Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp

MỞ ĐẦU
Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10), là một trong những loại coenzyme
tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử ở cả prokaryote và eukaryote. CoQ10 có vai
trò quan trọng trong việc sản xuất ra ATP - nguồn năng lượng sinh học của cơ thể.
CoQ10 ngày càng được sử dụng nhiều làm nguồn thực phẩm chức năng, giúp cải
thiện sức khỏe và được đưa vào các mỹ phẩm làm đẹp như một chất chống oxy hóa,
chống lão hóa; ứng dụng trong y tế nhằm ngăn ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh về
tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng hệ thống miễn dịch, giảm huyết áp...
Với nhiều ứng dụng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày một tăng lên. Để
đáp ứng nhu cầu đó đã có nhiều giải pháp được đưa ra như tổng hợp hóa học, bán
tổng hợp và công nghệ sinh học. Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên hiện nay
CoQ10 được sản xuất chủ yếu bằng con đường lên men nhờ vi khuẩn như
Agrobacterium tumefaciens, Escherichia. coli, Sporobolomyces salmonicolor,
Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus denitrificans…
A. tumefaciens là một trong những vi khuẩn đang được sử dụng để sản xuất
CoQ10 hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có hàm lượng CoQ10 tương đối cao
so với các vi sinh vật khác, chỉ tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền,
phù hợp sản xuất ở quy mô công nghiệp..Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực
tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận
Coenzyme Q10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp”
 Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp Coenzyme Q10.
- Nghiên cứu quy trình công nghệ thu nhận Coenzyme Q10.
- Ứng dụng Coenzyme Q10 vào sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức
năng.
 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập, tuyển chọn chủng A. tumefaciens sinh tổng hợp Coenzyme Q10.
- Nghiên cứu tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoenzymeQ10.
- Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 và xác định đặc tính của Coenzyme Q10
từ chủng A. tumefaciens tái tổ hợp.
- Khảo sát khả năng ứng dụng của Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực

phẩm chức năng dưới dạng viên nang.
 Những đóng góp mới của luận án
- Đã phân lập và tuyển chọn được chủng A. tumefaciens TT4 sinh tổng hợp
CoQ10 cao.
1


- Đã tách dòng và giải trình tự được 2 gen dps và dxs mã hóa cho 2 enzyme chìa
khóa của con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A. tumefaciens TT4 phân
lập ở VN và tạo được chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang 2 gen trên cho năng
suất sinh tổng hợp CoQ10 cao.
- Xây dựng quy trình tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens.
- Bước đầu ứng dụng Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực phẩm chức
năng dưới dạng viên nang.
 Bố cục của luận án
- Luận án được trình bày trong 123 trang: mở đầu (2 trang), tổng quan tài liệu
(32 trang), vật liệu và phương pháp nghiên cứu (20 trang), kết quả và thảo luận
(58 trang với 11 bảng, 50 hình), kết luận và kiến nghị 1 trang), danh mục các
công trình đã công bố (1 trang) và tài liệu tham khảo (9 trang với 4 tài liệu
tiếng Việt và 107 tài liệu tiếng Anh).
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Cấu tạo Coenzyme Q10
1.2. Nguồn thu Coenzyme Q10
1.2.1. Tổng hợp hóa học
1.2.2. Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật
1.2.3. Coenzyme Q10 từ vi sinh vật
1.3.Con đường tổng hợp Coenzyme Q10 từ vi sinh vật
1.4. Lên men sinh tổng hợp Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens
1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon
1.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ nitơ

1.4.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng
1.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ
1.4.5. Ảnh hưởng của pH
1.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan
1.5. Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp Coenzyme Q10
1.5.1. Lên men gián đoạn
1.5.2. Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed – batch)
1.6. Tách chiết và đặc tính Coenzyme Q10
1.6.1. Tách chiết Coenzyme Q10
1.6.2. Tinh sạch Coenzyme Q10
1.6.3. Đặc tính của Coenzyme Q10
1.7. Cải biến chủng vi sinh vật sinh tổng hợp Coenzyme Q10
1.7.1. Đột biến chủng
1.7.2. Chủng tái tổ hợp
1.8. Vai trò và ứng dụng của Coenzyme Q10
1.8.1. Vai trò của Coenzyme Q10
1.8.2. Ứng dụng của Coenzyme Q10
2


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
Các mẫu nốt sần cây hoa hồng được thu thập từ Tây Tựu và Mê Linh, Hà Nội.
Chủng A. tumefaciens EHA105 từ Viện Công nghệ Sinh học, VAST.
Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu tách dòng và biểu hiện:
Mồi xuôi (DpsF): 5’-ATAGAGCTCATTGCCGCGCAAGGCGTCAGTT-3’;
Mồi ngược (DpsR): 5’-TTTGGATCCTCAGTTGAGACGCTCGATGCA-3’.
Mồi xuôi (DxsF): 5’-TAAGGATCCACGCATAGAACAGGCCAAAC-3’;
Mồi ngược (DxsR): 5’-ATTGTCGACTCAGCCGGCGAAACCGACGC-3’;
Cặp mồi 16 S được sử dụng trong giải trình tự:

Mồi xuôi 27F: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’;
Mồi ngược 1492R: 5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’.
Các plasmid được sử dụng trong nghiên cứu: pJet1.2/Blunt (Thermo Scientific,
Mỹ), pCAMBIA1301 (Viện Công nghệ Sinh học, VAST.)
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng A. tumefaciens sinh tổng hợp
CoQ10 theo Islam (2010).
- Nuôi cấy chìm chủng A. tumefaciens DPXS12 sinh tổng hợp Coenzyme Q10.
- Tách chiết DNA tổng số, DNA plasmid từ vi khuẩn, khuếch đại gen dps, dxs,
16S bằng kỹ thuật sốc nhiệt, biến nạp DNA plasmid vào E. Coli bằng sốc
nhiệt,...theo Sambrook và Russel (2001).
- Phương pháp biến nạp plasmid vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung
điện.
- Phương pháp tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens theo Ranadive (2011).
- Xác định hàm lượng CoQ10 bằng phương pháp Craven.
- Phương pháp phân tích Coenzyme Q10 bằng HPLC.
- Phương pháp tạo phức β-cyclodextrin - CoQ10 theo Fir và cộng sự (2009).
- Phương pháp xác định hoạt tính sinh học của CoQ10 theo Fir (2009), Hisa và
cộng sự (2014).
- Phương pháp điều chế viên nang cứng chứa CoQ10.
- Phương pháp tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp CoQ10 bằng quy hoạch bậc
hai theo Box – Behnken.
- Phương pháp tin sinh học.

