Đề tài Các phương pháp nhân giống in vitro lan Hồ Điệp

Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp

Phần I: Mở Đầu
Cuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu tạo một gốc vườn nhỏ mang màu xanh
cây lá thiên nhiên vào trong nhà của người dân ngày càng cao.Vốn nhiều họ, nhiều
chủng loại, màu sắc phong phú lại tốn ít diện tích nên việc chọn trồng và tạo một vườn
lan nhỏ trong khuôn viên nhà là sự lựa chọn của nhiều cá nhân, nhiều hộ gia
đình.Trong số những loại phong lan được nuôi trồng ở nước ta hiện nay, bên cạnh
những loài tương đối dễ trồng như Mokaro, Dendro, lan Vũ Nữ…thì vẫn có những loài
lan thích hợp với một số khu vực địa lý nhất định, cụ thể là Địa Lan – loài hoa chỉ có
thể nuôi trồng trong điều kiện lí tưởng của Đà Lạt .[4]
Không quá kén chọn và hạn chế nơi trồng như Địa Lan song Hồ Điệp cũng là
một trong những giống lan quý lại khó trồng. Do đó, đòi hỏi người trồng phải có đôi
chút am hiểu về loài hoa này.Thích hợp với điều kiện trong nhà lại là một trong những
giống lan được yêu thích không chỉ về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một nét đẹp
rất sang trọng, trang nhã. Chính vì vậy, Hồ Điệp đã nhanh chống trở thành sản phẩm
trồng trọt được nhiều người ưa chuộng và mang lại hiệu quả kinh tế cao không chỉ ở
Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới như:Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản,
Mỹ…Bên cạnh đó, hoa Hồ Điệp rất lâu tàn, độ bền bông cao, giàu sức quyến rũ nên
nó đã được lựa chọn làm vật trang trí, tạo cảnh quan trong các ngày lễ, tết.Vốn là một
loài rất khó nhân giống bởi Hồ Điệp thường cho hệ số nhân rất thấp trong điều kiện
vườn ươm. Để có được số lượng lớn cây giống đồng đều và sạch bệnh đáp ứng nhu
cầu thị trường là một vấn đề thật nan giãi. Do đó, việc nhân giống bằng kỷ thuật nuôi
cấy mô ra đời tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh, giá cả lại
phải chăng là rất hữu ích.
Xuất phát từ thực tiễn này cộng với sự đam mê của chính bản thân mình, tôi đã
tiến hành tìm kiếm sưu tập từ đó đưa ra đề tài: “Các phương pháp nhân giống in vitro
lan Hồ Điệp”.

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

1


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp

Phần II: Nội Dung
II.1. Tổng quan tài liệu
1.1. Lịch sử và thành tựu của ni cấy mơ [5]
1.1.1. Trên thế giới
 Năm 1902, nhà thơng thái Haberlant lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mơ của
sinh vật ra ngồi cơ thể nhưng ơng đã dùng tế bào q chun biệt nên khơng thành
cơng. Mơ động vật được cấy trước tiên do A.Carrel(1919), đến năm 1934 mơ thực vật
mới được ni cấy.
 Năm 1934 White đã thành cơng trong việc phát hiện ra sự sống vơ hạn của việc
ni cấy tế bào rễ cà chua.
 Năm 1964 Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ ni cấy chồi ngọn. Ơng đã
thành cơng trơng việc chuyển cây con của cây sen cạn và cây White Lupin từ mơi
trường ni cấy tối thiểu, tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hồn chỉnh. Sau đó,
nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá những thành phần dinh dưỡng qua trọng cần thiết
cho sự phát triển của tế bào được ni cấy (White (1951),Gauthere (1939),Van
Overbeck (1941), Steward và Caplin (1951)).
 Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự
nảy chồi.
 Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến mơi trường ni cấy đánh dấu một
bước tiến trong kỷ thuật ni cấy mơ. Mơi trường của họ dùng làm cơ sở cho việc
ni cấy nhiều loại cây và vẫn còn sử dụng rộng rải cho đến ngày nay.
 Năm 1960-1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vơ tính lan bằng ni cấy
đỉnh sinh trưởng.Từ kết quả đó, lan được xem là cây ni cấy mơ đầu tiên được

thương mại hố. Từ đó đến nay, cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật đã được phát
triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác (Haramaki(1971), Murashige(1972), Miller
và Murashige (1976)) và được ứng dụng thương mại hóa.
1.1.2. Ở Việt Nam
Ni cấy mơ tế bào thực vật đã được phát triển ở Việt Nam sau chiến tranh thế
giới kết thúc (1975). Phòng thí nghiệm ni cấy mơ và tế bào đầu tiên được xây dựng
đầu tiên ở viện sinh học, viện khoa học Việt Nam(KHVN) do tiến sĩ Lê Thị Muội
đứng đầu. Bước đầu tập trung nghiên cứu những vấn đề cơ bản như ni cấy bao phấn,
ni cấy mơ sẹo và protoplast. Các kết quả đầu tiên về ni cấy thành cơng bao phấn
lúa và thuốc lá được cơng bố năm 1978 (Lê Thò Muội và cs,, 1978; Lê Thò Xuân
và cs,, 1978). Tiếp đó là thành cơng về protoplast ở thuốc lá và khoai tây (Lê Thị Muội
và Nguyễn Đức Thành(1978),Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội 1980,1981).Trong
cùng thời gian tại phân viện KHVN tại Tp.HCM, muội hơn nửa là tại Đại học Nơng
SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

2


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
Nghiệp I (ĐHNNI) Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam
(KHKTNNVN) và các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào cũng được thành lập
chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây . Hiện nay, chúng ta có rất nhiều phòng
thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các trường đại học các viện nghiên cứu (viện
Di Truyền Nông Nghiệp(DTNN), viện Rau Quả Trung ương(RQTƯ)) mà ở cả một số
tỉnh và cơ sở sản xuất(Yên Bái ,Hưng Yên, Thanh Hóa….). Giữa những năm 1980 trở
lại đây, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật phát triển
mạnh. Những kết quả khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây(viện
Công Nghệ Sinh Học (CNSH), ĐHNNI, viện KHKTNNVN), dứa, chuối, mía (viện

CNSH, ĐHNNI, viện KHKTNNVN, viện RQTƯ) một số cây hoa phong lan (phân
viện CNSH thành phố Hồ Chí Minh), Hồng, Cúc, Cẩm Chướng(viện CNSH, viện
DTNN) và cây công nghiệp như bạch đàn (viện DTNN, viện Lâm Nghiệp). Một số kết
quả bước đầu đã ghi nhận trong lỉnh vực chọn dòng tế bào như chọn dòng tế bào
kháng bệnh (Lê Bích Thủy và cs,, 1994), chọn dòng chịu muối ,chịu mất nước
(Nghuyễn Tường Vân và cs ,,1994; Đinh Thị Phòng và cs,, 1994). Các kết quả về dung
hợp cây lai tế bào chất và chuyển gen lục lạp củng thu được kết quả lý thú (Nguyễn
Đức Thành và cs,, 1988; Nguyễn Đức Thành và cs,, 1993, 1997) nuôi cấy bao phấn để
tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều ở viện CNSH và DTNN. Nuôi cấy các dược
liệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các tế bào có hàm lượng các chất sinh học quan
trọng cao cũng đã và đang phát triển.
1.2. Các giai đoạn nhân giống invitro [5]
Cho tới nay việc nhân giống invitro đã áp dụng cho nhiều loại cây (350 loài,
Murashige (1974) chia quy trình nhân giống ra làm 4 giai đoạn :
 Nuôi cấy khởi đầu, tái sinh chồi, cụm chồi.
 Nhân nhanh chồi, cụm chồi trong điều kiện invitro.
 Tạo cây con hoàn chỉnh, huấn luyện cây con.
 Phục hồi, chuyển cây ra trồng trong điều kiện tự nhiên.
1.3. Các phương pháp nhân giống invitro [5]
1.3.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực
vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và nuôi cấy chồi bên).
Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ các
chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất
kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một thời gian nuôi cấy
nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển
thân, ra lá và rể để thành một cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển dần ra đất và thích
nghi bình thường.
SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

