh). Cây đậu tương biến
nạp đầu tiên đã thu được từ việc sử dụng phương pháp này (Mc.Cabe và cộng sự,
1988). Và gần đây đã có hàng loạt công bố về biến nạp thành công trên lúa, đu đủ,

23


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

mía, bông,…đã khẳng định những ưu việt của phương pháp này. Tuy nhiên nhược
điểm của nó là tần số biến nạp còn thấp, cây tạo ra có thể ở dạng thể khảm.
Phương pháp chuyển gen trực tiếp nhờ polyethylen glycol: là phương pháp
chuyển DNA thông qua xử lý polyethylen glycol. Là phương pháp chuyển gen cho
hiệu quả cao, cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua các thế hệ (Potrykus
và công sự, 1985). Ưu điểm: tần số chuyển nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần
biến nạp cao, có thể chuyển gen vào protoplast của bất kì loài cây nào. Tuy nhiên,

việc nuôi cấy protoplast cũng như việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ hệ thống này còn
khó khăn ở một số loài cây.
1.4.1.2. Chuyển gen thông qua Agrobacterium
Là phương pháp hữu hiệu đầu tiên dùng để chuyển gen ở thực vật. Cho đến
nay, chuyển gen thông qua Agrobacterium là phương pháp cho tần số biến nạp cao
hơn và có thể xác định được sự xâm nhập ổn định hơn bất cứ phương pháp chuyển
gen nào.
Quá trình chuyển gen gồm nhiều bước khác nhau với mục đích đưa được các
gen quan tâm vào hệ gen của tế bào thực vật, để thu nhận được các protein tái tổ
hợp biểu hiện các tính trạng mong muốn. Trong các bước của quy trình chuyển gen
ngoài đối tượng cây chuyển gen và phương pháp chuyển gen thì việc xác định
vector và gen chuyển là những yếu tố quan trọng làm cơ sở cho quá trình chuyển
gen thành công [11, 12].
1.4.1.3. Gen chuyển
Hiện nay, người ta đã xác định được khoảng 130.000 gen từ 19 loài cây
trồng khác nhau. Các gen chìa khóa quan trọng đối với năng suất, chất lượng, khả
năng chống chịu của cây trồng,…cũng đang dần được nghiên cứu cùng với trình tự
nucleotit và cấu trúc, chức năng của gen trong genome [15]. Trong quá trình chuyển
gen vào thực vật, tùy vào tính trạng mong muốn tạo ra ở cây trồng chuyển gen để
xác định cụ thể gen cần chuyển. Việc xác định được gen cần chuyển là tiền đề cho
việc thiết kế các vector chuyển gen vào thực vật. Đã có rất nhiều các gen mới có ý
nghĩa trong công tác tạo giống cây trồng được phát hiện như: các gen kháng sâu,

24


Luận văn tốt nghiệp

Hoàng Thị Thảo

gen kháng thuốc diệt cỏ, gen chín sớm, gen kìm hãm quá trình chín của quả,…Căn
cứ vào mục đích của quá trình chuyển gen sẽ lựa chọn và tách chiết để thu được các
gen quan tâm. Việc phát hiện ra các gen này có thể tạo ra một cuộc cách mạng trong
nông nghiệp, là cơ sở để tạo ra những giống cây trồng mang các đặc tính mới như
mong muốn của con người.
1.4.1.4. Vector chuyển gen
Sau khi xác định được gen quan tâm cần chuyển thì bước tiếp theo là cần
phải đưa gen này vào vector biến nạp chuẩn bị cho việc chuyển nạp gen vào tế
bào thực vật. Một vector chuyển gen cần có những thành phần sau: một đoạn
khởi đầu cho tái bản, một gen chỉ thị chọn lọc để thao tác trong E. coli và một
gen chỉ thị khác được khống chế bởi promoter mạnh của thực vật phục vụ cho
việc chọn lọc ở thực vật [11]. Vector chuyển gen có thể được thiết kế bằng các
phản ứng ghép nối với việc sử dụng các enzyme giới hạn phù hợp hoặc bằng kỹ
thuật Gateway® [11, 14].
Các promoter hoạt động mạnh trong vector biểu hiện gen cho phép dịch mã,
tạo nhiều protein lai. Các vị trí cắt đặc hiệu của enzyme giới hạn có vai trò cài gắn
các gen quan tâm. Các gen chỉ thị được gắn vào các vector chuyển gen góp phần
sàng lọc để loại bỏ các mẫu biến nạp không mang gen chuyển. Các gen chỉ thị này
có thể là gen chọn lọc di truyền tức là những gen mã hóa cho các loại enzym có khả
năng khử độc đối với các chất kháng sinh như: kanamycin, hygromycin,
streptomycin, gentamycin,…hoặc chất diệt cỏ glyphosate hay Basta hoặc là các gen
chỉ thị chọn lọc sinh hóa như gen gus-gen thông báo [ 2, 12].
Có hai hệ thống vector dùng cho chuyển gen thông qua A. tumefaciens là hệ
thống vector liên hợp và hệ thống vector nhị thể. Trong đó vector liên hợp là một
vector lai mang đoạn gen cần chuyển và tất cả các thành phần của một vector biểu
hiện gen. Nó có cấu trúc gần giống như một Ti-plasmid của Agrobacterium, tức là
chứa vùng hoạt động tham gia vào quá trình chuyển gen vào thực vật, đó là các
vùng bờ trái, bờ phải và vùng vir. Còn hệ thống vector nhị thể là 2 plasmid tự tái
bản, một là T-DNA còn lại vùng bờ trái, bờ phải, xen vào đó là gen cần chuyển, một

25