Nghiên cứu tạo axít phenyllactic và ứng dụng trong bảo quản một số rau quả chế biến tối thiểu

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi.
Các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí, tập san khoa học với sự đồng ý của các đồng tác giả,
phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ thực hiện luận án đã được cảm ơn và
các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 3 tháng 10 năm 2016
Tác giả luận án

Bùi Kim Thúy

1


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo
điều kiện của Lãnh đạo Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, các
nhà khoa học trong và ngoài nước. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự
giúp đỡ này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Duy Lâm và
PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài Trâm, những thầy cô giáo trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo
tận tình cho tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Vụ Khoa học và công nghệ, Bộ Công Thương đã
hỗ trợ một phần kinh phí để thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ Phòng Vi sinh học phân tử, Viện
Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện thí
nghiệm phục vụ luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp của tôi đang công tác tại

Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạchvà gia đình đã động viên,
khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành
luận án này.
Hà Nội, ngày 3 tháng 10 năm 2016
Tác giả luận án

Bùi Kim Thúy

2


MỤC LỤC

3


KÍ HIỆU VIẾT TẮT
AA

: Axít ascorbic

BZN

: Benzoat natri

CBTT

: Chế biến tối thiểu

CFU/ml

: Colony Forming Unit
Số đơn vị khuẩn lạc/ml mẫu

CL

: Canxi lactat

FAO

: Food and Agriculture Organization
Tổ chức lương thực và nông nghiệp

FDA

: Food and Drug Administration
Cục Quản lý thuốc và dược phẩm Hoa
Kỳ

GRAS

: Generally Recognized as Safe
Chứng nhận tuyệt đối an toàn

HPLC

: High Pressure Liquid Chromatography
Sắc kí lỏng cao áp

MAP

: Modified Atmosphere Packaging
Bao gói khí điều biến

MIC

: Minimum Inhibitory Concentration
Nồng độ ức chế tối thiểu

MRS

: Man Rogosa Sharpe

PDA

: Potatoes Dextrose Agar

PLA

: Axít phenyllactic

PPA

: Axít phenylpyruvic

PVC

: Polyvinylchloride
Màng nhựa dẻo

TCVN

: Tiêu chuẩn Việt Nam

TSS

: Tổng số chất rắn hòa tan

VKHKTS

: Vi khuẩn hiếu khí tổng số

NMNMT
S

: Nấm men, nấm mốc tổng số

DANH MỤC BẢNG

4


5


DANH MỤC HÌNH

6

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Từ lâu, vi khuẩn lactic là nhóm vi sinh vật được coi là an toàn (GRAS) và
việc ứng dụng thành công nhóm vi khuẩn này hay những hợp chất kháng vi sinh vật
mà chúng sản sinh ra trong bảo quản thực phẩm đã được đề cập nhiều. Một số loại
chế phẩm sinh học đã được thử nghiệm và ứng dụng trong thực tiễn đem đến hiệu
quả cao như bacterioxin và một số loại axít hữu cơ như axít lactic, axetic, xitric.
Bacterioxin là các hợp chất có bản chất protein có khả năng ức chế vi sinh vật khá
tốt được ứng dụng nhiều trong thực phẩm tuy phổ kháng vi sinh vật không rộng
[35]. Trong khi đó, axít lactic, axít axetic và axít xitric lại có khả năng phòng trừ vi
sinh vật tương đối yếu. Do vậy, những loại axít này thường được sử dụng kết hợp
với những hợp chất khác để làm tăng hiệu quả. Gần đây, một hợp chất sinh học mới
có tiềm năng ứng dụng như là chất bảo quản thực phẩm được sinh tổng hợp bởi
nhóm vi khuẩn lactic được các nhà khoa học thế giới phát hiện có tên là axít
phenyllactic. So với nhiều loại bacterioxin sản sinh bởi vi khuẩn lactic như nisin thì
axít phenyllactic có khối lượng phân tử thấp, phổ kháng vi sinh vật rộng và tính bền
cũng như độ hòa tan cao [109]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng axít
phenyllactic là một hợp chất an toàn, có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram âm lẫn
gram dương và nấm men, nấm mốc, đặc biệt là nhiều loài nấm sinh độc tố [54][100]
[110].
Trước những lợi ích cũng như tiềm năng đã được kiểm chứng thì axít
phenyllactic là sản phẩm rất phù hợp sử dụng cho những đối tượng nông sản, thực
phẩm dễ bị lây nhiễm bởi vi sinh vật gây hại và đòi hỏi có tính an toàn cao khi sử
dụng. Rau quả chế biến tối thiểu (CBTT) là một trong những đối tượng nông sản
đang được người tiêu dùng hướng tới hiện nay với tiêu chí đảm bảo độ tươi, ngon,
tiện dụng và an toàn ít sử dụng hóa chất bảo quản nhất. Hơn nữa, rau quả chế biến
thối thiểu là một dạng sơ chế, là những sản phẩm rau quả tươi đã thay đổi hình dạng
ban đầu bằng một số tác động nhưng không bị xử lý nhiệt hay hóa chất đến mức
chúng bị thay đổi trạng thái tươi sống. Rau quả tươi được chế biến tối thiểu thường
phải qua các công đoạncơ bản mà không phải qua khâu nấu chín như xử lý cơ học