3


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
1.3.2. Nuôi cấy mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phân hóa của
các tế bào đã được phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện
diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng phát triển thành cây con hoàn chỉnh trong
điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực
hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào
mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy
nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn.
1.3.3. Nuôi cấy tế bào đơn
Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đạt trên máy lắc có
tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn.Tế
bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối. Với các chất
thích hợp được bổ sung vào môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt
tính sinh học. Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn
được tách ra và trải trên môi trường thạch.
+ Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng
cụm có mô sẹo.
+ Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinine/auxin thích hợp, tế bào đơn có khả
năng tái sinh thành cây con hoàn chỉnh.
1.3.4. Nuôi cấy protoplast-chuyển gen
Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách bởi vỏ cellullose, có sức sống và
duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có.
Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào,

tiếp tục phân chia và tái sinh cây hoàn chỉnh (tính toàn thể ở thực vật). Khi tế bào chất
mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo tế
bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá trình dung hợp protoplast
có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài.
1.3.5. Nuôi cấy hạt phấn đơn bội
Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo mô sẹo.
Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội.
II.2. Tìm hiểu về nhân giống lan Hồ Điệp
2.1. Nguồn gốc và đặc điểm của lan Hồ Điệp [4]
2.1.1. Nguồn gốc

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

4


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
Lan Hồ Điệp là giống lan có tên gọi Phalaenopsis, thuộc họ phụ Vandeae.
Tên gọi Phalaenopsis bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp trong đó Phalaina có nghĩa là “con
bướm” và Opsis có nghĩa là “giống như”.
Lan Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius đặt tên
là Angraecum album, năm 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum, 1825 nhà thực vật
Hà Lan định danh lại là Phalaenopsis.
Loài hoa này có xuất xứ ở miền Bắc Australia, Ấn Độ và các nước Đông Nam
Á như Philippine, Inđônêsia, bán đảo Đông Dương. Quê hương của lan Hồ Điệp là các
nước của vùng Đông Nam Á, rừng Việt Nam không có loài Phalaenopsis amabilis, chỉ
có 5 loài tương tự được biết là Phaenopsis mannii, Phalaeopsis gibbosa, Phalaenopsis
lobbi, Phalaenopsis fuscata và Phalaenopsis cornu-cervi. Lan Hồ Điệp được trồng ở

mọi nơi trên thế giới, hầu hết là ở Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan, Thái Lan và
Mỹ. Cây con được nuôi cấy mô nhiều ở các nước Phần Lan, Thái Lan, Đài
Loan…Hiện nay giống Hồ Điệp có trên 70 loài và càng ngày càng lai tạo ra rất nhiều.
2.1.2. Đặc điểm
 Lan Hồ Điệp là cây đơn thân, ngắn, lá to, dày, mọc sát vào nhau. Hoa nở luân
phiên hết cái này đến cái khác, thời kì nở hoa thay đổi theo loài và thường nở trong vài
tháng. Phát hoa mọc từ nách lá, dài, chùm hoa nở từng cái, 3 đài to tròn, hai cánh xoè
rộng kín, sắc đẹp. Môi hoa cong dẹp có hai râu dài nên cả đóa hoa trong giống như con
bươm bướm. Hai hàng hoa xếp đều đặn 2 bên cành, khẽ đong đưa như đàn bướm xinh
xắn đang bay lượn chập chờn. Trụ có hình bán nguyệt với hai phân khối u lên, chứa
đầy phấn hoa. Số hoa trên cành biểu thị sức sống của cây. Số lượng càng nhiều thì cây
càng sung sức. Riêng đặc tính phân nhành hoa lại tùy thuộc nhiều vào từng loại giống.
 Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, không thua kém bất cứ giống lan nào khác
từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại Hồ Điệp có sọc nằm ngang hoặc thẳng đứng,
hoặc có đốm to hay nhỏ…Lan Hồ Điệp sinh trưởng chậm, khoảng 40 ngày với điều
kiện chăm sóc tốt mới mọc thêm một lá hoàn chỉnh. Khi cây có trên 4 lá mới có thể
phân hoá mầm hoa. Loài lan này có độ bền bông cao trong điều kiện thích hợp, rất
thích hợp để trồng trong nhà, dễ ra hoa. Nhưng nó vốn vẫn là loài hoa khó tính.
2.2. Điều kiện sinh thái [5]
2. 2.1. Nhiệt độ [3]
Lan Hồ Điệp có nguồn gốc từ miền nhiệt đới, do đó nhiệt độ thích hợp để trồng
Lan Hồ Điệp tương đối cao, nhiệt độ thích hợp để trồng ban ngày là từ 25-280C, ban
đêm là 18-200Cgiai đoạn ươm cây non thì cần nhiệt độ ban đêm khoảng 230C . Nếu
nhiệt độ nhà trông nhỏ hơn 150C rễ cây ngừng hút chất dinh dưỡng, quá trình sinh
trưởng ngừng lại, thậm chí bị lạnh hại làm rụng hoa hoặc làm cho cánh hoa xuất hiện
các đốm nhỏ ảnh hưởng đến vẽ đẹp của hoa, giai đoạn phấn hoa đòi hỏi phải có sự
SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

5


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
cách biệt khá cao về độ lêch nhiệt độ ngày /đêm, nhiệt độ ban ngày thích hợp nhất là
25 0C, ban đêm 10-200C, kéo dài 3-6 tuần rất có lợi cho sự phân hóa hoa.
2. 2.2. Nước tưới
Hồ Điệp là loài đơn thân, không có giả hành nên không dự trữ nước, hơn nữa
diện tích bốc hơi của bản lá khá lớn và chúng không có mùa nghỉ vì thế phải cung cấp
cho không một lượng nước đầy đủ và thường xuyên trong suốt năm. Trong mùa mưa
mỗi ngày phải tưới cho chúng 2 lần, trừ những ngày có mưa, một lần vào 9 giờ sáng,
một lần vào 3 giờ chiều. Tưới như vậy sẽ đảm bảo cây khô ráo khi trời tối vì đọng
nước ở nách lá suốt đêm có thể gây ra sự thối rữa. Vào mùa nắng, nên tưới cho chúng
1 ngày 3 lần.
Điều kiện thoát nước là tương đối quan trọng, Hồ Điệp không thể chịu được một
độ ẩm lắng đọng (nhất là ban đêm), vì rất đễ tạo điều kiện cho bệnh thối rữa phát triển.
Tốt nhất cứ ba ngày ta nên pha Dithane M45, Maneb, Captan vào trong nước tưới với
nồng độ 1/400 để ngừa chứng bệnh nói trên. Nên nhớ, Hồ Điệp là loài lan thích hợp
với giá thể và nước tưới có pH khá thấp (pH=5,2) vì thế phải dùng axít phôtphoric để
giảm pH của nước.
Ở nước ta, vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh hơn, nhưng những giọt mưa
nặng hạt cũng không kém phần nguy hiểm vì thế đa số các loại Hồ Điệp bị chết do
những cơn mưa đầu mùa. Đây cũng là một hình thức tưới của thiên nhiên mà ta không
kiểm soát được. Do đó để ngừa tình trạng trên, mái giàn che Hồ Điệp nên dùng những
tấm tôn nhựa xanh, như vậy sẽ loại trừ những trận mưa không cần thiết và tạo được
những tia sáng khuếch tán rất lý tưởng.
Vào mùa khô, ta vẫn duy trì mức độ tưới đều đặn như trong mùa mưa, vì lúc này
ẩm độ trong không khí giảm xuống rõ rệt. Do đó, sự tăng số lần tưới nhằm mục đích
tạo cho
cây tăng trưởng liên tục. Nếu cây có trạng thái thiếu nước, ủ rũ bạn nên chuyển cây

