Đề tài Tìm và phân loại các ncRNA có trong vi khuẩn Bacillus Subtilis

GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

Đề tài: Tìm và phân loại các ncRNA
có trong vi khuẩn Bacillus Subtilis.

SVTH:

Trang 1


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

Lý do chọn đề tài
Từ những năm 60, khái niệm ncRNA (non coding RNA) đã lần đầu tiên được biết
đến. Trong những năm năm gần đây, với sự phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học,
việc nghiên cứu ncRNA đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể. Hơn thế nữa, sự ra đời của
tin sinh học đã trở thành công cụ đắc lực để hỗ trợ. Tuy nhiên, lĩnh vực này còn khá mới
mẻ, cần được đầu tư nghiên cứu. Do đó tôi chọn đề tài:” Tìm và phân loại các ncRNA có
trong vi khuẩn Bacillus Subtilis”.

SVTH:

Trang 2


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

Mục lục
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NON-CODING RNA CÓ TRONG VI KHUẨN ..... 5
1.1 .

Khái niệm về non-coding RNA có trong vi khuẩn: ........................................ 5

1.1.1.

Khái niệm: ................................................................................................ 5

1.1.2.

Lịch sử nghiên cứu: .................................................................................. 5

1.1.3.

Chức năng:................................................................................................ 6

1.2 .

Một số loại non-coding RNA điển hình và chức năng sinh học: .................... 9

1.2.1.

Long non-coding RNA (long ncRNA): .................................................... 9

1.2.1.1. Khái niệm: ............................................................................................ 9
1.2.1.2. Chức năng:............................................................................................ 9

1.2.2.

Small interfering RNA: .......................................................................... 10

1.2.2.1. Khái niệm và quá trình sinh tổng hợp: .................................................. 10
1.2.2.2. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của siRNA: ............................................. 11
1.2.2.3. Chức năng: ............................................................................................. 11
1.2.3.

Small ncRNA: ........................................................................................ 12

1.2.3.1 . Khái niệm:............................................................................................. 12
1.2.3.2 . Một số loại small RNA và chức năng của chúng: ................................ 12
CHƯƠNG 2: PHÂN LOẠI, CHỨC NĂNG SINH HỌC CỦA CÁC ncRNA CÓ
TRONG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS .................................................................... 17
2.1.

SVTH:

Tổng quan về vi khuẩn Bacillus Subtilis: .................................................. 17

2.1.1.

Lịch sử phát triển: ................................................................................... 17

2.1.2.

Đặc điểm phân loại: ................................................................................ 17

2.1.3.

Đặc điểm phân bố: .................................................................................. 17

Trang 3


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

2.1.4.

Đặc điểm hình thái: ................................................................................ 18

2.1.5.

Đặc điểm sinh hóa: ................................................................................. 18

2.1.6.

Vai trò của vi khuẩn B.Subtilis .............................................................. 19

Phân loại và chức năng của một số small RNA trong vi khuẩn

2.2.

Bacillus.Subtilis: ........................................................................................................... 20
2.2.1.

RNA 6S: ................................................................................................. 21

2.2.1.1. bsrA: ................................................................................................... 22
2.2.1.2. bsrB: ................................................................................................... 23
2.2.2.

tmRNA (ssrA): ....................................................................................... 25

2.2.3.

RNA tế bào chất (small cytoplasmatic RNA): ....................................... 28

2.2.4.

RNA điều hòa: ........................................................................................ 29

2.2.4.1. FsrA: ................................................................................................... 29
2.2.4.2. RatA:................................................................................................... 32
2.2.4.3. sr1: ...................................................................................................... 33
2.2.5.
2.3.

Các small RNA chưa rõ chức năng: ....................................................... 35

Phương pháp phát hiện ncRNA: ............................................................... 37

2.3.1.

Phương pháp thực nghiệm:..................................................................... 37

2.3.2.

Phương pháp tin sinh học: ...................................................................... 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO:.................................................................................... 39
CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 40
3.1.

3.1.1.

Trên thế giới: .......................................................................................... 40

3.1.2.

Ở Việt Nam: ........................................................................................... 40

3.1.
SVTH:

Tình hình phát triển: ...................................................................................... 40

Hướng nghiên cứu trong tương lai: ........................................................... 40
Trang 4


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NON-CODING RNA CÓ
TRONG VI KHUẨN