3


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN A. TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP
COENZYME Q10

Kết quả từ 13 mẫu nốt sần khác nhau thu thập từ vùng trồng hoa hồng Mê Linh
và Tây Tựu - Hà Nội đã phân lập được12 chủng vi khuẩn trên môi trường chọn lọc
MacConkey, bao gồm 5 chủng từ nốt sần hoa hồng phường Tây Tựu, 7 chủng từ nốt
sần hoa hồng huyện Mê Linh. Để chứng minh các vi khuẩn phân lập được là A.
tumefaciens, các chủng phân lập được tiến hành sàng lọc dựa theo một số đặc điểm
hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử.
Kết quả từ 12 chủng phân lập đã sàng lọc được 4 chủng là A. tumefaciens. Từ các
chủng phân lập trên và 3 chủng chuẩn A. tumefaciens tiến hành tuyển chọn thông qua
khả năng sinh tổng hợp CoQ10. Kết quả cho thấy, chủng vi khuẩn TT4 có khả năng
sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (13 mg/l) sau 96 giờ nuôi cấy so với các chủng khác.
Từ các kết quả phân tích về hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử chủng vi
khuẩn phân lập TT4 được định danh là A. tumfaciens TT4. Chủng này sẽ được sử
dụng cho các nghiên cứu tăng cường sự sinh tổng hợp CoQ10.
3.2. NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS SINH
TỔNG HỢP COENZYME Q10
3.2.1. Tách dòng gen dps và dxs từ A. tumefaciens TT4
DNA tổng số đã tách chiết từ chủng A. tumefaciens TT4 được dùng làm khuôn để
khuếch đại hai đoạn gen dps và dxs mã hóa hai enzyme chìa khóa của con đường tổng
hợp CoQ10 là decaprenyl diphosphate synthase và 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate
A
synthase.
B
dps

M

dxs
Kb

Kb

- 3,0
- 2,0
1077 bp 

- 1,2

M

2100 bp 

- 3,0
- 2,0
- 1,2

- 0,5
- 0,2

- 0,5

Hình 3.1. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA tổng số của A.
tumefaciens TT4. M, thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scientific, Mỹ)
4


Kết quả phổ điện di sản phẩm PCR cho thấy xuất hiện một băng DNA xấp xỉ 1,2
kb (hình 3.1A) và một băng kích thước khoảng 2,1 kb (hình 3.1B) khi sử dụng cặp
mồi DpsF/R và DxsF/R tương ứng. Kích thước của các sản phẩm PCR thu được là
hoàn toàn phù hợp với kích thước của hai đoạn gen đích cần khuếch đại. Từ kết quả
này cho thấy hai đoạn gen dps và dxs đã được khuếch đại từ khuôn DNA tổng số của

chủng A. tumefaciens TT4 bằng kỹ thuật PCR.
Sản phẩm PCR của hai gen dps và dxs được xử lý bằng enzyme Klenow và gắn
vào vector tách dòng pJET1.2/blunt (Thermo Scienctific, USA). Sản phẩm nối ghép
được biến nạp vào E. coli DH10b để chọn dòng mang vector tái tổ hợp. Kết quả biến
nạp cho thấy xuất hiện 10 và 7 khuẩn lạc trên môi trường LB thạch chứa ampicilin
(100 µg/ml) tương ứng với hai gen dps và dxs. Plasmid đã được tách chiết từ những
khuẩn lạc và được sử dụng cho sàng lọc sơ bộ để chọn ra một dòng tương ứng với
mỗi gen để nghiên cứu tiếp theo. Trước tiên, plasmid được sử dụng làm khuôn cho
phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen dps và dxs tương ứng. Kết quả cho thấy
đều xuất hiện băng sản phẩm PCR trên phổ diện di với kích thước phù hợp với kích
thước của gen dps (hình 3.2A) và dxs (hình 3.2B). Kích thước sản phẩm PCR từ
khuôn DNA plasmid tương đương với kích thước sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng
số của chủng A. tumefaciens TT4 ban đầu (hình 3.2). Kết quả nhận được chứng tỏ hai
dòng được lựa chọn mang gen đích tương ứng là dps và dxs. Tuy nhiên, để chắc chắn
hơn DNA plasmid của hai dòng này tiếp tục được xử lý bẳng các enzyme hạn chế
thích hợp.
A

C3

TT4

M

B
Kb

C6

TT4

M
Kb

- 3,0
- 2,0
1077 bp 

- 1,2
2100 bp 
- 0,5

- 3,0
- 2,0
- 1,2

- 0,2
- 0,5
- 0,2

Hình 3.2. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA plasmid của
các dòng tái tổ hợp. C3, C6 là khuôn DNA plasmid tách chiết từ clone số 3 và số 6. TT4 là
khuôn DNA tổng số tách chiết từ chủng A. tumefaciens TT4. Đường chạy M là thang DNA
chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ)

5


Theo thiết kế hai trình tự cắt của enzyme hạn chế SacI và BamHI được đưa vào
đầu 5’ của cặp mồi DpsF/R và tương tự trình tự cắt của BamHI và SalI được đưa vào

cặp mồi DxsF/R. Kết quả xử lý bằng enzyme cắt hạn chế cho thấy đối với cả hai
clone 3 và 6 đều văng ra băng DNA có kích thước tương ứng với kích thước gen dps
khoảng 1077 bp (hình 3.3A) và gen dxs khoảng 2100 bp (hình 3.3B). Từ các kết quả
thu được có thể khẳng định rằng hai dòng số 3 và 6 là các dòng tái tổ hợp mang hai
gen đích tương ứng là dps và dxs.
A

1

2

M

B

3

4

Kb

Kb

- 3,0
- 2,0
 1077 bp 

M

 2100 bp 

- 3,0
- 2,0

- 1,2

- 1,2

- 0,5

- 0,5

- 0,2

- 0,2

Hình 3.3. Phổ điện di sản phẩm cắt DNA plasmid bằng các enzyme hạn chế đối với dòng số 3
mang gen dps (A) và dòng 6 mang gen dxs (B). Đường chạy 1, 3 là DNA plasmid chưa cắt;
đường chạy 2, 4 là DNA plamid được cắt bằng cặp enzyme SacI/BamHI và BamHI/SalI tương
ứng với clone 3 và 6. Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ)