sang vị trí khác hoặc tăng số lần tưới lên. Một lần tưới bổ sung vào giữa trưa trong
mùa khô rất thích hợp cho sự phát triển của Hồ Điệp.
2. 2.3. Ánh sáng [3]
Lan Hồ Điệp rất kỵ ánh sáng chiếu thẳng trực tiếp, do đó phải có biện pháp che
sáng đồng thời tùy thuộc vào cây lớn nhỏ mà có biện pháp điều chỉnh ánh sáng cho
thích hợp. Thời kỳ ươm cây non nhu cầu về ánh sáng có cường độ 10.000-12.000 lux,
giai đoạn cây bánh tẻ là 12.000-20.000 lux, giai đoạn thúc ra hoa 20.000-30.000 lux.
Trong điều kiện trồng trong nhà lưới, mùa hè và mùa thu phải che đi 75-85% ánh sáng,
cần phải có hai lớp che sáng đặt chồng lên nhau, mùa đông xuân thì ánh sáng yếu hơn
chỉ cần che 40-50% là đủ.

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

6


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
2. 2.4. Độ thông thoáng
Rất cần thiết vì Hồ Điệp hay bị bệnh thối nhũn lá (phõng lá), sự thông thoáng
giúp lá cây mau khô sau khi tưới và bộ rễ không bị úng nước nên hạn chế bệnh rất
nhiều. Ở nước ta vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh những giọt mưa nặng hạt
có thể làm thối đọt. Do đó để ngăn ngừa tình trạng trên nên dùng những tấm tôn nhựa
xanh để che. Có một số trường hợp trồng Hồ Điệp trên cao (sân thượng) có hiệu quả
hơn. Tuy nhiên gió nhiều và mạnh dễ làm cây mất nước nhanh nếu ta không cung cấp
đủ lá cây sẽ héo rũ, nhăn.
2. 2.5. Dinh dưỡng
Hồ Điệp cần dinh dưỡng thường xuyên, quanh năm vì không có mùa nghỉ . Khi
tưới phân không nên tưới với nồng độ cao càng đừng tưới lên đọt, nhất là lúc lá non

mới nhú ra từ đỉnh sinh trưởng. Hồ Điệp cần phân bón tưới với nồng độ loãng và có
thể tưới nhiều lần trong tuần. Có thể tưới thêm phân hữu cơ như: bánh dầu 15
ngày/lần, vitamin B1, kích thích ra rễ…
Cách tưới phân
+ Thời kỳ cây dưới 12 tháng tuổi cần dùng N, P, K với tỷ lệ cao 30-10-10,
sau đó dùng phân N, P, K với tỉ lệ 20-20-20 hoặc 18-18-18 cho đến lúc ra hoa. Tuy
nhiên vào mùa mưa nếu tưới phân 30-10-10 thấy cây yếu mềm quá có thể tăng cường
lượng lân và kali bằng cách xen kẽ phân 20-20-20 hoặc 18-18-18 (dù là cây con), để
cây được cứng cáp, tăng cường sức đề kháng sâu bệnh.
+ Lúc cây trưởng thành (18-24 tháng tuổi) vào thời điểm cuối năm, thời
tiết lạnh có thể kích thích cây ra hoa bằng cách tưới phân 10-30-30, đến khi cây bắt
đầu nhú cành hoa rồi ta trở lại tưới phân 20-20-20 cho đến lúc hoa nở và tàn. Không
nên để cành hoa lâu quá trên cây, khi nụ hoa cuối cùng đã nở và có 1, 2 hoa bắt đầu
héo, thì ta nên cắt cành hoa bỏ đi để dưỡng sức cho cây. Khi cắt cành hoa càng sớm thì
lá mới ra mau và cây sinh trưởng tốt hơn để lần ra hoa sau sẽ mạnh hơn.
2.2.6. Sâu bệnh
Đối với phong lan, việc phòng bệnh hết sức quan trọng, vì khi cây đã bị bệnh rất
khó trị và có thể làm chết cây. Ngoài việc chăm sóc lan kỹ lưỡng đều đặn, tưới nưới và
dinh dưỡng cần phải tưới thêm thuốc trừ nấm bệnh nhằm tăng sức đề đề kháng cho
cây. Lan Hồ Điệp hay bị con bọ trĩ chích tạo vết thương trên lá từ đó vi khuẩn xâm
nhập gây bệnh thối nhũn trên lá. Có thể dùng một số loại thuốc để phòng trị như
Malathion, lannat… để phòng trị.
2.2.7. Chậu, giá thể, cách trồng
Cách trồng chung nhất cho các loại Hồ Điệp là chậu thật thoáng, có nhiều lỗ có
thể sử dụng chậu đất nung có nhiều lỗ hay chậu nhựa cũng được. Chậu phải thật sạch
không có rêu bám trên thành chậu. Thông thường các nhà vườn trồng lan với số lượng
SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

7


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
lớn (vài ngàn cây) thường dùng than, dớ, xơ dừa, mút… làm giá thể để trồng lan Hồ
Điệp. Có rất nhiều cách trồng lan Hồ Điệp tuỳ theo từng vùng. Nhưng có điểm chung
là than, mút nằm dưới đáy chậu, còn xơ dừa hay dớn sẽ nằm trên miệng chậu cách
trồng này giúp cây thoát nước tốt vào mùa mưa, không bị thối rễ và phát triển tốt.
Trong thời gian khoảng 2 năm ta thay chậu một lần, nếu cây lớn quá mau có thể thay
chậu sớm hơn.
2.3. Tình hình sản xuất lan Hồ Điệp ở Việt Nam [5]
Hiện nay, tại TP.HCM cây lan Hồ Điệp được xem là cây trồng chiến lượt trong
việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng và vật nuôi. Đây là cây trồng đem lại hiệu quả cao
gấp 2-3 lần so với việc trồng lúa, hoa màu v.v.. Trong xu thế đất trồng ngày càng hẹp
thì cây lan không chiếm diện tích đất nhiều nên là giải pháp rất hiệu quả. Không chỉ
đẹp về màu sắc, hình dáng, hoa lâu tàn… giá thành rẻ nên ngày càng được ưa chuộng
và nuôi trồng. Tại TP.HCM và các tỉnh lân cận có rất nhiều vườn trồng Hồ Điệp với
qui mô từ vài trăm đến vài nghìn cây. Điển hình là công ty Lâm Thăng của Đài Loan
đầu tư và công ty Kim Ngân chuyên trồng về lan Hồ Điệp, hàng năm có thể cung ứng
cho thị trường từ vài ngàn đếm vài chục ngàn cây, nhất là vào dịp Tết Nguyên Đán.
Tuy nhiên do không có sự liên kết giữa các nhà vườn nên sản phẩm làm ra không tìm
được thị trường tiêu thụ, giữa cung và cầu không hợp lý.
Về nguồn cây giống thì ở nước ta do không đầu tư nên cây giống không đạt chất
lượng tốt, giống mới không nhiều nên các nhà vườn thường nhập giống từ các nước
như Thái Lan, Đài Loan…Ngoài ra hàng năm việc nhập khẩu hoa từ các nước này ước
tính tiêu tốn hàng triệu USD. So với các nước có ngành trồng lan phát triển như Đài
Loan hay Thái Lan thì ngành trồng ở nước ta cần phải học hỏi nhiều và cần phải có
chính sách phát triển hợp lý nhằm đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn.
2.4. Nhân giống invitro lan Hồ Điệp
2.4.1. Nhân giống Hồ Điệp lai từ trục phát hoa [14]