(làm sạch, tách vỏ, cắt gọt, tạo hình,…), ổn định sản phẩm (xử lý hóa học) và bao
gói[80]. Nhược điểm lớn nhất của chế biến tối thiểu là thời hạn sử dụng sản phẩm bị
giảm do khả năng bảo quản bị kém đi so với bảo quản các sản phẩm nguyên vẹn.
Do rau quả CBTT bị loại bỏ lớp vỏ bảo vệ bên ngoài, làm kích hoạt các enzyme
hoạt động tạo môi trường thuận lợi cho sự xâm nhập và phát triển của các loài vi
7


sinh vật khác nhau nên đã làm thay đổi màu sắc, cấu trúc, mất trọng lượng dẫn tới
tổn thất về cả số lượng và chất lượng trong quá trình bảo quản [78].
Vi sinh vật gây hại rau quả CBTT rất đa dạng về chủng loại và số lượng.
Trong các sản phẩm rau quả chế biến tối thiểu người ta tìm thấy một số vi sinh vật
phát triển mạnh như vi khuẩn ưa ẩm, vi khuẩn lactic, coliform, nấm men, nấm mốc,
trong đó có nhiều loài có khả năng sinh độc tố mycotoxin [21]. Ngoài ra, những sản
phẩm rau quảsẵn sàng để sử dụng vẫn còn bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh sau quá
trình CBTT là một vấn đề tồn tại trong đảm bảo an toàn thực phẩm. Trong số đó,
đáng kể đến là Listeria monocytogenes, Salmonella typhivà Escherichia coli, đặc
biệt là E. coli O157: H7 [104].
Hạn chế tới mức thấp nhất vi sinh vật gây hại và ngăn chặn quá trình làm
biến màu sản phẩm là những vấn đề cần được quan tâm và giải quyết trong CBTT.
Những hợp chất hóa học thông thường được sử dụng cho mục đích này gồm clo,
axít ascorbic, axít axetic, axít lactic và muối canxi (canxi lactat, canxi clorua) [45]
[60]. Do khả năng ức chế vi sinh vật của những hợp chất này đối với rau quả cắt
không cao nênmột số hợp chất hóa học khác được sử dụng kết hợp như 4hexylresorcino, cysteine, benzoat natri, sorbat kali,… để đem lại hiệu quả tốt hơn
trong việc ngăn chặn biến màu, giảm thối hỏng do vi sinh vật gây ra và đảm bảo
được độ cứng của sản phẩm [38]. Việc sử dụng những chất hóa học này đang ngày
càng bị hạn chế bởi mong muốn của người tiêu dùng đang ngày càng ưa chuộng sử
dụng những sản phẩm thực phẩm tươi và tự nhiên có tính an toàn cao không sử
dụng chất bảo quản hoá học. Nhiều nỗ lực đã được thực hiện nhằm tìm ra những
hợp chất tự nhiên hay những chế phẩm sinh học để thay thế những chất hóa học có

khả năng phòng trừ vi sinh vật gây hại trên rau quả chế biến tối thiểu [38].
Xu hướng sử dụng thực phẩm tươi và thực phẩm ít chế biếncủa người tiêu
dùng hiện nay ngày càng tăng, hình thành nên một dạng thực phẩm mới là các sản
phẩm rau quả chế biến tối thiểu. Rau quả CBTT hiệnlà một trong những mặt hàng
hóa sôi động nhất trong các cửa hàng rau quả thực phẩm ở Mỹ. Thị trường rau
quả cắt ở các nước Châu Á đã phát triển từ cuối những năm 80 và đầu những năm
90,đặc biệt là Nhật Bản và Hàn Quốc. Ở nhiều nước phát triển, việc sản xuất các
sản phẩm rau quả tươi dạng CBTT đã trở thành một ngành công nghiệp có thị phần
không nhỏ [47]. Tuy nhiên, ở Việt Nam, CBTT gần đây mới bắt đầu được quan tâm
nghiên cứu và thương mại. Dạng thực phẩm này tuy mới xuất hiện với số lượng hạn
chế về chủng loại nhưng có tiềm năng phát triển mạnh mẽ vì phù hợp với xu thế
phát triển kinh tế xã hội và lối sống hiện đại. Một số kết quả nghiên cứu bước đầu
8


về công nghệ CBTTcủa Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạchđạt
đượcmột số kết quả nhất định như đảm bảo được độ cứng, màu sắc của mít, dứa cắt
mặc dù thời gian bảo quản còn ngắn (8-10 ngày) [2-4].Công nghệ CBTT ở Việt
Nam hiện nay rất cần có hướng nghiên cứu sâu hơn, đa dạng hơn về chủng loại.
Cho tới nay, những công trình nghiên cứu và ứng dụng axít phenyllactic trên
thế giới mới dừng ở phạm vi tuyển chọn những chủng vi khuẩn lactic có khả năng
sinh axít phenyllactic cao ứng dụng trực tiếp trong thực phẩm như bổ sung vào bột
làm bánh hay bổ sung vào thức ăn chăn nuôi [99][105], chỉ có một vài nghiên cứu
thử nghiệm sản xuất axít phenyllactic thông qua quá trình lên men ở quy mô nhỏ
phòng thí nghiệm (3-10 lít) [69]. Do đó, việc “Nghiên cứu tạo axít phenyllactic và
ứng dụng trong bảo quản một số rau quả chế biến tối thiểu”là thực sự cần thiết.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu tạoaxít phenyllactic từ vi khuẩn lactic và đánh giá được hiệu quả
của axítphenyllactic trong việc duy trì chất lượng và đảm bảo an toàn thực phẩm đối
với một số sản phẩm rau quả chế biến tối thiểu.

