Tách dòng và giải trình tự gene mã hóa enzyme feruloyl coa synthase từ chủng amycolatopsis sp HR104

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

HOÀNG THỊ THÚY QUỲNH
Tên đề tài:
TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TÌNH TỰ GENE MÃ HÓA ENZYME
FERULOYL-COA SYNTHASE TỪ CHỦNG Amycolatopsis sp. HR104

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2011-2015

Thái Nguyên, 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

----------------------

HOÀNG THỊ THÚY QUỲNH
Tên đề tài:
TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TÌNH TỰ GENE MÃ HÓA ENZYME
FERULOYL-COA SYNTHASE TỪ CHỦNG Amycolatopsis sp. HR104

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2011-2015

Giảng viên hƣớng dẫn

1 TS. DƢƠNG VĂN CƢỜNG
2 PGS.TS. NGÔ XUÂN BÌNH

Thái Nguyên, 2015

i

LỜI CÁM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được đề tài này với sự nỗ lực
của bản thân, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo và động viên của thầy cô,
bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành khóa luận :
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo PGS.TS Ngô Xuân Bình và T.s
Dương Văn Cường, người đã tận tình giúp đỡ hướng dẫn chỉ bảo, giải đáp thắc mắc và
củng cố kiến thức cho tôi.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Chị Ma Thị Trang, cán bộ phòng thí
nghiệm công nghệ gene - Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên đã trực tiếp chỉ
bảo kĩ năng làm việc, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Công
nghệ thực phẩm đã đào tạo và dạy dỗ tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh
động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn trong quá trình học tập nghiên cứu.

Thái Nguyên, ngày

tháng 06 năm 2015

Sinh viên

Hoàng Thị Thúy Quỳnh


ii

BẢNG DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Đặc điểm cấu trúc thành phần của vanillin ................................................5
Bảng 2.2: Hàm lượng vanillin trong các mặt hàng thực phẩm ...................................8
Bảng 2.3: Các chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất vanillin từ acid ferulic ........19
Bảng 3.1: Các thành phần của vector pTZ57R/T ......................................................29
Bảng 3.2 : Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ............................................30
Bảng 3.3:Bảng danh mục các thiết bị thí nghiệm .....................................................31
Bảng 3.4: Bảng thành phần phản ứng PCR: .............................................................33
Bảng 3.5: Bảng thành phần phản ứng gắn nối ..........................................................34
Bảng 3.6: Bảng thành phần của phản ứng cắt enzyme .............................................38


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Con đường loại bỏ nhóm acetyl và không có quá trình β-oxidative ( phụ
thuộc CoA) ................................................................................................................ 10
Hình 2.2: Con đường loại bỏ nhóm acetyl và quá trình β-oxidative (phụ thuộc CoA)11
Hình 2.3: Con đường loại bỏ nhóm cacboxyl ........................................................... 12
Hình 2.4: Con đường loại bỏ nhóm acetyl và nhóm cacboxyl từ CoA ..................... 13
Hình 2.5: Con đường Con đường loại bỏ chuỗi bên ................................................. 14
Hình 2.6 : Quá trình tổng hợp vanillin từ guaiacol ................................................... 17
Hình 2.7: Vi sinh vật tổng hợp vanillin từ acid ferulic ............................................. 21
Hình 2.8: Con đường phân hủy vanillin trong chủng vi sinh vật .............................. 21
Hình 2.9: Sơ đồ con đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA...................................... 23
Hình 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene fcs .................. 33
Hình 4.2: Kết quả gắn sản phẩm PCR vào vector đích pTZ57R/T ........................... 42
Hình 4.3: Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-fcs ...................................... 43
Hình 4.4: Kết quả cắt kiểm tra đồng thời bằng cả hai enzyme EcoRI và BamHI .... 44
Hình 4.5: Kết quả PCR khuếch đại gene fcs từ plasmid ........................................... 45

Hình 4.6: Kết quả giải trình tự hai đầu của sản phẩm DNA plasmid pTZ-fcs .......... 47
Hình 4.7 : Kết quả so sánh sự tương đồng khi giải trình tự kết hợp cả mồi xuôi và
mồi ngược .................................................................................................................. 48
Hình 4.8: Kết quả phân tích so sánh trình tự gene từ cả hai chiều............................ 50
Hình 4.9: Kết quả trình tự đoạn gene fcs sau khi giải trình tự .................................. 51
Hình 4.10 Kết quả phân tích sự sai khác của nucleotide .......................................... 53


iv

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
Amp

: Ampicillin

BLAST

: Basic Local Alignment Search Tool ( Công cụ tìm kiếm so sánh
chuỗi cấu trúc cơ sở)

Bp

: Base pair – Cặp bazơ nitơ

CoA

: Coenzyme Acetoacetyl

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

DMSO

: Dimethylsulfoxide

dNTP

: Deoxyribonucleotide triphosphate

E. coli

: Escherichia coli

EDTA

: Etilendiamin tetraaxetic acid

Et al

: Cộng sự

fcs

: Feruloyl-coA synthetase

ech

:Enoyl-CoA hydratase

IPTG

: Isopropyl Thiogalactoside

Kb

: Kilo base – Kilo bazơ nitơ

LB

: Laria Broth

NCBI

: National Cetrer for Biotechnology Information ( Trung tâm
quốc gia về thông tin công nghệ sinh học)

PCR

: Polymerase Chain Recation (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