2.4.1.1. Vật liệu và phương pháp nuôi cấy
Trục phát hoa Hồ Điệp lai được cắt khi các hoa gần tàn. Các mắt được làm sạch
và tẩy trùng bằng phương thức của Scuully, có 4 loại chồi khác nhau trên các khúc
mắt được dùng trong thí nghiệm.
 Chồi nguyên vẹn được dùng để kiểm chứng .
 Chồi bị làm chấn thương bằng cách cắt bỏ 2/3 chồi theo mặt cắt song song với
trục phát hoa và như thế mặt cắt sẽ nghiêng với hướng mọc một gốc α.
 Chồi bị làm chấn thương bằng cách cắt chồi làm hai mặt cắt theo trục.
 Đâm dọc chồi bằng một kim nhọn từ đỉnh xuống gốc.
2.4.1.2 Điều kiện nuôi cấy
SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

8


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
 Môi trường Murashige và Skoog( M+S).
 Môi trường Knudson C.
 pH:5.8.
 Ánh sáng: 5000 1m/m2.
 Quang kỳ : 14 giờ.
 Nhiệt độ: 2100C.
 Dụng cụ chứa đựng môi trường là lọ thuốc nhỏ chứa 10ml.
2.4.2. Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm trong điều kiện invitrro [3]
Trong tự nhiên hạt lan ít nảy mầm (chỉ nảy mầm 1-2%) do hạt lan không có chứa
anbunin và một phôi chưa phân hóa, có kích thước nhỏ nên khó chứa chất dự trữ .Vì
vậy, trong tự nhiên hạt lan Hồ Điệp nảy mầm được nó phải cộng sinh với nấm
Rhizoctonia mucoroides. Nấm sẽ cung cấp đường để nuôi cây, phân giải các chất hữu

cơ khó hấp thu. Bù lại cây sẽ cung cấp nước cho nấm, chỗ ở và các khoáng chất mà nó
thu được từ sương. Dựa trên nguyên tắc này, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô đã tạo
môi trường gieo hạt lan Hồ Điệp trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo với tỉ lệ rất cao.
2.4.2.1.Tiến hành
 Chọn quả lan: Chọn các quả 4 tháng tuổi, quả căng đều, không bị nứt vở,
không bị sâu bệnh làm nguyên liệu để gieo hạt.
 Khử trùng : Dùng cồn 750 rửa sạch quả, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1%
trong 10 phút. Rửa lại quả bằng nước vô trùng 5 lần, thấm khô bằng giấy thấm vô
trùng. Dùng dao tách vỏ quả để lấy các hạt nhỏ li ti bên trong và gieo trong môi trường
đã chuẩn bị sẵn.
 Để gieo hạy lan có thể sử dụng các loại môi trường nền: Knudson, VacineWent (VW), Murashige –Skoog ( MS) có bổ sung thêm đường và các chất hữu như:
Dịch nghiền của khoai tây, chuối , cà rốt, nước dừa, pepton…
2.4.3. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm trong nhân giống Hồ Điệp lai [2]
2.4.3.1. Hệ thống nuôi cấy
Hệ thống ngập chìm tạm thời được sử dụng trong nghiên cứu này là hệ thống
bình nuôi cấy Plantima do công ty A-tech Bioscientific của Đài Loan sản xuất . Hệ
thống này gồm những bộ phận chủ yếu sau: Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để đẩy
môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại, timer dùng để điều
khiển chu kỳ ngập, hệ thống ống dẫn và van điều khiển, các màng lọc thoáng khí vô
trùng, các bình Platima bằng nhựa polycarbonate gồm có 2 ngăn, ngăn dưới chứa môi
trường lỏng và ngăn trên chứa mẫu thực vật.

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

9


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp

Bằng cách điều chỉnh tự động áp lực không khí thông qua một máy bơm, môi
trường lỏng từ ngăn dưới sẽ được bơm lên ngăn chứa mẫu cấy và khi đạt đến thời gian
ngập chìm tạm thời dung dịch sẽ quay trở lại ngăn dưới . Trong giai đoạn dung dịch
ngập mẫu có sự trao đổi không khí, mẫu được xoay chuyển nhẹ và làm mới không khí
bên trong bình nuôi cấy, dòng khí đi vào và thoát ra được khử trùng nhờ cách lọc vô
trùng 0,45µm . Thời gian ngập chìm và tần suất ngập chìm được điều khiển bằng
timer.

Hình 1: Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập[11]
2.4.3.2. Mẫu cấy lan Hồ Điệp
Đối tượng thí nghiệm là một loài lan Hồ Điệp lai có tên gọi Doritaenopsis Taida
Salu. Mẫu cấy gồm có :
 Protocorm – like bodies –PLBs của giống Dtps Taida Salu.
 Mẫu cấy chồi được lấy trong thí nghiệm tái sinh chồi từ PLBs trong các hệ
thống khác nhau trên môi trường tái sinh chồi.
2.4.3.3. Phương pháp thí nghiệm
A. Khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau
Thí nghiệm khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau
được tiến hành trong nhằm so sánh hiệu quả trong việc nâng cao hệ quả nhân và chất
lượng của PLBs trong hệ thống TIS so với các hệ thống nhân giống trên môi trường
thạch và trong hệ thống nuôi cấy lỏng lắc. Đồng thời khảo sát các thông số tối ưu cho
việc nhân PLBs trên hệ thống TIS . Mật độ mẫu cấy và tần xuất ngập chìm.

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

10

Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
Môi trường nuôi cấy : Môi trường MS bổ sung BA và NAA, sucrose, glucose,
nước dừa. Môi trường đối chứng trên thạch có sử dụng than hoạt tính và agar.
B. Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống TIS
Mẫu cấy là những PLBs thu được từ quá trình nhân PLBs. Môi trường nuôi cấy
là môi trường MS 1/2 có bổ sung nước dừa, pepton, dịch chiết khoai tây, sucrose. Đối
chứng là các mẫu được cấy trên môi trường đặc.
Khảo sát các thông số tối ưu cho việc tái sinh chồi và nhân chồi trên hệ thống
TIS. Mật độ mẫu cấy và tần suất ngập chìm.
C. Khảo sát sự ra rễ của chồi Hồ Điệp tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS
Mẫu cấy là những chồi được tách ra từ quá trình tái sinh chồi, chồi lúc cấy vào có
chiều dài là khoảng 8-9 mm, chiều rộng là khoảng 3-4 mm, chiều cao thân là khoảng
10mm, không có rễ. Môi trường nuôi cấy là môi trường MS 1/2 có bổ sung nước dừa,
pepton, dịch chiết khoai tây, sucrose, IBA. Đối chứng là mẫu nuôi cấy trên môi trường
đặc .