1.1 . Khái niệm về non-coding RNA có trong vi khuẩn:
1.1.1. Khái niệm:
Non-coding RNA (ncRNA) là phân tử RNA chức năng, mà nó không mã hóa protein.
Nó còn được gọi là RNA không mã hóa protein ( non-protein-coding RNA, npcRNA),
non-messenger RNA(nmRNA), RNA chức năng (fucntional- RNA, fRNA). Giới hạn
small RNA(sRNAs) thường được sử dụng cho ncRNA ngắn của vi khuẩn. Trình tự DNA
mà từ đó một ncRNA được phiên mã thường được gọi là một gen RNA.
- Non-coding RNA bao gồm những RNA có tính phổ biến cao và rất quan trọng, như
là RNA thông tin (tRNA), RNA ribosome (rRNA), cũng như snoRNA, miRNA, siRNA,
piRNA và long ncRNA, bao gồm ví dụ như là gen Xist( X- inactive specific transcript)gen X bất hoạt phiên mã đặc biệt và Hotair. Số ncRNA mã hóa trong hệ gen của người là
chưa được biết rõ. Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây trong lĩnh vực transcriptomic và
tin sinh học đã cho thấy sự tồn tại của hàng ngàn ncRNA. Kể từ khi nhiều ncRNA mới
được phát hiện tuy nhiên vẫn chưa được kiểm chứng về chức năng, và cũng có thể không
có chức năng.
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu:
RNA lần đầu tiên được phát hiện bởi Friedrich Miescher vào năm 1868, và đến năm
1939, RNA được cho là có liên quan đến tổng hợp protein. Hai thập kỉ sau đó, Francis
Crick đã phát hiện ra RNA là thành phần trung gian dịch mã. Ông ta đã lí luận rằng, RNA
thích hợp hơn cho cặp base với phiên mã một mRNA hơn là một polypeptide tinh khiết.
Các ncRNA đầu tiên được mô tả là một tRNA alanine được tìm thấy trong nấm men bánh
mì, cấu trúc của nó đã được công bố vào năm 1965. Để sản xuất một mẫu tinh khiết

SVTH:

Trang 5


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

alanine tRNA, Robert W. Holley đã sử dụng 140kg của nấm men bánh mì thương mại để
cung cấp cho 1g tinh khiết tRNA để phân tích.
- Tiếp theo đó ribosome RNA được khám phá, tiếp theo đó là URNA trong đầu những
năm 1980. Tiếp theo đó là sự phát hiện ra các ncRNA mới với snoRNAs, Xist, CRISPR,
và nhiều nữa. Những bổ sung gần đây đáng chú ý bao gồm riboswitches và miRNA. Việc
phát hiện ra cơ chế can thiệp có liên quan đến RNA giúp Craig C. Mello và Andrew Fire
về sau giành được giải Nobel sinh lý học hay y học năm 2006.
1.1.3. Chức năng:
Non-coding RNA thuộc về một vài nhóm và có liên quan đến nhiều quá trình của tế
bào. Những ncRNA có vai trò quan trọng trung tâm, được bảo tồn trên tất cả hoặc hầu
hết sự sống của tế bào cho đến những ncRNA đặc biệt hơn về một hoặc một vài loài có
quan hệ chặt chẽ với nhau. Nhiều ncRNA được bảo tồn được cho là hóa thạch phân tử
hoặc các di tích từ kỉ Luka hoặc thế giới RNA.
Các vai trò chính của ncRNA:
Vai trò của ncRNA trong quá trình dịch mã:
 Nhiều ncRNA trong số ncRNA được bảo tồn rất cần thiết và có liên quan phức
tạp đến quá trình dịch mã.
 Ribosome có các hạt ribonucleoprotein( là các rRNA liên kết với protein còn gọi
là tiền ribosome). Qua quá trình trưởng thành các ribonucleoprotein này chuyển
từ nhân con ra tế bào chất và tạo thành ribosome ở đó) là nơi diễn ra dịch mã
trong tế bào.
 Ribosome bao gồm hơn 60% là rRNA. Trong sinh vật nhân sơ chúng được tạo
thành từ 3 ncRNA còn trong sinh vật nhân thực là 4 ncRNA. Các rRNA đóng vai
trò là chất xúc tác cho quá trình dịch mã.
 Một tập hợp khác của ncRNA, tRNA từ các phân tử trung gian giữa mRNA và
protein. snoRNA hộp H/ACA và hộp C/D là các ncRNA được tìm thấy ở trong vi
khuẩn cổ và sinh vật nhân thực.

SVTH:

Trang 6


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

 Enzyme Rnase MPN(là enzyme hoạt hóa ribonucleoprotein với 2 vai trò khác
nhau ở sinh vật nhân thực) bị hạn chế trong sinh vật nhân thực. Cả 2 nhóm của
ncRNA đều liên quan đến sự phát triển của rRNA.
 Ở vi khuẩn, RNA-vận chuyển-thông tin (transfer-messenger-RNA,tmRNA) là
một RNP có liên quan đến giải cứu ribosome bị trì trệ (rescuing stalled
ribosomes)
ncRNA trong việc cắt intron và nối exon (RNA splicing): hầu như chỉ xảy ra ở sinh
vật nhân thực.
ncRNA trong việc điều hòa gen: Sự biểu hiện của hàng ngàn gen được điều hòa bởi
ncRNAs. Sự điều hòa này có thể xảy ra ở trong (cis) hoặc ở ngoài (trans):
 Tác động ngoại sinh (trans-acting):
 Ở sinh vật nhân thực: mức độ điều hòa biểu hiện gen cao hơn. Một microRNA
có thể làm giảm mức độ biểu hiện của hàng trăm gen. Cơ chế mà các phân tử
miRNA trưởng thành hoạt động là thông qua một phần bổ sung cho một hoặc
nhiều phân tử mRNA. Chức năng chính của miRNA là giảm điều hòa biểu
hiện gen. ncRNA Rnase P cũng đã được chứng minh là ảnh hưởng đến sự biểu
hiện gen.
 Trong cơ thể người, Rnase P là cần thiết cho sự sao chép bình thường và hiệu
quả ncRNAs khác nhau bởi RNA polymeraseIII. Chúng bao gồm gen tRNA,
rRNA 5S , RNA SRP , và U6 snRNA.
 ncRNAs ở vi khuẩn, RNA 6S liên kết đặc biệt với RNA polymerase
holoenzyme chứa yếu tố đặc trưng sigma70. Sự tương tác này ức chế sự biểu