SDS

: Natri lauryl sulfat

TA

: TA-Cloning

TAE

: Tris-acetate-EDTA

UV

: Ultraviolet

X-gal

: 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactoside


v

MỤC LỤC
PHẦN 1 :MỞ ĐẦU......................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................................... 3
1.3. Yêu cầu của đề tài ..................................................................................................... 3
1.4. Ý nghĩa của đề tài ...................................................................................................... 3
1.4.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................... 3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................................... 3
PHẦN 2 :TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 4
2.1. Giới thiệu về vanillin................................................................................................. 4
2.1.1. Lịch sử và nguồn gốc vanillin ................................................................................ 4
2.1.2. Đặc điểm hình thái Vanillin planifolia. .................................................................. 4
2.1.3. Cấu trúc đặc điểm lý hóa của vanillin .................................................................... 5
2.1.4. Hoạt tính sinh học vanillin ..................................................................................... 6
2.1.5. Vai trò của vanillin trong công nghiệp và trong đời sống ...................................... 7
2.2. Các con đường sinh tổng hợp vanillin ...................................................................... 9

2.2.1. Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật .................................................. 9
2.2.2. Con đường sinh tổng hợp vanillin từ vi sinh vật.................................................... 9
2.3. Các phương pháp sản xuất vanillin ......................................................................... 15
2.3.1. Sản xuất vanillin từ thực vật ................................................................................ 15
2.3.2. Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hóa học ............................................................. 16
2.3.3. Sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ sinh học .......................................... 17
2.4. Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất vanillin ................................ 20
2.4.1. Các gene mã hóa enzyme sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic ......................... 20
2.5. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước .................................................... 24
2.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ....................................................................... 24
2.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ......................................................................... 26
PHẦN 3 :VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 28
3.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 28
3.1.1. Vật liệu ................................................................................................................. 28


vi

3.1.2. Enzyme, hóa chất ................................................................................................. 30
3.1.3 Dụng cụ ................................................................................................................. 31
3.1.4 Thiết bị .................................................................................................................. 31
3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................................ 32
3.3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 32
3.4. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................... 32
3.4.1. Khuếch đại đoạn DNA bằng phương pháp PCR .................................................. 33
3.4.2. Điện di DNA trong gel agarose ............................................................................ 33
3.4.3. Gắn DNA vào vector pTZ57R/T bằng enzyme T4 Ligase .................................. 34
3.4.4. Chuẩn bị tế bào khả biến ...................................................................................... 34
3.4.5. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến ........................................................ 35
3.4.6. Tách chiết DNA plasmid bằng phương pháp sử dụng SDS - kiềm...................... 36

3.4.7. Phương pháp lập bản đồ giới hạn ......................................................................... 37
3.4.8. Xác định trình tự nucleotit bằng phương pháp sanger ......................................... 38
3.4.9. So sánh trình tự DNA trên ngân hàng gene NCBI ............................................... 39
PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 40
4.1. Kết quả nhân gene fcs bằng phương pháp PCR ...................................................... 40
4.2. Kết quả gắn sản phẩm PCR vào vector đích pTZ57R/T ......................................... 42
4.3. Sàng lọc các dòng mang vector pTZ-fcs bằng điện di so sánh kích thước trên gel
agarose............................................................................................................................ 43
4.4. Kết quả chọn lọc dòng mang vector pTZ-fcs bằng lập bản đồ giới hạn ................. 44
4.5. Kết quả chọn lọc dòng bằng phương pháp PCR ..................................................... 45
4.6. Kết quả phân tích giải trình tự gene fcs................................................................... 46
PHẦN 5 :KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 55
5.1 Kết luận .................................................................................................................... 55
5.2 Kiến nghị .................................................................................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 56


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Vanillin (3-methoxy-4 hydroxybenzaldehyde) là một chất thơm quan trọng
được sử dụng phổ biến trên thế giới trong công nghiệp thực phẩm, đồ uống, nước
hoa, dược phẩm, dinh dưỡng (Hua, Ma et al. 2007) [27]. Sản lượng vanillin tiêu thụ
trên thế giới hàng năm ước tính khoảng 12000 tấn (Krings 1998, Lomascolo 1999)
[33,38]. Vanillin tự nhiên được sản xuất chủ yếu bằng phương pháp tách chiết từ
nguồn vỏ quả của loài lan Vanilla phanifolia. Lượng vanillin được tạo ra bằng
phương pháp này mới đáp ứng được khoảng 1% nhu cầu từ thị trường (Prince,
1994) [44], trong khi lượng vanillin còn lại chủ yếu được tổng hợp nhân tạo theo

phương pháp hóa học (Li and Rosazza, 2000) [36]. Tuy nhiên, theo quy định của
Mỹ và châu Âu thì vanillin tổng hợp hóa học không được coi như tương đương với
vanillin tự nhiên (Muheim A, 1999) [41]. Trên thực tế, giá thành của 1 kg vanillin tự
nhiên dao động trong khoảng 1,200 tới 4,000 USD, trong khi đó giá của 1 kg
vanillin nhân tạo chỉ vào khoảng 15 USD (Yoon, Li et al. 2005) [55]. Ngoài ra quá
trình tổng hợp vanillin theo phương pháp tổng hợp hóa học tác động gây ảnh hưởng
xấu tới môi trường.
Có một số nghiên cứu chỉ ra rằng vanillin được tổng hợp từ các vi sinh vật
khác nhau thông qua chuyển hóa sinh học từ các nguồn cơ chất khác nhau như acid
ferulic, eugenol, isogenol, lignin ... Trong số đó acid ferulic là một trong những đối
tượng được nghiên cứu về con đường sinh tổng hợp để tạo ra vanillin có thể sử
dụng như vanillin tự nhiên. Ở vi sinh vật acid ferulic được biến đổi thành
feruloyl-CoA dưới sự xúc tác của enzyme feruloyl-coA synthetase mã hóa bởi gene
fcs sau đó feruloyl-CoA tiếp tục được chuyển hóa thành vanillin dưới sự tác động
của enzyme enoyl-CoA hydratase/aldolase hóa bởi gene ech (Yoon, Li et al. 2005)
[55]. Những chủng vi sinh vật được xác định có mang gene fcs và ech mã hóa cho
quá trình chuyển hóa acid ferulic để tạo ra vanillin như: Amycolatopsis sp. HR104
(Yoon, Li et al. 2005) [55]. Amycolatopsis sp. HR167 (Achterholt, Priefert et al.


