Thiết kế vector biểu hiện con đường sinh tổng hợp provitamin a trong e coli

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LA VĂN BẢO

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CON ĐƢỜNG
SINH TỔNG HỢP PROVITAMIN A TRONG E. coli

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2011 – 2015

THÁI NGUYÊN - 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LA VĂN BẢO

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CON ĐƢỜNG
SINH TỔNG HỢP PROVITAMIN A TRONG E. coli

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: K43 - CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2011 – 2015

Giảng viên

: ThS. Lƣơng Thị Thu Hƣờng

Khoa CNSH-CNTP –Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

THÁI NGUYÊN - 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khóa luận
tốt nghiệp này với sự cố gắng của cá nhân, tôi đã nhận được sự hướng dẫn,
giúp đỡ, chỉ bảo và động viên của thầy cô bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn
thành luận văn:
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo: Ths. Lương Thị Thu
Hường, Thầy giáo TS. Dương Văn Cường, KS Ma Thị Trang người đã trực
tiếp giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như
quá trình hoàn chỉnh luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh
Học và Công Nghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
vừa qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, các anh chị làm việc tại Viện
Khoa Học Sự Sống – Đại Học Thái Nguyên đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để
tôi học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm chân thành tới gia đình, người, thân và
bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn trong quá
trình học tâp, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Xin chân trọng cảm ơn!
Thái nguyên, tháng 6 năm 2015
Sinh viên

La Văn Bảo


ii

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Danh mục các thiết bị ..................................................................... 19
Bảng 3.2: Thành phần phản ứng cắt với EcoRI và HindIII . .......................... 24
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt với EcoRI và XbaI ............................... 24
Bảng 3.4: Thành phần phản ứng gắn nối ...................................................... 26


iii

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Công thức cấu tạo của provitamin A ................................................ 5
Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa provitamin A thành vitaminA ............................. 6
Hình 2.3: Tổng hợp carotenoid bằng phương pháp ngưng tụ Wittig.............. 10
Hình 2.4: Tổng hợp carotenoid bất đối. .......................................................... 10
Hình 2.5 Hình thái của E. coli ......................................................................... 13
Hình 3.1 Cấu trúc vector pLUG-crtY ............................................................. 15
Hình 3.2: Cấu trúc vector pR-iEIB ................................................................. 16
Hình 3.3 Cấu tạo vector pET28 ...................................................................... 16
Hình 3.4 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện con đường sinh tổng hợp rovitamin
A trên nền tảng vevtor pET28......................................................... 21
Hình 3.5 Cơ chế của hiện tượng biến nạp ....................................................... 27
Hình 4.1: Kết quả cắt plasmid pLUG-crtY và mở vòng vector pET28 với

EcoRI và HindIII ............................................................................. 29
Hình 4.2. Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET-Y .................................... 30
Hình 4.3. Kết quả cắt các dòng plasmid bằng đồng thời hai Ezyme EcoRI và
HindIII ............................................................................................. 31
Hình 4.4: Kết quả kiểm tra chiều gắn của gene crtY trong vector pET-Y ..... 32
Hình 4.5: Hình minh họa cở sở kiểm tra chiều gắn gene crtY trong pET-Y.. 33
Hình 4.6: Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid pET-iEIBY ................. 34
Hình 4.7: Kết quả điện di kiểm cắt các dong plasmid pET-iEIBY bằng XbaI
và EcoRI .......................................................................................... 35
Hình 4.8: Kết quả điện di kiểm tra chiều gắn cụm gene iEIB trong pET-iEIBY . 36
Hình 4.9: Cụm iEIB được gắn xuôi chiều....................................................... 37
Hình 4.10: Biểu hiện của pET- iEIBY trong E. coli BL21 ............................. 38


iv

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

Bp

: Base pair – Cặp bazơ nitơ

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

E. coli

: Escherichia coli

EDTA

: Etilendiamin tetraaxetic acid

IPTG

: Isopropyl Thiogalactoside

Kb

: Kilo base – Kilo bazơ nitơ

LB

: Laria Broth

TAE

: Tris-acetate-EDTA

X-gal

: 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactoside

cs

: cộng sự.