Để kiểm tra trình tự và khung đọc của hai gen đích dps và dxs đã được tách dòng
hai plasmid tái tổ hợp được sử dụng làm khuôn cho phản ứng xác định trình tự. Trình
tự nuclecotide và axit amin suy diễn của gen dps và dxs đã được xác định. Kết quả
cho thấy gen được tách dòng chứa một khung đọc mở cho phép dịch mã tổng hợp
một protein nguyên vẹn.
3.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs
Trong nghiên cứu này vector pCAMBIA1301 với kích thước 11837 bp được sử
dụng làm vector biểu hiện phù hợp chủng chủ A. tumefaciens. Hai gen dps và dxs sẽ
được đưa độc lập và đồng thời vào vector pCAMBIA1301 để tạo ra các cấu trúc biểu

hiện pCAM-dps, pCAM-dxs và pCAM-dps-dxs.
3.2.2.1. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs độc lập
Hai gen dps và dxs được cắt ra khỏi vector tách dòng bằng hai cặp enzyme cắt
hạn chế tương ứng là SacI/BamHI và BamHI/SalI. Hai gen dps và dxs thu được đã
được gắn vào vector biểu hiện pCAMBIA1301 đã được mở vòng bằng cặp enzyme
6


cắt hạn chế tương ứng. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b để chọn
dòng. Kết quả biến nạp cho thấy xuất hiện 11 và 2 khuẩn lạc tương ứng với gen dps
và dxs trên môi trường LB thạch chứa kanamycin (100 µg/ml). DNA plasmid từ các
dòng đã được sử dụng để sàng lọc sơ bộ cho các nghiên cứu tiếp theo. Đối với gen
dps, 8 dòng đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng phản ứng PCR
sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.4A) và xử lý bằng cặp enzyme cắt hạn chế SacI/BamHI
(hình 3.4B). Kết quả cho thấy cả 8 dòng đều xuất hiện băng DNA khoảng 1,1 kb
tương ứng với kích thước gen dps (1077bp) (hình 3.4B).
1

2

3

4

5

6

7

8

ĐC

M

1

2

3

4

5

6

7

8

+

-

Kb

Kb

- 3,0
- 2,0

- 3,0
- 2,0

- 1,2

1077 bp 

M

- 1,2
- 0,5
- 0,5

- 0,2

- 0,2
B

A

Hình 3.4. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa
chọn đối với gen dps. Đường chạy 1-8 tương ứng với 8 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm
PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. Đường chạy (+) là sản
phẩm PCR từ khuôn gốc. Đường chay (-) là sản phẩm cắt plasmid đối chứng. M là thang DNA
chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ).
1
A

2100 bp 

2

ĐC

M

1
Kb

- 3,0
- 2,0

2

M
Kb

B

- 3,0
- 2,0

2100 bp 

- 1,2

- 1,2

- 0,5

- 0,5

Hình 3.5. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa
chọn đối với gen dxs. Đường chạy 1-2 tương ứng với 2 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm
PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. M là thang DNA chuẩn
100bp (Thermo Scienctific, Mỹ).

7


Tương tự đối với gen dxs, 2 dòng đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen
đích bằng phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.5A) và xử lý bằng cặp
enzyme BamHI/SalI (hình 3.5B). Kết quả cho thấy cả 2 dòng đều xuất hiện băng
DNA khoảng 2,1 kb tương ứng với kích thước đọan gen đích dxs (2103 bp) (hình
3.5B). Các kết quả thu được cho thấy rằng gen dps và dxs đã được tách dòng thành
công trong vector biểu hiện pCAMBIA1301. Các cấu trúc tái tổ hợp được ký hiệu
pCAM-dps và pCAM-dxs tương ứng.
3.2.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang đồng thời hai gen dps và dxs
Để tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp chứa đồng thời hai gen dps và dxs, gen dps
thu được từ vector tách dòng sau khi xử lý bởi cặp enzyme cắt hạn chế SacI và
BamHI được nối vào vector pCAM-dxs đã được mở vòng bởi SacI/BamHI. Sản phẩm
nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b và kết quả thu được 10 khuẩn lạc. Kết quả
PCR từ khuôn plasmid sử dụng cặp mồi DpsF/R cho thấy cả 10 khuẩn lạc đều cho
sản phẩm có kích thước tương đương với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) (hình
3.6A). Đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs không thấy xuất hiện sản phẩm, điều đó
chứng tỏ plasmid từ 10 dòng thu được mang gen dps. Dòng số 9 được lựa chọn để
kiểm tra plasmid bằng việc cắt với SacI/BamHI, kết quả cho thấy xuất hiện 1 băng

DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.6B). Từ kết quả này có thể khẳng định rằng đã gắn được
gen dps vào vector tái tổ hợp pCAM-dxs để tạo cấu trúc tái tổ hợp mới chứa đồng
thời hai gen dps và dxs, được ký hiệu pCAM-dps-dxs.
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ĐC M1

RE/9
Kb

A

B

- 3,0
- 2,0
- 1,2

1077 bp 

- 0,5 1077 bp 

M2
Kb

- 3,0
- 2,0
- 1,0
- 0,5

Hình 3.6. Phổ điện di sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng sử dụng cặp mồi DpsF/R
(A) và sản phẩm cắt enzyme hạn chế (B). Đường chạy 1-10, sản phẩm PCR từ khuôn plasmid
của 10 dòng tương ứng; mẫu đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs (ĐC); RE/9, dòng số 9 được
xử lý bởi SacI/BamHI thang DNA chuẩn 100 bp (M1) và 1kb (M2).

8


3.2.2.3. Tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs
Các cấu trúc tái tổ hợp pCAM-dps, pCAM-dxs, pCAM-dps-dxs được biến nạp
vào tế bào A. tumefaciens EHA 105 khả biến bằng phương pháp xung điện. Các dòng
tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường chứa kanamycin (100µg/ml). Tiến hành xác

định khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng tái tổ hợp pCAM-dps, pCAMdxs, pCAM-dps-dxs, và chủng đối chứng pCAM (hình 3.7). Kết quả cho thấy chủng
tái tổ hợp chứa đơn gen pCAM-dps và pCAM-dxs có khả năng sinh tổng hợp CoQ10
tăng lên 1,34 và 1,38 lần so với đối chứng. Khi kết hợp cả hai gen dps và dxs tạo
chủng pCAM-dps-dxs đã làm tăng khả năng tổng hợp CoQ10 của A. tumefaciens lên
1,80 lần so với đối chứng. Do đó các dòng A. tumefaciens mang cấu trúc pCAM-dpsdxs được lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo.

CoQ10 (mg/l)

20
15
10
5
0
pCAM

pCAM-dps

pCAM-dxs

pCAM-dps-dxs

Hình 3.7. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng A. tumefaciens tái tổ hợp. Chủng tái tổ
hợp chứa vector tái tổ hợp mang đơn gen pCAM-pds và pCAM-dxs và đồng thời hai gen pCAMdps-dxs. Chủng đối chứng mang vector pCAMBIA1301.

Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của 28 dòng A. tumefaciens
pCAM-dps-dxs tái tổ hợp cho thấy khả năng sinh tổng hợp CoQ10 là khác nhau (hình
3.8). Trong số 28 dòng có dòng số 12 có khả năng tổng hợp CoQ10 cao nhất so với
dòng khác (19 mg/l) gấp 2,16 lần so với chủng gốc mang vector pCAM, vì vậy dòng
số 12 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
20.0

18.0

CoQ10 (mg/L)

16.0
14.0
12.0
10.0

8.0
6.0

4.0
2.0
0.0

1

2

3

8

10

11

12

14

15

20

pCAM

Các dòng tái tổ hợp

Hình 3.8. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc
pCAM-dps-dxs
9


Dòng số 12 được kiểm tra cấu trúc pCAM-dps-dxs bằng cách tiến hành tách
plasmid, thực hiện phản ứng PCR và xử lý bởi enzyme hạn chế. Kết quả PCR từ
khuôn plasmid sử dụng cặp mồi DpsF/R và DxsF/R cho thấy đều cho sản phẩm có
kích thước tương đương với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) và dxs (2103bp)
(hình 3.9B, 3.9A). Để kiểm tra plasmid bằng việc cắt với SacI/BamHI, kết quả cho
thấy xuất hiện 1 băng DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.9C). Từ kết quả này có thể khẳng
định rằng vector tái tổ hợp pCAM-dps-dxs đã được đưa vào thành công trong A.
tumefaciens. Dòng số 12 được ký hiệu là A. tumefaciens DPXS12.
M

1

3,0 2,0 -

Kb

M

2

3

M

2100bp

-

Kb

- 3,0
- 2,0

3,0 1077 bp 

2,0 -

- 1,0

1077 bp

1,0 0,5 -

- 0,5

A

B

C

Hình 3.9. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A, giếng 1) và dxs (B, giếng 2), sản phẩm cắt
enzyme hạn chế SacI/BamHI (C, giếng 3) từ DNA plasmid của A. tumefaciens DPSX12. M, thang DNA
chuẩn 100 bp (Thermo Scientific)

3.3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP
COQ10 TỪ A. TUMEFACIENS TÁI TỔ HỢP
3.3.1. Ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng đến khả năng sinh tổng
hợp CoQ10
Khi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng
sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens trên môi trường với các loại đường khác
nhau. Kết quả thể hiện trên hình 3.10A và 3.10B cho thấy, trong môi trường có chứa
nguồn cacbon là sucrose cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (16 mg/l) và nồng độ
đường sucrose 5% cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất.
Cũng tương tự như thế khi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn
nitơ tới khả năng sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens. Kết quả thể hiện trên hình
3.10C và 3.10D cho thấy, trong môi trường có chứa nguồn nitơ là cao ngô (CSL) cho
sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (26,68 mg/L) và nồng độ cao ngô 1% cho sinh tổng
hợp CoQ10 cao nhất.
10


A
CoQ10 (mg/L)

CoQ10 (mg/L)

18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

B

0.0%

C

7.5%

10%

D

60

25

50
CoQ10 (mg/L)

CoQ10 (mg/L)

5.0%

Nồng độ sucrose (w/v)

Nguồn cacbon (đƣờng)

30

2.5%

20
15
10
5

40
30
20
10

0

0

0.5%
Nguồn nitơ

1%

2%

3%

4%

5%

Nồng độ CSL (w/v)

Hình 3.10. Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A), nồng độ sucrose (B), nguồn nitơ (C), nồng độ
CSL(D) đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp.

3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đầu môi trƣờng
Kết quả hình 3.11A cho thấy, với pH đầu là 8,0 hàm lượng CoQ10 thu được là

cao nhất đạt 68,8 mg/L, vì vậy pH đầu là 8,0 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp
theo.
3.3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống
Kết quả hình 3.11B cho thấy, hàm lượng CoQ10 thu được cao nhất đạt khi OD =
0,8 đạt 108 mg/l cao gấp 1,6 lần so với OD = 0,05. Vì vậy tỷ lệ cấp giống với OD =
0,8 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy
Kết quả hình 3.11C cho thấy, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CoQ10 của A.
tumefaciens DPXS12 là 28oC. Vì vậy cứu nhiệt độ 28oC được lựa chọn cho các
nghiên cứu tiếp theo.
3.3.5. Ảnh hƣởng của thời gian
Từ kết quả hình 3.11D cho thấy, thời gian lên men càng tăng thì hàm lượng
CoQ10 được sinh tổng hợp cũng tăng. Tuy nhiên hàm lượng CoQ10 thu được từ 96
giờ đến 144 giờ tăng không đáng kể, sau 144 giờ hàm lượng CoQ10 chỉ tăng 1,03%
11


(tăng 2,57 mg/L) so với 96 giờ lên men. Từ kết quả thu được thời gian 96 giờ được
lựa chọn để thu nhận CoQ10 trong quá trình lên men.
80

A

60
50
40
30
20

100

80
60
40
20

10
0

0
6.0

140

6.5

7.0
pH

7.5

8.0

0.05 0.1

B
CoQ10 (mg/l)

120
100
CoQ10 (mg/L)

C

120
CoQ10 (mg/L)

CoQ10 (mg/L)

70

80
60
40
20
0

20

25

28
30
Nhiệt độ (độ C)

140
120
100
80
60
40

20
0

0.2

0.8

1.2

1.6

2.0

D

0

37

0.4

OD giống

24

48

72

96

120 144

Thời gian (giờ)

Hình 3.11. Ảnh hưởng của pH đầu môi trường (A), OD giống (B), nhiệt độ nuôi cấy (C), thời gian
(D) đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp.

3.4. TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COQ10 TỪ A.
TUMEFACIENS
3.4.3. Tối ƣu hóa quá trình sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp

Dựa trên cơ sở đã khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên men sinh
tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp, tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời
của nồng độ đường sucrose (X1), nồng độ cao ngô (X2), nhiệt độ (X3) . Kết quả được
thể hiện trên bảng 3.3.
Phương trình hồi quy biểu diễn hàm lượng CoQ10 mô tả ảnh hưởng của các yếu
tố độc lập và các mối tương tác giữa chúng được biểu diễn như sau:
Hàm lượng CoQ10= - 634,73 + 36,11.X1 + 32,92.X2 + 344,62.X3 + 4,2.X1X2 0,32.X1X3 + 3,66.X2X3 – 2,78.X12 – 75,27.X22 – 81,98.X32

12


Bảng 3.1. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng CoQ10 thu được

TN
1
2
3
4

5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

Nồng độ
sucrose (%)
2,5
2,5
7,5
7,5
5,0
5,0
5,0
5,0
2,5
7,5
2,5
7,5
5,0
5,0

5,0
5.0
5.0

Nồng độ cao
ngô (%)
0,5
1,5
0,5
1,5
0,5
1,5
0,5
1,5
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1.0
1.0

Nhiệt độ
(oC)
28
28
28
28

24
24
32
32
24
24
32
32
28
28
28
28
28

Hàm lượng CoQ10
(mg/l)
82,885
78,048
90,872
107,285
93,571
85,433
93,571
109,518
78,912
101,791
95,831
105,901
127,177
124,478