2

2000) [5], Pseudomonas putida (Plaggenborg, Overhage et al. 2003) [42], Bacillus
subtili (Plaggenborg, Overhage et al. 2003) [42], Pseudomonas fluorescens (Di
Gioia, Luziatelli et al. 2010) [15].... Mặc dù vanillin được tổng hợp từ những sinh
vật trên nhưng lượng vanillin được tạo ra cho năng suất thấp hoặc sản phẩm nhanh
chóng bị chuyển đổi thành các sản phẩm phụ khác hoặc bị vi sinh vật sử dụng như
nguồn cacbon cung cấp năng lượng cho sinh vật phát triển (Yoon, Li et al. 2005)
[55 ]. Ngoài ra quá trình lên men của một số xạ khuẩn gặp khó khăn bởi dịch nuôi
cấy có độ nhớt cao do sự sinh trưởng của hệ sợi xạ khuẩn và bào tử (Bushell ME,

1999) [10].
Trong những năm gần đây với sự kết hợp giữa những thành tựu của công
nghệ DNA tái tổ hợp và những thành tựu kỹ thuật di truyền, các nhà khoa học trên
thế giới đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp sản xuất sản xuất vanillin bằng công
nghệ DNA tái tổ hợp. Chủng tái tổ hợp được tạo thành mang các gene được tách
dòng từ những sinh vật có khả năng sinh tổng hợp sản xuất vanillin. Với các đặc
tính như khả năng sinh trưởng phát triển tốt, có khả năng tiếp nhận các gene ngoại
lai vào trong hệ gene nội tại hệ gene không có con đường phân hủy vanillin và các
đặc điểm di truyền cùng với quy trình lên men đã được nghiên cứu kĩ (Priefert,
Rabenhorst et al. 2001) [43]. E. coli được coi là một trong số đối tượng thích hợp để
nghiên cứu và ứng dụng tạo chủng tái tổ hợp cho sản xuất vanillin. Việc sử dụng
phương pháp DNA tái tổ hợp trong sản xuất vanillin đã khắc phục được những khó
khăn còn tồn tại trong việc sản xuất vanillin .
Ở Việt Nam sản xuất vanillin mới chỉ dừng lại ở phương pháp tổng hợp hóa
học và việc sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp còn là một
hướng đi mới. Xuất phát từ thực tiễn tôi tiến hành thực hiện đề tài: "Tách dòng và
giải trình tự gene mã hóa enzyme feruloyl-coa synthase từ chủng Amycolatopsis
sp. HR104" . Nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo ra chủng vi
sinh vật tái tổ hợp có khả năng sản xuất vanillin, trước mắt là tạo ra chủng E. coli tái
tổ hợp.


3

1.2. Mục tiêu của đề tài
- Tách dòng và giải trình tự gene fcs mã hóa enzyme feruloyl-coa - synthase
từ chủng Amycolatopsis sp. HR104.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Tách dòng và giải trình tự gene fcs từ chủng Amycolatopsis sp. HR104.
1.4. Ý nghĩa của đề tài

1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Tách dòng và giải trình tự gene fcs tạo tiền đề cho nghiên cứu tổng hợp
vanillin trong E. coli sau này.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Sản phẩm của nghiên cứu góp phần mở ra hướng nghiên cứu mới cho sản

xuất vanillin tự nhiên.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về vanillin
2.1.1. Lịch sử và nguồn gốc vanillin
Vanilin là chất thơm tự nhiên được tách từ vỏ quả của một số loài lan nhiệt
đới (họ Orchidaceae). Trong 110 loài lan Vanilla được tìm thấy có ba loài có khả
năng sản xuất ra vanillin: Vanilla planifolia, Vanillus tahitensis và Vanillus pompona
(Ravishankar, 2000) [45]. Trong số đó V. planifolia là loài được đánh giá cao hơn về
năng suất và chất lượng của vỏ quả và là nguồn cung cấp chính các sản phẩm
vanillin tự nhiên (Sinha, Sharma et al. 2008) [49].
Lịch sử của vanillin bắt đầu được khám phá tại Mexico trong khoảng những
năm 1300 và người Aztec người bản địa của Mexico là những người đầu tiên trồng
và sử dụng vanillin làm đồ uống của họ. Đến năm 1500 khi người Tây Ban Nha
xâm lược Mexico họ đã học cách sử dụng hương liệu này cho đồ uống . Những năm
sau đó vanillin bắt đầu được đưa vào trồng ở các nước Châu Âu tuy nhiên quá trình
trồng vanillin gặp khó khăn về vấn đề thụ phấn tự nhiên do cây vanillin không đậu
quả. Trong khoảng thời gian này nguồn cung cấp vanillin chính vẫn là từ Mexico.
Đến năm 1841 khi giáo sư Charles Morre tìm ra phương pháp thụ phấn nhân tạo cho

vanillin phương pháp này đã giúp trồng thành công vanillin ở các nước bên ngoài
Mexico. Ngày nay vanillin tự nhiên được trồng ở các nước thuộc Châu Phi, Châu Á và
các nước nhiệt đới....sản phẩm vanillin được sử dụng phổ biến trong các ngành công
nghiệp hương liệu, thực phẩm, đồ uống, dược liệu, nước hoa....(Ravishankar, 2000)
[45].