hiện từ một promoter phụ thuộc vào sigma70 trong pha tĩnh.
 Một ncRNAs khác ở vi khuẩn, OxyS RNA kiềm hãm bằng cách liên kết với
chuỗi Shine-Dalgarno. OxyS RNA được tạo ra để đáp ứng với stress oxy hóa
trong Escherichia coli.
 Một nghiên cứu gần đây đã cho thấy rằng chỉ có hoạt động phiên mã của trình
tự ncRNA có thể có ảnh hưởng đến biểu hiện gen. Enzyme dịch mã RNA

SVTH:

Trang 7


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

polymerase II của ncRNA là cần thiết để tái tạo nhiễm sắc chất trong
Schizosaccharomyces pombe(nấm).
 Tác động nội sinh (cis-acting):
 Một số ncRNA được gắn vào đầu 5’UTRs của gen mã hóa protein (protein
coding gen) và ảnh hưởng tới sự biểu hiện của chúng theo các con đường khác
nhau. Chẳng hạn như một riboswitches có thể ràng buộc trực tiếp lên một
phân tử mục tiêu nhỏ, sự ràng buộc của mục tiêu ảnh hưởng đến sự hoạt động
của gen.
 Trình tự RNA dẫn đầu (RNA leader) được tìm thấy ở đầu nguồn của gen đầu tiên
của operons sinh tổng hợp amino acid. Những nguyên tố RNA này được hình
thành từ một trong hai cấu trúc có thể có trong vùng mã hóa các chuỗi peptide rất
ngắn là giàu acid amino- sản phẩm cuối cùng của operon. Một cấu trúc kết thúc
(terminator) hình thành khi có sự dư thừa acid amin điều hòa và sự di chuyển của
ribosome lên sự dẫn đầu phiên mã không bị cản trở. Khi có một sự thiếu hụt của

tRNA charged của acid amin điều hòa, ribosome translating các peptide dẫn đầu
và các cấu trúc antitermination hình thành. Điều này cho phép RNA polymerase
sao chép lại (transcribe) các operon. Các RNA dẫn đầu được biết đến là operon
histidine, operon Leucine, operon Threonine và operon Tryptophan.
ncRNA và cấu trục nhiễm sắc thể: chỉ có ở sinh vật nhân thực.
ncRNA và hệ gen phòng thủ (defense): CRISPR (Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats) được lặp lại tìm thấy trong DNA của nhiều vi khuẩn và vi
khuẩn cổ. Sự lặp đi lặp lại được ngăn cách bởi các miếng đệm (spacers) có chiều dài
tương tự. Nó đã được chứng minh rằng những miếng đệm này có thể được bắt nguồn từ
thể thực khuẩn và sau đó giúp bảo vệ các tế bào khỏi bị nhiễm trùng.

SVTH:

Trang 8


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

1.2 . Một số loại non-coding RNA điển hình và chức năng sinh học:
1.2.1. Long non-coding RNA (long ncRNA):
1.2.1.1. Khái niệm:
Long non-coding RNA là nhóm rộng lớn bao gồm các RNA không mã hóa protein có
kích thước lớn hơn 200nucleotide.
Chức năng của long non-coding RNA như là phân tử scaffold điều hòa sửa đổi
histone và ảnh hưởng đến các chương trình ngoại di truyền (epigenetic) trong sản phẩm
của quá trình phiên mã (transcriptome). Biểu hiện rối loạn điều hòa (dysregulated) của
long non-coding RNA đã cho thấy là có liên quan đến một loạt các khuyết tật (defect)
trong sự phát triển và các bệnh (diseases).

Nghiên cứu các mô hình biểu hiện của long non-coding RNA sẽ là một phương pháp
rất quan trọng trong sự hiểu biết những vai trò của chúng trong nhiều nhiều hệ thống mô
hình. (Epigenetic được hiểu là những thay đổi có tính hợp tác và có thể di truyền được về
mặt kiểu hình do các quá trình không liên quan đến thay đổi trình tự DNA.)
1.2.1.2. Chức năng:
Chưa có thông tin cụ thể (trong vi khuẩn).
Sự điều hòa sao mã trên S. cerevisiae, vi khuẩn và thực vật cũng được thực hiện bởi
lnc RNA antisense. Như thế, nấm men, vi khuẩn, thực vật và con người cùng chung một
cơ chế điều khiển sao mã bởi các lncRNA không phụ thuộc siRNA.
Ngày nay, nhiều chức năng của long non-coding RNA đã được tìm thấy như là truyền
tín hiệu(signaling), phục vụ như mồi nhử phân tử (molecullar decoys), hoặc dẫn hướng
(guiding) phức hợp ribonucleoproein đến vùng nhiễm sắc đặc biệt và cũng tham gia như
là scaffolds trong việc tái tạo (formation) phức hợp.
Truyền tín hiệu: sự phiên mã của một vài lnRNA nhất định rất nhanh và trong một
khoảng thời gian cụ thể. Sự biểu hiện của chúng có thể có trong phản ứng với các kích