Hình 2: Cây sinh trưởng trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm [13]
2.4.4.4. Điều kiện thí nghiệm
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật (Trung
tâm Công Nghệ Sinh Học TP. HCM) trong điều kiện nhiệt độ khoảng 25 ± 20C, độ ẩm
80- 85 %, thời gian chiếu sáng 10 giờ / ngày, cường độ chiếu sáng 2500 lux.
2.4.4. Nhân nhanh phôi và Protocorm – like body cây lan Hồ Điệp bằng hệ thống
Bioreactor [1]
2.4.4.1. Vật liệu và phương pháp
SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

11

Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp

Đối tượng nghiên cứu
Giống lan Hồ Điệp có màu trắng (phalaenopsis amabilis ).
Mẫu thí nghiệm
Nguồn mẫu lá phôi và PLB ( có màu xanh, đường kính từ 1-1,5 mm) thu nhận
sau 2- 3 tháng cấy chuyền trên môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l
NAA, 20%
nước dừa và 30 g/l đường . Nguồn mẫu này được dùng làm nguồn vật liệu để làm thí
nghiệm.
Môi trường nuôi cấy
Môi trường MS cơ bản có bổ sung kết hợp các thành phần BA, NAA, và nước
dừa, sau đó bổ sung 9g/l agar, 1g/l than hoạt tính, pH môi trường được điều chỉnh về
5,8 trước khi hấp khử trùng .
 Đối tượng thí nghiệm tối ưu hóa môi trường nuôi cấy tăng sinh phôi và PLB.
Dùng các bình thủy tinh có thể tích 250 ml, thể tích môi trường đỏ vào là 40 ml. Bình
thủy tinh có độ truyền suốt ánh sáng cao để mẫu cấy có khả năng quang hợp tốt.
 Đối với hệ thống bioreactor
Bioreactor sử dụng trong nghiên cứu có dạng hình cầu, thể tích 3 lít (sản xuất tại
Hàn Quốc). Phần đáy có dạng hình trụ (đường kính ngoài 45 mm, cao 100 mm). Phần
trên có dạng hình cầu (đường kính ngoài 170 mm). Đáy được nối với máy sục khí,
bên dưới là một miếng ceramic (đường kính 20 mm, dày 2mm) có tác dụng tạo bọt khí
mịn. Nắp đậy làm bằng vật liệu silicone, hình nón cụt, đường kính trung bình là 100
mm và có khả năng chịu nhiệt tốt (không biến dạng khi hấp vô trùng ở 1210C, 1atm,
trong 30 phút). Trên nắp có ống nối với màng lọc khí . Màng lọc khí sử dụng là loại
chịu nhiệt, đường kính lỗ màng lọc là 0,2 Mm. Hệ thống nuôi cấy này sử dụng 2 màng
lọc, một để lọc khí vào và một để lọc khí ra. Các ống dẫn khí được làm từ silicone chịu
nhiệt, chia làm 2 loại: Loại đường kính 7 mm và loại đường kính 13 mm. Sử dụng một
máy bơm để cung cấp khí cho bioreactor với lượng khí khoảng 20 lít/ phút.

Điều kiện nuôi cấy
Thực hiện các quá trình nuôi cấy ở nhiệt độ 25 ± 20C, cường độ ánh sáng khoảng
2000lux, sử dụng ánh sáng trắng từ đèn neon, thời gian chiếu sáng là 10 giờ /ngày, độ
ẩm trung bình là 75- 80% .
Phương pháp thí nghiệm
Các bước thiết lập và vận hành hệ thống nuôi cấy bioreactor được thực hiện như
sau:

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

12


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
Bước 1: Chuẩn bị các bộ phận của hệ thống bioreactor :bình cầu, nắp silicone,
các ống dẫn silicone, máy lọc khí, máy sục khí. Chuẩn bị môi trường nuôi. Chuẩn bị
môi trường nuôi cấy và mẫu nuôi cấy .
Bước 2 : Gói các bộ phận của hệ thống bioreactor vào trong túi nilon chịu nhiệt
và đem hấp khử trùng ở 121 0C, 1 atm trong 40 phút. Đồng thời hấp vô trùng môi
trường cùng một lúc .
Bước 3 : Tiến hành lần lượt, đổ môi trường nuôi cấy vào bình cầu với thể tích
nuôi cấy là 1lít, cấy mẫu phôi và PLB vào, đậy nắp lại và sau đó gắn các màng lọc khí.
Nắp đậy được dán bằng keo dán ống nước. Sau cùng gắn máy sục khí vào hệ thống để
thực hiện quá trình nuôi cấy.

Hình 3: Các thiết lập và vận hành hệ thống bioreactor.[1]
Thiết kế thí nghiệm
 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy tăng sinh phôi và PLB

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực
vật (BA, NAA) và nước dừa phát sinh phôi vô tính và PLB của lan Hồ Điệp. Các thí
nghiệm được bố trí theo các bảng như sau.

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

13


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
Sau 8 tuần nuôi cấy, thu nhận phôi và PLB, tiến hành lấy kết quả với các chỉ
tiêu sau: Trọng lượng tươi, đường kính phôi, PLB và đánh giá thông qua quan sát thực
tế.
Bảng 1: Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôi
cấy bổ sung 0,5 mg /l NAA và 20 % nước dừa.
Môi trường nuôi cấy

BA (mg/ l)

V1

3,0

V2

2,0

V3

1,0

V4

0,5

Bảng 2:Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôi
cấy bổ sung 2,0 mg /l BA và 20% nước dừa.
Môi trường nuôi cấy

NAA (mg /l)

V5

1,0

V6

0,5

V7

0,0

Bảng 3: Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường
nuôi cấy bổ sung 2,0 mg /l BA và 0,5 mg /l NAA.
Môi trường nuôi cấy

Nước dừa (%)

V8

30

V9

20

V10

10

V11

5

V12

0

 Khảo sát sự tăng sinh của phôi và PLB trong hệ thống nuôi cấy bioreactor
Từ kết quả đạt được ở thí nghiệm tối ưu môi trường tăng sinh phôi nhóm nghiên
cứu xác định được các thành phần tối ưu cho môi trường nuôi cấy trong bioreactor là:
Môi trường MS cơ bản, thể tích nuôi cấy 1lít bổ sung 2,0 mg / l BA , 1,0 mg /l NAA
và 20 % nước dừa, chỉnh pH về 5,8 trước khi đem đi hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm
trong 40 phút. Các bước tiến hành nuôi cấy trong hệ thống bioreactor đã được trình

