Luận văn nghiên cứu tạo phôi lợn bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------------

Nguyễn Thị Hương

NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI LỢN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG
NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. Nguyễn Lai Thành


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

Hà Nội

Nguyễn Thị Hương

2


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS. Nguyễn Mộng Hùng
nguyên Trưởng phòng Công nghệ tế bào Động vật – Trung tâm nghiên cứu
khoa học sự sống – Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
Thầy là người đầu tiên đã thu nhận và hướng dẫn tôi khi tôi bắt đầu tiến
hành luận văn cao học này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Lai Thành, Chủ nhiệm
bộ môn Tế bào – Mô phôi – Lý sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên. Thầy là người trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt khóa học.
Thầy đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian nghiên cứu
cũng như hoàn thành luận văn cao học này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Đào Đức Thà và Ths. Nguyễn Thị Thoa,
Ths. Lưu Ngọc Anh cùng các đồng nghiệp phòng Thí nghiệm Trọng điểm
công nghệ tế bào động vật, Viện Chăn nuôi.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Phạm Việt Quỳnh cùng các
em Phòng Công nghệ Tế bào Động vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô trong khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội và đặc biệt là
các thầy cô giáo trong bộ môn Tế bào – Mô phôi – Lý sinh đã truyền đạt
cho tôi những kiến thức trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua.
Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình
tôi, những người đã luôn ủng hộ và là nguồn động viên lớn lao giúp tôi có
thể hoàn thành khóa học này.
Học viên
Nguyễn Thị Hương

Nguyễn Thị Hương

i Cao học K16 Sinh học

Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AMP:

Adenosine monophosphate

BSA:

Bovine serum albumin ( Albumin huyết thanh bò)

DMSO:

Demethyl sulfoxide

DNA:

Deoxyribonucleic acid (Axit Deoxyribonucleic)

eCG:

equine chorionic gonadotropin (Huyết thanh thai ngựa)

FCS:

Fetal calf serum (Huyết thanh bê)

FSH:

Follicle stimulating hormone (Hóc môn kích thích nang trứng)

GV:

Germinal vesicle (Túi mầm)

hCG:

Human chorionic gonadotropin (Chorionic gonadotropin người)

ICM:

Inner cells mass ( Nút phôi)

ICSI:

Intracytoplasmic sperm injection

IVF:

In vitro fertilization (Thụ tinh ống nghiệm)

IVM:

In vitro maturation (Nuôi thành thục trong ống nghiệm)

IVC:

In vitro culture (Nuôi cấy ống nghiệm)

LH:

Luteinizing hormone (hóc môn gây rụng trứng)

NCSU:

North Carolina State University

PBS:

Phosphate buffer solution (Dung dịch đệm phot phat)

PFF:

Porcine follicular fluid (Dịch nang trứng lợn)

SOD:

Superoxide dismutase

TTON:

Thụ tinh trong ống nghiệm

ZP:

Zona pellucida (Màng sáng)

TCN:

Tiêu chuẩn nuôi

Nguyễn Thị Hương

ii


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC HÌNH................................................................................................................iv
MỞ ĐẦU...............................................................................................................................1
................................................................................................................................................2
Chương 1. TỔNG QUAN.....................................................................................................3
1.1 Buồng trứng và sự tạo trứng___________________________________________3
1.1.1 Cấu tạo và hoạt động của buồng trứng..................................................................3
1.1.2 Cấu tạo và sự hình thành tế bào trứng...................................................................7
1.2 Cấu tạo và hoạt động của ống dẫn trứng________________________________11
1.3 Cấu tạo tinh trùng và quá trình hình thành tinh trùng_____________________14
1.3.1 Cấu tạo tinh trùng................................................................................................14
1.3.2 Quá trình sinh tinh...............................................................................................14
1.4 Sự thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm (IVM) và vai trò của môi trường
16
1.4.1 Sự thành thục của tế bào trứng............................................................................17
1.4.2 Vai trò của tế bào nang........................................................................................18

1.4.3 Vai trò của việc bổ sung dịch nang trứng và FCS trong môi trường nuôi thành
thục trứng.....................................................................................................................19
1.5 Sự hoạt hóa tinh trùng_______________________________________________21
1.5.1 Khái niệm hoạt hóa tinh trùng.............................................................................22
1.5.2 Sự hoạt hóa tinh trùng in vitro.............................................................................22
1.5.3 Các phương pháp sàng lọc làm tăng chất lượng tinh trùng.................................23
1.6 Thụ tinh trong ống nghiệm____________________________________________26
1.6.1 Sự thụ tinh...........................................................................................................26
1.6.2 Quá trình thụ tinh trong ống nghiệm...................................................................26
1.6.3 Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng trong thụ tinh ống nghiệm.............................27
1.7 Nuôi phôi trong ống nghiệm___________________________________________28
1.7.1 Quá trình phát triển phôi.....................................................................................28
1.7.2 Môi trường nuôi phôi sau thụ tinh.......................................................................35
1.8 Cất giữ lạnh phôi____________________________________________________36
1.9 Giải đông phôi______________________________________________________39
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................40
2.1 Đối tượng__________________________________________________________40
2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất____________________________________________40
2.2.1 Thiết bị................................................................................................................40
2.2.2 Hóa chất...............................................................................................................40
2.2.3 Dụng cụ, vật tư tiêu hao......................................................................................41
2.3 Phương pháp nghiên cứu_____________________________________________42
2.3.1 Phương pháp thu và bảo quản buồng trứng từ lò mổ..........................................42