SVTH:

Trang 9


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

thích (stimuli), chẳng hạn như căng thẳng tế bào và nhiệt độ. Vì vậy, lncRNA có thể dùng
như tín hiệu phân tử và có thể hoạt động như là phân tử đánh dấu (markers) of
functionally significant biological events.
Các loại mồi phân tử hoạt động sẽ diễn ra khi những lncRNA cụ thể được sao chép,
sau đó gắn vào yếu tố protein. Mồi nhử lncRNA có thể là các yếu tố protein “sponge”như

là các yếu tố phiên mã và bộ điều chỉnh (modifiers) nhiễm sắc chất. Điều này dẫn đến
những thay đổi lớn trong sản phẩm sau phiên mã của tế bào.
Các lncRNA có thể dẫn hướng phân tử bằng localizing phức hợp ribonucleoprotein
đặc biệt tới ác mục tiêu nhiễm sắc chất cụ thể. Hoạt động này có thể gây ra những thay
đổi trong biểu hiện gen cis (các gen lân cận) hoặc trans (các gen nằm xa gen) mà không
thể được dự đoán dễ dàng bởi chính trình tự lncRNA của nó.
Lắp ráp các phức hợp protein phức tạp có thể được hỗ trợ bởi các lnRNA, các yếu tố
liên kết với nhau để hình thành các chức năng mới. Một số lncRNA sở hữu các domain
khác nhau liên kết các yếu tố protein khác nhau hoàn toàn, có thể ảnh hưởng đến kích
hoạt hoặc kìm hãm phiên mã.
1.2.2. Small interfering RNA:
1.2.2.1. Khái niệm và quá trình sinh tổng hợp:
Small interfering RNA (RNA can thiệp kích thước nhỏ) là các RNA nhỏ được hình
thành từ các RNA sợi đôi. Là một lớp của các phân tử RNA sợi đôi, chiều dài khoảng 2025 nucleotide. siRNA đóng nhiều vai trò, nhưng nhất của nó đáng chú ý là trong con
đường can thiệp RNA (RNAi), nơi mà nó can thiệp với các biểu hiện của các gen cụ thể
với trình tự nucleotide bổ sung.
Ở sinh vật nhân thực: Hiện tượng RNAi lần đầu tiên được khám phá trên giun tròn
Caenorhabditis Elegans do câm lặng gen bởi RNA sợi đôi. Theo sau đó những nghiên
cứu của Guo và Kemphues đã phát hiện ra RNA sợi đối mã (antisense) và sợi mã hóa
(sense) có hiệu quả ức chế biểu hiện gen như nhau. Sau đó Fire và cộng sự đã tập trung
dùng antisenseRNA để ức chế biểu hiện gen. Hiệu quả tác động của hỗn hợp sense hay
antisense ít nhất gấp 10 lần so với dùng antisense hay sense.Các siRNA được chuyển vào

SVTH:

Trang 10


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

trong tế bào để nghiên cứu vai trò của protein trong việc đáp ứng phá hủy DNA và điều
khiển chu kỳ tế bào, sự chuyển hóa chu kỳ tế bào cơ bản, tín hiệu và sự sắp xếp của
chúng trong suốt quá trình phân bào, vận chuyển qua màng, sao mã và sự methyl hóa
DNA. Những phân tử này có thể dùng để phân biệt gen chủ với những gen khác. Trong
các tế bào của cơ thể người, sự kích hoạt gen được thấy đầu tiên là các siRNA kích hoạt
các promoter của E-cadhehin, yếu tố tăng trưởng mạch nội mô (VEFG) và p21 làm tăng
mức độ mRNA và protein của các gen này.Trong cơ thể, con đường siRNA đóng vai trò
quan trọng trong việc hạn chế lây nhiễm virus vì nó làm bất ổn các RNA được tạo ra
trong chu kỳ sống.
Ở vi khuẩn: Chưa rõ
1.2.2.2. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của siRNA:
siRNA có một cấu trúc được xác định rõ ràng, bao gồm một RNA mạch kép ngắn
(có khoảng 19-21 nucleotic) với đầu 5’-P và 3’-OH và có 2 nucleotide nhô ra.

Hình Cấu trúc siRNA
Cơ chế: Chưa có cơ chế cụ thể ở vi khuẩn.
1.2.2.3. Chức năng:
siRNA có nhiều chức năng như:
-

Chức năng vận chuyển thông tin di truyền.

-

Chức năng tham gia tổng hợp và vận chuyển Protein.

-

Chức năng hoàn thiện các phân tử RNA.

SVTH:

Trang 11


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

-

Ngoài ra RNA còn có các chức năng quan trọng khác.