v

MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 2
1.3. Ý nghĩa của đề tài.................................................................................... 3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học .............................................................................. 3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn............................................................................... 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU....................................................... 4
2.1 Cơ sở khoa học của đề tài ....................................................................... 4
2.1.1 Provitamin A và vai trò của provitamin A trong thực tiễn ................ 4
2.1.2 Các con đường tổng hợp provitamin A ............................................. 8
2.2. Tổng quan các nghiên cứu trong và ngoài nước ................................... 14
2.2.1. Tình hình nghiên cứu về provitamin A trong nước ........................ 14
2.2.2. Tình hình nghiên cứu về provitamin A trên thế giới ...................... 14
PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 15
3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu.......................................................... 15
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 15
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................... 15
3.1.3. Hóa chất .......................................................................................... 17
3.1.4. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ....................................................... 19
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................... 20
3.3. Nội dung ................................................................................................ 20
3.3.1 Nội dung 1........................................................................................ 20
3.3.2 Nội dung 2........................................................................................ 20
3.3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................. 20


vi

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 28
4.1 kết quả thiết kế vector biểu hiện mang polycistronic operon chứa 5 gene
idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector pET28 ....................................... 28
4.1.1. Kết quả gắn crtY vào vector pET28 tạo vector tái tổ hợp pET-Y 28
4.1.2 Kết quả gắn cụm gene iEIB (idi, crtE, crtI, crtB) vào vector pET-Y
tạo vector tái tổ hợp pET-iEIBY ..................................................................... 34
4.2. Kết quả và đánh giá biểu hiện của pET- iEIBY trong E. coli BL21 .... 38
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................... 39
5.1. Kết luận ................................................................................................. 39
5.2. Kiến nghị ............................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Provitamin A (ß-caroten) là một hợp chất thuộc nhóm carotenoid và là
tiền chất để tổng hợp vitamin A- một nhóm sắc tố tự nhiên được tổng hợp
nhiều trong nhiều loại thực vật, vi khuẩn, tảo và nấm (Das và cs, 2007)[7].
Trong thực vật, provitamin A tham gia vào các quá trình quang hợp, che chắn
ánh sáng, hình thành màu sắc của thực vật màu vàng, da cam, đỏ và tham gia
vào tham gia vào quá trình hình thành một số hormone (Vilchez và cs,
2011)[8]. Ngoài ra provitamin A còn tham gia hình thành các màu sắc cho vi
sinh vật, chim, côn trùng, cá và động vật giáp xác (Takahashi và cs, 1998)[9].
Ngày nay người ta đã tìm thấy hơn 600 chất trong họ carotenoid, trong đó có
20 loại được tìm thấy trong máu người và đông vật, tiêu biểu là α-caroten, ßcaroten, lycopene, lutein và crytoxamthin (Rao and Rao, 2007)[10]. Ngoài ra
provitamin A còn có rất nhiều tác dụng quan trọng đối với cơ thể người.

Provitamin A là tiền chất của vitamin A (Hà Thị Bích Ngọc, 2006)[4],
một loại vitamin liên quan đến thị lực. Ngoài provitamin A còn có tác dụng
chống oxy hóa, tăng cường hệ miễn dịch, ức chế sự phát triển của tế bào ung
thư, bệnh tim mạch (Paiva and Russell, 1999)[11]. Mặc dù provitamin A rất
quan trọng đối với cơ thể nhưng con người không thể tự tổng hợp được loại
vitamin này mà chủ yếu thông qua con đường hấp thụ từ nguồn thức ăn cung
cấp từ bên ngoài.
Hiện nay, nhu cầu sử dụng provitamin A ngày càng gia tăng. Nó được
bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi, sản xuất dược phẩm và mỹ phẩm (Lee
và cs, 2003)[12]. Ngày nay, có một số phương pháp để sản xuất provitamin
A, chủ yếu là sản xuất bằng phương pháp tổng hợp hóa học, lên men hoặc
tách chiết từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên với quy mô và số lượng nhỏ