Nguyễn Thị Hương

iii


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

2.3.2 Phương pháp thu trứng từ buồng trứng...............................................................42
2.3.3 Phương pháp thu dịch nang trứng.......................................................................43
2.3.4 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng thu được..............................................43
2.3.5 Phương pháp nuôi tế bào trứng chín in vitro.......................................................44
2.3.6 Phương pháp đánh giá chất lượng trứng.............................................................44
2.3.7 Phương pháp hoạt hóa tinh trùng in vitro............................................................45
Tinh trùng chúng tôi sử dụng cho quá trình thụ tinh là tinh đông lạnh trong cọng
rạ và bảo quản lạnh trong nitơ lỏng. Sau khi lấy tinh ra khỏi bình bảo quản
lạnh, để cân bằng ngoài không khí 10 giây sau đó đưa vào bể ổn nhiệt 37oC
trong 20 giây.____________________________________________________45
Cho tinh trùng vào một ống vô trùng chứa M199 pH 7,8 sau đó ly tâm 2000
vòng/phút trong 2 phút.____________________________________________45
Sau khi ly tâm xong, hút bỏ phần dịch nổi bên trên và hòa tan đều phần cặn trong
1ml M199 pH 7,8 trộn đều bằng cách dùng pipet vô trùng hút đẩy nhẹ
nhàng.__________________________________________________________45
Sau khi đã pha loãng chuyển tinh trùng vào đĩa vô trùng sau đó phủ dầu khoáng
và ủ trong tủ nuôi cấy ở điều kiện 38,5oC, độ ẩm 95% và 5% CO2 để chuẩn
bị cho thụ tinh.___________________________________________________45
2.3.8 Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm.............................................................45
2.3.9 Phương pháp nuôi hợp tử trong ống nghiệm.......................................................46
2.3.10 Phương pháp đánh giá chất lượng phôi.............................................................47
2.3.11 Phương pháp bảo quản lạnh phôi......................................................................47
2.3.12 Phương pháp giải đông phôi và nuôi cấy phôi sau giải đông............................48
2.3.13 Phương pháp xử lý số liệu.................................................................................49
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................................50
3.1 Kết quả thu buồng trứng và tế bào trứng________________________________50
3.2 Kết quả đánh giá, phân loại trứng trước khi nuôi cấy in vitro_______________52

3.3 Kết quả nuôi trứng thành thục________________________________________55
3.4 Kết quả thụ tinh và tạo phôi___________________________________________58
3.4.1 Kết quả thụ tinh của trứng sau khi nuôi in vitro..................................................58
3.4.2 Kết quả tạo phôi từ trứng sau khi nuôi và thụ tinh in vitro.................................60
3.5 Đánh giá thử nghiệm cất giữ lạnh______________________________________63
3.5.1 Chất lượng phôi trước đông lạnh........................................................................63
3.5.2 Đánh giá chất lượng phôi sau giải đông..............................................................64
3.6 Kết quả thu dịch nang trứng__________________________________________67
KẾT LUẬN.........................................................................................................................70
KIẾN NGHỊ.......................................................................................................................71
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................72

MỤC LỤC HÌNH
Trang

Nguyễn Thị Hương

iv


Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Thị Hương

Khoa Sinh học

v


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

MỞ ĐẦU
Trong suốt quá trình phát triển, loài người đã khai phá thiên nhiên, thuần
hóa và chọn lọc rất nhiều loại động vật, giữ lại những giống loài tốt, có lợi cho
mình và loại thải những giống không hiệu quả. Trong các loài động vật được
thuần hóa, lợn là loài động vật gắn bó với con người từ thuở hoang sơ cho tới tận
bây giờ. Điều này đã nói lên sự cần thiết và vai trò to lớn của lợn trong đời sống
con người. Vai trò đầu tiên phải kể đến của lợn đó là nguồn thực phẩm cần thiết,
có giá trị dinh dưỡng cao cho con người. Theo Harris và cs (1956) thì cứ 100g
thịt lợn nạc có 367 Kcal và 22 g protein [18]. Trong xã hội hiện đại, lợn còn
đóng vai trò vô cùng quan trọng trong nghiên cứu khoa học. Theo các nhà
nghiên cứu giải phẫu và mô học thì cấu tạo phôi thai của lợn và người có sự
tương đồng rất lớn [3]. Do đó các nhà nghiên cứu đã sử dụng phôi thai lợn để
tiến hành nghiên cứu về cấu tạo, sự phát triển và các cơ chế hoạt động của phôi
thai người. Còn theo các nhà dinh dưỡng học thì nhu cầu dinh dưỡng và tỷ lệ các
chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của lợn rất gần với con người. Vì vậy
mà lợn đã được sử dụng làm đối tượng để tiến hành các thí nghiệm về dinh
dưỡng cho con người. Cùng với sự phát triển của khoa học thì lợn càng giữ
nhiều vai trò quan trọng trong việc phục vụ sức khỏe con người. Các nhà nghiên
cứu đã sử dụng công nghệ cấy ghép, chuyển gen để cải thiện sức kháng bệnh tật,
thay đổi đặc tính sinh trưởng, sử dụng lợn như một bộ máy sinh học để tạo ra
nguồn dược liệu quí.
Đặc biệt trong y học, các nhà khoa học đã tạo ra mô hình trên lợn nhiều loại
bệnh khác nhau của người bằng cách đưa gen gây bệnh của người vào hệ gen của
lợn. Mặt khác, cũng bằng cách này, các nhà khoa học còn cố gắng tạo ra cho các bộ
phận để chuyển những con lợn chuyển gen của người với khả năng tương đồng cao
về mặt miễn dịch nhằm mục đích cấy ghép các cơ quan cho người bệnh. Kỹ thuật
tạo phôi lợn kết hợp với cấy truyền phôi lợn là những kỹ thuật bắt buộc cần có để