126,506
126,58
125,35

Từ kết quả trên dựa vào phương pháp tối ưu hóa tìm được điều kiện lên men tối ưu
nhất: nồng độ sucrose 5 %, nồng độ bột cao ngô 1 % và nhiệt độ 28oC. Khi đó, hàm
lượng CoQ10 đạt được 127,18 mg/l.
3.5. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT COENZYME Q10 TỪ CHỦNG
A. TUMEFACIENS TÁI TỔ HỢP
3.5.1. Đánh giá các phƣơng pháp phá vỡ tế bào
Hiệu quả phá vỡ tế bào sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất tách chiết CoQ10.
Trong nghiên cứu này màng tế bào A. tumefaciens được phá vỡ bằng bốn phương
pháp khác nhau bao gồm siêu âm, xử lý bằng axit HCl theo mô tả của Tian, xử lý
bằng ethanol theo mô tả của Ranadive và xử lý bằng enzyme theo mô tả của Zahiria
kết hợp với các bước tách chiết. Kết quả được biểu diễn trên hình 3.12.
Kết quả cho thấy phương pháp xử lý tế bào bằng ethanol cho hiệu quả thu nhận
CoQ10 cao hơn so với các phương pháp khác được sử dụng. Tương tự như những vi
khuẩn Gram âm khác, A. tumefaciens có chứa một lớp màng trong và màng ngoài
mỏng do đó dưới tác động của ethanol sẽ làm các tương tác kỵ nước trên màng bị yếu
đi dẫn đến cấu trúc màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nằm trên
màng hoặc trong màng ra môi trường. Vì vậy, phương pháp xử lý tế bào bằng ethanol
đã được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu tối ưu và sử dụng trong các nghiên cứu tiếp
theo.
13


0.60

COQ10 (mg/g)

0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
Siêu âm

HCl

EtOH

Enzyme

Phƣơng pháp xử lý tế bào

Hình 3.12.Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào

3.5.2. Xác định điều kiện xử lý tế bào bằng ethanol
3.5.2.1. Xác định tỷ lệ ethanol/sinh khối
Kết quả cho thấy hàm lượng CoQ10 được chiết xuất tăng lên khi tỷ lệ
ethanol/sinh khối tăng (hình 3.13A). Khi so sánh hàm lượng CoQ10 thu được với các
tỷ lệ chiết khác nhau cho thấy tỷ lệ 10:1 cao hơn 1,32 lần (tương đương 24,3%) so
với tỷ lệ 5:1, trong khi đó hàm lượng CoQ10 thu được ở tỷ lệ 15:1 chỉ cao hơn so với
tỷ lệ 10:1 là 1,08 lần. Từ kết quả thu được tỷ lệ ethanol/sinh khối (10 ml/g) sẽ được
sử dụng để tách chiết CoQ10 trong các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.2.2. Xác định thời gian đồng hóa
Kết quả hình 3.13B cho thấy hàm lượng CoQ10 thu được tăng lên khi thời gian
đồng hóa tăng và đạt cao nhất ở thời gian 3 phút. Tuy nhiên khi thời gian đồng hóa
tăng tiếp thì hiệu quả thu hồi CoQ10 lại giảm. Sự giảm này có thể là do tác động của

sóng siêu âm trong thời gian dài đã làm phá hủy cấu trúc của CoQ10.
3.5.2.3. Xác định nhiệt độ xử lý
Kết quả hình 3.13C cho thấy khi nhiệt độ ủ tăng lên thì hàm lượng CoQ10 thu
được cũng tăng (1,15 và 1,17 lần ở 37 oC và 60oC tương ứng so với điều kiện 25oC.
Từ kết quả nhận được, chúng tôi thấy rằng nhiệt độ 37oC là phù hợp để thực hiện xử
lý tế bào bằng ethanol.
Từ các kết quả thu được trong nghiên cứu này, quy trình tách chiết CoQ10 từ
sinh khối A. tumefaciens đã được xác lập và mô tả tóm tắt như sau: trộn sinh khối vi
khuẩn với ethanol 100% theo tỷ lệ 10:1 (v/w), đồng hóa bằng siêu âm 3 phút, ủ ở
nhiệt độ 37oC trong 3 giờ, ly tâm loại bỏ xác tế bào, chiết với hexane theo tỷ lệ 1:1,
cô đặc chân không ở 45oC.

14


5:1
10:1
15:1
Tỷ lệ ethanol/sinh khối
(ml/g)

1

1

0.8

0.8
CoQ10 (mg/g)

CoQ10 (mg/g)

CoQ10 (mg/g)

0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

0.6
0.4
0.2

0.6
0.4
0.2
0

0
1

2
3
5
10

Thời gian (phút)

15

25

37
60
Nhiệt độ (oC)

C
A
B
Hình 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/sinh khối (A), thời gian đồng hóa (B), nhiệt độ xử lý (C)
đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp.

3.5.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10
3.5.3.1. Đánh giá so sánh độ sạch của dịch chiết Coenzyme Q10
CoQ10 thu được theo quy trình trên được phân tích và định lượng trên hệ thống
HPLC với các điều kiện sắc ký như sau: Pha động A: Metanol 100%. Pha động B:
Ethanol 100%. Cột C18 kích thước 250 mm x 4 mm nhồi hạt với kích thước 5μm.
Nhiệt độ cột 35oC, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl, detector UV – Vis tại
bước sóng 275 nm. Kết quả được thể hiện trên hình 3.14A, 3.14B
A

B

Hình 3.14. Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A) và dịch chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp (B)

Kết quả cho thấy với bước sóng hấp thụ cực đại của CoQ10 (275 nm), chỉ thấy

xuất hiện một số đỉnh phụ rất nhỏ so với đỉnh chính CoQ10 trên phổ sắc ký HPLC.
So sánh với phổ CoQ10 chuẩn của hãng Sigma có thể thấy rằng dịch chiết CoQ10 là
tương đối sạch khi so sánh ở bước sóng 275 nm.
Tuy nhiên, trong dịch chiết còn có thể có chứa các hợp chất khác không hấp
thụ cực đại tại bước sóng 275 nm. Do đó để đánh giá độ sạch, dịch chiết được phân
tích bằng phương pháp quét phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm và so sánh với
CoQ10 chuẩn. Kết quả cho thấy phổ hấp phụ của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn
đều xuất hiện một đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 275 nm, đây chính là đỉnh
CoQ10. Khi so sánh phổ hấp thụ này so với dịch CoQ10 chuẩn chúng tôi thấy hoàn
toàn tương tự. Tuy nhiên, ngoài đỉnh chính (bước sóng 247 – 309) thì cường độ hấp
15


thụ dịch chiết CoQ10 cao hơn so với CoQ10 chuẩn (hình 3.15), điều đó chứng tỏ
trong dịch chiết vẫn còn lẫn tạp chất. Phân tích tổng thể phổ hấp thụ (ngoại trừ đỉnh
CoQ10) cho thấy cường độ hấp thụ của mẫu CoQ10 tách chiết cao hơn 2,59 lần so
với CoQ10 chuẩn.
3.0