-

Một chức năng mới được phát hiện đó là khả năng điều hoà biểu hiện gen của RNA.

1.2.3. Small ncRNA:
1.2.3.1 . Khái niệm:
Small RNA là dạng phân tử RNA nhỏ (chứa từ 50-250 nucleotide) không mã hóa.
Chúng có cấu trúc bậc cao và chứa một vài thân vòng. Việc xác định các sRNA có thể
dựa trên hai phương pháp phân tích trên máy tính lẫn kết quả thực nghiệm. sRNA có thể
gắn với protein đích hoặc chỉnh sửa chức năng của protein liên kết, hoặc gắn với mRNA
đích và điều hòa biểu hiện của gen.
1.2.3.2 . Một số loại small RNA và chức năng của chúng:
sRNAs có thể liên kết với protein mục tiêu, và thay đổi chức năng của protein ràng
buộc, hoặc liên kết với mRNA mục tiêu và điều hòa biểu hiện gen. Có thể được phân loại
sRNAs antisense như cis-encoded sRNAs, nơi có sự chồng chéo giữa các antisense Srna

và gen mục tiêu, và xuyên mã hóa sRNAs, và trans-encoded RNA, nơi antisense sRNA
gen riêng biệt từ các gen mục tiêu.
Tương tác với gen housekeeping: Trong số các mục tiêu của sRNAs là một số gen
housekeeping . Các RNA 6S liên kết với RNA polymerase và điều hòa phiên mã, tmRNA
có chức năng trong tổng hợp protein, bao gồm cả việc tái chế ribosome bị đình trệ, 4.5S
RNA điều chỉnh nhận biết tín hiệu (SRP), đó là cần thiết cho sự bài tiết của các protein và
RNase P có liên quan đến trưởng thành tRNA. Phản ứng lại với những căng thẳng: Nhiều
sRNAs được tham gia trong việc điều hòa phản ứng stress. Chúng được thể hiện trong
điều kiện căng thẳng như các cú sốc lạnh, bắt đầu phản ứng SOS.
Phản ứng lại với những căng thẳng: Nhiều sRNAs được tham gia trong việc điều hòa
phản ứng stress. Chúng được thể hiện trong điều kiện căng thẳng như các cú sốc lạnh, bắt
đầu phản ứng SOS.
 Điều hòa của RpoS: Gen RpoS trong E. coli mã hóa 38 sigma, một yếu tố sigma
điều hòa phản ứng stress và hoạt động như một bộ điều chỉnh phiên mã các gen

SVTH:

Trang 12


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

có liên quan trong việc thích ứng tế bào. Có ít nhất ba sRNAs, DsrA, RprA và
OxyS, điều chỉnh dịch mã RpoS. DsrA và RprA cả hai kích hoạt RpoS dịch bởi
cơ sở ghép nối với một khu vực trong chuỗi dẫn đầu (leader sequence) của
mRNA RpoS nà làm gián đoạn việc hình thành một cấu trúc kẹp tóc cái mà giải
phóng lên vùng tải ribosome. OxyS ức chế dịch mã RpoS. Cấp độ DsrA được
tăng lên để đáp ứng với nhiệt độ thấp và áp lực thẩm thấu và cấp độ RprA được

tăng lên để đáp ứng với stress thẩm thấu và căng thẳng bề mặt tế bào, do đó tăng
mức độ RpoS để đáp ứng với những điều kiện. Mức độ OxyS được tăng lên để
đáp ứng với stress oxy hóa, do đó ức chế RpoS dưới những điều kiện này.


Sự điều hòa Protein ngoài màng: Màng ngoài của vi khuẩn gram âm hoạt động
như một rào cản để ngăn chặn sự xâm nhập của các độc tố vào tế bào vi khuẩn, và
đóng một vai trò quan trọng trong sự tồn tại của tế bào vi khuẩn trong môi trường
đa dạng. các protein màng bên ngoài (OMPs) bao gồm Porins và adhesins. Nhiều
sRNAs điều hoà biểu hiện của OMPs. OmpC Porins và OmpF là chịu trách nhiệm
cho việc vận chuyển các chất chuyển hóa và các chất độc. Các biểu hiện của
OmpC và OmpF được điều hòa bởi MicC sRNAs và MicF để đáp ứng với điều
kiện căng thẳng. Protein màng ngoài OmpA neo màng ngoài lớp murein của
không gian periplasmic. Biểu hiện của nó là điều hòa ức chế(downregulated)
trong giai đoạn tĩnh của các tế bào tăng trưởng. Trong E. coli Srna mica làm cạn
kiệt OmpA, Srna Vibrio cholerae VrrA kìm hãm tổng hợp của OmpA trong phản
ứng với stress.