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

14


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
bày ở trên. Đồng thời tiến hành nuôi cấy trên môi trường agar truyền thống với thể tích
bình và môi trường tượng tự như trong hệ thống bioreactor là 3 lít (thể tích bình)và 1
lít (thể tích môi trường) để làm mẫu đối chứng. Tất cả các thí nghiệm đều được theo
dõi và tiến hành lấy số liệu sau 6 tuần nuôi cấy. Kết quả thu nhận phôi và PLB thông
qua các chỉ số sau: Trọng lượng tươi, hệ số tăng sinh, tỉ lệ sống, số lượng, đường kính
của phôi và PLB được hình thành.
Xử lý số liệu
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, kết quả thí nghiệm được phân tích bằng
Duncan, s test ( Ducan, 1995) với α = 0,05 .
2.5. Kết quả các thí nghiệm
2.5.1. Nhân giống Hồ Điệp lai từ trục phát hoa [4]
Hai tuần sau, các chồi nguyên vẹn phồng lên và phát triển thành tước, trong khi
các chồi bị chấn thương đã phát triển thành mô sẹo. Từ 6-8 tuần người ta có thể quan
sát thấy các chồi bất định nhỏ màu xanh, trên mô sẹo. Kết quả thấy rằng mặt cắt
nghiêng 2/3 chồi và đâm dọc chồi được coi là phương pháp tốt nhất. Mặc dù phần lớn
chồi phát sinh bất định từ mô sẹo, vẫn có một ít phát sinh không bất định từ các chồi
bên còn lại trên mặt chấn thương.
Sau 10 tuần lễ các chồi bất định vừa đủ lớn thì không lấy ra được, biểu hiện lúc
các lá hình thành chồi đạt được chiều dài 5-10 mm và rễ bắt đầu xuất hiện . Cây con
được lấy ra trong điều kiện vô trùng, được trồng trên môi trường Knudson C và xử lý
như cây con trồng hạt. Khi cây con được lấy ra, các chồi khác vẫn được hình thành và
phát triển.Tuy nhiên, nếu để một số lượng quá nhiều trên một mắt thì các chồi lớn cản
trở sự phát triển các chồi nhỏ. Để đảm bảo các chồi phát triển liên tục ta cấy chuyền
các khúc mắt lúc đầu sang môi trường mới khi các chồi đựơc lấy ra hoặc khi môi

trường khô và cạn chất dinh dưỡng.

Hình 4: Sự hình thành chồi sinh dưỡng từ phát hoa.[6]

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

15


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
2.5.2. Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm trong điều kiện invitrro [3]
Các nhà khoa học đã tiến hành thí nghiệm trên một số giống lan Hồ Điệp nhằm
tìm được tuổi quả thích hợp và loại môi trường nuôi cấy tối ưu cho việc nhân giống
bằng gieo hạt. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 4 và bảng 5 dưới đây:
Bảng 4: Ảnh hưởng của các tuổi khác nhau tới quá trình nảy mầm.

Chỉ tiêu theo dõi
Công thức
70 ngày sau thụ
phấn
80 ngày sau thụ

Thời gian
Tỷ lệ
nảy mầm (ngày) mầm (%)

nảy

Chất
lượng mẫu

Hạt chết sau 4 ngày gieo
35

60

+

32

75

++

100 ngày sau thụ phấn

25

95

+++

120 ngày sau thụ phấn

22

100

+++

phấn
90 ngày sau thụ
phấn

Các kết quả ở bảng 4 cho thấy: Chỉ sau khi thụ phấn >100 ngày thì hạt lan Hồ
Điệp mới đủ độ chín và có khả năng nảy mầm cao nhất .

Hình 5: Hạt lan nảy mầm trong điều kiện in vitro. [12]

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

16


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
Kết quả ở bảng 5 chứng tỏ rằng : Tất cả các công thức bổ sung các chất hữu cơ tự
nhiên ở dạng riêng lẽ hay tổng hợp đều có thể rút ngắn thời gian nảy mầm của hạt so
với cây đối chứng từ 5-10 ngày. Môi trường bổ sung thêm khoai tây tỏ ra hiệu quả
nhất, chỉ sau 20 ngày các hạt đã nảy mầm và chất lượng chồi đạt được rất tốt. Trong
khi đó trên tất cả môi trường có bổ sung cà rốt chỉ có 15-60 % số hạt nảy mầm và chất
lượng mẫu hình thành rất xấu. Như vậy, sử dụng môi trường nền VW có bổ sung :
(100ml ND +10g đường +1g pepton +30g khoai tây + 6,5g agar) / l để gieo hạt là tốt
nhất.
Bảng 5: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự nảy mầm của hạt lan.
Chỉ tiêu
theo

dõi

Thời
gian
Tỷ lệ nảy hạt
Chất lượng
nảy mầm của hạt
mầm (%)
mẫu
(ngày)

Công thức
I (Đ/C )

30

50

+

I +30g KT

20

100

+++

I +30g CR

25

60

+

I + 50gKT

20

100

+++

I + 50g CR

25

55

+

I + 100g KT

20

100

+++

I + 100g CR

25

45

+

25

75

25

70

25

70

I + 30gKT +30g
CR
I+50gKT+50g CR
I+100gKT+100g
CR

++
++
++

Ghi chú : I :VW + 100ml ND +10g đường + 1g pepton + 6,6g agar.
KT : Khoai tây, CR: Cà rốt, ND: Nước dừa.
+ : Thể Protocorm nhỏ ,có máu xanh vàng.
++: Thể Protocorm nhỏ ,có máu xanh nhạt.
+++ : Thể Protocorm phồng to rất đều nhau có màu xanh đậm.

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

17


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
Gieo sau 20 ngày hạt nảy mầm, sau 50-60 ngày hình thành thể tiền chồi
(Protocorm) kích thước 1-2 mm. Sau đó, chuyển các thể tiền chồi sang môi trường :
VW + (100ml ND +10g đường +1g pepton +30g khoai tây + 6,5g agar +30g cà rốt) / l
để hình thành các cây non có 2-3 lá sau 60 ngày. Tiếp tục cấy chuyền cây non sang
chín môi trường này, khoảng 60 ngày sẽ tạo cây hoàn chỉnh đạt tiêu chuẩn chuyển ra
vườn ươm. Vì vậy, thời gian ra cây sau khi gieo là khoảng 6 tháng.
2.5.3. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm trong nhân giống Hồ Điệp lai [2]
2.5.3.1. Khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau
Chu kỳ ngập chìm, mật độ và thể tích môi trường sử dụng trong hệ thống TIS có tác
động rất lớn đến chất lượng mẫu cấy . Vì vậy, để đạt được hiệu quả cao nhất khi sử
dụng hệ thống TIS trong quá trình nhân PLBs, cần khảo sát và tối ưu hóa các thông số
về mật độ, thể tích và chu kỳ ngập chìm của hệ thống TIS. Sau 6 tuần nuôi cấy tiến
hành ghi nhận các.
Bảng 6: Kết quả khảo sát mật độ PLBs thích hợp cho việc nhanh trên hệ thống TIS.
Nghiệm
thức

2g

4g

6g

8g

Trọng lượng Số lượng PLBs/
Số chồi
tươi (g )
1g PLBs ban đầu

Nhận xét

11,25
1,87

19,58 ± 4,79

PLBs xanh tốt,
tròn, từng cụm.
Một số PLBs phát
triển thành chồi.
Không gian TIS
còn trống

1020,11 ± 110,36a 36,31 ± 6,91

PLBs xanh tốt,
tròn, một số PLBs
phát triển thành
chồi. Không gian
TIS còn trống

984,60 ± 116,54ab 73,21 ± 6,99

PLBs xanh tốt,
tròn, một số PLBs
phát triển thành
chồi. Không gian
TIS còn trống .