L1

Cường độ hấp thụ

2.5

S

2.0
1.5
1.0

0.5
0.0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
Bước sóng (nm)

Hình 3.15. So sánh độ sạch của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn. (L1) dịch chiết CoQ10 từ sinh
khối vi khuẩn, (S) dịch CoQ10 chuẩn

3.5.3.2. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 theo phương pháp chiết bằng
dung môi
Trong nghiên cứu này, hệ dung môi để chiết tinh sạch CoQ10 là ethanol:hexane
theo tỷ lệ 1:1 về thể tích. Dịch chiết CoQ10 với các lần chiết khác nhau: 1, 2, 3 được
phân tích bằng phương pháp quét phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm. Kết quả so
sánh phổ hấp thụ dịch chiết thu được tương ứng với số lần chiết cho thấy cường độ
phổ hấp thụ của dịch chiết với 3 lần chiết thấp hơn khoảng 3,25 lần so với 1 lần chiết
và 1,62 lần so với 2 lần chiết (hình 3.16A). Điều đó chứng tỏ dịch chiết CoQ10 với 3
lần chiết sạch hơn so với 1 và 2 lần chiết.

Cường độ hấp thụ

2.5
2.0

L1

L2

3.0

L3

A

1.5
1.0
0.5

2.5
Cường độ hấp thụ

3.0

0.0

2.0

L1

L3

S

B

1.5
1.0
0.5
0.0

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800

Bước sóng (nm)

Bước sóng (nm)

Hình 3.16. Phổ hấp thụ dịch chiết CoQ10 theo số lần chiết khác nhau (A). So sánh độ sạch của dịch

tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 1 lần chiết, L3,
dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết, S dịch CoQ10 chuẩn (B)
16


Tiến hành phân tích phổ hấp thụ của dịch tinh sạch và so sánh với phổ hấp thụ
CoQ10 chuẩn. Kết quả phổ hấp thụ ở bước sóng 309 – 800 nm của dịch chiết sau 3
lần chiết có sự giảm rõ rệt và gần tương đương như cường độ hấp thụ của dịch
CoQ10 chuẩn. Trong giải bước sóng 309 – 800 nm, cường độ hấp thụ giảm từ 5,46
lần (đối với dịch chiết 1 lần chiết) xuống còn 1,93 lần (đối với dịch chiết 3 lần chiết)
so với dịch CoQ10 chuẩn. Phân tích tổng thể, cường độ hấp thụ giảm từ 2,59 xuống
1,91 đối với dịch chiết 3 lần chiết lần so với CoQ10 chuẩn. Từ kết quả thu được cho
thấy phương pháp chiết bằng 3 lần chiết đã thu được dịch chiết CoQ10 sạch hơn đặc
biệt là loại bỏ được các tạp chất hấp thụ ở bước sóng từ 309 – 800 nm. Phương pháp
này tương đối đơn giản và sử dụng hệ dung môi rẻ không độc hại nên có thể được áp
dụng ở quy mô lớn để tách chiết và tinh sạch CoQ10.
3.5.3.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 theo phương pháp sắc ký lọc
gel qua cột silica
Trong nghiên cứu này, dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết được tiếp tục tinh sạch
sử dụng sắc ký cột silica gel. Kết quả cho thấy cường độ phổ hấp thụ của dịch CoQ10
sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica giảm đi ở cả hai vùng bước sóng 200-248 nm

và 309-800 nm. Cường độ hấp thụ trong dải bước sóng 200-248 nm giảm khoảng
13% sau khi tinh sạch; trong khi đó cường độ hấp thụ trong dải bước sóng 109 –
800nm giảm 58%. Phân tích tổng thể cho thấy cường độ hấp thụ giảm đi khoảng 24
% trong mẫu tinh sạch bằng silica gel (hình 3.17).
3.0
L3

S

E

Cường độ hấp thụ

2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
Bước sóng (nm)
Hình 3.17. So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L3, dịch chiết CoQ10 từ
sinh khối vi khuẩn sau 3 lần chiết; E1, dịch CoQ10 sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica gel; S,
dịch CoQ10 chuẩn

17


Khi so sánh với CoQ10 chuẩn, cường độ hấp thụ của dịch tinh sạch chỉ còn cao
hơn là 1,46 lần và thấp hơn nhiều so với dịch CoQ10 chiết 1 lần (2,59) và dịch chiết 3

lần chiết (1,91).
3.5.4. Quy trình thu nhận Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp
Dựa vào các kết quả nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy, phương pháp tách
chiết CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp luận án đã xây dựng quy trình thu nhận
CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp như hình 3.18.
A. tumefaciens tái tổ hợp

Lên men
(28 C, pH đầu 8, cấp giống OD
giống 0.8, thời gian 96 giờ
o

Ly tâm
thu sinh khối
Ethanol
100%
Phá vỡ tế bào
Trộn sinh khối với ethanol tỷ lệ 10:1 ml/g,
đồng hóa 3 phút, ủ 37o trong 3 giờ
n –hexan
tỷ lệ 1:1

Ly tâm thu dịch
Tách chiết
n-hexane tỷ lệ 1:1 (v/v)
Cô đặc chân không, áp suất 260
mbar, nhiệt độ 45oC
Tinh sạch
Chiết bằng ethanol:hexane, cô đặc, tinh
sạch bằng cột silica

Cô đặc chân không, áp suất 260
mbar, nhiệt độ 45oC
Chế
phẩmCoQ10
Hình 3.18. Quy trình thu nhận CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp

18


3.6. KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH HÓA LÝ CỦA COENZYME Q10
Nghiên cứu đặc tính cho thấy CoQ10 CoQ10 bền nhiệt 4 – 60oC, bền trong vùng
pH 6 – 9, bị phá hủy bởi ánh sáng mặt trời và ánh sáng huỳnh quang (hình 3.39, 3.40,
3.41).
120

120

100

Độ bền tương đối (%)

Độ bền tương đối (%)

100
80

A

60
40

20

4oC

25oC

37oC

24h

48h

72h

96h

120h

B

60
40
20

60oC

0
0h

80

pH 5

pH 6

pH 7

pH 8

pH 9

0

144h

0h

24h

Thời gian (giờ)

48h

72h

96h

120h

Thời gian (giờ)

Độ bền tương đối (%)

120

100
80

C

60
40

20

Che tối

Chiếu sáng Leon

Chiếu sáng mặt trời

0
0h

24h

48h

72h

96h

120h

144h

Thời gian (giờ)

Hình 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ(A), pH (B), ánh sáng (C) đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ
tế bào A. tumefaciens tái tổ hợp.