2

(Johnson và cs, 1996)[13], nhược điểm của phương pháp phương pháp này là
sản phẩm thu được với số lượng ít, không thân thiện với môi trường và phải
có nguồn nguyên liệu với số lượng lớn. Vì vậy, Cần có một phương pháp sản
xuất ưu việt hơn là yêu cầu được đặt ra.
Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, các nhà khoa học đã
đạt được nhiều thành tựu mới trong việc sản xuất provitamin A bằng phương
pháp sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để tổng hợp provitamin A từ vi sinh
vật. Quá trình sinh tổng hợp provitamin A gồm có hai con đường là con
đường Mevalonate với tiền chất đầu tiên là glucose, pyruvate và con đường
Nonmevalonate với tiền chất đầu tiên là Acetyl- CoA. Cả hai con đường này
đều dẫn đến hình thành cơ chất đầu tiên là isopentenyl diphosphate (IPP)
(Slattery và cs, 2000)[14] hoặc dimethylallyl diphosphate (DMAPP) đồng
phân của IPP. Hai chất này là hai tiền chất cấu tạo nên tất cả các hợp chất
isoprenoid ( Das và cs 2007)[7]. Sau đó diễn ra các phản ứng ngưng tụ liên

tiếp IPP và tạo ra các sản phẩm C30 và C40 carotenoid.
Hiện nay, việc sản xuất các hợp chất provitamin A ở Việt Nam là một
vấn đề còn mới, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc tách chiết từ thực vật
và phân lập các chủng vi sinh vật sản xuất provitamin A ở quy mô nhỏ. Việc
sử dụng các hợp chất provitamin A ở Việt Nam chủ yếu do nhập khẩu từ nước
ngoài với giá thành cao. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, tôi thực hiện đề tài:
‘‘Thiết kế vector biểu hiện con đƣờng sinh tổng hợp provitamin A trong
E. coli” nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo chủng vi
sinh vật có khả năng sản xuất provitamin A tái tổ hợp.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
- Thiết kế vector biểu hiện mang polycistronic operon gồm 5 gene idi,
crtE, crtI, crtB và crtY mã hóa 5 enzyme xúc tác các phản ứng chuyển hóa
con đường sinh tổng hợp provitamin A trên nền tảng vector pET 28.


3

- Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli chủng biểu hiện và cảm ứng
biểu hiện vector tái tổ hợp để sinh tổng hợp provitamin A.
- Đánh giá sơ bộ khả năng biểu hiện provitamin A của chủng E. coli tái
tổ hợp.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài tạo ra vật liệu nghiên cứu cho các nghiên cứu về biểu
hiện provitamin A trong E. coli sau này.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sản phẩm của nghiên cứu mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng sản xuất
provitamin A mới, rút ngắn thời gian sản xuất đáp ứng nhu cầu thực tiến.

4

PHẦN 2
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
2.1 Cơ sở khoa học của đề tài
2.1.1 Provitamin A và vai trò của provitamin A trong thực tiễn
2.1.1.1 Cấu trúc và đặc tính sinh học của provitamin A
Cấu trúc hóa học
Tất cả carotenoid đều có cấu trúc polyisoprennoid, là một chuỗi
cacbonhydrate liên kết với nhau bằng liên kết đôi đơn xen kẽ đối xứng với
nhau qua liên kết đôi trung tâm. Đơn phân của chúng là các đơn vị prenoid
hay còn gọi là terpenoid hay isopentenyl. Hầu hết các carotenoid đều được bắt
đầu từ cấu trúc cơ bản C40, trong đó khung carbon được tạo nên do mạch
hydrocarbon liên kết đôi đơn với nhau, sau đó khung này được biến đổi tạo
thành nhiều carotenoid khác nhau bằng cách: vòng hóa ở một hoặc hai đầu
của phân tử cấu tạo ra các nhóm kết thúc ở hai đầu phân tử khác; thay đổi các
mức hydro hóa; thêm các nhóm chứa oxy vào phân tử (Britton, 1995)[15].
Cấu trúc chuỗi xen kẽ liên kết đôi đơn này xác định đặc tính hấp thụ ánh sang
và hoạt động chống oxy hóa của carotenoid. Mỗi liên kết đôi trong chuỗi
polyene của carotenoid có thể tồn tại ở dạng đồng phân trans hoặc cis, nhưng
trong tự nhiên hầu hết các carotenoid tồn tại ở dạng đồng phân trans (Britton,
1995)[15].
Carotenoid tan trong lipid nên có xu hướng tích tụ trong các khoang tan
trong mỡ như màng lipoprotein. Tính chất tan trong lipid của carotenoid cũng
ảnh hưởng đến sự hấp thụ, vận chuyển bài tiết của chúng trong cơ thể.
Provitamin A có công thức cấu tạo là (C40H56) (hình 2.1)