điều đó trở thành hiện thực. Vì các lý do này mà việc nghiên cứu phôi và tạo phôi
Nguyễn Thị Hương

1


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

lợn in vitro đã được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm tới.
Xét trên phương diện công nghệ sinh học và chăn nuôi, kỹ thuật tạo phôi lợn
in vitro là kỹ thuật quan trọng góp phần nâng cao hiệu quả chăn nuôi bằng cách tạo
ra số lượng phôi lớn có chất lượng tốt và khả năng sống cao. Ngoài ra, trứng sau khi
nuôi thành thục còn có thể phục vụ cho nhiều nghiên cứu cơ bản khác như: ICSI,
cloning, chuyển gen, đông lạnh phôi lợn để bảo tồn các giống quí hiếm, những cá
thể giống tốt trong ngân hàng gen [42], [43], [71]. So với việc tạo phôi lợn bằng
phương pháp in vivo thì việc tạo phôi lợn bằng phương pháp in vitro có một số ưu
điểm vượt trội. Đó là phương pháp này giảm thiểu việc sử dụng lợn mẹ trong các
thí nghiệm vì có thể sử dụng các buồng trứng được thu từ các lò mổ với số lượng rất
lớn. Cùng với đó, số lượng trứng thu được đạt tiêu chuẩn để làm thí nghiệm cũng
rất nhiều vì vậy chi phí để tạo phôi bằng phương pháp này sẽ giảm đi đáng kể.
Ngoài ra, trước thực tế một số giống lợn quí hiếm của nước ta đang nằm
trước nguy cơ tuyệt chủng thì nhiệm vụ bảo vệ đa dạng sinh học các giống lợn là rất
cần thiết. Viện Chăn nuôi đã thực hiện bảo tồn bằng phương pháp in situ nhưng
phương pháp này rất tốn kém không an toàn so với phương pháp bảo tồn giống lợn
bằng phôi đông lạnh.
Với những mục đích như trên, đề tài “ Nghiên cứu tạo phôi lợn bằng
phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm” của chúng tôi đặt ra ba nội dung để giải
quyết là: Thử nghiệm tạo phôi in vitro từ trứng lợn thu từ lò mổ; Thử nghiệm cải

thiện chất lượng phôi lợn bằng cách bổ sung dịch nang buồng trứng lợn vào môi
trường nuôi thành thục trứng; Thử nghiệm bảo quản phôi lợn thụ tinh in vitro bằng
đông lạnh trong ni tơ lỏng.

Nguyễn Thị Hương

2


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

TỔNG QUAN

Chương 1.
1.1 Buồng trứng và sự tạo trứng

1.1.1 Cấu tạo và hoạt động của buồng trứng
Buồng trứng là cơ quan tạo giao tử cái (noãn bào - tế bào trứng) ở động vật
nói chung cũng như ở các gia súc nói riêng. Không giống như tinh hoàn, buồng
trứng nằm trong xoang bụng, sau thận, dưới đỉnh và trước khung xương chậu.
Buồng trứng ở mỗi con cái gồm một buồng trứng bên trái và một buồng trứng bên
phải. Chức năng của buồng trứng là: tạo ra tế bào trứng và sản xuất hormone sinh
dục cái [33]. Buồng trứng tạo trứng thành thục theo một tần suất nhất định. Ở lợn,
mỗi chu kỳ rụng trứng tạo ra khoảng 10-20 tế bào trứng mỗi. Tế bào trứng nằm
trong các nang trứng. Các hormone được buồng trứng tiết ra là estrogen và
progesterone. Estrogen được tiết ra từ các nang trứng còn progesterone được tiết
ra từ các thể vàng, cả hai hormone này đều thuộc nhóm hormone steroid.
Estrogen có chức năng: kích thích sự phát triển của các cơ quan sinh dục cái; tăng

hành vi liên quan đến động dục như chịu đực; kích thích sự phát triển của tuyến
vú; kích thích các đặc tính sinh dục của lợn nái. Progesterone có vai trò quan trọng
trong việc chuẩn bị tử cung để cho phôi làm tổ; ngăn cản sự thành thục của các tế
bào trứng khác trong quá trình mang thai; duy trì sự có chửa và kết hợp với
estrogen và các chất khác để kích thích sự phát triển của tuyến vú.
Buồng trứng gồm có 2 miền, miền tủy bên trong và miền vỏ bên ngoài.
Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết. Miền vỏ gồm các tế bào
và các lớp mô có nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng và hormone. Lớp ngoài cùng của
miền vỏ buồng trứng là biểu mô bề mặt. Biểu mô bề mặt là một lớp tế bào lập
phương bao phủ toàn bộ bề mặt của buồng trứng. Ngay bên dưới biểu mô bề mặt
là một lớp mỏng, dày đặc các mô liên kết, gọi là áo trắng buồng trứng. Phía dưới
áo trắng buồng trứng là nhu mô, được coi là lớp chức năng bởi vì nó chứa nang
trứng và các tế bào phân tiết hormone buồng trứng.