3. Nội dung nghiên cứu
-

Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh axít
phenyllactic cao;

-

Tạo axít phenyllactic từ vi khuẩn tuyển chọn được bằng phương pháp lên men;

-

Đánh giá chất lượng của axít phenyllactic thu được;

-

Đánh giá hiệu quả của axít phenyllactic trong sơ chế, bảo quản một số rau
(cà rốt, khoai tây) quả (dứa, mít, vải)chế biến tối thiểu.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học

9



Đã phân lập và tuyển chọn được bộ chủng giống vi khuẩn Lactobacillus
plantarum có khả năng sinh axít phenyllactic cao.Kết quả này đã góp phần
khai thác đa dạng vi sinh vật của Việt Nam cho ứng dụng trong công nghệ
sinh học;



Là công trình nghiên cứu đầu tiên có hệ thống tổng thể về quá trình tạo axít
phenyllactic, giải quyết trọn vẹn vấn đề từ khâu chủng giống đến khâu tạochế
phẩm và cuối cùng là ứng dụng sản phẩm trên một số đối tượng rau quả
CBTT. Đây là nguồn tài liệu đáng tin cậy để các nhà khoa học quan tâm đến
các vấn đề tương tự tham khảo.


4.2. Ý nghĩa thực tiễn


Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm axít phenyllactic để
có thể chủ động sản xuất chế phẩm đáp ứng nhu cầu sử dụng trong nước, đa
dạng hóa sản phẩm bảo quản sinh học an toàn;



Đối tượng lựa chọn để ứng dụng chế phẩm tạo ra là rau quả chế biến tối
thiểu. Đây là những sản phẩm rau quả ‘sẵn sàng để ăn’ và ‘sẵn sàng để nấu’
với yêu cầu phải đảm bảo chất lượng tươi, ngon và chứa những thành phần
tự nhiên. Bởi vậy, việc ứng dụng chế phẩm PLA là chế phẩm bảo quản sinh
học an toàn để bảo quản các sản phẩm CBTT có ý nghĩa thực tiễn cao;



Tạo ra cơ sở dữ liệu làm tài liệu tham khảo khi nghiên cứu sản xuất chế
phẩm sinh học từ vi sinh vật ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.

5. Điểm mới của luận án


Đã tuyển chọn được 02 chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarumC2 và C15
có khả năng sinh axít phenyllactic cao (hàm lượng đạt 1,2 g/l) với trình tự
gen rADN 16S tương đồng 99% với trình tự gen của chủng Lactobacillus
plantarum NRIC 1767. Hai chủng vi khuẩn này là hai chủng hoàn toàn mới
so với các công trình đã công bố trước đây trong và ngoài nước.



Đã xây dựng được quy trình tạo axít phenyllactic bởi chủng L.plantarum C2
bằng phương pháp lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng quy mô 800
lít/mẻ hoàn chỉnh, là tiền đề tiến tới sản xuất chế phẩm quy mô công nghiệp;



Đã tạo ra được chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học và ứng dụng
trong bảo quản rau quả chế biến tối thiểu, đây là điểm mới so với các công
trình nghiên cứu và ứng dụng axít phenyllactic khác trên thế giới;

6. Cấu trúc của luận án
Luận án được trình bày trong 155 trang gồm 3 phần với 35 bảng, 53 hình và
đồ thị.Phần 1. Tổng quan; Phần 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu; Phần 3. Kết
quả và thảo luận; Phần 4. Kết luận và kiến nghị; Tài liệu tham khảo với 112 tài liệu
tham khảo và Phần phụ lục.


10

CHƯƠNGI.TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về axít phenyllactic
1.1.1. Đặc tính và tác dụng của axít phenyllactic
Axít phenyllactic (PLA) là một loại axít thơm, có công thức phân tử là
C9H10O3, trong phân tử có chứa vòng thơm (thể hiện ở hình 1.1). PLA dễ dàng hòa
tan trong nước tạo thành dung dịch, nhiệt độ nóng chảy là 121-125ºC, khối lượng
phân tử 166,2 [53].

Hình 1. 1. Cấu trúc phân tử của axít phenyllactic

PLA đã được chứng minh là có khả năng ức chế sinh trưởng và sự phát triển
của một số loài vi khuẩn gram âm, gram dương, cùng nhiều loài nấm men, nấm mốc
gây hư hỏngthực phẩm [54][63][93]. PLA có thể gây ra những biến đổi về hoạt
động và cấu trúc của vi khuẩn Listeria monocytogenes. Cơ chế tiêu diệt vi khuẩn
là dưới sự hiện diện của PLA, vi khuẩn tập hợp thành khối, các polysaccarit
được tách ra, thành tế bào mất đi tính chất mềm dẻo, linh hoạt, bán thấm, làm
cho tế bào trương nước, căng ra và kết quả là các tế bào vi khuẩn bị vỡ và tan rã
[95].
Bên cạnh việc sử dụng PLA là chất kháng vi sinh vật trong nông sản và
thực phẩm, gần đây PLA còn được sử dụng trong một số dược phẩm và mỹ phẩm
[29][74]. Hơn nữa, PLA còn được chứng minh là có ảnh hưởng tốt đến hệ thống
miễn dịch, khả năng đẻ trứng của gà. Tỷ lệ đẻ trứng của gà tăng lên, độ cứng của
vỏ trứng cũng tăng khi bổ sung PLA vào khẩu phần ăn hàng ngày [105]. Một số
nghiên cứu cho thấy PLA hoàn toàn không gây độc với con người và động vật.
PLA có mặt trong một số loại mật ong tự nhiên với hàm lượng cao và được đánh
giá là rất an toàn với môi trường sống [109].