2.1.2. Đặc điểm hình thái Vanillin planifolia.
V. planifolia sinh trưởng và phát triển trong điều kiện khí hậu nhiệt đới,
lượng mưa trung bình khoảng 190 - 230 cm, nhiệt độ dao động trong khoảng 24300C, độ ẩm cao (Ravishankar, 2000) [45].
Hình thái bên ngoài của cây V. planifolia: Cây có dạng thân leo, thân mọng
nước, có tua quấn quanh trục thân đối diện với lá giúp cho cây bám vào giá thể. Lá


5

mịn, dày, có màu xanh lá cây tươi sáng, kích thước lá dài khoảng 10 - 23 cm rộng
khoảng 4 -6 cm. Sau khi trồng khoảng từ 2 - 3 năm cây bắt đầu ra hoa thành những
chùm màu vàng. Cánh hoa dài khoảng 10 cm cuống hoa dài khoảng 4-5 cm. Có đài
hoa và cánh hoa dài 5 cm màu xanh nhạt. Sau quá trình thụ tinh 10-12 tháng có thể
thu được quả vanillin trưởng thành. Quả trưởng thành có vỏ màu xanh vàng, hình
trụ tự nhiên, ba mặt, dài 20-25 cm và rộng 1-1,5 cm. Những quả vanillin tươi chúng
có mùi khó chịu và chỉ thu được các hợp chất thơm khi xử lý chúng. Thời gian thu
hoạch phụ thuộc theo từng vùng miền khác nhau (Ravishankar, 2000) [45].

2.1.3. Cấu trúc đặc điểm lý hóa của vanillin
Vanillin thương phẩm có thể tồn tại ở dạng bột, tinh thể màu trắng mùi thơm
mạnh và dễ chịu. Các đặc điểm tính chất của vanillin được trình bày trong bảng:

Bảng 2.1: Đặc điểm cấu trúc thành phần của vanillin
(Sinha, Sharma et al. 2008) [ 49]

Công thức cấu tạo

C8H8O3

Tên khoa học

(3-methoxy-4 hydroxybenzaldehyde

Công thức phân tử

Trọng lượng phân tử

152,15

Nhiệt độ nóng chảy

80- 810C

Nhiệt độ sôi

850C

Độ hòa tan

1g/100 ml

Tỉ trọng hơi

5,2

Áp suất hơi

2,2 x 10_3 mmHg ở 250 C

Hằng số phân ly

pKa1 = 7,40, pKa2 = 11,4 ( 250C


6

2.1.4. Hoạt tính sinh học vanillin
2.1.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn
Vanillin và các dẫn xuất của vanillin có hoạt tính kháng và chống lại hoạt động
của các loại nấm như nấm men, nấm mốc gây hại trong thực phẩm (Fitzgerald,
Stratford et al. 2005) [20], trong các loại nước trái cây, thạch hoa quả (Lo´ pez-Malo A
1998) [37], trong nước giải khát (Fitzgerald DJ, 2004) [ 19]. Chống lại hoạt động các
nấm men gây bệnh quan trọng trong y học như Candida albicans và Cryptococcus
neoformans (Boonchird, 1982) [9] và là tác nhân kháng của các loại vi khuẩn
Escherichia coli, Lactobacillus plantarum, Listeria innocua gây hại trong y học. Schiff
bases (thuốc nhuộm fuchsin) có nguồn gốc từ vanllin được coi là một chất kháng khuẩn
chống lại một số chủng vi khuẩn Gram đương và gram âm như Pseudomonas
pseudoalcaligenes, Proteus vulgaris, Citrobacter freundi, Enterobacter aerogenes,
Staphylococcus subfava và Bacillus megaterium (Vaghasiya YK, 2004) [51].
2.1.4.2 Hoạt tính chống oxy hóa
Theo Kumar và cộng sự nghiên cứu trong vanillin có chứa các hoạt chất
chống oxy hóa và hoạt tính loại bỏ các gốc tự do gây hại cho tế bào thần kinh. Do
vậy vanillin có khả năng giảm ảnh hưởng của các tác nhân gây hại cho tế bào thần
kinh như: Làm giảm quá trình oxy hóa xảy ra trong não bệnh nhân bị bệnh
Alzheimer's, ngăn chặn sự hình thành của một hợp chất gọi là peroxynitrite tác nhân

gây nên bệnh thoái hóa não ở bệnh Parkinson (Kumar SS, 2002) [34].
2.1.4.3 Hoạt tính chống ung thư và đột biến gene.
Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng vanilin có hoạt tính chống ung thư
và đột biến gene (Imanishi H 1990, LR 1994.) [29,39]. Vanillin ức chế đột biến ở
locus CD59 trên nhiễm sắc thể 11 ở người được cảm ứng bởi hydrogen peroxide,
N-methyl-N-nitrosoguanidine và mitomycine C (Gustafson DL, 2000) [23]. Vanillin
ức chế con đường Non-homologous DNA end- joining ( NHEJ) gây ra đứt gãy trên
mạch kép DNA ức chế bởi hoạt tính của DNA -PK( DNA protein kinase) (Durant S,
2003) [16] và có thể làm giảm lượng khối u ruột cảm ứng bởi nhiều tác nhân trong
mô hình chuột (Akagi K, 1995) [6].