Nguyễn Thị Hương

3


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

Người ta cho rằng tất cả nang nguyên thủy (primordial follice) được hình
thành trước khi con con vật cái được sinh ra. Số lượng lớn nhất được tìm thấy ở
bào thai lợn từ ngày 50-90 sau khi thụ thai. Nang nguyên thủy là một tế bào sinh
dục được bao quanh bởi một lớp nang tế bào dẹt có cấu trúc dạng biểu mô.
Chúng nằm trong nhu mô và thường quan sát được theo nhóm gọi là ổ trứng
(egg nest) [55]

Hình 1: Sơ đồ sự phát triển của nang trứng
Trong buồng trứng ở cá thể đã thành thục thường xuyên có các nang trứng ở
trạng thái phát triển và thành thục. Giải phẫu miền vỏ của một gia súc cái có hoạt
động sinh sản sẽ cho thấy các giai đoạn thành thục này (Hình 1). Ngoài các nang
trứng nguyên thủy còn có các nang trứng sơ cấp hay còn gọi là nang bậc 1. Đây là
những nang có dấu hiệu phát triển từ nang nguyên thủy với lớp tế bào nang bắt đầu
biến đổi thành dạng hình trụ vuông hay chữ nhật. Sau giai đoạn nang sơ cấp là sự
tăng sinh các tế bào hạt bao quanh một tế bào trứng có khả năng phát triển. Khi số
lượng tế bào hạt tăng thành 2 rồi thành nhiều lớp thì nang trứng giai đoạn này được

Nguyễn Thị Hương

4


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

gọi là nang thứ cấp (nang bậc II - secondary follicle). Trong quá trình phát triển, các
tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hình thành các xoang giữa
các nang bào. Các xoang nhỏ lớn dần cùng sự phát triển của trứng và sau đó thì kết
hợp làm một. Khi một xoang đã được hình thành thì nang đó được gọi là nang bậc
III (tertiary follicle) hay còn gọi là nang có hốc. Nang bậc III thành thục khi quan
sát thấy nó chứa đầy dịch và nổi lên bề mặt buồng trứng và được gọi là nang Graaf.
Dịch trong nang bậc III được gọi là dịch nang trứng. Đây là một dịch nhớt giàu
hormone sinh sản steroid. Nhiều hormone sinh sản khác cũng như các yếu tố không
phải hormone giúp điều hoà chức năng buồng trứng cũng đã được tìm thấy trong
dịch nang trứng.

Hình 2: Cấu tạo bên trong nang Graaf
Có nhiều lớp tế bào trong nang Graaf được coi là có chức năng quan trọng
(Hình 2). Bao Graaf thường có kích thước rất lớn, ở lợn đường kính bao Graaf
trước khi vỡ vào khoảng 8-12 mm, nó đội cả màng trắng và biểu mô phủ buồng
trứng lồi hẳn lên trên mặt buồng trứng. Bao Graaf là một cái xoang chứa dịch
với rất nhiều enzym, hormon, AMP vòng và các phân tử khác, các nang bào bị
đẩy ra ngoại vi, hình thành một lớp bọc xoang dày khoảng 5-6 lớp tế bào hạt.
Noãn bào có vài lớp nang bào bao quanh được gọi là vành phóng xạ sẽ bao

Nguyễn Thị Hương

5


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

quanh trứng khi trứng rụng và cả khi trứng di chuyển trong ống dẫn trứng. Khối
gồm noãn bào và vành phóng xạ lúc này bị đẩy về một phía của xoang và chỉ nối
với thành nang bởi một dải vài lớp tế bào gọi là cuống mang trứng, đặc điểm này
tạo thuận lợi cho sự tách noãn khỏi thành nang trứng. Màng sáng lúc này đã rất
dày và rõ. Noãn bào cực đại tuy có kích thước rất nhỏ so với nang trứng (khoảng
150 µm so với 15-20mm). Nhân noãn bào rất lớn còn gọi là bóng phôi, nó có thể
nằm ở giữa noãn bào hay lệch về một phía hoặc sát với màng tế bào. Vỏ nang
trứng gồm 2 lớp cũng rất rõ và dày. Trước khi trứng rụng một vài giờ, nhân noãn
bào di chuyển tới sát màng nhân và tiếp tục lần phân chia giảm nhiễm và kết
thúc trước khi trứng rụng. Kết quả của lần phân chia này là từ noãn bào 1 cho ra
2 tế bào con đơn bội (n kép) đồng đều về số nhiễm sắc thể nhưng lại không chia
đều tế bào chất. Một tế bào chiếm gần như toàn bộ tế bào chất trở thành noãn

bào 2 có tác dụng sinh dục. Một tế bào nhỏ chỉ có rất ít tế bào chất không có tác
dụng sinh dục gọi là thể cực 1. Cả hai tế bào đều nằm bên trong màng sáng.
Quá trình biến đổi của nang trứng đã làm nang trứng tăng thể tích lên khoảng
500 lần, kích thước noãn bào cũng tăng lên nhưng không nhiều như nang trứng,
ở người nó tăng từ 10µm ở nang nguyên thuỷ lên 80µm ở bao Graaf.
Dấu hiệu trước khi rụng trứng là xuất hiện một vùng màu nhạt ở cực nang
trứng phần lồi lên mặt buồng trứng do sự ngừng lưu thông máu cho các mao
mạch nằm ở lớp vỏ trong của nang trứng chín. Ở vùng này, lớp biểu mô phủ
buồng trứng, lớp màng trắng của buồng trứng và vỏ ngoài của nang trứng gián
đoạn để lộ ra lớp vỏ trong. Khi nang trứng vỡ ra, noãn bào 2 cùng với vòng tia
tách khỏi thành hốc lọt qua chỗ vỡ ra ngoài, đồng thời dịch nang trứng trong hốc
nang trứng trào ra ngoài. Hiện tượng này gọi là sự rụng trứng. Phần nang trứng
còn lại gọi là thể vàng (hoàng thể). Tuỳ thuộc trứng có làm tổ trong niêm mạc tử
cung hay không mà thể vàng tiếp tục phát triển thành thể vàng có mang hoặc tiêu
giảm và biến mất [29].

