Nghiên cứu kỹ thuật bào chế, đánh giá khả năng kháng khuẩn trên in vitro của chế phẩm kem Silver sulfa

Trần văn quang

nghiên cứu kỹ thuật bào chế, đánh giá
khả năng kháng khuẩn trên in vitro
của chế phẩm kem Silver sulfa 1%

Ngời hớng dẫn :
TS. Nguyễn Thị Lộc


Đặt vấn đề
Bỏng là một bệnh ngoại khoa khá quan trọng
Để điều trị bỏng các chế phẩm của sulfadiazin bạc có
nhiều u điểm đã đợc chứng minh trong lâm sàng.
Viêc cung ứng thuốc có khó khăn.
Các mục tiêu cụ thể của khóa luận :
1. Nghiên cứu kỹ thuật bào chế kem Silver sulfa
1%.
2. Nghiên cứu độ giải phóng hoạt chất của chế
phẩm.
3. Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn trên in vitro
có so sánh với với chế phẩm Silvirin 1% (ấn Độ).


Phần I
Tổng quan tài liệu
1. Tỷ lệ mắc bệnh bỏng.
Thời bình : 1,8% - 10% so với chấn thơng ngoại khoa.
Trong chiến tranh : 3% - 10% tổng số thơng binh và có thể
lên tới 70% - 85%.
2. Thuốc mỡ sát khuẩn điều trị vết bỏng

tại chỗ
* Kem maduxin;* Mỡ cao vàng;* Damcream .
* Chế phẩm chứa hoạt chất sulfadiazin bạc nh :
Sivadene (Mỹ), Flammazin (Pháp), Silvirin (ấn Độ),
Slivin (Pakistan)


3. chÕ phÈm thuèc mì cã ho¹t
chÊt sulfadiazin b¹c.
3.1. C«ng thøc ho¸ häc.
Sulfadiazin b¹c lµ muèi b¹c cña N1- pyrimidin 2 - yl - sulfanilamid (AgC10H9N4O2S)
KLPT = 357,1.
§é hoµ tan trong níc < 1/10.000.


O
H2N

S

N(6)
N(1)
N(2)

O(2)
Ag

H×nh 1 : C«ng thøc ho¸ häc cña sulfadiazin b¹c

3.2 Cơ chế tác dụng.
* sulfadiazin có tác dụng kìm khuẩn: do
cạnh tranh ức chế với PABA.
* Ion bạc:
Ion bạc chuyển cầu nối giữa 2 nitơ thuộc 2 nhân
purin đối diện .Do vậy đã làm mất khả năng
sinh sản phân đôi của vi khuẩn.
Phối hợp: nhân pyrimidin sẽ dễ dàng làm vận
chuyển ion bạc qua màng vi khuẩn.
* Cơ chế tác dụng khác với các hợp chất bạc
khác, khác với sulfadiazin đơn độc.


3.3. Tác dụng kháng khuẩn.
Bảng 1: Khả năng kháng khuẩn trên invitro
của sulfadiazin bạc
Nồng độ sulfadiazin bạc
Họ và loài

50 g/ml

100 g/ml

130/130

130/130

E. cloacae

24/24

24/24

Klebsiella pneumoniae

53/54

54/54

Escherichia coli

63/63

63/63

100/101

101/101

S. epidermidis

51/51

51/51

Enterococus (nhóm D)

52/53

52/53

Candia albicans

43/50

50/50

Ps. Aeruginosa

S. aureus


3.4. Hấp thu thuốc.
* Các nghiên cứu về hấp thu với Ag111 cho thấy hầu hết
thuốc tích tụ ở lớp biểu bì (có tác dụng tại chỗ).
Khoảng 10% lợng sulfadiazin bôi tại chỗ đợc hấp thu..
Để đo sulfadiazin và các chất chuyển hoá đặc hiệu cần
dùng phơng pháp HPLC.
* Lợng bạc đợc hấp thu trong cơ thể khoảng dới 1%. Đo
bằng quang phổ hấp phụ nguyên tử.
3.5. Những u điểm trong điều trị lâm sàng.
- Có phổ kháng khuẩn rộng
- Có thể làm mềm mô bỏng đông cứng.
- Không gây đau khi bôi.
- Không gây rối loạn điện giải hay kiềm toan.
- Không làm bẩn y phục hay vải trải giờng.


Phần II
Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu

1. Vật liệu trang thiết bị.
1.1. Vật liệu hoá chất.
- Bạc sulfadiazin đạt tiêu chuẩn USP 24.
- Các tá dợc cần thiết đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
- Các chất bảo quản, các chất chống ôxy hoá đạt
tiêu chuẩn DĐVN III.
- Các dung môi dùng cho SKLM, HPLC-pp.
- Màng nhân tạo cellophan.
- Các hoá chất khác cần thiết.