11

Như vậy, axít phenyllactic được đánh giá là hợp chất an toàn có khả năng
ức chế, kiểm soát tốt nhiều loài vi sinh vật gây hại thực phẩm nên rất có tiềm năng
ứng dụng trong bảo quản nông sản và thực phẩm. Từ đó, việc nghiên cứu tạo ra chế
phẩm axít phenyllactic tự nhiên an toàn để ứng dụng trong bảo quản là hướng đi
mới và cần thiết hiện nay.
1.1.2. Cơ chế tổng hợp PLA
PLA có thể được tạo ra bằng phương pháp hóa học và sinh học. PLA được tổng
hợp bằng con đường hoá học thông qua quá trình khử của kẽm và axit hydrochloric và
azlactone, hoặc quá trình hydro hoá dưới sự xúc tác của Raney-N hoặc hợp kim của
Pd-C.Bằng phương pháp này có thể sinh ra cả 2 dạng đồng phân là dạng D và dạng L.
Tuy nhiên, việc sản xuất PLA theo phương pháp này còn nhiều hạn chế như điều kiện
tiến hành phản ứng phải tuân thủ một cách nghiêm ngặt và gây ảnh hưởng tới môi
trường sống [101].
Ngược lại, quá trình tổng hợp PLA bằng con đường sinh học có nhiều ưu điểm
hơn. Sản xuất PLA theo phương pháp này chủ yếu sinh ra đồng phân dạng D là dạng
có mặt trong cơ thể sống. Do vậy, PLA sản xuất theo phương pháp tổng hợp sinh học
dễ dàng được người tiêu dùng chấp nhận [109].

Hình 1.2. Cơ chế sinh tổng hợp axít phenyllactic[68]

Ở quá trình này, PLA được sản sinh ra bởi một số loài vi sinh vật thông qua
quá trình lên men. PLA là sản phẩm cuối cùng của quá trình biến đổi phenylalanine,
một trong số 20 axít amin thiết yếu sinh protein được mã hóa bởi AND (hình 1.2).

12


Trong quá trình biến đổi đó, ở điều kiện nhất định, phenylalanine chuyển hóa
thànhaxít phenylpyruvic.Tiếp đến, sự hoạt hóa của enzym D-phenyllactic acid

dehydrogenase, axít phenylpyruvic tiếp tục chuyển hóa thành axít phenyllactic [68].
Do đó, sản lượng PLA được tạo ra phụ thuộc rất nhiều chủng vi sinh vật sinh PLA
và thành phần, điều kiện môi trường nuôi cấy vi sinh vật [69].
1.1.3. Vi sinh vật sinh tổng hợp PLA và các yếu tố ảnh hưởng
1.1.3.1. Vi sinh vật sinh tổng hợp PLA
Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới đã tìm ra được một số chủng vi sinh
vật có khả năng sinh PLA thông qua quá trình lên men trên môi trường đặc hiệu
(bảng 1.1). Chủng nấm men Geotrichum candidumđược phát hiện lần đầu tiên là có
khả năng sản sinh PLA trên môi trường lên men từ dịch chiết đậu tương và dịch
chiết nấm men [36]. Nhiều nghiên cứu sau đó đã tìm ra được nhiều chủng vi khuẩn
chủ yếu thuộc nhóm vi khuẩn lactic, đặc biệt là chi Lactobacilluscó khả năng sinh
PLA [97][100]. Trong số những chủng vi khuẩn có khả năng sinh PLA thuộc chi
này thì loài Lactobacillus plantarum được phát hiện nhiều hơn cả [97][101][109].
Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống có đặc tính chung là lên men
gluxit thành axít lactic. Tất cả những vi khuẩn lactic này đều có đặc điểm chung là:
gram dương, bất động, không sinh bào tử, catalaza âm tính, nitratoreducaza âm tính,
là vi khuẩn kị khí chịu khí, là loại cơ thể độc nhất có khả năng lên men hiếu khí cũng
như kị khí. Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống rất khác nhau. Tế bào của
chúng có thể là hình cầu như Streptoococcus hay Lactococcus, Enterococcus,
Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus. Người ta phân biệt chúng
bằng khả năng lên men đồng hình hay dị hình[100].
Giống (chi) Lactobacillus là những vi khuẩn không sinh bào tử thuộc lớp vi
khuẩn gram dương. Những trực khuẩn này đứng riêng lẻ hay thành chuỗi, thủy phân
đường saccharoza mạnh, hình thành axít dạng D, L hay DL, không khử nitrat, chúng
phân giải gelatin, casein, indole và H 2S. Chúng không có catalaza và cytochrome
oxydaza. Chúng là những vi khuẩn khuyết dưỡng nhiều loại vitamin, axít amin.
Nhiều vi khuẩn thuộc nhóm lactic đã được phát hiện có khả năng sinh PLA như
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus rhamnosus,
Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus brevis,...(bảng
1.1).

13


Bảng 1.1. Một số loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp axít phenyllactic [93]
Chủng vi sinh vật

Chất tạo thành

Brevibacterium lactofermentum

Axít phenyllactic

Geotrichum candidum

Axít phenyllactic

Lactobacillus plantarum 20B,
Lactobacillus plantarum 21B

Axít phenyllactic, 4-hydroxy- phenyllactic
acid

Lactobacillus plantarum MiLAB 393

3- Axít phenyllactic , cyclo (Phe-pro), cyclo
(Phe-OH-Pro)

Lactobacilluscoryniformis
Si3,Lactobacillus sakei

Peptide, Axít phenyllactic, cyclo (Phe-pro),
cyclo (Phe-OH-Pro), reuterin

Lactobacillus plantarum MiLAB 14

Hydroxy fatty acids, Axít phenyllactic
cyclo (Phe-pro), cyclo (Phe-OH-Pro)

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
alimentarius, Lactobacillus rhamnosus,
Lactobacillus sanfranciscensis,
Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus
brevis, Leuconostoc citreum