5

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của provitamin A
Đặc tính sinh học của provitamin A
Provitamin A có màu vàng cam, thường thấy trong các phần xanh của
thực vật và các loại rau quả có màu da cam như cà rố, bí ngô, đào, khoai lang
đỏ, … (Nguyễn Minh Thủy, 2005)[2].
Provitamin A rất nhạy cảm với oxy trong không khí và ánh sang. Betacaroten tan trong lipid và các chất hòa tan lipid, không tan trong nước
(Nguyễn Minh Thủy, 2005)[2].
2.1.1.2 Vai trò của provitamin A đối với con người
Theo WHO và FAO, mỗi năm có hàng triệu trẻ em bị thiếu vitamin A
mà nguyên nhân là khẩu phần ăn không đủ provitamin A. Sự thiếu hụt
vitamin A thường gây ra bệnh mù mắt cho khoảng 400 triệu trẻ em hàng năm,
hơn phân nửa số trẻ này chết trong vòng một năm sau khi bị mù, và còn làm
nguy hại đến hệ thống miễn nhiễm của trẻ em dưới 5 tuổi.
Chức năng quan trọng nhất của provitamin A là chuyển đổi thành
Vitamin A. Vitamin A là một loại vitamin quan trọng đối với sức khỏe con
người, nếu thiếu vitamin A con người dễ mắc phải một số bệnh như: rối loạn
thị lực, giảm hoạt động của phổi, khí quản gây ra các bệnh về khoang miệng.
Ngoài ra, Vitamin A còn ảnh hưởng tới quá trình biệt hóa tế bào, quá trình
tổng hợp glycoprotein, quá trình tổng hợp dịch nhầy ở biểu mô, và quá trình
hình thành, phát triển của xương (Debjani Duttavà cs, 2005)[16].


6

Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa provitamin A thành vitaminA
Trong cơ thể người và động vật không có khả năng tổng hợp carotenoid,
chúng ta phải cung cấp từ nguồn thức ăn từ thực vật và vi tảo. Theo nhiều
nghiên cứu đã chỉ ra ra lượng carotenoid hấp thu hằng ngày thích hợp là 6 mg,
giá trị này được tính toán dựa trên tỉ lệ của các hợp chất tiền Vitamin A dạng
hoạt động (retinol), đặc biệt là beta-caroten là tiền chất Vitamin A hoạt động

chuyển hóa 100 % (Vilchez và cs, 2011)[8].
Ức chế tế bào ung thư
Carotenoid có tác động mạnh mẽ vào tế bào ung thư do chúng điều khiển
tăng trưởng của tế bào, điều hòa biểu hiện gene và tác động lên các tế bào
miễn dịch . Tác động này, carotenoid có thể hạn chế sai khác bất thường dẫn
tới sự phát triển không ngừng của tế bào ung thư. Carotenoid tác động vào
quá trình ung thư theo hai hướng: một là chúng tác động vào quá trình oxy


7

hóa tế bào do tính chất oxy hóa mạnh, hai là chúng tham gia vào quá trình biệt
hóa và phân chia của tế bào (Bertram, 1999)[17].
Mỗi carotenoid có hoạt đông khác nhau ở một giai đoạn phát triển khác
nhau của bệnh ung thư và beta-caroten hoạt động ở giai đoạn đầu tiên của
khối u (Misawavà cs, 1991)[18].
Provitamin A tác động mạnh mẽ vào tế bào ung thư do chúng điều khiển
tăng trưởng của tế bào, điều hòa biểu hiện gene, và tác động lên các tế bào
miễn dịch, hạn chế các sai khác bất thường dẫn tới sự phát triển không ngừng
của tế bào ung thư. Provitamin A tác động vào quá trình ung thư theo hai
hướng: một là chúng tác động vào quá trình oxy hóa tế bào do tính chất chống
oxi hóa mạnh, hai là chúng tham gia vào quá trình biệt hóa và phân chia tế
bào (Heller và cs, 1998)[19]
Phòng ngừa bệnh tim mạch
Nguyên nhân chủ yếu của tim mạch là do tích lũy quá nhiều sản phẩm
oxy hóa và viêm (Heller và cs, 1998)[19]. Đặc biệt là do sự oxy hóa
lipoprotein tỷ trọng thấp do ROS (các phân tử hoạt động có chứa oxy – hay
các gốc tự do ,ví dụ như oxy nguyên tử hay các peroxit) gây ra và là nguyên
nhân gây nên xơ vứa động mạch. Carotenoid có tác dụng tới các bệnh tim
mạch là chống lại quá trình oxy hóa lipoprotein và xơ vứa động mạch. Ngoài