7

2.1.4.4 Hoạt tính hạ lipid máu
Vanillin được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển tình trạng bệnh lí như siêu
mỡ máu. Ngoài ra vanillin đóng vai trò như một tác nhân hạ lipid trong máu khi
nồng độ vượt quá mức quy định cho phép trong điều trị bệnh tiểu đường (type 2) và
các bệnh liên quan đến rối loạn tim mạch và béo phì (Mokshagundam LRV, 2003)
[40].
2.1.4.5 Hoạt tính chống tạo hồng cầu lưỡi liềm
Trong các thí nghiệm in vitro đã chứng minh vanillin có khả năng chống tạo
hồng cầu lưỡi liềm bởi tác động của nhóm aldehyde với hemoglobin trong tế bào
hồng cầu (Abraham DJ, 1991) [4]. Tuy nhiên vanillin được hấp thụ qua đường uống
không có tác động trị liệu bởi vì nó có sự phân hủy nhanh chóng trong dịch tiêu hóa.
Để khắc phục vấn đề này, chế phẩm vanillin MX-1520 đã được tổng hợp. Lợi ích
sinh học của loại thuốc này chống tạo thành hồng cầu lưỡi liềm gấp 5 lần so với
vanillin tự nhiên (Sinha, Sharma et al. 2008) [ 49].
2.1.4.6 Các hoạt tính khác
Các loại đầu dễ bay hơi tách chiết từ nghệ, cỏ xả, húng quế kết hợp với vanillin

có tác dụng hiệu quả trong chống lại các loài muỗi. Ngoài ra vanillin còn có các hoạt
tính khác như chống đau răng, chống độc cho gan, chống viêm, kháng vi rút, giảm đau,
sát trùng, giảm căng thẳng, thuốc lợi tiểu và nhuận tràng (Sinha, Sharma et al. 2008)
[49].
2.1.5. Vai trò của vanillin trong công nghiệp và trong đời sống
Vanillin và các hợp chất có nguồn gốc từ vanillin được sử dụng ở hầu hết các
nơi trên thế giới. Lượng vanillin được sử dụng trong các sản phẩm như một nguyên
liệu chính hay là một hương vị phụ trong các thành phần khác thì nó vẫn giữi hương
vị đặc trưng . Vai trò của vanillin được ứng dụng trong các lĩnh vực như:
2.1.5.1 Chất tạo mùi trong sản phẩm gia dụng
Vanillin hoặc vanillin tổng hợp được sử dụng phổ biến để tạo mùi thơm thứ
cấp trong các sản phẩm gia dụng hằng ngày như: Chất tẩy rửa, bột giặt, nước rửa
chén, giúp tăng cường mùi hương cho sản phẩm. Ngoài ra vanillin cũng được sử


8

dụng trong các chất kết dính như sản phẩm keo nhằm giảm thiểu mùi khó chịu của
sản phẩm (Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14 ].
2.1.5.2 Vanillin được ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm
Vanillin được ứng dụng rộng rãi trong các mặt hàng có nguồn gốc từ sữa như
kem, sữa chua, gia tăng hương vị cho sữa, bột kem cà phê ngoài ra vanillin còn
được sử dụng tạo hương vị cho các loại bánh, socola, kẹo và mùi hương đặc biệt
cho các loại đồ uống có ga. Mức độ sử dụng vanillin tùy thuộc vào từng sản phẩm
(Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14].

Bảng 2.2: Hàm lƣợng vanillin trong các mặt hàng thực phẩm
Sản phẩm

Hàm lƣợng

Đồ uống không cồn

0,0063%

Kem

0,095%

Kẹo

0,02%

Đồ nướng

0,022%

Nước ngọt

0,033%-2%

Hòa tan hoặc rắc lên bề

Chocolate

0,097%

mặt

Kẹo Bonbons

Lên tới 0,05%

Chocolate sữa

Lên tới 0,03%

Đường cô

Lên tới 0,015%

Mứt kẹo

Lên tới 0,055%

Đường vanilin

2%

Trạng thái vật lí

Bột
Nguồn: CAS N0:121-33-5

2.1.5.3 Dược phẩm
Vanillin là một nguyên liệu quan trọng trong ngành công nghiệp dược phẩm để
sản xuất một số thuốc như aldomet, dopamine, papaverine, L-DOPA và chất tạo bọt
(Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14].
2.1.5.4 Tạo hương
Vanillin được sử dụng tạo mùi hương dễ chịu cho các sản phẩm như nến, sáp

thơm và là thành phần trong nước hoa (Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14].