3.7. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA COENZYME Q10
3.7.1. Hoạt tính chống oxy hóa của CoQ10
Hoạt tính chống oxy hóa của CoQ10 có thể được xác định thông qua việc làm
giảm màu của thuốc thử DPPH, được xác định bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sóng
517 nm trên máy quang phổ. Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxi hóa của Coenzyme
Q10 tăng khi nồng độ Coenzyme Q10 tăng dần. Dựa trên kết quả tính toán, tại nồng
độ 0,18 mM Coenzyme Q10 có khả năng làm giảm 50% gốc tự do 0,5 mM DPPH
(EC50 = 0,18 mM).
3.7.2. Khả năng ức chế tế bào ung thƣ của CoQ10
Ảnh hưởng của CoQ10 đến tế bào ung thư được đánh giá thông qua tỷ lệ tế bào
còn sống sau khi xử lý với CoQ10. Kết quả hình 3.20 cho thấy CoQ10 ảnh hưởng ít
đến sự sinh trưởng của cả hai dòng tế bào ung thư ở nồng độ dưới 20 µM sau 72 giờ
xử lý. Tuy nhiên ở nồng độ cao hơn 40 và 80 µM, CoQ10 đã có sự ảnh hưởng rõ rệt
19


lên cả hai dòng tế bào ung thư. Đối với tế bào Hep-2C, tỷ lệ tế bào còn sống sau 48
giờ và 72 giờ xử lý ở nồng độ 40 µM là 35,1 và 27,1%; ở nồng độ 80 µM là 29,4 và
14,7% tương ứng. Đối với dòng tế bào FL, tỷ lệ tế bào còn sống sau 48 giờ và 72 giờ

xử lý ở nồng độ 40 µM là 50,8 và 26,1% tương ứng; 100% tế bào bị chết ở nồng độ
80 µM sau 48 giờ xử lý. Kết quả nghiên cứu trên dòng tế bào thận thỏ bình thường
RK13 cho thấy tế bào sinh trưởng hoàn toàn bình thường ở các nồng độ khảo sát.
Số lượng tế bào/ giếng

A
700000

Con trol

5 uM

10 u M

20 u M

40 u M

80 u M

600000
500000

20 µM

0 µM

80 µM

400000

300000
200000

100000
0
0h

24h
48h
Thời gian (giờ)

Số lượng tế bào/ giếng

B

500000
450000
400000
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0

Control
0 µM

0h
C

Số lượng tế bào/ giếng

300000

Con trol

5 uM

10 uM
20 µM

20 uM

72h

40 uM

80 µM

24h
48h
Thời gian (giờ)
5 uM

80 uM

10 u M

20 u M

72h
40 u M

80 u M

250000
0 µM

20 µM

0h

24h
48h
Thời gian (giờ)

80 µM

200000

150000
100000
50000
0
72h

Hình 3.20. Ảnh hưởng của CoQ10 lên dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2C (A), FL (B) và tế bào
thận thỏ bình thường RK13 (C). Một số hình ảnh tế bào đại diện ở nồng độ 0, 20 và 80 µM CoQ10

20


3.8. ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG DƢỚI DẠNG VIÊN NANG
3.8.1. Nghiên cứu tạo phức hợp Coenzyme Q10 với β-Cyclodextrin
Cyclodextrin là một chất có bề mặt ưa nước ở phía ngoài và phần kỵ nước nằm
bên trong, do đó nó có thể hình thành phức với các hợp chất ưa béo và làm tăng độ
hòa tan trong nước, độ bền, hoạt tính sinh học của chúng. Dạng hòa tan trong nước
của CoQ10 sẽ tăng khả năng hấp thu vào tế bào và đồng thời tăng cường quá trình hô
hấp của ty thể. Vì vậy, CoQ10 đã được tạo phức với β-cyclodextrin với các tỷ lệ mol
khác nhau (1:1, 1:3, 1:5, 1:10). Để lựa chọn tỷ lệ mol CoQ10: β-CD thích hợp tiến
hành đánh giá tỷ lệ thu hồi của CoQ10 từ các công thức thông qua hàm lượng CoQ10
trước và sau khi sấy phun. Kết quả cho thấy tỷ lệ CoQ10: β-CD 1:5 và 1:3 cho khả
năng thu hồi CoQ10 cao hơn đáng kể so với các tỷ lệ khác. Trong đó, tỷ lệ 1:5 khả
năng thu hồi CoQ10 là cao nhất đạt 99%.
3.8.2. Khảo sát một số đặc tính phức CoQ10- β- Cyclodextrin
3.8.2.1. Khả năng hòa tan của phức CoQ10- β- Cyclodextrin
Kết quả nghiên cứu khả năng hòa tan trong nước của phức β-CDQ10 cho thấy
khả năng hòa tan tăng lên khi tỷ lệ tạo phức giữa CoQ10 và β-CD tăng. Với tỷ lệ 1:1
và 1:3, dung dịch β-CDQ10 xuất hiện kết tủa sau 60 phút, trong khi đó tỷ lệ 1:5 –
1:20 không thấy xuất hiện sự lắng cặn này.
Kết quả nghiên cứu khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong các pH khác
nhau cho thấy mức độ hòa tan là phụ thuộc vào pH và tỷ lệ giữa CoQ10: β-CD. Ở pH
thấp (pH ≤ 5), mức độ hòa tan kém hơn so với ở pH 6 và 7. Mức độ hòa tan của tỷ lệ
1:1 và 1:3 kém trong tất cả các pH khảo sát (pH 2-7). Tỷ lệ 1:5 có khả năng hòa tan
tốt ở pH 6-7, giảm đi ở pH 2-5.