ra carotenoid đã được sử dụng để ức chế con đường peroxy hóa lipid trong cơ
thể, vì carotenoid có mặt trong màng tế bào đóng vai trò quan trọng đảm bảo
ổn định cấu trúc màng tế bào. Một số carotenoid tham gia vào quá trình
peroxy hóa cholesterol như : astaxanthin, cantaxathin, lutein và beta –
carotene (Palozzavà cs, 2008)[20].
Bệnh tim mạch được hình thành do sự tích lũy quá nhiều sản phẩm oxy
hóa gây nên (Singh và cs, 1995)[21], đặc biệt là quá trình oxy hóa lipoprotein
tỷ trọng thấp (LDL) do ROS dẫn đến hình thành các mảng bám trên thành


8

mạch gây sơ vữa thành mạch (Dhalla và cs, 2000)[22]. Tác động chính của
provitaminA tới các bệnh tim mạch là chống lại quá trình oxy hóa, do
provitaminA được vận chuyển trong các lipoprotein tỷ trọng thấp thông qua
đó có thể trực tiếp ức chế quá trình oxi hóa của LDL (Reaven và cs,
1994)[23].
Ngoài ra provitamin A còn có một số chức năng khác.
Provitamin A có khả năng làm chậm sự tiến triển của bệnh thoái hóa
điểm vàng làm giảm thiểu các nguy cơ mù lòa (Gordon and Schooff,
2002)[24].
Ngoài ra, carotenoid còn có khả năng điều tiết miễn dịch tiết ra
interleukin-2 và intelukin-4, nâng cao khả năng miễn dịch của cơ thể.
2.1.1.3 Vai trò của provitamin A trong công nghiệp và đời sống
Hầu hết các caroten đã được sản xuất để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ của
con người và động vật (Ausich, 1997)[25]. Chúng được sử dụng như thức ăn
bổ sung trong chăn nuôi gia cầm trên quy mô công nghiệp, có tác dụng làm
tăng sắc tố màu da hay lòng đỏ trứng gia cầm, cho đến màu sắc thịt của các
loài cá, màu sắc của lớp vỏ động vật giáp xác trong nuôi trồng thủy sản
(Ausich, 1997); (Johnson and Schroeder, 1996) [25][13].

Trong nghành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm provitamin A được
sản xuất dưới dạng dược chất, sử dụng ngoài chế độ ăn của con người. Đối
với nghành công nghiệp mỹ phẩm, sự đa dạng về màu sắc của chúng được
ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất mỹ phẩm. Chúng có thể sử dụng làm
chất bảo quản mỹ phẩm, bảo vệ da chống lại tác hại của UV có trong ánh sáng
mặt trời (Del Campo và cs, 2000)[26].
2.1.2 Các con đường tổng hợp provitamin A
2.1.2.1 Con đường sinh tổng hợp provitamin A trong tự nhiên
Trong tự nhiên tất cả carotenoid nói chung và provitamin A nói riêng
đều tổng hợp theo con đường ispenoid. Sinh tổng hợp carotenoid bắt đầu từ
đơn phân isopentenyl diphosphate và dimethylallyl diphosphate. Có hai con


9

đường tổng hợp carotenoid đó là con đường mevalonate (MVA) và một con
đường tương đối mới đó là 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP). Cơ
chất được hình thành đầu tiên là isopentenyl diphosphate (IPP) và đồng phân
của nó của dimethylallyl diphosphate (DMAPP). Trong tự nhiên các sinh vật
Eukaryote thường sử dụng các đường MVA để chuyển đổi acetyl-CoA thành
IPP, sau đó được đồng phân hóa để tạo thành DMAPP. Còn các sinh vật
Prokaryote thì tổng hợp với một con đường khác, sử dụng các đường MEP để
sản xuất IPP và DMAPP qua một phản ứng ngưng tụ ban đầu giữa pyruvate
và glyceraldehyde-3-phosphate. Tổng hợp carotenoid ở thực vật được diễn ra
theo cả hai con đường MVA và MEP.
2.1.2.2 Tổng hợp provitamin A bằng con đường hóa học
Trong 600 carotenoid tự nhiên thì có 8 loại đã được tổng hợp trên quy
mô công nghiệp. Các carotenoid này bao gồm lycopen, lutein, zeaxanthin,
cathanxanthin, astaxanthin, α-caroten, β-cryptoxanthin và β-caroten (Ernst,
2002)[27].