9

2.2. Các con đƣờng sinh tổng hợp vanillin
2.2.1. Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật
Quả vanillin được thu hoạch từ tháng 6 đến tháng 8 sau quá trình thụ phấn và
ở giai đoạn này mùi hương của vanillin chưa được giải phóng.
Mùi hương của vanilin chỉ được giải phóng trong quá trình lên men qua quá
trình được gọi là "curing" quá trình ủ. Khi glucoside, glucovanillin, các β-glucoside
liên quan bị thủy phân bởi enzyme β-D -glucosidase sẽ giải phóng ra vanillin tự do và
các chất liên quan.
Mặc dù vanillin là một trong số những chất thơm được nghiên cứu nhiều
song những con đường sinh tổng hợp của chúng trong thực vật vẫn còn gây nhiều
tranh luận, bởi vì chưa có nghiên cứu chính xác nào xác định nêu ra con đường đặc
trưng của tất cả các con đường được đề xuất. Có giả thuyết đưa ra cho con đường
sinh tổng hợp vanillin: Vanillin là sản phẩm của con đường acid shikimic. Ở con
đường này phenylalanine hoặc tyrosine trải qua khử amin hóa tới C6-C3
phenylpropanoid, tiếp đó đóng vai trò như một cơ chất cho vanillin (Belanger,
2007) [8].
2.2.2. Con đường sinh tổng hợp vanillin từ vi sinh vật
Một số sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đã được nghiên cứu để
xác định các gene mã hóa các enzyme xúc tác phản ứng tổng hợp vanillin từ các cơ
chất khác nhau như lignin, eugenol, isoeugenol, acid ferulic, glucose... Trong đó các
con đường chuyển hóa sinh học từ acid ferulic được ưu tiên nghiên cứu nhiều.
Acid ferulic (acid 4- hydroxy- 3- methixycinnamic) là một thành phần phổ
biến trong thực vật, nó được tạo ra từ sự trao đổi chất phenulpropanoid kết hợp với
acid dihydroferulic tạo nên tính chắc chắn của thành tế bào bằng liên kết chéo giữa
lignin và polysacchatide. Acid ferulic là thành phần chủ yếu của phenolic được tìm

thấy trong thành tế bào của thực vật hai lá mầm, nó có thể thu được từ các nguồn
gốc phế phẩm nông nghiệp như vỏ ngô, cám ngô, củ cải đường, thành tế bào nội
nhũ gạo, lúa mì, lúa mạch (Zheng, 2007) [56]. Vì vậy acid ferulic là một cơ chất
thích hợp cho sản xuất vanillin sinh học.


10

Các nghiên cứu đã chỉ ra 5 con đường chuyển hóa acid ferulic thành vanillin,
đó là con đường loại bỏ nhóm acetyl và không có quá trình β-oxidative, con đường
loại bỏ nhóm acetyl và quá trình β-oxidative, Con đường loại bỏ nhóm cacboxyl ,
Con đường loại bỏ nhóm acetyl và nhóm cacboxyl từ CoA, Con đường Con đường loại
bỏ chuỗi bên (Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14].

2.2.2.1 Con đường loại bỏ nhóm acetyl và không có quá trình β-oxidative ( phụ
thuộc CoA)
Các gene mã hóa enzyme cần cho con đường chuyển hóa này đã được xác
định và xác nhận hoạt tính của chúng. Con đường chuyển hóa được biểu diễn ở hình
2.1

Hình 2.1: Con đƣờng loại bỏ nhóm acetyl và không có quá trình β-oxidative
( phụ thuộc CoA)
(Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14]
Con đường này có ba bước xúc tác với sự tham gia của hai enzyme: 4hydroxycinnamate-CoA ligase (4-CL) hay feruloyl-CoA syntheatase, được mã
hóa bởi gene fcs và 4-hydroxycinnamate- CoA- hydratase/lyase (HCHL) hay


11

enoyl-CoA hydratase/lyase được mã hóa bởi gene ech. Trên con đường này

enzyme 4-CL chuyển acid ferulic thành feruloyl-ScoA, sau đó enzyme HCHL
xúc tác thủy phân feruloyl-ScoA thành một hợp chất trung gian tạm thời
4-hydroxy-3-methoxyphenul-b-hydroxypropionyl-ScoA và tách chuỗi bên tạo thành
vanillin và acetyl-ScoA. Gene thứ ba liên kết với gene fcs và gene ech mã hóa
enzyme vanillin-xidroreductase được cảm ứng bởi acid ferulic.
Các gene và enzyme tham gia vào các phản ứng tương ứng đã được xác định ở
các chủng vi sinh vật khác nhau như Amycolatopsis sp. HR167 (Achterholt, Priefert et
al. 2000) [5], Pseudomonas putida KT2440 (Plaggenborg, Overhage et al. 2003)
[42], Bacillus subtilis (Plaggenborg, Overhage et al. 2003) [42], Pseudomonas
fluorescens (Di Gioia, Luziatelli et al. 2010) [15]. Sự nhận biết về các gene mã hóa
cho các enzyme đưa ra cơ hội mới cho điều hướng trao đổi chất và cấu trúc các
chủng tái tổ hợp.
2.2.2.2 Con đường loại bỏ nhóm acetyl và quá trình β-oxidative (phụ thuộc CoA)
Con đường này được đề xuất cho Pseudomonas putida và chủng
Rhodotorula rubra. Được thể hiện ở hình 2.2

Hình 2.2: Con đƣờng loại bỏ nhóm acetyl và quá trình β-oxidative (phụ thuộc
CoA)
(Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14]


12

Ở con đường này sự hình thành feruloyl-ScoA từ acid ferulic được xúc tác
bởi enzyme 4 -CL. Tiếp theo enzyme HCHL tiến hành xúc tác phản ứng cộng nước để
tạo thành 4- hydroxy-3-methoxypheyl-b-ketopropionyl-ScoA và trải qua quá trình lưu
phân( thyolytic) thành vanillyl-ScoA và aceryl-ScoA. Sau đó vanillyl- ScoA cộng nước
( Hydrate) và loại CoASH hình thành vanillin, bước này được xúc tác bởi enzyme
b- ketoacyl-CoA-thiolase (Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14].
2.2.2.3 Con đường loại bỏ nhóm cacboxyl