Nguyễn Thị Hương

6


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

1.1.2 Cấu tạo và sự hình thành tế bào trứng
Cấu tạo tế bào trứng
Trứng lợn có hình cầu, đường kính của trứng chín không kể màng sáng dao
động trong khoảng 120-170 μm (Hình 3). Trứng là loại tế bào có kích thước lớn
nhất trong cơ thể, được biệt hóa cao độ và có khả năng kết hợp với tinh trùng để

hình thành hợp tử. Hợp tử này sẽ phát triển thành một cơ thể mới.

Hình 3. Tế bào trứng lợn
thành thục
Lớp vỏ tế bào trứng lợn
được gọi là màng sáng, nó do chính tế bào trứng tạo nên. Màng sáng là dạng
chuyên hoá cao của khuôn ngoại bào (glicocalix) của tế bào trứng, là sự mở rộng
các glycoprotein màng từ màng sinh chất. Nó bao trực tiếp quanh màng bào tương.
Lớp này khá dày, nó bảo vệ trứng khỏi các tác động cơ học có hại. Nó còn có tính
đặc hiệu loài và ngăn cản không cho các tinh trùng khác loài xâm nhập. Ở nhiều
loài động vật, màng trứng thứ nhất thường có những vi lỗ xuyên qua gọi là noãn
khổng (micropile). Trên màng trứng noãn khổng có vị trí khác nhau tuỳ loài, ở cực
trên, cực dưới hoặc ở nơi trứng dính vào buồng trứng. Xuyên qua màng sáng có các
chồi tế bào chất xuất phát từ các nang bào để tăng cường mối liên kết và trao đổi
chất với tế bào trứng. Ở động vật có vú còn có các tế bào nang bao quanh trứng gọi
là vành phóng xạ có chức năng nuôi dưỡng trứng trong thời gian trứng đã giải
phóng khỏi buồng trứng, tinh trùng phải chui qua được các lớp tế bào này mới thụ
tinh được cho trứng.
Bên trong tế bào chất có một lớp mỏng tế bào chất ngoại vi (khoảng 5µm),
ngay dưới màng trứng có cấu tạo đặc biệt có độ quánh lớn hơn lớp tế bào chất bên
trong gọi là lớp vỏ. Trong lớp này cũng chứa nhiều phân tử actin dạng cầu, trong
quá trình thụ tinh, các phân tử này sẽ trùng hợp lại hình thành những sợi actin dài

Nguyễn Thị Hương

7


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

gọi là vi sợi (microfilament) rất cần thiết cho quá trình phân bào và tạo ra vi lông
nhung trên bề mặt trứng giúp cho tinh trùng xâm nhập vào trứng. Lớp này còn có
rất nhiều hạt vỏ được bao bọc bởi màng sinh chất có cấu trúc tương đồng với thể
đỉnh (cũng được tạo ra từ phức hệ Golgi) có chứa rất nhiều enzym. Trong hạt vỏ
còn chứa các phân tử mucopolisaccarit, là một loại glycoprotein dính và phân tử
hyalin. Các enzym và mucoprotein sẽ được hoạt hoá để ngăn không cho các tinh
trùng khác chui vào sau khi đã có một tinh trùng xâm nhập vào trứng [29].
Sự hình thành tế bào trứng
Sự hình thành và thành thục (chín) của giao tử phải hoàn thành ở cả con
đực và con cái trước khi quá trình sinh sản bắt đầu. Sự hình thành và thành thục
giao tử cái bắt đầu trước khi gia súc được sinh ra. Quá trình này được biểu diễn
qua Hình 4. Tế bào trứng đầu tiên được gọi là noãn nguyên bào (oogonium).
Noãn nguyên bào xuất hiện từ phần kéo dài của túi noãn hoàng (yolk sac), hình
thành từ hậu tràng của phôi (hindgut of embryo). Sau khi hình thành, noãn
nguyên bào tăng sinh bằng sự phân chia nguyên nhiễm xảy ra trong nhu mô của
buồng trứng đang trong quá trình hình thành ở phôi. Sự tăng sinh này dừng lại
trước khi gia súc được sinh ra, do đó buồng trứng gia súc ở thời điểm sinh ra có
một số lượng noãn bào (oocyte) nhất định có khả năng phát triển. Noãn bào bước
vào tiền kỳ phân bào giảm nhiễm thứ nhất ở thời kỳ bào thai và với phân bào
giảm nhiễm bị dừng lại ở cuối tiền kỳ ngay sau khi sinh. Noãn bào ở trạng thái
dừng phân chia này được gọi dictyate oocyte.

Nguyễn Thị Hương

8


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

Hình 4. Quá trình hình thành giao tử cái
Ở giai đoạn sau khi sinh ra và lúc trưởng thành (sau khi gia súc thành thục
giới tính), sự phát triển và thành thục tế bào trứng thường xảy ra theo chu kỳ.
Tuy nhiên, trước khi gia súc thành thục về tính không có tế bào trứng nào chín

Nguyễn Thị Hương

9


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

hoàn toàn. Những tế bào trứng bắt đầu phát triển trước và sau khi thành thục về
tính bị thoái hoá và mất khả năng phát triển. Người ta ước tính rằng dưới 1% tế
bào trứng đạt đến giai đoạn thành thục và giải phóng ra lúc rụng trứng.
Sự phát triển và thành thục của tế bào trứng sẽ tiếp tục theo chu kỳ sau khi
thành thục về tính. Trong các sóng noãn nang phát triển trong mỗi chu kỳ động
dục, một số tế bào trứng cùng với nang trứng nguyên thủy bắt đầu phát triển và
thành thục, trong khi các tế bào trứng khác vẫn ở trạng thái dừng phát triển. Tuy
nhiên, ở giai đoạn thể vàng thoái hoá, tế bào trứng ở các nang trội đạt đến sự
thành thục và được giải phóng ra thông qua sự rụng trứng vào đường sinh dục
(ống dẫn trứng) để thụ tinh.Ở bò, cừu, dê và ngựa thường chỉ có 1 tế bào trứng
chín rụng trong khi đó ở lợn có khoảng 10-25 tế bào trứng có thể thành thục và
được giải phóng ra lúc rụng trứng.
Tiếp sau giai đoạn nghỉ phân bào giảm nhiễm, sự thành thục được phục