Điều hòa các gen độc lực(Virulence): Ở Salmonella InvR RNA kìm hãm tổng hợp
protein OmpD lớn bên ngoài màng, và Srna SgrS điều hòa sự biểu hiện của protein phản
ứng tiết SopD. Ở Staphylococcus aureus, RNAIII điều chỉnh một số gen tham gia vào
việc sản xuất độc tố và enzyme và các protein bề mặt tế bào. Các sRNAs FasX và Pel ở
Streptococcus pyogenes được mã hóa trong các locus liên quan đến độc tính. Pel RNA
kích hoạt tổng hợp các protein bề mặt liên kết và tiết protein.
Dò tìm mật độ tới hạn (Quorum sensing):

SVTH:

Trang 13

GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

 Quorum Sensing là cơ chế vi khuẩn điều khiển gene liên quan đến mật độ quần
thể bằng cách tạo ra (Producing), phóng thích (Releasing) và dò tìm (Detecting)
các phân tử tín hiệu; là tiến trình các tế bào vi khuẩn thông tin liên lạc với nhau
bằng các phân tử tín hiệu. Nhờ Quorum Sensing, vi khuẩn có thể kích hoạt sự
hoạt động của các gen mã hóa các tiến trình như: tạo màng sinh học, tạo bào tử,
phát sáng, sản xuất kháng sinh, tiết ra các độc tố v.v…
 Ở các loài vi khuẩn Vibrio, sRNAs Qrr và protein chaperone Hfq có liên quan
đến các quy định của quorum sensing. sRNAs Qrr điều chỉnh sự biểu hiện của
mRNA quorum sensing tổng thể điều chỉnh(master regulators) LuxR và HapR.

SVTH:

Trang 14


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

TÀI LIỆU THAM KHẢO:
1. />2. ?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CCEQ
FjAA&url=http%3A%2F%2Fen.wikipedia.org%2Fwiki%2FNoncoding_RNA&ei=QlaRUOuAMq-uiQfGnICYBA&usg=AFQjCNHEIcSieAx8p5VSGYTdp5-m8Xu8A
3. />4. />5. />6. />7. www.projects.mfpl.ac.at/bacrnas/php/fileadmin/user_upload/EMBO_report
s/EMBO_report.pdf
8. />1&ved=0CCMQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.biolcell.org%2Fboc%

2F101%2F0117%2F1010117.pdf&ei=xVeRUKCUDY2TiAeLkIHACQ&u
sg=AFQjCNETXbM3PRTFKzx4zHJ-ABSAA_8jvw
9. />3&ved=0CDgQFjAC&url=http%3A%2F%2Fnar.oxfordjournals.org%2Fco
ntent%2F34%2F9%2F2791.abstract&ei=xVeRUKCUDY2TiAeLkIHACQ
&usg=AFQjCNEuB7kEEtvvtytva8EPDLHoXWXaBw
10. />7&cad=rja&ved=0CFkQFjAG&url=http%3A%2F%2Fwww.cs.washington
.edu%2Feducation%2Fcourses%2Fcse586%2F10au%2Fsmall_RNA_revie
w.pdf&ei=xVeRUKCUDY2TiAeLkIHACQ&usg=AFQjCNEUp6xQDzxzl
Z_rcKcmcP0ghGZ3mw
11. />18&ved=0CFkQFjAHOAo&url=http%3A%2F%2Fgenesdev.cshlp.org%2F

SVTH:

Trang 15


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

content%2F21%2F23%2F3123.full.pdf&ei=jVmRUPy3GqeviQeZxoCwD
Q&usg=AFQjCNEYuA0PKBlBlluMMpIflOBP5JdOIQ
12. />13. />14. />15. />16. />17. />long_non-coding_rna_%28lncrna%29

SVTH:

Trang 16


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

CHƯƠNG 2: PHÂN LOẠI, CHỨC NĂNG SINH HỌC
CỦA CÁC ncRNA CÓ TRONG VI KHUẨN BACILLUS
SUBTILIS
Tổng quan về vi khuẩn Bacillus Subtilis:

2.1.

2.1.1. Lịch sử phát triển:
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ
chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho
các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi.
Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 -1957, khi Henrry và các cộng sự tách
được ch subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng
viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn
này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm.
2.1.2. Đặc điểm phân loại:
Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus Subtilis thuộc:
-

Bộ: Eubacteriales.

-

Họ: Bacillaceae.

-

Giống: Bacillus.

-

Loài: Bacillus Subtilis.

2.1.3. Đặc điểm phân bố:
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được
phân bố hầu hết trong tự nhiên.
Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100
triệu CFU/g.

SVTH:

Trang 17


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis
rất hiếm.
Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus
subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996).
2.1.4. Đặc điểm hình thái:
Bacillus subtilis

là

trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn,

G+,kích thước

0,5 - 0,8m x 1,5 – 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn.
Vi khuẩn có khả năng di động,có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế
bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 m. Bào tử phát triển bằng cách
nảy mầm do sự nứt củabào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử
ngoại, tia phóngxạ (Tô Minh Châu, 2000).

Hình 2.1: Vi khuẩ n Bacillus Subtilis.
2.1.5. Đặc điểm sinh hóa:

SVTH:

Trang 18


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, saccharose, xylose, arabinosse Indol
(-), nitrate (-), VP (+), H2S(-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrate (+),
di động (+), hiếu khí (+).
Dung huyết: một số dòng gây dung huyết ở dạng trên thạch máu ngựa và thỏ do tác
động của hemolysine.

Bảng 2.1.