23,05
4,65

40,15
5,08

53,30
6,80

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

±

±

±

±

973,27 ± 30,68ab

753,26 ± 151,81b

PLBs không được
tròn, hơi vàng chồi
113,25 ± 8,91 nhiều, lá chồi bị
vàng. Chật kín
không gian TIS

Lớp 07S1

18


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
Kết quả cho thấy nghiệm thức sử dụng 6g PLBs cho kết quả tạo 986,35 PLBs
tính trên 1g PLBs ban đầu và sau 6 tuần nuôi cấy lượng PLBs tạo thành vừa đủ lấp kín
không gian bình TIS, PLBs có màu xanh tốt, dạng tròn . Mật độ này là thích hợp nhất
cho việc nhân PLBs trong bình TIS.
Khi sử dụng 6g PLBs để nuôi cấy trong bình Plantimia có chứa môi trường để
nhân PLBs có thể tích là 200ml, nhóm nghiên cứu đã nhận thấy rằng:
 Thời gian ngập chìm 10 phút với chu kỳ 1 giờ cho hệ số nhân PLBs tăng nhiều
(8545 PLBs) so với chu kỳ 2 giờ ngập một lần, nhưng PLBs chủ yếu ở dạng trong,
mọng nước rất khó chuyển sang dạng chồi để phát triển thành cây hoàn chỉnh. Như
vậy tần số ngập chìm cao đã gây ra hiện thủy tinh thể cho mẫu cấy .
 Thời gian ngập chìm 10 phút với chu kỳ 2 giờ, các PLBs bị trương to hơn bình

thường.
 Thời gian ngập chìm 5 phút với chu kỳ 2 giờ cho chất lượng PLBs tốt nhất, chồi
xanh tốt phát triển bình thường.
Bảng 7: Khảo sát ảnh hưởng của tần xuất ngập chìm của hệ thống lên việc nhân PLBs.
Nghiệm
thức

Trọng
tươi (g)

2 giờ
phút

/10

2 giờ
phút

/5

1 giờ
phút

/10

lượng Số PLBs
thành

hình

Số chồi

Nhận xét

50,85 ± 5,31

6276,98 ± 413,26b 125,28 ± 11,65

PLBs rất
xanh tốt

42,27 ± 6,27

6112,30 ± 326,41b 82,96 ± 6,57

PLBs xanh
tốt

8545,68 ± 612,45a 187,89 ± 9,60

PLBs rất
to, một số
có
dạng
trong
mọng
nước.

68,18 ± 6,96

Tóm lại việc nhân PLBs trên hệ thống TIS cho kết quả tối ưu khi thời gian ngập
từ 5-10 phút với chu kỳ 2 giờ, thể tích nuôi cấy 200ml và mật độ 6g PLBs .Sau 6 tuần
nuôi cấy mỗi bình Plantima cho khoảng 6100 PLBs từ 600PLBs ban đầu, tức là từ 1
PLBs ban đầu tạo ra 10-11 PLBs mới, nếu so sánh trên môi trường thạch, cùng thơi
gian nuôi cấy, cùng thể tích và mật độ, sau 6 tuần thu được 2200 PLBs tức là 1 PLBs
ban đầu tạo ra 3-4 PLBs mới và so sánh với nuôi cấy lỏng lắc trong bình tam giác
250ml với thể tích môi trường 40ml thì từ 1 PLBs ban đầu tạo ra 7-8 PLBs . Vậy, nuôi

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

19


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
cấy trên hệ thống TIS cho tỉ lệ nhân PLBs gấp 3 lần trên môi trường thạch và gấp 1,3
lần trên môi trường lỏng.
Bảng 8: Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy khác nhau lên sự nhân nhanh PLBs sau 2
tháng nuôi cấy.
Hệ thống nuôi cấy

Số PLBs tạo ra / 1PLBs ban đầu

Lỏng lắc

8,3 ± 0,58

TiS

10,2 ± 1,55

Thạch

3,6 ± 0,31

2.5.3.2.Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống TIS
Trên hệ thống TIS, từ một PLBs ban đầu rất nhiều cây được tái sinh cho lượng cây tái
sinh vượt trội so với nuôi cấy trên môi trường thạch. Khảo sát mật độ PLBs sử dụng
cho giai đoạn tái sinh chồi trong bình TIS ghi nhận kết quả trong bảng sau:
Bảng 9: Ảnh hưởng của mật độ PLBs lên sự tái sinh chồi và nhân chồi trong hệ thống
TIS.
Nghiệm thức

20 PLBs

30 PLBs

50 PLBs

Đối chứng
trên
thạch
(30 PLBs)

Tỉ lệ PLBs tái Trọng lượng tươi
Số
chồi
sinh chồi (%)
(g)

/PLBs ban đầu

100

100

100

100

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

11,54 ± 2,19

18,41 ± 2,67

31,25 ± 5,10

7,24 ± 1,04

Lớp 07S1

Nhận xét

4,35 ± 0,38ab

Cụm
chồi
xanh tốt, lá
tròn mượt, có

rễ.

4,66 ± 0,71ab

Cụm
chồi
xanh tốt, lá
tròn mượt, có
rễ.

6,30 ± 0,64a

Cụm
chồi
xanh
tốt
nhưng lá nhỏ
hơn nghiệm
thức 20, 30
PLBs

1,73 ± 0,26c

Lá hơi bị dún
lại, thân chồi
kéo dài

20

Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
Trong bình Plantima ở mật độ 50 PLBs cho trung bình số cây tái sinh từ một
PLBs ban đầu là 6,3 so với 1,73 PLBs trên môi trường thạch (gấp 3,6 lần). Thêm vào
đó, sự sinh trưởng và phát triển của chồi tái sinh trong hệ thống TIS đều vượt trội hơn
trong bình tam giác về các chỉ tiêu chiều cao thân, chiều dài, chiều rộng lá.
Bảng 10:Ảnh hưởng của tần xuất ngập chìm lên tái sinh chồi từ PLBs.
Nghiệm thức

Trọng lượng tươi(g)

Số chồi/ PLBs

Nhận xét
Chồi xanh tốt, có
PLBs dạng cụm

4 giờ / 3 phút

25,48 ± 4,84

3,17 ± 0,66c

6 giờ / 3 phút

34,39 ± 6,79

6,46 ± 0,64 a

Chồi xanh tốt

8 giờ /3 phút

28,17 ± 4,05

4,46 ± 0,60 b

Chồi xanh tốt

Kết quả cho thấy: Tần xuất ngập 3 phút trong chu kỳ 6 giờ cho kết quả số chồi
tạo thành trên một PLBs là cao nhất.Chu kỳ ngắn (4 giờ) hay dài (8 giờ) cho kết quả
tạo chồi thấp hơn hẳn. Điều này cho thấy với chu kỳ 4 giờ cho ngập một lần mẫu được
cung cấp chất dinh dưỡng thường xuyên hơn nhưng số chồi tạo ra trên 1 PLBs chỉ là
3,17 và từ gốc lại tiếp tục tạo thêm PLBs mới, còn ở chu kỳ 8 giờ cho ngập một lần
cho số chồi tạo thành là 4,46 ít hơn so với chu kỳ 6 giờ (6,46 chồi) có lẽ thời gian quá
dài giữa các lần bơm (8 giờ) làm mẫu không được cung cấp dinh dưỡng cũng như sự
thoáng khí cần thiết cho sự phát triển của mẫu, vì vậy PLBs tái sinh và tiếp tục tạo
thêm chồi nách và các chồi này phát triển rất đồng đều dẫn đến trọng lượng tươi của
mẫu cũng gia tăng đáng kể (34,39).
Trong hệ thống TIS, môi trường không khí luôn luôn có sự trao đổi giữa bên
trong và bên ngoài bình thông qua hệ thống bơm và các màng lọc, do đó chồi Hồ Điệp
tái sinh trong hệ thống TIS phát triển rất tốt so với trong bình tam giác kín thông
thường thể hiện qua các chỉ têu trong bảng 11.