Phương pháp chung cho việc tổng hợp C40 carotenoid là sử dụng
phương pháp ngưng tụ Wittig giữa C10-dialdehyde với hai phân tử C-15phosphonium đối xứng để tạo nên cấu trúc đối xứng và sau đó thực hiện phản
ứng đồng phân hóa và kết tinh hóa tạo nên C40 hoàn chỉnh. Phương pháp
ngưng tụ Wittig là phương pháp có hiệu quả cao được ứng dụng đa dạng trong
giai đoạn cuối cùng của công nghiệp tổng hợp carotenoid (Ernst, 2002)[27].
Phương pháp ngưng tụ Wittig đã thành công trên rất nhiều carotenoid và trong
đó có β-caroten. Đối với carotenoid đối xứng thì quá trình tổng hợp xảy ra một
phản ứng ngưng tụ Wittig và một phản ứng đồng phân hóa.


10

Hình 2.3: Tổng hợp carotenoid bằng phương pháp ngưng tụ Wittig
(Ernst, 2002)[27].
Carotenoid bất đối tổng hợp sử dụng phản ứng ngưng tụ Wittig không
đối xứng qua hai giai đoạn kết hợp với phản ứng kết tinh, đồng phân hóa
(Ernst, 2002)[27].

Hình 2.4: Tổng hợp carotenoid bất đối (Ernst, 2002)[27].
2.1.2.3 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất ProvitaminA
Công nghệ DNA tái tổ hợp là phân tử DNA được tạo thành từ hai hay
nhiều trình tự DNA của các loài sinh vật khác nhau. Trong kỹ thuật di truyền,


11

DNA tái tổ hợp thường là được tạo thành từ việc gắn những đoạn DNA có
nguồn gốc khác nhau vào trong vectơ tách dòng. Những vectơ tách dòng
mang ADN tái tổ hợp này có thể biểu hiện thành các protein tái tổ hợp
trong các sinh vật.

Có một số thuận lợi riêng trong tổng hợp sinh học các hợp chất
carotenoid : sự tổng hợp riêng của 600 carotenoid khác nhau, có khả năng
sinh tổng hợp trên phạm vi lớn, các đặc tính sinh học của quá trình tổng hợp
các carotenoid, kiến thức về sự sinh tổng hợp của một số carotenoid có thể áp
dụng đối với các carotenoid khác, tất cả các công cụ hiện đại của quá trình
sinh học và công nghệ DNA tái tổ hợp có thể sử dụng để phát triển hệ thống
sản xuất các hợp chất carotenoid, hơn nữa với sự tổng hợp sinh học, chỉ các
đồng phân lập thể có trong tự nhiên mới được tạo ra (Ausich, 1997)[25].
Kỹ thuật điều hướng trao đổi chất là phương pháp sử dụng DNA tái tổ
hợp nhằm biến đổi mạng lưới trao đổi chất trong tế bào sống để sản xuất ra
hợp chất mong muốn với hiệu suất cao (Bailey, 1991)[28]. Tức là, nghiên cứu
sử dụng các vi sinh vật phù hợp để sản xuất ra các chất cần thiết trên quy mô
công nghiệp, có thể thương mại hóa các sản phẩm (Ikeda and Katsumata,
1992)[29]. Sản phẩm carotenoid được tạo ra bằng phương pháp này
chính là carotenoid tự nhiên, do đó chúng sẽ an toàn hơn so với các
phương pháp hóa hoc.
Nhu cầu về carotenoid trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, công
nghiệp dược phẩm ngày càng tăng, do đó yêu cầu đặt ra là phải tìm ra cách
đổi mới phương pháp sản xuất các carotenoid để thu được lượng carotenoid
cần thiết. Điều hướng trao đổi chất ở vi sinh vật có thể giúp sản xuất một cách
hiệu quả các hợp chất carotenoid trong các vi sinh vật không chứa gene tham
gia sinh tổng hợp carotenoid mà các phương pháp khác không thể thực hiện
được (P. Lee, 2002)[30]. Việc sử dụng các phương pháp tách chiết truyền