120

120

100

100

CoQ10 còn lại (%)

CoQ10 còn lại (%)

3.8.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phức CoQ10- β- Cyclodextrin

80

60
40
20

4oC

25oC

37oC

60oC

0

80
60
40

Che tối
Chiếu sáng Leon
Chiếu sáng mặt trời

20
0

0

24

48
72
96
Thời gian (giờ)

120

144

0

A

24

48
72
96
Thời gian (giờ)
B

Hình 3.21. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A), ánh sáng (B) đến độ bền của CoQ10
21

144


Kết quả hình 3.21A cho thấy hàm lượng CoQ10 hầu như không thay đổi sau 144
giờ ở điều kiện nhiệt độ từ 4 – 60oC. Từ kết quả thu được có thể thấy phức CoQ10CD có tính bền nhiệt cao, điều này có ý nghĩa cho quá trình tạo chế phẩm CoQ10,
bảo quản cũng như ứng dụng của CoQ10 sau này.
3.8.2.3. Ảnh hưởng của ánh sáng tới phức CoQ10- β- Cyclodextrin
Kết quả cho thấy khi bị chiếu sáng huỳnh quang hàm lượng CoQ10 giảm 45,4 %
sau 144 giờ chiếu sáng (hình 3.21B). Tuy nhiên mức độ giảm thấp hơn khoảng 2 lần
so với CoQ10 tự do. Khi bị chiếu sáng bởi ánh sáng mặt trời theo ngày đêm hàm
lượng CoQ10 giảm đến 45% sau 96 giờ. Tương tự, sự tổn thất của CoQ10 trong phức
β-CDQ10 thấp hơn CoQ10 ở trạng thái tự do. Như vậy, việc tạo phức với β-CD làm
tăng đáng kể độ bền của CoQ10 dưới tác dụng của ánh sáng.
3.8.3. Xây dựng quy trình điều chế viên nang cứng chứa Coenzyme Q10
Dựa vào các kết quả nghiên cứu tạo phức CoQ10 với β-cyclodextrin. Quy
trình công nghệ điều chế thực phẩm chức năng bổ sung dưới dạng viên nang cứng
chứa CoQ10 được thể hiện trên hình 3.22.
CoQ10
β – cyclodextrin
Tạo phức với β – cyclodextrin
tỷ lệ 1:5 (mol/mol)

Khuấy trộn trong 60 phút, nhiệt độ 60oC

Sấy phun
Nhiệt độ đầu vào 105oC, đầu ra 60oC
Maltodextrin
Phối trộn, đóng viên nang,
bao gói

Sản phẩm viên
nang cứng
CoQ10
Hình 3.22. Quy trình công nghệ sản xuất viên nang thực phẩm chức năng chứa CoQ10
22


3.8.4. Kiểm nghiệm viên nang chứa CoQ10
Các kết quả thu được khi tiến hành kiểm nghiệm viên nang thực phẩm chức năng
CoQ10 về các tiêu chí: độ đồng đều khối lượng, độ tan rã, độ ẩm, độ đồng đều hàm
lượng đều đạt tiêu chuẩn yêu cầu của viên nang theo dược điển Việt Nam IV.
Kiểm tra phân tích chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm: Viên nang thực phẩm
chức năng chứa CoQ10 từ sinh khối A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp đã được Viện
Dinh dưỡng phân tích các chỉ tiêu an toàn thực phẩm. Kết quả được trình bày trong
bảng 3.2 cho thấy sản phẩm đạt chỉ tiêu chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm.
Bảng 3.2. Kết quả phân tích viên nang thực phẩm chức năng CoQ10
TT
1
2
3

Chỉ tiêu phân tích

Tổng số vi khuẩn hiếu khí
Coliforms
E. coli

Đơn vị
CFU/g
CFU/g
CFU/g

Kết quả
KPH
KPH
KPH

4

S. aureus

CFU/g

KPH

5
6
7
8
9
10
11
12

13
14

Shigella spp
CFU/25g
B. cereus
CFU/g
Salmonella
CFU/25g
Tổng số bào tử nấm men, CFU/g
mốc
Aflatoxin G1
μg/kg
Aflatoxin B1
μg/kg
Aflatoxin G2
μg/kg
Aflatoxin B2
μg/kg
Chì
μg/kg
Thủy ngân
μg/kg

15

Cadimi

μg/kg

KPH
KPH
KPH
KPH
KPH
KPH
KPH
KPH
0,120
0,040

Phương pháp
TCVN 4884:2005
TCVN 6848:2007
TCVN
79242:2008
TCVN
48301:2005
TCVN 7902:2008
TCVN 4992:2005
TCVN 4829:2005
TCVN
82752:2010
AOAC 990.33

AOAC 991.10

0,028

Thử nghiệm độc tính cấp của viên nang thực phẩm chức năng Coenzyme Q10

trên chuột. Cho chuột uống mẫu thử với mức liều từ 5 – 20 viên/kg chuột. Kết quả
không nhận thấy biểu hiện khác thường so với nhóm chứng, không nhận thấy có biểu
hiện ngộ độc trên chuột thí nghiệm trong thời gian theo dõi. Tất cả chuột đều ăn
uống, hoạt động và tăng trọng bình thường. Không xác định được liều gây chết 50%
động vật thí nghiệm (LD50) vì mẫu thử không gây chết chuột thử nghiệm ở mức liều
tối đa nhất có thể cho uống.

23


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Luận án đã thu được những kết quả chính như sau:
1. Từ 12 chủng vi khuẩn phân lập được từ nốt sần cây hoa hồng huyện Tây Tựu –
Hà Nội đã tuyển chọn được chủng A. tumefaciens TT4 có khả năng sinh tổng
hợp CoQ10 cao cho nghiên cứu tiếp theo.
2. Đã tách dòng và giải trình tự được 2 gen dxs và dps mã hóa cho 2 enzyme chìa
khóa của con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A. tumefaciens TT4 phân
lập ở VN và tạo được chủng A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp mang 2 gen
trên cho năng suất sinh tổng hợp CoQ10 cao.
3. Xác định được điều kiện thích hợp nuôi cấy chủng A. tumefaciens DPXS12 tái
tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10: sucrose 5 %, CSL: 1%, nhiệt độ 28 oC, pH đầu 8,
OD cấp giống 0.8, thời gian 96 giờ, hàm lượng CoQ10 thu được đạt 127,18
mg/l.
4. Xây dựng được quy trình tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp:
Ethanol 100% theo tỷ lệ 10:1 (v/w), đồng hóa bằng siêu âm 3 phút, ủ ở nhiệt
độ 37oC trong 3 giờ, chiết bằng hexane theo tỷ lệ 1:1, cô đặc chân không ở
45oC, tinh sạch bằng hệ dung môi ethanol:hexane và cột silica.
5. Đã xác định được một số đặc tính hóa lý và hoạt tính sinh học của CoQ10 từ
A. tumefaciens tái tổ hợp. CoQ10 bền nhiệt 4 – 60oC, bền trong vùng pH 6 – 9,
không bền bởi ánh sáng mặt trời và ánh sáng huỳnh quang, có khả năng chống

oxy hóa thông qua khử gốc tự do DPPH (EC50 = 0,18 mM). Bước đầu chứng
minh được CoQ10 có khả năng ức chế hai dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep2C và FL.
6. Đã tạo được phức CoQ10 - β-cyclodextrin để hòa tan tốt trong nước và ứng
dụng trong chế tạo viên nang dạng thực phẩm chức năng.
Kiến nghị:
Tiếp tục khảo sát một số hoạt tính sinh học cũng như khả năng ứng dụng của
CoQ10 trong thực phẩm chức năng như sữa tươi và đồ uống có bổ sung
CoQ10.

24