Hình 6: PLBs nhân nhanh trong hệ thống nuôi cấy TIS.[7]

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

21

Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
Bảng11: Ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy khác nhau lên sự tái sinh chồi từ PLBs
sau 2 tháng nuôi cấy.
Hệ thống nuôi Số chồi /mẫu Chiều cao thân
cấy
cấy
(mm)

Chiều cao lá
(mm)

Bình tam giác
(môi trường
thạch )

1,73

7 ± 0,36

6 ± 0,14

TIS
(môi
trường lỏng)

6,30

9 ± 0,23

7 ± 0,24

Chiều
lá

rộng

(mm)
3 ± 0,5
5

±

0,22

Hình 7: Chồi tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS và bình tam giác.[7]
a1, a2, a3 :Chồi tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS .
b: Chồi tái sinh từ PLBs trong bình tam giác.
2.5.3.3. Khảo sát sự ra rễ của chồi Hồ Điệp tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS
Kết quả thí nghiệm từ các hệ thống nuôi cấy khác lên sự sinh trưởng và phát triển của
chồi Hồ Điệp đã cho thấy hệ thống càng có nhiều sự thông thoáng thì chồi Hồ Điệp
càng sinh trưởng và phát triển tốt hơn. Ở hệ thống TIS nhờ hệ thống bơm đẩy môi
trường lên để tạo sự ngập chìm cho mẫu cấy, trong quá trình bơm môi trường khí trong
bình được trao đổi nên trong bình có sự thông thoáng nhiều hơn so với trong bình tam
giác. Những cây Hồ Điệp trong hệ thống TIS có độ thông thoáng tốt hơn phát triển
mạnh hơn so với cây trong bình tam giác không thoáng khí thể hiện ở các chỉ tiêu
chiều cao, chiều dài và chiều rộng lá, số rễ và chiều dài rễ.
Bảng 12: Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự ra rễ và phát triển chồi của Hồ
Điệp.

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

22


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
Nghiệm
thức

Trọng lượng Số chồi / số Chiều rộng Chiều dài rễ Tình
tươi (g)
chồi ban đầu lá (cm)
(cm)
trạng cây.

4 giờ /3
47,39 ± 6,27
phút

3,79 ± 0,65a

0,68 ± 0,06b

0,92 ± 0,16c

Xanh
mướt

6 giờ /3
60,19 ± 7,78
phút

3,39 ± 0,59a

0,97 ± 0,09a

2,62 ± 0,29a

Xanh
mướt

8 giờ /3
43,23 ± 5,39
phút

2,59
,26b

0,77± 0,05b

1,67 ± 0,14b

Xanh
mướt

±

0

Bảng 13: Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời lên sự sinh trưởng và
phát triển của chồi Hồ Điệp sau 2 tháng nuôi cấy .

Hệ thống Chiều cao Chiều rộng Chiều dài lá
nuôi cấy
thân (mm)
lá (mm)
(mm)
Bình tam
giác
15 ± 0,4
500ml
TIS

20 ± 0,6

Số rễ

Chiều dài
rễ
(mm)

6 ± 0,2

11 ± 0,3

3

10 ± 0,1

9,8 ± 0,4

15 ± 0,7

6

26 ± 0,2

Hình 8: Sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp trong hệ thống TIS
và bình tam giác 500 ml .[7]
a : Cây con Hồ Điệp trong hệ thống TIS
b : Cây con Hồ Điệp trong bình tam giác 500 ml

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

23


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp
Hệ thống ngập chìm tạm thời đã hội tụ đủ những điều kiện cần thiết như ngập
không quá lâu, thoáng khí tốt giúp cây không bị thủy tinh thể, cây tăng cường khả
năng quang hợp nên cây phát triển khá đều đặn, thích hợp cho quá trình tạo bộ rễ khỏe
mạnh trước khi đưa ra vườn ươm. Tóm lại, khi nuôi cấy trong hệ thống TIS giúp cây
phát triển nhanh và mạnh hơn những cây được nuôi cấy trong hệ thống kín thông
thường giúp rút ngắn thời gian để cây đạt được kích thước để đưa ra vườn ươm.
2.5.4. Nhân nhanh phôi và Protocorm – like body cây lan Hồ Điệp bằng hệ thống

Bioreactor [1]
2.5.4.1. Xác định môi trường tối ưu tăng sinh phôi và PLB
Sau 8 tuần nuôi cấy, các chỉ tiêu về trọng lượng tươi, đường kính phôi và PLB
của P.amabilis được trình bày ở các bảng sau.
Bảng 14: Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôi
cấy bổ sung 0,5 mg /l NAA và 20 % nước dừa sau 8 tuần nuôi cấy.
Môi trường Trọng lượng tươi (mg)

Nhận xét

3874a

Phôi và PLB tạo thành có màu vàng nhạt
và xanh thẫm, không có những cụm lông
xum quanh. Đường kính từ 1-1,5 mm.

3812b

Phôi và PLB tạo thành có màu vàng nhạt
và xanh thẫm, một vài PLB có cụm lông
xum quanh. Đường kính từ 1-2 mm.

V3

3420c

Một số PLB lớn có màu xanh thẫm xuất
hiện. PLB có độ đồng đều lớn, đường kính
2 mm.

V4

2597d

PLB tạo thành chưa hoàn thiện, không có
cấu trúc rõ ràng.

V1

V2

Ghi chú: Những mẫu tự khác nhau được nêu trong các cột trên biễu diễn sự khác
nhau có ý nghĩa với α =0,05 trong Duncan, s test.
Bảng 15: Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường
nuôi cấy bổ sung 2,0 mg / l BA và 20 % nước dừa sau 8 tuần nuôi cấy.

SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

24


Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp

Môi trường

Trọng lượng tươi (mg)

V5

V6

V7

Nhận xét

4312a

PLB tạo thành có màu xanh
thẫm, có những cụm lông xum
quanh, đường kính 1-1,5 mm.

3812b

Phôi và PLB tạo thành có màu
vàng nhạt và xanh thẫm, một
vài PLB có những cụm lông
xum quanh. Đường kính 1-2
mm.

4289a

PLB tạo thành có màu xanh
thẫm, có những cụm lông
xung quanh, đường kính từ 11,5 mm.

Hình 9: Sự phát sinh phôi và PLB trong các môi trường khác nhau.[8]
Kết quả thu nhận được cho thấy, ở nghiệm thức V1 và V2 PLB tạo thành có

màu xanh đậm, không có những cụm lông xung quanh, đường kính PLB từ 1-1,5 mm.
Ở các nghiệm thức, tuy khối lượng PLB tạo ra lớn nhưng PLB kém phát triển. Ở
nghiệm thức V3, PLB tạo thành lớn hơn, phát triển hơn, có độ đồng đều cao hơn và có
hình dạng rõ ràng hơn. Ở các nghiệm thức V5 và V7, khối lượng PLB tạo ra là lớn
nhất, có
SVTH: Bùi Thị Thu Nhi

Lớp 07S1

25