Axít phenyllactic

Lactobacillus plantarum FST1.7

Axít phenyllactic

Lactobacillus plantarum ITM21B

Axít phenyllactic

Lactobacillus sp SK007

Axít phenyllactic

Lactobacillus plantarum CRL778,

Lactobacillus reuteri CRL1100,
Lactobacillus brevis CRL772và
CRL796

Axít phenyllactic, axít axetic

Lactobacillus có khả năng sinh bacterioxin, PLA, axít 4-hydroxy
phenyllactic và có khả năng sinh protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử 10 30 KDa [62].
1.1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của Lactobacillus plantarum

14

,


Để tổng hợp và thu nhận PLA đạt hiệu suất cao nhất từ Lactobacillus
plantarum, phương pháp nuôi cấy chìm gián đoạn với thành phần môi trường và
điều kiện nuôi cấy thích hợp thường được sử dụng. Thành phần môi trường là
nhân tố quyết định tới quá trình sinh trưởng và phát triển của Lactobacillus
plantarum cũng như hiệu suất sinh PLA. Thành phần dinh dưỡng bao gồm các yếu
tố như nguồn cacbon, nguồn nitơ, nguồn khoáng… và các yếu tố môi trường như
ảnh hưởng của pH, thời gian lên men, hàm lượng oxy.
a. Ảnh hưởng của môi trườngnuôi cấy
Vi khuẩn lactic có nhu cầu về dinh dưỡng khá phức tạp bởi khả năng tổng
hợp hạn chế những yếu tố sinh trưởng của chúng như vitamin B và các axít amin.
Chúng đòi hỏi một số nhân tố cho sinh trưởng như nguồn cacbon và nitơ ở dạng
cacbohydrate, axít amin, vitamin và khoáng chất [53]. Một số yếu tố kích thích sinh
trưởng cũng có ảnh hưởng đến tỷ lệ sản xuất axít phenyllactic. Hỗn hợp các axít
amin, peptit luôn kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic và làm cho tỷ lệ phát
triển cao hơn những chủng chỉ có axít amin tự do [100]. Axít béo cũng có ảnh

hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic và các muối phosphate là những muối
quan trọng nhất trong quá trình lên men lactic. Ion ammonium không phải là nguồn
nitơ duy nhất mà chúng còn có một số ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa một số
axít amin nhất định. Nhìn chung, những đặc tính tốt của vi khuẩn lactic sử dụng
trong công nghiệp là khả năng chuyển hóa nhanh và hoàn toàn những nguyên liệu rẻ
tiền thành axít với nhu cầu dinh dưỡng thấp nhất và cung cấp chất đồng phân lập thể
thích hợp hơn với sản lượng cao mà không có sản phẩm phụ nào [93].
Nhu cầu về cacbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại nguồn cacbon khác nhau để đáp ứng
nhu cầu dinh dưỡng cacbon của chúng. Tuy nhiên, nguồn cacbon quan trọng nhất đối
với vi khuẩn vẫn là monosaccharide và disaccharide [8][108].Những nguyên liệu tinh
bột thường được sử dụng để sản xuất axít lactic bao gồm cao lương, lúa mì, ngô, sắn,
khoai tây, gạo, lúa mạch đen và đại mạch. Những nguyên liệu này phải được thủy
phân thành đường trước khi lên men bởi chúng chứa chủ yếu là α(1,4)-glucose và
α(1,6)-glucose [71]. Những chủng vi khuẩn L.amylophilus và L.amylovorus có khả
năng sản sinh amylase thường được sử dụng để lên men trực tiếp nguyên liệu tinh bột
để tạo ra axít lactic [106]. Nguyên liệu xenlulose được sử dụng để sản xuất axít lactic
theo cách tương tự như tinh bột,chúng chứa chủ yếu là β(1,4)-glucan gồm xylan,
arabinan, galactan và lignin [107]. Rỉ đường là phụ phẩm của quá trình sản xuất

15


đường và nó thường chứa một lượng lớn đường saccharose [53]. L. delbrueckii và E.
faecalis là hai chủng được sử dụng để sản xuất axít lactic từ rỉ đường [49].
Nhu cầu về nguồn nitơ
Phần lớn vi khuẩn lactic đều là các vi khuẩn dị dưỡng nitơ, vì vậy để đảm
bảo cho quá trình phát triển và sinh tổng hợp axít hữu cơ được dễ dàng chúng cần
có nguồn nitơ sẵn có trong môi trường. Nguồn cung cấp dinh dưỡng nitơ là các axít
amin, trong quá trình nuôi cấy con người sẽ bổ sung các nguồn chứa nitơ như: cao