12

thống trước đây đòi hỏi các sinh vật chủ phải có sự tổng hợp tự nhiên các hợp
chất mà con người mong muốn. Tuy nhiên, những sinh vật có khả năng tổng
hợp các tiền chất để tạo ra những chất mong muốn đó có hiệu xuât cao cũng

có thể sử dụng làm vật chủ (Yutaka Miura, 1998)[31]. Điều này có ỹ nghĩa
quan trọng trong việc mở rộng phạm vi những vi sinh vật được sử dụng làm
vật chủ. Mục đích tạo ra những sinh vật phù hợp để sản xuất ra lượng lớn
hợp chất carotenoid trong tế bào vật chủ mà không cần quan tâ tới khả năng
tổng hợp carotenoid trong tự nhiên của chúng.
Từ những năm 90, các gene liên quan đến quá trình sinh tổng hợp
carotenoid đã được nghiên cứu tách dòng và phân lập thành công từ một số
loài vi khuẩn, nấm và thực vật (Norihiko Misawa, 1990)[32].
Ngày nay, với sự tiến bộ của kỹ thuật di truyền, đặc biệt sự là sự phát
triển của công nghệ DNA tái tổ hợp provitamin A ở cấp độ phân tử, cho phép
con người tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp provitamin A
bằng cách đưa các gene biểu hiên ngoại lai vào trong cơ thể của chúng. Đồng
thời, sử dụng các kỹ thuật điều hướng trao đổi chất có thể tăng cường được
khả năng tổng hợp, mang lại hiệu suất cao.
Đặc điểm của vi khuẩn E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp
E. coli là vi khuẩn gram âm, hình que dài khoảng 2,5µm, có roi
(flagenlla), bộ gene gồm 4.693.221 cặp bp mã hóa cho ít nhất 4.000 gene. E.
coli là loài được chọn trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử và công nghệ
gene vì dễ nuôi, có bộ gene đơn giản và đã được giải trình tự. Giống như các
loài vi khuẩn gram âm khác, E. coli không có màng nhân và nhiễm sắc thể là
một phân tử sợi đôi dạng vòng rất lớn với những vị trí gắn màng và một vị trí
khởi đầu sao chép (origin of relication). Các tế bào E. coli có thể hỗ trợ sao
chép các DNA plasmid và chon lọc các DNA plasmid tái tổ hợp thôngqua
gene kháng kháng sinh hay phức hợp màu như Xgal- β galactosidase.


13

Hình 2.5 Hình thái của E. coli
Nhằm duy trì sự tồn tại của các vector trong tế bào chủ, thông thường

E. coli được cải tiến theo thành các chủng theo các hướng cơ bản sau :
Loại bỏ hệ thống sử đổi hạn chế (restriction modification) vì hệ thống
này sẽ can thiệp vào sự sao chép của DNA lạ trong tế bào vi khuẩn nhờ đó vi
khuẩn sẽ phân giải DNA lạ theo như cách DNA bacteriophage bị phân giải do
hệ thống phòng vệ tự nhiên. Do đó các chủng E. coli dùng cho tạo dòng sẽ bi
đột biến trong hệ thống sửa đổi hạn chế nội sinh (hsdR) hay gây đột biến
trong phức hợp mcrA/mcrB/mrr là phức hợp phân giải DNA lạ không được
methyl hóa một cách chính xác.
Hệ thống sửa đổi DNA được sửa đổi để ngăn chặn sự tái tổ hợp. Gene
recA của E. coli mã hóa cho một DNA- dependent- ATPase cần thiết cho sự
tái tỏ hợp ở E. coli. Các chủng E. coli dùng để tạo dòng có đột biến recA
thông thường thực hiện được sự tái tổ hợp.
Thay đổi enzyme endonuclease nhằm làm tăng sản lượng plasmisd và
cải biến chất lượng DNA được tách chiết bằng cách sử dụng các phương
pháp hóa sinh chuẩn.