hồi cùng với sự phát triển của tế bào trứng và sự hình thành màng trong suốt bao
quanh tế bào trứng. Sự phát triển của tế bào trứng thường đi cùng với sự phát
triển của nang trứng. FSH kích thích sự tăng sinh của tế bào hạt bao quanh tế bào
trứng, cùng với sự phát triển của nang sơ cấp thành nang thứ cấp. Sự kích thích
tiếp tục của FSH làm cho tế bào hạt tiếp tục tăng sinh và hình thành xoang.
Trong giai đoạn phát triển này, nang trứng hay tế bào trứng đã đạt tới khả năng
rụng trứng trở thành nang trội. Khi nang trội và các nang có xoang khác tiết đủ
oestrogen, có một đợt LH tăng lên trước rụng trứng. Nồng độ LH cao đã xâm
nhập vào dịch nang trứng và giải phóng tế bào trứng thoát khỏi trạng thái dừng
phát triển. Sau đó, quá trình phân bào giảm nhiễm I tiếp tục cho đến khi hoàn
thành việc hình thành thể cực thứ nhất. Sản phẩm của phân bào giảm nhiễm thứ
nhất là tế bào trứng thứ cấp và thể cực thứ nhất nằm giữa màng tế bào chất và
màng trong suốt. Với sự phân chia này, số nhiễm sắc thể trong tế bào trứng thay
đổi từ trạng thái nhị bội (2n) xuống đơn bội (n). Tế bào trứng thứ cấp giữ lại toàn
bộ nguyên sinh chất và một nửa vật chất nhân (nhiễm sắc thể) của tế bào trứng

Nguyễn Thị Hương

10


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

nguyên thuỷ. Một nửa vật chất nhân khác được đẩy ra ngoài thành thể cực thứ
nhất. Sự phân bào giảm nhiễm thứ nhất được hoàn thành ngay trước rụng trứng ở
bò, lợn, cừu và ngay sau khi rụng trứng ở ngựa.
Sự phân bào giảm nhiễm lần thứ II (giảm nhiễm II) bắt đầu ngay sau khi
hoàn thành sự phân chia lần thứ nhất. Sự phân chia này dừng ở trung kỳ II. Sự

dừng phân bào giảm nhiễm lần II sẽ được giải phóng và phân bào giảm nhiễm II
bắt đầu trở lại trong quá trình thụ tinh. Với quá trình thụ tinh, sản phẩm của phân
bào giảm nhiễm II là hợp tử (trứng đã được thụ tinh) và thể cực thứ 2. Tế bào
trứng thực sự không bao giờ tồn tại ở bò, lợn, cừu hay ngựa, mà chỉ ở dạng
chuyển tiếp. Tế bào trứng thực sự có thể là sản phẩm của sự phân chia thành thục
thứ 2 nếu sự gphân chia được hoàn thành trước khi thụ tinh.
1.2 Cấu tạo và hoạt động của ống dẫn trứng
Ống dẫn trứng (hay còn gọi là ống fallop) là một cặp ống xoắn kéo dài từ
buồng trứng xuốn chóp sừng tử cung. Chức năng của chúng là vận chuyển tinh
trùng và tế bào trứng. Ngoài ra, ống dẫn trứng còn là nơi xảy ra quá trình thụ tinh
và phân chia của hợp tử ở giai đoạn đầu. Về mô học, ống dẫn trứng gồm 3 lớp tế
bào khác biệt nhau. Lớp ngoài cùng, chủ yếu là mô liên kết, là màng thanh mạc.
Lớp giữa, gồm cả các sợi cơ vòng và cơ dọc, gọi là áo cơ. Lớp trong cùng, gồm
có các tế bào biểu mô phân tiết gọi là áo niêm mạc.