1.2. Dụng cụ, trang thiết bị.
- Cân phân tích độ chính xác 0,1mg của Trung Quốc .
- Máy ly tâm của Nhật Bản.
- Tủ điều nhiệt giữ đợc nhiệt độ ở 400C, Trung Quốc
- Bản mỏng Silicagel 60 F254 ,VKN cung cấp.
- Đèn huỳnh quang soi ở bớc sóng 254 nm.
- Thạch Muller - Hinton.
- Các chủng vi khuẩn: S. aureus, P. aeruginosa, E. coli.
- Dụng cụ nghiên cứu khả năng giải phóng dợc chất ra
khỏi tá dợc thuốc mỡ.
- Máy sắc ký lỏng cao áp hiệu năng cao Shimadzu.
- Các dụng cụ cần thiết khác trong phòng thí nghiệm.


2. Phơng pháp nghiên cứu.
2.1. Định tính hoạt chất .
*Định tính Sulfadiazin
- Theo DĐVN I:Dùng phơng pháp SKLM :
+ Hệ dung môi triển khai : Methanol : NH4OHđặc

= 100 : 1,5 .
+Thể tích chấm 10l.
+ Soi đèn huỳnh quang ở bớc sóng 254nm.
+ Giá trị Rf chuẩn : 6,4. 2.2.
*Định lợng sulfadiazin bạc trong kem.
Phơng pháp đo nitrit :
1 ml natri nitrit 35,71mg sunfadiazin bạc.


2.3. Các bớc nghiên cứu mô hình kem Silver sulfa 1%.
Xây dựng các công thức bào chế

NC sơ bộ độ bền vững

Loại bớt CT
kém bền vững

Kiểm tra độ giải phóng hoạt chất
trên invitro

Loạibớt CT có độ
giải phóng kém

Kiểm tra độ kháng khuẩn

Hình 4: Các bớc nghiên cứu mô hình kem Sliver sulfa 1%


2.3.1 (Bớc 1): Xây dựng các công thức bào chế.
* Xây dựng các công thức cốt tá dợc

+ Trong tất cả các công thức sử dụng chất bảo quản
là hỗn hợp nipagin: nipason =95: 5.
+ Các tá dợc phối hợp trong công thức phải đem lại
giá trị HLB thích hợp (8 - 18)
HLB hỗn hợp
HLBc = sum @ (f x HLBn)
HLB yêu cầu
%A = [100 (X - HLBb)] / (HLBa - HLBb)
%B = 100 - %A.


* Nghiên cứu tìm chất chống ôxy hoá
Ion bạc trong công thức hoạt chất rất dễ bị ôxy hoá.
-Nghiên cứu với 4 chất chống ôxy hoá sau:
Natri sulfit ,natri bisulfit,natri metasulfit,hydro quinon.
- Hàm lợng : 0,05%; 0,10% và 0,15%.
- Thời điểm:
t0: ngay sau khi bào chế t1 sau khi bào chế 1 ngày, t2
sau khi bào chế 3 ngày, t3 sau khi bào chế 7 ngày.
- Phơng pháp đánh giá : xem xét sự thay đổi màu sắc.


Chuẩn bị tá dợc

Chuẩn bị dợc chất

Làm thuốc mỡ đặc

Phối hợp tá dợc
Kiểm nghiệm

bán thành phẩm
Làm đồng nhất
Kiểm nghiệm
thành phẩm
Đóng lọ, dán nhãn

Hình 5: Sơ đồ quy trình bào chế kem Silver sulfa 1%


2.3.2. (Bớc 2): Nghiên cứu sơ bộ độ bền vững.
- Điều kiện 1:
Ly tâm thuốc mỡ mới bào chế trong vòng 5 phút với
tốc độ 600v/phút ở nhiệt độ 20 10C. Quan sát sự
phân lớp của thuốc mỡ.
- Điều kiện2:
Đặt thuốc mỡ ở 40 10C trong vòng 1 ngày đêm.
Quan sát sự thay đổi của thuốc mỡ.
-Lựa chọn ba công thức bền vững nhất nghiên cứu
độ giải phóng hoạt chất


2.3.3. (Bớc 3): Nghiên cứu độ giải phóng hoạt chất
qua màng cellophan
*Khuếch tán thuốc qua màng:
- Ngăn trên : 3g thuốc mỡ
- Môi trờng khuếch tán : 25ml dung dịch NH4OH
2,5%
- Thời gian t1, t2, t3, t4 đã định sẵn.
* Định tính hoạt chất giải phóng: SKLM(DĐVN I)để
xác định đã có hoạt chất giải phóng và xác định t1.

*Định lợng nồng độ : phơng pháp HPLC.
- Với mỗi CT, ở 1 thời điểm t, khuếch tán 5 mẫu để
tính lợng hoạt chất giải phóng qua màng bằng phơng
pháp HPLC.


- Xây dựng đờng chuẩn: bằng phơng pháp bình
phơng tối thiểu.
- Các thông số của phơng pháp HPLC:
+ Pha động là một hệ dung môi A: B = 28 : 72 với
. Dung môi A là hỗn hợp : Acetolnitrile
có H3PO4 (1/900).
. Dung môi B là hỗn hợp : Nớc cất có
H3PO4 (1/900).
+ Thể tích mẫu tiêm 50 l.
+ Tốc độ dòng 1ml/phút.
+ Cột: RP18, Sopam (250 x 4,6mm,5m).
+ Đo ở bớc sóng 266nm.