nấm men, cao thịt, pepton, cao ngô, casein.Dinh dưỡng phổ biến nhất cho quá trình
lên men sản xuất axít lactic, axít phenyllactic là dịch chiết nấm men, nhưng chính
điều này lại làm tăng giá thành sản xuất. Dịch chiết ngô, một phụ phẩm của quy
trình ngâm chiết ngô, đã được sử dụng thay thế dịch chiết nấm men trong sản xuất
thành công axít lactic [27]. Hàm lượng nitơ của dịch chiết ngô phụ thuộc vào quy
trình ngâm chiết được sử dụng. 85% hàm lượng nitơ tổng số gồm protein, peptit và
axít amin. Mu và cộng sự (2008) đã nghiên cứu chọn lọc ra được thành phần môi
trường tối ưu có chứa dịch chiết ngô (4,7%) và bột nấm men ((3%) để sản xuất axít
phenyllactic với sản lượng 2,3 g/l [68].Yun và cộng sự đã chỉ cho thấy cám gạo và
cám lúa mì là thành phần dinh dưỡng quan trọng để sản xuất axít lactic bởi vì chúng
chứa một số nhân tố dinh dưỡng cũng như cacbohydrat có khả năng lên men [108].
Nhu cầu về các chất khoáng
Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển đầy đủ của mình, vi khuẩn
Lactobacillus plantarum cần phức hợp các hợp chất vô cơ như: photpho, lưu huỳnh,
kali, magie, mangan, đồng, sắt, natri…đặc biệt là mangan.
Lactobacillus plantarum cần một nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ cho
sự phát triển của chúng. Axít axetic, axít xitric, axít oleic hoặc axít linolenic có tác
động thuận lợi đến tốc độ phát triển của vi khuẩn Lactobacillus plantarum. Đó cũng
là lý do mà môi trường nuôi cấy và bảo quản Lactobacillus plantarum thường có
mặt của các muối axetat, xitrat và Tween-80 [44].
b. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ và pH cũng là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển
của vi khuẩn lactic và sản xuất axít [69].
Ảnh hưởng của pH
Hoạt động của vi khuẩn lactic chịu tác động rất mạnh của pH môi trường lên
men. Độ pH của môi trường tác động đến quá trình trao đổi chất của tế bào, đặc biệt

16

là tác động đến hệ enzim của chúng, mỗi enzim đều có một dải pH tối ưu mà tại đó
hoạt lực của enzim là cao nhất [53]. Nếu pH không thích hợp, vi khuẩn có thể bị ức
chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt. Cho nên việc xác định pH ban đầu thích hợp và
duy trì pH cần thiết trong thời gian sinh trưởng của tế bào là rất quan trọng. Các vi
khuẩn lactic có pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5 – 6,2 (Lactobacillus), 5,5 – 6,5
(Pecliococcus), 6,3 – 6,5 (Leuconostoc). Giá trị pH cuối cùng mà mỗi giống vi
khuẩn lactic có thể chịu được là khác nhau: Lactobacillus có thể chịu được pH = 3,2
– 3,5, Pecliococcus có thể chịu được pH = 3,5 – 4,4, Leuconostoc là pH = 5.
Khoảng pH thích hợp cho Lactobacillus plantarum sinh PLA cao nhất là 5,5 - 6,5
[57].
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của vi khuẩn, do tốc độ phản
ứng phụ thuộc vào nhiệt độ. Tốc độ phản ứng hóa sinh, hoạt lực enzim, tốc độ của
quá trình chuyển hóa phụ thuộc vào nhiệt độ. Mỗi loài vi khuẩn phát triển ở dải
nhiệt độ khác nhau. Đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu cho rằng vi khuẩn
Lactobacillus plantarum có thể phát triển trong dải nhiệt độ từ 30°C- 45°C [95].
Nhưng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng phát triển là 30 0C. Nếu nhiệt độ thấp vi
khuẩn sinh trưởng kém, mất nhiều thời gian, nếu nhiệt độ quá cao trên 45°C thì vi
khuẩn sẽ bị tiêu diệt.
Ảnh hưởng của thời gian lên men
PLA là một axít, khi nó được sinh ra trong điều kiện lên men sẽ làm giảm
pH của môi trường. Do đó, thời gian lên men là một yếu tố rất quan trọng để PLA
thu được với hiệu suất cao nhất. Nếu thời gian ngắn có thể sinh khối Lactobacillus
plantarum tạo ra ít, PLA chưa được tạo ra, còn nếu thời gian quá dài thì lượng
dinh dưỡng của môi trường giảm, không đủ thức ăn cho vi khuẩn, vi khuẩn sẽ
chết, đồng thời pH giảm mạnh sẽ ức chế vi khuẩn hoạt động, gây tốn kém. Bởi
vậy, việc tối ưu hoá thời gian lên men là rất cần thiết. Theo những nghiên cứu mới
đây, PLA tạo ra đạt năng suất cao khi thời gian lên men kéo dài từ 24 giờ – 72 giờ
ở điều kiện lên men chìm sục khí, gián đoạn có điều chỉnh pH 6 và bổ sung cơ
chất [69].

1.1.4. Công nghệ sản xuất axít phenyllactic
1.1.4.1. Công nghệ lên men sinh axít phenyllactic
Axít phenyllactic được phát hiện lần đầu tiên là do chủng nấm men
Geotrichun candidum sảnsinh ra khi chủng này được nuôi cấy trên môi trường dịch
17


chiết đậu tương và dịch chiết nấm men với sản lượng từ 0,6 - 1 g/l [112]. Sau đó,
nhiều loài vi khuẩn thuộc nhóm lactic có khả năng sinh PLA cũng được tìm thấy
như Lactobacillus plantarum, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus
rhamnosus, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii, Leuconostoc
citreum, Lactobacillus brevis [100]. Trong số 12 chủng vi khuẩn lactic được sử
dụng phổ biến trong sản xuất thực phẩm lên men đã phát hiện được 9 chủng có khả
năng sinh PLAvới sản lượng từ 0,028 – 0,091 g/l.Một số chủng vi khuẩn được phân
lập từ bột mỳ lên men có khả năng sinh PLA nhưLactobacillus plantarumITM21A
và L.sanfranciscensis IDMC57 với hàm lượng PLA là 0,058 g/l,L.citreum ITM22A
với hàm lượng PLA 0,071 g/l. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides
ITMY30phân lập từ quả oliu có khả năng sinh 0,094 g/l PLA [97].Ngoài ra, một số
vi khuẩn probiotic thương mại được phát hiện là có khả năng sinh PLA như
L.johnsonii La1 và L.acidophillus IBB801 có thể sinh 0,042 g/l và 0,025 g/l PLA
[64]. Lactobacillus plantarumFST1.7 được xác định là có khả năng sinh 33,47mg
PLA trong 1kg bột mỳ lên men [20]. L.plantarum TMW1.468 cũng được phát hiện
là có khả năng sinh 0,083 g/l PLA [101]. Trong số 112 chủng vi khuẩn phân lập từ
rau củ lên men truyền thống của Trung Quốc thì 70 chủng có khả năng sinh PLA
với sản lượng cao hơn, trong đó chủng Lactobacillus plantarum SK007 có thể sinh
0,094 g/l PLA tương đương với chủng Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteroides ITMY30[56].
Mặc dù PLA có thể được sản sinh ra bởi nhiều loài vi khuẩn Lactobacillus,
nhưng hoạt tính sinh PLA vẫn còn thấp. PLA được sản sinh bởi vi khuẩn lactic
nuôi cấy trên môi trường MRS cao nhất cũng chỉ đạt đến 0,94 g/l [56][99]. Những