Kết quả các phản ứng sinh hóa của B.Subtilis.

2.1.6. Vai trò của vi khuẩn B.Subtilis
B.Subtilis I đã được chứng minh là có tuân theo các kĩ thuật di truyền, và nó đã trở
nên được chấp nhận rộng rãi như một sinh vật mô hình cho các nghiên cứu ở phòng thí
nghiệm, đặc biệt là hình thành bào tử - là một ví dụ đơn giản về sự khác biệt của tế bào.
Nó cũng có rất nhiều roi, cái mà giúp cho B.Subtilis di chuyển nhanh được trong chất
lỏng. B.Suubtilis được biết đến như một “mô hình” (model) trong phòng thí nghiệm. Nó

SVTH:

Trang 19


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

thường được sử dụng thường xuyên như vi khuẩn Gram dương Escherichia coli, một loại
vi khuẩn Gram âm được nghiên cứu rộng rãi.
Các chủng của B.Subtilis được phân lập từ thiên nhiên hoang dại (wild-type) thường
khó khăn để làm việc so với các chủng phòng thí nghiệm đã trải qua quá trình đột biến và
chọn lựa. Những chủng này thường đã được cải thiện khả năng chuyển đổi ( hấp thu
(uptake) và tích hợp (integration) DNA của môi trường), tăng trưởng, và mất khả năng
cần thiết trong tự nhiên (loss of abilities needed in the wild).
Như một sinh vật mô hình, B.Subtilis thường được sử dụng trong các nghiên cứu
phòng thí nghiệm hướng vào phát hiện các tính chất cơ bản và đặc điểm của vi khuẩn
Gram dương hình thành bào tử. Trong đó, các nguyên tắc và cơ chế cơ bản hình thành
endospore bền (durable endospore) đã được suy luận từ các nghiên cứu hình thành bào tử
trong B.Subtilis.

Tính ổn định cao của B.Subtilis trong điều kiện khắc nghiệt của môi trường làm cho
nó trở thành một trong những đại diện hoàn hảo cho các ứng dụng chế phẩm sinh học,
trong thực phẩm, đồ uống, khử trùng:
 B.Subtilis có khả năng sinh nhiều enzyme, trong đó, quan trọng nhất là amylase
và protease – 2 loại enzyme thuộc hệ thống men tiêu hóa.
 B.Subtilis có khả năng sinh tổng hợp một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế
sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn
Gram(+) và cả Gram(-) và nấm gây bệnh.
 B.Subtilis thường tồn tại trong sản phẩm ở trạng thái bào tử, nhờ vậy khi uống
vào dạ dày nó không bị acid cũng như các men tiêu hóa ở dịch vị phá hủy. Ở ruột,
bào tử nảy mầm và phát triển thành thể hoạt động giúp cân bằng hệ vi sinh vật có
ích trong đường ruột, cải thiện hệ thống tiêu hóa, nhất là sau khi sử dụng kháng
sinh kéo dài.
2.2.

Phân loại và chức năng của một số small RNA trong vi khuẩn Bacillus.Subtilis:

SVTH:

Trang 20


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

Những nghiên cứu có hệ thống đã được thực hiện ở một số vi khuẩn gram dương. Gần
đây, đã có 24 small RNA ở vi khuẩn Bacillus Subtilis đã được biết đến bằng cả phương
pháp thực nghiệm lẫn phương pháp tin sinh học.
Bảng tóm tắt:

Đặc điểm
Nhóm
ncRNA

Tên

bsrA, bsrB

6S

tmRNA

ssrA

RNA tế bào
chất

scr

RNA
hòa

điều

ncRNA chưa
biết
chức
năng

FsrA,

sr1

Chức năng

Chưa rõ
tmRNA cho phép
giải phóng và tái
sinh các ribosome bị
kẹt lại tại đầu 3’ do
các mRNA bị lỗi
Giúp đỡ trong việc
nhận và ràng buộc
một ribosome vào
lưới nội chất để sản
xuất protein bài tiết

RatA,

bsrC, bsrD,
bsrE,
bsrF,
bsrH, bsrG,
bsrL, csfG,
surA, surC

Phương pháp
phát hiện
Northern blot, dự
đoán bằng máy
tính.

Western blot,
2D-page

Chưa rõ

Điều hòa các phản
ứng.

Northern blot, tin
sinh học, 2Dpage, RT-PCR,
overexpression,
western
blot,EMSA.

Chưa rõ

Chủ yếu là tin
sinh học

2.2.1. RNA 6S:
Trong quá trình nghiên cứu chủ đề về các RNA mới trong vi khuẩn Bacillus Subtilis
bằng phương pháp so sánh bộ gen của vùng intergenic, các nhà khoa học đã khám phá ra
2 small RNA không mã hóa mới là BsrA và BsrB.