Lớp cơ

Nếp niêm
mạc
Mạch máu

Nguyễn Thị Hương

11


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

Hình 5. Cấu tạo ống dẫn trứng
Ống dẫn trứng là một ống cơ (Hình 5) được chia thành 3 vùng chức năng:
phần hình phễu ở gần buồng trứng còn gọi là vùng vân mao giúp thu trứng khi rụng
trứng. Có nhiều nếp gấp trong niêm mạc phần hình phễu, và hầu hết các tế bào niêm
mạc có lông chuyển (cilia). Phần phình ống là đoạn giữa, có chiều dài bằng một nửa
ống dẫn trứng và có đường kính 3-5mm. Niêm mạc phần phình ống có 20-40 nếp
gấp dọc, điều đó giúp tăng diện tích bề mặt của phần phình ống. Đa số các tế bào
niêm mạc phần phình ống là lông chuyển, nhưng cũng có một số tế bào phân tiết có
mặt ở đây. Tác động của lông chuyển là hỗ trợ cho sự di chuyển của tế bào trứng
xuống phía phình ống. Phần phình ống nối với phần eo ống ở chỗ nối phình ống eo ống. Vị trí này rất khó phân biệt bằng giải phẫu và được mô tả là một cấu trúc
sinh lý mà ở đó tế bào trứng được giữ lại một thời gian trong lúc di chuyển. Sự thụ
tinh xảy ra ở chỗ tiếp giáp này. Phần eo ống thường nhỏ hơn phần phình ống, nó có
đường kính từ 0,5-1mm. Nó còn được phân biệt bởi lớp cơ trơn dày hơn so với
phần phình ống và có 4 - 8 nếp gấp niêm mạc. Tỷ lệ tế bào phân tiết cao hơn tế bào
lông chuyển ở phần eo ống. Phần eo ống liên quan tới việc vận chuyển tinh trùng có
hoạt lực tới vị trí thụ tinh và loại bỏ những tinh trùng đã chết. Eo ống nối với đầu
sừng tử cung. Nhìn chung, ống dẫn trứng co bóp do kích thích của oestrogen và bị
ức chế bởi progesterone.
Ống dẫn trứng động vật có vú cung cấp một môi trường phù hợp cho sự di
chuyển và chín muồi của các giao tử, thụ tinh và sự phát triển của phôi ở giai đoạn
đầu. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để nhận biết những sản phẩm do ống dẫn
trứng tiết ra, từ đó có thể giúp cho việc phát triển các môi trường phù hợp để nuôi
phôi. Môi trường do ống dẫn trứng tạo ra đóng một vai trò quan trọng trong việc
thúc đẩy thụ tinh và sự phát triển của phôi ở giai đoạn đầu. Phân tích sinh hoá dịch
ống dẫn trứng có thể giúp nhận biết được những thành phần phù hợp cho môi
trường nuôi phôi ở giai đoạn đầu in-vitro. Rõ ràng là mối quan hệ giữa phôi - ống
dẫn trứng đặc biệt quan trọng và những hệ thống nuôi trong ống nghiệm nào nhận

Nguyễn Thị Hương

12


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

biết được mối quan hệ này đều thành công trong việc nuôi phôi trong ống nghiệm.
Dựa trên sự hiểu biết về tiểu môi trường ống dẫn trứng người ta đã tổng hợp nên
các môi trường in vitro để tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm. [55].

Nguyễn Thị Hương

13


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

1.3 Cấu tạo tinh trùng và quá trình hình thành tinh trùng

1.3.1 Cấu tạo tinh trùng
Tinh trùng được hình thành từ ống sinh tinh trong tinh hoàn. Tinh trùng có
kích thước nhỏ hơn trứng rất nhiều lần (50-60 μm), nó có cấu tạo phù hợp với
chức năng vận chuyển. Tinh trùng mang bộ gen đơn bội và được gọi là giao tử
đực. Cấu tạo chung của tinh trùng gồm ba phần: phần đầu, phần giữa (phần cổ)
và phần đuôi.
Phần đầu: Đầu tinh trùng lợn có hình quả lê dẹp, dài 8 μm, rộng 4 μm và
dẹp 1 μm. Đầu chứa hai bộ phận chính là nhân và thể đỉnh. Nhân tinh trùng chứa

nhiễm sắc thể ở trạng thái đậm đặc trong một thể tích rất nhỏ, chiếm 65% thể
tích phần đầu. Thể đỉnh là một cái bao kín dẹp lại thành cái mũ đội lên nhần đầu
của nhân. Thể đỉnh được hình thành từ thể golgi. Thể đỉnh chứa các emzyme
thủy phân và nhiều proteaza nhằm giúp tinh trùng xâm nhập vào trứng trong quá
trình thụ tinh.
Phần cổ: Sau đầu có một phần rất ngắn, hơi eo lại được gọi là cổ. Trong tế
bào chất phần cổ chứa hai trung thể, một nằm sát nhân và một nằm xa nhân
Phần đuôi: Chia làm ba đoạn: đoạn giữa, đoạn chính và đoạn cuối. Đoạn
giữa nằm ngay sau cổ, có thiết diện lớn nhất phần đuôi, gồm có sợi trục và tế bào
chất bao quanh. Trong tế bào chất chứa rất nhiều ty thể, các ty thể xếp theo hình
xoắn ốc xung quanh sợi trục của đuôi. Đây được gọi là trạm năng lượng của tinh
trùng phục vụ mục đích sản sinh nhiều năng lượng cho tinh trùng hoạt động
trong quá trình thụ tinh.
Đoạn chính: có cấu trúc tương tự đoạn giữa, và là phần dài nhất của đuôi
và có vai trò ổn định các yếu tố co rút của đuôi.
Đoạn cuối: đây là đoạn ngắn nhất, chỉ gồm sợi trục và màng bao quanh,
phần này chịu trách nhiệm cho sự chuyển động.

1.3.2 Quá trình sinh tinh
Tinh trùng được phát sinh trong tuyến sinh dục đực hay còn gọi là tinh

Nguyễn Thị Hương

14


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

hoàn. Quá trình sinh tinh được biểu diễn trong Hình 6.

Hình 6. Sơ đồ quá trình hình thành giao tử đực
Các tinh nguyên bào thường nằm sát màng đáy, có kích thước 10 μm và
thường có nhân tròn hoặc elip. Tinh nguyên bào thế hệ cuối cùng chuyển sang giai
Nguyễn Thị Hương