Con đường này được bắt đầu với sự tham gia của enzyme decarboxylase xúc
tác phản ứng đồng phân hóa acid ferulic thành một chất quinoid trung gian và sau
đó loại gốc cacboxyl tạo thành 4-vinylguaiacol. Tuy nhiên các chất trung gian của
các phản ứng xuôi dòng tiếp theo giữa 4-vinylguaiacol và vanillin chưa được xác
định (Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14]. Sơ đồ chuyển hóa của vanillin được thể
hiện ở hình 2.3

Hình 2.3: Con đƣờng loại bỏ nhóm cacboxyl
(Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14]
Tính đặc hiệu của con đường loại bỏ nhóm cacboxyl thay đổi theo từng đối
tượng sinh vật, Đặc trưng của mỗi loại enzyme decarboxylase phụ thuộc vào từng vi
sinh vật.


13

2.2.2.4 Con đường loại bỏ nhóm acetyl và nhóm cacboxyl từ CoA
Trong con đường này, liên kết đôi dạng trans của acid ferulic cộng nước tạo
thành một hợp chất trung gian tạm thời 4-hydroxy-3-methoxy-b-hydroxypropionic
acid. Sau đó enzyme aldolase phân tách acetate giải phóng trực tiếp vanillin. Ngoài
ra, chất trung gian tạm thời còn có thể mất đi một hidro tạo thành acid 3
(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)3-ketopropionic và sau đó nhóm loại nhóm acetyl
deacetylated thành vanillin (Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14]. Sơ đồ con đường
chuyển hóa được thể hiện ở hình 2.4

Hình 2.4: Con đƣờng loại bỏ nhóm acetyl và nhóm cacboxyl từ CoA
(Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14]
Một enzyme có khả năng loại bỏ nhóm acetyl (fca) đã được xác nhận ở
chủng Pseudomonas putida strain WCS358. Sự tồn tại của chất trung gian tạm thời
và cơ chế chính xác của con đường này chưa được xác nhận đầy đủ. Con đường

CoA-deacetylation decarboxyltion được đề xuất cho các loài Delftia acidovorans,
Pseudomonas sp., P. mira, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, E. coli,


14

Streptomyces setonii, Aspergillus niger, Fomes fomentarius, Fusarium solani,
Polysporus versicolor và Rhodotorula rubra.
2.2.2.5 Con đường loại bỏ các chuỗi bên
Cùng với phản ứng loại nhóm cacboxyl, acid ferulic bị đồng phân hóa thành
một chất quinod trung gian tạm thời mà chính nó bị khử thành acid
(4-hydroxy-3-methoxy phenylpropionic acid) (Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14].
Sơ đồ con đường chuyển hóa được thể hiện ở hình 2.5

Hình 2.5: Con đƣờng Con đƣờng loại bỏ chuỗi bên
(Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14]
Con đường này đã được đề xuất cho sự biểu hiện của S. cerevisiae dưới điều
kiện yếm khí hoặc Lactobacillus plantarum, tuy nhiên quá trình khử cũng được thể
hiện dưới điều kiện hiếu khí ở Phanerochaete chrysosporium (Gupta, 1981) [22].
Phụ thuộc vào vi sinh vật mà acid dihydroferulic được trao đổi tiếp thành
homovanillic, hoặc acid vanillic. Sau đó acid vanillic được hoàn nguyên thành


15

vanillin.
Acid ferulic là một cơ chất thích hợp cho sản xuất vanillin. Ngoài ra nó còn
biểu hiện các chức năng sinh lí bao gồm hoạt tính chống oxi hóa, kháng khuẩn
chống viêm, chống nghẽn mạch, chống ung thư, chống lại chứng động mạch vành,
cholesterol thấp, tăng cường khả năng sống của tinh trùng và còn được đánh giá là

chất có khả năng chống lại các gốc tự do làm giảm thiểu các tác nhân gây hại của
quá trình oxi hóa.
2.3. Các phƣơng pháp sản xuất vanillin
2.3.1. Sản xuất vanillin từ thực vật
Vanillin tự nhiên được thu được chủ yếu từ nguồn hạt và vỏ quả loài lan
nhiệt đới V. planifolia. Quả vanillin được thu hoạch khi quả chuyển màu từ màu
xanh sang màu vàng quá trình này thường kéo dài khoảng tám đến chín tháng sau
khi thụ phấn (Ravishankar, 2000) [45]. Quá trình chế biến quả vanillin thành
vanillin thương phẩm trải qua nhiều công đoạn, quá trình khác nhau. Những vùng
miền khác nhau có các phương pháp chế biến vanillin khác nhau nhưng phương
thức chế biến vanillin vẫn dựa trên phương thức truyền thống theo kiểu Mexico
(Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14]. Bao gồm bốn giai đoạn chính:
- Killing (làm héo từ từ): Đây là quá trình sử dụng nhiệt độ làm ngưng các
quá trình tự nhiên trong quả vanillin sau khi thu hoạch, tạo điều kiện cho enzyme
xúc tác sự hình thành hợp chất thơm. Các phương pháp làm héo thường được sử
dụng là ánh nắng mặt trời, lò sấy, nước nóng....
- Curing (ủ): Sau quá trình killing cần duy trì nhiệt độ đủ cao và độ ẩm cần
thiết để enzyme hoạt động và tránh quá trình lên men gây hại sảy ra.
- Làm khô: Sau thời gian ủ quả vanillin đạt được màu đặc trưng và độ đồng
nhất về hương thơm, cần tiến hành làm khô đến duy trì độ ẩm khoảng 25%-30% so
với độ ẩm ban đầu.
- Đóng gói: Vỏ quả được lưu trữ đóng trong các hộp.
Để thu được vanillin vỏ quả sẽ được ngâm trong hỗn hợp ethanol, và nước
bằng phương pháp tác chiết khác nhau như ngâm xử lí nhiệt... Sản phẩm có thể ở
dạng bột và dạng lỏng tùy vào mục đích sử dụng.
Tuy nhiên quá trình sản xuất vanillin bằng nguồn thực vật gặp những khó