2.3.4. (Bớc 4): Nghiên cứu độ kháng khuẩn.
Sử dụng phơng pháp khuếch tán trên gel thạch:
Thạch Muller - Hinton đổ đĩa đờng kính 9cm, đục 2 lỗ
đối xứng có đờng kính 1cm, 1 lỗ cho Silver sulfa 1%
(công thức có độ giải phóng hoạt chất tốt nhất tìm đợc ở
bớc 3), lỗ còn lại cho thuốc đối chứng Silvirin 1%. Sử
dụng 3 đĩa thạch cho 3 chủng vi khuẩn. S. aureus; P.
aeruginosa; E. coli (theo quy định của DĐVN).
Các chủng vi khuẩn thuần đợc làm thành hỗn dịch 108
VK/ml cấy láng trên bề mặt thạch, đợi khô mặt thạch

cho thuốc vào lỗ thử và lỗ chứng tơng ứng. Các đĩa thạch
đợc ủ 370C trong 24 giờ.
Đọc kết quả bằng cách đo đờng kính vòng vô khuẩn
xung quanh lỗ thử và lỗ chứng.


Phần III
Kết quả và bàn luận
1. Kết quả xây dựng công thức bào chế.

Xây dựng công thức:
CT 1:
Sulfadiazin bạc
1,0g
Acid stearic
24,0g
Triethanolamin
1,0g
Glycerin
13,0g
Chất bảo quản
0,50g
Nớc tinh khiết vđ 100ml


CT 2
Sulfadiazin b¹c
1,0g
Sorbitan stearat
1,4g

Polysorbat 80
0,6g
Alol cetostearic
6,5g
Triglycorides
11,0g
Glycrol
0,4g
ChÊt b¶o qu¶n
0,5g
Níc tinh khiÕt v® 100ml
CT 3:
Sulfadiazin b¹c
1,0g
Alcol cetostearic
8,0g
Glycerin monostearat 0,4g
Vaselin
6,0g
Paraffin
0,5g
Tween 60
0,6g
ChÊt b¶o qu¶n
0,2g
Níc tinh khiÕt v® 100ml

CT 4:
Sulfadiazin b¹c
Alcol stearylic

S¸p ong
Tween 80
Span 80
Sorbitol
ChÊt b¶o qu¶n
Níc tinh khiÕtv®
CT 5:
Sulfadiazin b¹c
Alcol cetylic
DÇu paraffin
Glycerol stearat
Polysorbat 80
Glycol propylen
ChÊt b¶o qu¶n
Níc tinh khiÕt v®

1,0g
15,0g
8,0g
3,8g
1,2g
8,0g
0,2g
100ml
1,0g
3,0g
20,0g
2,9g
3,1g
7,0g

0,2g
100ml


Lùa chän chÊt chèng oxy ho¸.
B¶ng 2: HiÖu lùc b¶o vÖ chèng «xy ho¸ cña natri bisulfit.
Thêi ®iÓm
t0

t1

t2

t3

0,05%

-

-

+

0,10%

-

-

-

+

0,15%

-

-

-

-

Hµm l­îng

Chän chÊt chèng «xy ho¸ lµ natri bisulfit , hµm lîng 0,15%,


2. Kết quả nghiên cứu sơ bộ độ bền vững.
Bảng 3: Kết quả nghiên cứu sơ bộ độ ổn định
Điều kiện

CT1

CT2

CT3

CT4

CT5

ĐK 1

++

-

+

++

-

ĐK 2

++

-

-

+++

++

Chọn các công thức: CT2, CT3, CT5 để đo giải phóng
hoạt chất qua màng.

3. Kết quả đo giải phóng hoạt chất
3.1. Kết quả định tính hoạt chất giải phóng qua màng:
Bảng 4: Kết quả định tính bằng SKLM

Thời điểm lấy mẫu

CT2

CT3

CT5

30 phút

-

-

-

60 phút

+

+

-

90 phút

+

++

+

Chọn các thời điểm t1 = 90phút, t1 =120phút,
t3 =180phút, t 4=360 phút để đo lợng hoạt chất giải
phóng qua màng bằng HPLC.


3.2.Kết quả định lợng dợc chất giải phóng qua
màng .
3.2.1. Kết quả xây dựng đờng chuẩn.
- Sắc ký đồ dung môi của cốt tá dợc.
- Các đờng chuẩn:
+ Chuẩn 1: nồng độ hoạt chất 2,12g/ml.
+ Chuẩn 2: nồng độ hoạt chất 5,30g/ml.
+ Chuẩn 3: nồng độ hoạt chất 10,60g/ml.
Kết quả đợc phơng trình tuyến tính
y = 5,9118.e - 0,06.x + 0.
Hệ số tơng quan r = 0,999833 1.
Cho thấy có sự tơng quan khá chặt chẽ giữa diện tích
pic và nồng độ.