15


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

đoạn tăng trưởng, lớn lên gọi là tinh bào 1. Các tinh bào 1 đang ở giai đoạn tiền kỳ
của giảm phân 1. Kết thúc giảm phân 1, tinh bào 1 phân chia tạo ra hai tế bào nhỏ
hơn gọi là tinh bào 2. Ngay lập tức, các tinh bào 2 phân chia thành hai tinh tử.
Để trở thành tinh trùng, tinh tử phải trải qua một loạt quá trình biến đổi
phức tạp gồm: biến đổi trung thể, biến đổi nhân và hình thành thể đỉnh [1].
Biến đổi trung thể: ở kỳ cuối giảm phân 2, trung thể tách ra làm hai hạt nhỏ
và di chuyển về phía sau, trung thể gần nằm trong hố lõm của màng nhân, trung thể
xa phát ra sợi trục. Sợi trục mọc dài kéo theo các biến đổi khác của tinh tử.
Sự biến đổi nhân: Nhân mất nước, nhỏ lại, trở nên đồng nhất và bắt màu đậm
Sự hình thành thể đỉnh: Trong tinh tử, hệ thống golgi gồm một hệ thống
các bể chứa dẹp và nhiều không bào. Các không bào lớn dần, trong chúng xuất
hiện các thể đặc biệt gọi là hạt tiền thể đỉnh. Các không bào này hợp thành một
không bào duy nhất với một hạt thể đỉnh duy nhất. Không bào ép sát vào phần
đầu của nhân, dẹp lại hình thành thể đỉnh.
Cùng với sự bé đi của nhân và hình thành thể đỉnh, sợi trục mọc dài dần
và bào tương di chuyển theo trục về phía đuôi, ty thể tập trung vào phía đầu gần

nhân của sợi trục. Khi tinh trùng hình thành có một giọt bào tương lớn gồm có
bào tương, một phần ty thể và phần còn lại của bộ máy golgi bám vào đuôi tinh
trùng. Đây là cầu nối các tinh trùng non với nhau [1].
1.4 Sự thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm (IVM) và vai trò của môi
trường
Sau khi đạt tới kích thước cực đại, noãn bào chuyển sang một giai đoạn
mới là giai đoạn thành thục. Giai đoạn thành thục diễn ra dưới sự điều khiển của
cơ chế thần kinh – hormone trong tương tác noãn bào với các tế bào xung quanh.
Sự chuyển sang thời kỳ thành thục được thực hiện dưới ảnh hưởng của các
hormone kích dục tố của thùy trước tuyến yên. Dưới tác động của kích dục tố,
biểu mô nang sản sinh ra progesteron, chất này đi vào noãn bào và kích thích quá
trình thành thục.

Nguyễn Thị Hương

16


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

1.4.1 Sự thành thục của tế bào trứng

Túi mầm
nhân

Màng sáng

Hình 7. Trứng đang trong quá trình thành thục nhân

Sự thành thục nhân
Trong giai đoạn thành thục nhân, nhân có kích thước rất lớn và thường
được gọi là bóng phôi (Hình 7). Sau khi tiếp nhận kích dục tố, nhân nhanh chóng
thực hiện tiếp các kỳ còn lại của Meiose. Các lưỡng trị hội tụ trở lại và qua giai
đoạn cuối cùng của tiền kỳ. Đồng thời nhân di chuyển tới bề mặt trứng ở cực

Nguyễn Thị Hương

17


Luận văn Thạc sỹ

Khoa Sinh học

động vật, sau đó màng nhân vỡ ra, dịch nhân hòa với tế bào chất, các lưỡng trị
sắp xếp thành tấm trung kỳ của thoi phân chia. Thoi phân chia trực giao với bề
mặt trứng, các lưỡng trị phân chia ở hậu kỳ và sau mạt kỳ hình thành nên hai tế
bào. Một tế bào gồm nhân và rất ít nguyên sinh chất, tách khỏi noãn bào nằm
ngoài màng sinh chất, trong màng noãn hoàng, được gọi là thể cực một. Tế bào
thứ hai lớn hơn rất nhiều và được gọi là noãn bào bậc hai. Trong noãn bào bậc
hai, nhiễm sắc thể lập tức phân bố thành tấm trung kỳ của lần phân chia thứ hai.
Dưới tác động của nhân tố ức chế giảm phân, quá trình giảm phân sẽ dừng lại ở
trung kỳ của giảm phân 2 và sự thụ tinh sẽ giải tỏa ức chế này để trứng tiếp tục
phát triển [1]. Trong tự nhiên, thời gian trải qua các giai đoạn tan biến túi mầm,
metaphse I và metaphase II của các loài khác nhau là khác nhau. Ở bò thời gian
từ khi tan biến túi mầm đến giai đoạn metaphase II là 19 giờ còn ở lợn là 38 giờ.
Do đó để nuôi thành thục trứng lợn đòi hỏi khoảng thời gian là 38-44 giờ.
Sự thành thục tế bào chất
Đồng thời với các diễn biến của nhân, tế bào chất cũng có nhiều biến đổi.

Trứng trở nên mọng nước, tăng áp suất nội bào, giảm tính thấm, lớp tế bào chất
bề mặt trở nên có tính co giãn và xuất hiện khả năng phân chia. Một trong những
sự kiện quan trọng đánh dấu sự thành thục của trứng là sự vỡ màng nhân. Màng
nhân bị vỡ dưới ảnh hưởng của tác nhân phá hủy màng nhân. Tác nhân này xuất
hiện trong noãn bào dưới ảnh hưởng của progesteron và không có sự tham gia
của nhân. Sau khi vỡ màng nhân các tác nhân hội tụ nhiễm sắc thể, tác nhân
trương nhân tinh trùng, tác nhân phân bào xuất hiện để chuẩn bị cho các yếu tố
cần thiết cho quá trình thụ tinh, hình thành và phát triển phôi. [1]

1.4.2 Vai trò của tế bào nang
Tế bào nang là những tế bào soma, xếp thành nhiều lớp bao quanh trứng.
Các tế bào nang đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự thành thục trứng, trong
quá trình nuôi cùng trứng, các tế bào nang phát triển, và tăng sinh mạnh, chúng
cung cấp một số yếu tố cần thiết cho quá trình ức chế giảm phân và thành thục tế
bào chất của trứng qua đó nâng cao khả năng phát triển của trứng [61], [71]. Một
Nguyễn Thị Hương

18