nghiên cứu sản xuất PLA từ vi khuẩn lactic đều ứng dụng axít amin làm cơ chất.
Sản lượng PLA sinh ra từ L.plantarum ITM21B tăng lên khi tăng lượng axít amin
phenylalanin [99]. Tuy nhiên, quá trình trao đổi axít amin bởi vi khuẩn lactic bị
giới hạn bởi khả năng huy động của chất nhận amin trong phản ứng chuyển hóa
amin. Vermeulen và cộng sự đã chỉ ra rằng việc chuyển hóa phenylalanin là một
nhân tố hạn chế trong quy trình sản xuất PLA bởi L.sanfranciscensis DSM20451
và L.plantarum TMW1.468. Họ cũng nhận thấy rằng sản lượng PLA tăng từ 530% khi bổ sung α-ketoglutarate vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn [101]. Li và
cộng sự (2007) đã chỉ ra rằng quá trình sinh tổng hợp PLA bởi Lactobacillus
plantarum SK007 bị hạn chế bởi phenylalanin và điều này có thể vượt qua được
nhờ giải pháp thay thế cơ chất phenylalanin bằng axít phenylpyruvic. Kết quả là
sản lượng PLA đã tăng từ 0,094 g/l lên 1,31 g/l (tăng 14 lần)[56]. Trong một
nghiên cứu khác, khi bổ sung 3 g/l axít phenylpyruvic vào môi trường nuôi cấy vi
18


khuẩn Lactobacillus plantarum IMAU 10124 thu được sản lượng axít phenyllactic
lên tới 2,9 g/l, gấp trên 12 lần so với không bổ sung tiền chất [110].
Axít phenyllactic có nhiều đặc tính giống với axít lactic và cùng được sản
sinh ra từ vi khuẩn lactic. Tuy nhiên, khác với axít phenyllactic mới được phát hiện
và nghiên cứu thì axít lactic đã được nghiên cứu từ lâu và cho đến nay được sản
xuất thương mại ứng dụng nhiều trong thực phẩm. Để sản xuất axít lactic bằng công
nghệ sinh học tiện lợi thì những nguyên liệu thô rẻ tiền thường được sử dụng bởi
những nhà sản xuất polymer và sản xuất công nghiệp khác luôn luôn cần số lượng
lớn axít lactic với giá thành tương đối thấp. Những nguyên liệu thô sử dụng để sản
xuấtaxít lactic phải có những đặc tính là rẻ, mức nhiễm tạp thấp, tỷ lệ sản xuất
nhanh, sản lượng cao, ít hoặc không có sản phẩm phụ, khả năng lên men không cần
tiền xử lý hoặc xử lý ít và luôn sẵn có quanh năm. Khi những nguyên liệu tinh chế
được sử dụng cho sản xuất, giá thành cho tinh sạch sản phẩm cần phải thấp. Tuy
nhiên, điều này không có lợi về mặt kinh tế vì cacbohydrate tinh chế quá đắt làm
tăng giá thành sản xuất [44]. Bởi vậy, nhiều nghiên cứu đã sàng lọc những nguyên

liệu thô rẻ tiền cho sản xuất axít lactic đạt hiệu quả kinh tế. Những nguyên liệu rẻ
tiền như tinh bột, xenlulose, whey và rỉ đường thường được sử dụng để sản xuất axít
lactic. Trong số đó, tinh bột và xenlulose được quan tâm sử dụng nhiều hơn bởi giá
thành rẻ, số lượng nhiều và có thể thay mới được [8].
Bên cạnh đó, một số phế phụ phẩm công nghiệp như whey và rỉ đường được
sử dụng làm cơ chất cho sản xuất axít lactic. Whey là phụ phẩm chính của ngành
công nghiệp sữa và nó chứa lactose, protein, chất béo và muối khoáng. Để tận dụng
hoàn toàn lactose của whey, người ta thường bổ sung thêm nguồn nitơ vào whey
nhằm mục đích giảm lượng dinh dưỡng không sử dụng hết của quá trình lên men và
tăng hiệu quả kinh tế. Schepers và cộng sựđã bổ sung thêm dịch chiết nấm men vào
whey làm cho quá trình sản xuất axít lactic bởi chủng L. helveticus tăng nhanh [92].
Ngoài ra, để tăng nhanh quá trình sản xuất axít lactic cần phải bổ sung thêm dinh
dưỡng vào môi trường lên men. Dinh dưỡng phổ biến nhất để sản xuất axít lactic là
dịch chiết nấm men, nhưng chính điều này lại làm tăng giá thành sản xuất. Dịch
chiết ngô, một phụ phẩm của quy trình ngâm chiết ngô, đã được sử dụng thay thế
dịch chiết nấm men trong sản xuất thành công axít lactic [27].
Với mục tiêu sản xuất axít lactic, axít phenyllactic đạt hiệu suất cao, ngoài
việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi sinh vật và lựa chọn chủng vi sinh vật thích
hợp, thì việc lựa chọn công nghệ lên men tối ưu để thu được axít với hàm lượng
cao, giảm thời gian lên men cũng như giá thành sản xuất đóng vai trò hết sức quan
trọng. Axít lactic, axít phenyllactic thường được sản xuất theo phương pháp lên men
19