14

2.2. Tổng quan các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
2.2.1. Tình hình nghiên cứu về provitamin A trong nước
Hiện nay nghiên cứu provitamin A ở Việt Nam còn là vấn đề mới và
chỉ dừng lại ở mức độ tách chiết từ thực vật, và phương pháp làm tăng
provitamin A ở một số loại cây ngũ cốc.
- Năm 2003 Bùi Minh Đức và cs đã phân lập thành công tinh thể betacaroten tự nhiên giàu carotenoid (provitamin A) từ quả gấc cho công tác
phòng chống thiếu vitamin A ở Việt Nam. (Bùi Minh Đức và cs, 2003)[3].
- Năm 2006 Hà Thị Bích Ngọc và cs đã tiến hành tổng hợp được các
hợp chất carotenoid trong một số thực vật ở Việt Nam (Hà Thị Bích Ngọc và
cs)[4].
- Năm 2011 Nguyễn Thị Hương và cs đã tách dòng được gene crtI mã

hóa cho Phytoene dehydrogenase từ Pantoea ananatis. Đây là một trong tổng
số 5 gene tổng hợp provitamin A (Nguyễn Thị Hương và cs, 2011)[5].
- Năm 2012 Nguyễn Thị Hương và cs đã tạo ra chủng vi khuẩn E. coli
có khả năng sản xuất lycopen (Nguyễn Thị Hương và cs, 2012)[6].
2.2.2. Tình hình nghiên cứu về provitamin A trên thế giới
Trên thế đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về provitamin A được
công bố.
- Raman Babu và cs thuộc CIMMYT,ĐH Nông Nghiệp Sichuan,ĐH
Nông nghiệp Huazhong,Trung Quốc (2012). Đã chứng minh ảnh hưởng được
ảnh hưởng của chỉ thị phân tử lcyE và crtRB1 đối với hàm lượng provitamin
A trong 26 quần thể bắp trên thế giới. (Raman Babu và cs, 2012)[33]
- Năm 2014, Schmidt MA và cộng sự đã tiến hành chuyển thành công
gene có khả năng sinh tổng hợp provitamin A vào trong cây đậu tương
(Schmidt MA và cs, 2014).[34]


15

PHẦN 3
ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn E. coli BL21 được cung cấp bới phòng thí nghiệm Vi
sinh, Viện Công nghệ sinh học, viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
 Gene crtY gắn trong vector pLUG
Gene crtY (1161 bp), mã hóa cho enzyme lycopene cyclase, xúc tác cho
quá trình chuyển hóa từ lycopen thành β-carotene. Ở 2 đầu của gene crtY có vị trí
nhận biết của 2 enzyme EcoRI và HindIII. Vector pLUG-crtY đã được tách dòng
thành công trước đó cũng được sử dụng làm vật liệu cung cấp gene crtY.

Hình 3.1 Cấu trúc vector pLUG-crtY


16

 Cụm gene idi-crtE-crtI-crtB gắn trong vector pRSET
Cụm gene idi-crtE-crtI-crtB mã hóa cho quá trình chuyển hóa từ tiền
chất isopentenyl diphosphate (IPP) và đồng phân của nó dimethylallyl
diphosphat (DMAPP) để tạo ra hợp chất lycopene đã được gắn thành công
vào vector pRSET-A trước đó, được sử dụng làm vật liệu cung cấp gene.

Hình 3.2: Cấu trúc vector pR-iEIB
 Vector pET 28

Hình 3.3 Cấu tạo vector pET28


17

Thành phần cấu tạo từng phần trong plasmid pET28
Thành phần

Vai trò
Kiểm soát chặt chẽ sự biểu

T7 Promoter
Vùng khởi đầu sao chép
Vị trí đa tách dòng

hiện của gene
Cho phép tạo ra số lượng lớn
trong E. coli
Cho phép gắn gene quan tâm

Xpress fwd primer

Vị trí
Base 368-386

Base 3207-3889
Base 158-204
Base 222-240

0RF frame 1

Vị trí khung đọc 1

Base 523- 1023

0RF frame 2

Vị trí khung đọc 2

Base 3995-4810

origin

Cho phép tổng hợp DNA

Base 3270-3889

3.1.3. Hóa chất
Các hóa chất tinh khiết được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân
tử của Invitrogen, Fermantas, Sigma, Bioneer gồm:
 Các hóa chất tách DNA plasmid
Tách chiết plasmid theo phương pháp “Preparation of Plasmid DNA
by Alkaline Lysis with SDS”
- Solution I: + Tris HCl 1M pH8
+ EDTA 0.5M pH8
+ glucose, H2O khử ion
- Solution II: + NaOH 3M
+ SDS 10%
- Solution III: + CH3COOK 3
+ CH3COOH
+ H2O khử ion