16

khăn như thời gian sản xuất dài, cần nhiều công lao động, chịu ảnh hưởng của điều
kiện khí hậu, thiên tai, bệnh dịch, tình hình kinh tế chính trị. Ngoài ra để sản xuất ra
1 kg vanillin thương phẩm cần tới 500 kg vỏ quả tương ứng với hơn 4000 hoa được
thụ phấn. Do vậy lượng vanillin được tách chiết tự nhiên chỉ đáp ứng 1% nhu
cầu của thị trường (Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14].
2.3.2. Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hóa học
Do sự khan hiếm nguồn cung cấp vanillin cũng như giá thành của vanillin
thương phẩm, vanillin tổng hợp được nghiên cứu và sản xuất nhằm cung cấp lượng
vanillin tinh khiết đáp ứng nhu cầu cần thiết của thị trường. Quá trình tổng hợp
vanillin nhân tạo được bắt đầu với sự tổng hợp các hợp chất tự nhiên như eugenol
hợp chất có trong tinh dầu cây đinh hương và được sử dụng thương mại hóa cho
đến những năm 1920. Sau đó vanillin được tổng hợp bằng dịch kiềm sunphit giàu
lignin (sản phẩm phụ của ngành công nghiệp giấy). Quá trình tổng hợp vanillin
bằng phương pháp này bao gồm các bước sử lí dung dịch lỏng chứa lignin bằng các
chất oxi hóa, pH kiềm, nhiệt độ, áp xuất cao. Lignin bị phân hủy và oxi hóa tạo
thành vanillin cùng với các sản phẩm khác (Hocking, 1997) [25]. Tuy nhiên quá
trình sản xuất vanillin từ ligin tạo nhiều sản phẩm phụ cần phải có sự tinh sạch loại
bỏ sản phẩm phụ ra khỏi sản phẩm do vậy quá trình này làm tăng chi phí cho sản
phẩm vanillin. Ngoài ra quá trình lignin gây ảnh hưởng đến môi trường nên không
còn sử dụng phổ biến (Hopp, 2000) [26].
Ngày nay hầu hết vanillin tổng hợp được sản xuất từ nguyên liệu hóa dầu
guaiacol và acid glyoxilic tạo thành acid vanillylmandelic. Đây là quá trình gồm hai
bước bắt đầu với phản ứng ngưng tụ trong môi trường kiềm giữa guaiacol và acid
glyoxilic tạo thành acid vanillymandelic và tiếp đó được chuyển thành vanillin bởi
quá trình loại bỏ nhóm CO2 oxi hóa (Esposito, 1997) [17]. Quá trình được chuyển
hóa được thể hiện ở hình 2.6


17

Guaiacol

Acid glyoxilic

Acid vanillymandelic

Vanillin

Hình 2.6 : Quá trình tổng hợp vanillin từ guaiacol
(Esposito, 1997) [17]
Vanillin được tổng hợp từ guaiacol bằng kỹ thuật này hầu như không có sản
phẩm phụ, do vậy quá trình tinh sạch sản phẩm xẽ được đơn giản hóa. Mặc dù quá
trình tổng hợp vanillin từ guaiacol làm giảm tác động đến môi trường so với các
phương pháp tổng hợp vanillin từ eugenol, lignin, song vanillin được tổng hợp bằng
con đường nhân tạo đều có sự thay đổi mạnh về thành phần hóa học nên chúng vẫn
bị gi nhãn nhân tạo.
2.3.3. Sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ sinh học
2.3.3.1 Sử dụng enzyme
Nhờ sự hiểu biết về con đường sinh tổng hợp vanillin các nhà khoa học đã
tìm ra phương pháp sản xuất vanillin từ eugenol và isoeugenol bằng enzyme nhờ
các biến đổi sinh học. Quá trình chuyển hóa sử dụng các enzyme styrene
dioxygenase, vanillyl alcohol oxidase (dehydrogenase) và lipoxygenase. Các nhà
nghiên cứu đã biến đổi creosol một thành phần chính của creosote được thu được từ
sử lí nhiệt gỗ và vanillylamine (thành phần được thu từ quá trình thủy phân
capsaicin là phần cay chủ yếu của hồ tiêu) thành vanillyl alcohol và sau đó vanillyl
alcohol tiếp tục được enzyme vanillyl alcohol oxidase biến đổi tạo thành
vanillin (Daphna Havkin-Frenkel, 2010) [14].
Một loại enzyme khác là lipoxygenase được tách chiết từ đậu tương cũng có
khả năng chuyển hóa isoeugenol thành vanillin. Việc sử dụng than hoạt tính cùng
với hydrogen peroxide góp phần tăng thêm lượng vanillin được tạo thành so với quá