SVTH:

Trang 21


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

2.2.1.1. bsrA:
RNA BS190 là RNA được phân lập từ vi khuẩn Bacillus Subtilis. RNA này được gọi
là BS190 vì chiều dài ở thể trưởng thành của nó là 190nt và gen mã hóa nó nằm trên vùng
intergenic AspA-yrvM của bộ gen Bacillus Subtilis. Tiền thân của RNA BS190 là RNA
BS201. RNA BS201 được mã hóa bởi vùng intergenic aspA-yrvM và dần dần được xử lí
thành các RNA 190nt bằng cách loại bỏ 11nt ở đầu 5’.
Trình tự và cơ chế:

Hình 2.2: Bản đồ và trình tự vùng intergenic aspS-yrvM.
Sơ đồ đại diện các tổ chức của khu vực quanh gen RNA BS190nt (BsrA). Hộp màu
đen đậm là gen mã hóa cho RNA BS 190 BsrA(Solid box, the gene encoding BS190

SVTH:

Trang 22


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

RNA (bsrA)). Hộp có kẻ caro thể hiện thượng nguồn (upstream) và hạ nguồn
(downstream) của mảnh DNA được sử dụng để xây dựng các chủng đột biến vô nghĩa
(null-mutant). Việc đánh số của cơ sở dữ liệu hệ gen Bacilus Subtilis.
(A) Trình tự của một đoạn DNA0.9kb bao gồm gen BsrA. Vùng mã hóa RNA tương
ứng với vị trí nucleotide 18815-18626 trong cơ sở dữ liệu hệ gen Bacillus Subtilis. Khu
vực mã hóa cho RNA BS 201 được gạch chân. Nucleotide ở đầu 5’ kết thúc của RNA

BS190 được xác định bằng mồi mở rộng (prime extension). Những hộp được bao bọc bởi
nét chấm đứt là hai ORFs tương đương với một phần của gen AspS và yrvM. Trình tự
của promoter có thể (-35 và -10) ở phía trước của RNA BS190 được đi kèm theo hộp.
Các phương pháp phát hiện: Northern blot, dự đoán bằng máy tính.
Chức năng: chưa rõ.
2.2.1.2. bsrB:
Các nhà khoa học đã phân lập và mô tả đặc điểm một RNA mới của Bacillus Subtilis.
Họ đó là phân tử RNA BS203, tên gọi này xuất phát từ chiều dài của nó ở thể trưởng
thành là 203nucleotide. Nó nằm tại vùng intergenic yocl-yocJ trên hệ gen Bacillus
Subtilis. Bằng phương pháp Northern blot đã cho thấy rằng nó được phiên mã trong nuôi
cấy tế bào sinh dưỡng (vegetative growing cell) và số lượng BS203 giảm ở giữa giai đoạn
sinh dưỡng. Việc dự đoán cấu trúc thứ cấp của RNA BS203 dưới sự hỗ trợ của máy tính
đã cho thấy đặc điểm của ba cấu trúc stem-loop. Mặc dù biểu hiện hoạt động trong suốt
giai đoạn sinh dưỡng, sự tăng lên của đột biến bất hoạt gen (knockout mutant) không bị
ảnh hưởng bởi sự suy giảm của RNA BS203.

SVTH:

Trang 23


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

Hình 2.3: Bản đồ gen BsrB và dự đoán cấu trúc thứ cấp của RNA BS203.
(A) Sơ đồ đại diện các tổ chức của khu vực quanh gen RNA BS203. Hộp màu đen đậm là
gen mã hóa cho RNA BS203, BsrB.
(B) Trình tự promoter của BsrB. Nơi bắt đầu phiên mã được gạch chân.
(C) Cấu trúc bậc hai dự đoán của RNA BS203.

-

Chức năng: chưa rõ.

SVTH:

Trang 24


GVHD: Đặng Đức Long

Đồ án công nghệ 1

2.2.2. tmRNA (ssrA):
ssrA là một dạng lai độc đáo giữa tRNA và mRNA và nó được biểu hiện ở tất cả các
loài vi khuẩn. Trong mọi tế bào, protein được tổng hợp nhờ bởi các ribosome theo một cơ
chế giải mã chính xác các thông tin di truuyền. Bình thường quá trình giải mã này sẽ
được bắt đầu với việc nhận biết các trình tự khởi đầu và kết thúc với việc nhận biết các
trình tự kết thúc. Một khi trong quá trình dịch mã nó gặp phải một mRNA bị lỗi, bị đứt
đoạn do đó thiếu mất mã kết thúc ở đầu 3’. Giống như chiếc xe đang đi vào ngõ cụt,
ribosome sẽ bị kẹt lại và các polypeptide chưa hoàn thành sẽ có thể tạo nên độc tính đối
với tế bào. May thay, ở vi khuẩn vấn đề này đã được giải quyết bởi sự can thiệp của
tmRNA (transfer-messenger RNA) hay còn có tên gọi khác là 10 SaRNA (SSrA).
tmRNA mang cả hai chức năng, nó vừa mang chức năng của tRNA vừa mang chức năng
của mRNA. tmRNA có 2 vùng domian chức năng vùng giống như nhánh acceptor của
tRNAAla (bao gồm acceptor và T stem-loop) với đầu 3’CCA có thể gắn với acid amin
Alanin và một phần nữa được gọi là khung đọc mở ngắn (short ORF).

Hình 2.4: Ribosome bị trì hoãn bởi mRNA lỗi và vai trò của tmRNA

SVTH:

Trang 25