gián đoạn, gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng và liên tục. Lên men gián đoạn và gián
đoạn có bổ sung dinh dưỡng thường thu được nồng độ axít cao hơn lên men liên
tục, trong khi đó hiệu suất cao hơn có thể đạt được khi sử dụng lên men liên tục
[92]. Một ưu điểm nữa của lên men liên tục so với gián đoạn là khả năng liên tục
quy trình trong một thời gian dài hơn. Những quy trình lên men liên tục và gián
đoạn lặp lại cùng với hệ thống tuần hoàn tế bào có thể thu được mật độ tế bào và

sản lượng sản phẩm lớn. Oh và cộng sự đã sản xuất axít lactic ở tỷ lệ 6,4 g/l.h bằng
phương pháp lên men gián đoạn lặp lại tuần hoàn tế bào. Kết quả cũng chỉ cho thấy
chỉ 26% lượng dịch chiết nấm men so với lên men gián đoạn thông thường cần để
sản xuất ra cùng một lượng axít lactic, bởi vậy đã giảm được giá thành sản xuất
đáng kể. Mật độ tế bào cao nhất thu được lớn hơn 28 g/l, làm tăng hiệu suất và giảm
lượng dinh dưỡng bổ sung thêm [72]. Phương pháp lên men gián đoạn chủng
Lactobacillus plantarum SK007 có bổ sung dinh dưỡng 2 giờ/một lần (100g/l PPA,
500g/l glucose) và điều chỉnh pH 6,0 có thể đạt được sản lượng PLA cao nhất là
17,38 g/l [69].
Gần đây, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm loại bớt axít lactic đồng
thời ngay khi nó được hình thành. Quá trình lên men thẩm tách bằng điện với màng
trao đổi ion cũng thường được sử dụng để loại bớt axít lactic. Hệ thống lên men
thẩm tách điện có đồng hồ đo mức độ là hệ thống hiệu quả nhất và thu được sản
lượng cao hơn nếu nồng độ glucose trong dịch lên men được kiểm soát luôn duy trì
ở một mức thấp hơn. Màng lọc nano và nhựa trao đổi ion được ghép với lò phản
ứng sinh học trong việc lấy bớt axít lactic [71].
1.1.4.2. Thu hồi axít phenyllactic
Trong quy trình sản xuất axít hữu cơ, tiếp ngay sau quá trình lên men là quá
trình thu hồi sản phẩm axít từ dịch lên men. Một số phương pháp được sử dụng để
thu hồi axít lactic bao gồm trích li,thu hồi bằng hóa học, chưng cất, thẩm tách điện
và trao đổi ion … Nhiều quá trình dùng dung môi trích li đã được dùng để tinh chế
axít lactic sau khi tế bào vi sinh vật đã được tách khỏi dịch đường. Một hệ thống
trích li liên tục dựa trên ete isopropyl được công ty Anh Croda Bowmans Chemicals
Ltd. đưa vào ứng dụng ở mức độ sản xuất công nghiệp [72]. Tuy nhiên, phương
pháp trích li lỏng-lỏng có nhược điểm là khó chọn các dung môi thích hợp, các
dung môi trích li tốt lại thường có độc tính cao đối với tế bào và ngược lại.
Thu hồi axít lactic bằng phương pháp chưng cất cũng được sử dụng dựa trên
nguyên tắc este hóa axít lactic bằng rượu methanol rồi sau đó thủy phân metyl
lactate thành axít lactic bằng cách chưng cất. Đối với phản ứng este hóa, người ta
dùng chất xúc tác để đảm bảo chỉ có quá trình este hóa xảy ra. Hỗn hợp sản phẩm

20


este hóa sau đó gồm rượu chưa phản ứng, nước và este được đưa vào một hệ thống
chưng cất gồm có bộ phận ngưng tụ chính ở trên và phụ ở dưới. Hỗn hợp hơi vào hệ
thống ngưng tụ, đầu tiên qua bộ phận ngưng tụ phụ, các hợp phần của hơi là metyl
lactate và nước ít bay hơi nhất được ngưng tụ chảy xuống nồi đun phía dưới. Tại
đây, chỉ có phản ứng thủy phân xảy ra vì rượu methanol đã bị bay hơi lên trên, còn
axít lactic ở lại nồi ở dạng lỏng, methanol có độ bay hơi lớn nhất tiếp tục đi lên bộ
phận ngưng tụ chính phía trên và được đưa hồi lưu trở lại cho phản ứng este hóa
[106].
Một trong những phương pháp hiện đại mới được áp dụng và cho kết quả
khả quan là phương pháp thu hồi axít lactic bằng thẩm tách điện. Vũ Hồng Thắng
và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm thu hồi axít lactic bằng thiết bị thẩm tách điện
của Nhật Bản. Sử dụng chủng Lactobacillus lactis lên men trên môi trường dịch
thủy phân tinh bột sắn tạo dạng axít lactic dạng L(+). Sau khi xử lý dịch lên men
bằng than hoạt tính, năng suất thu hồi khoảng 261 g/l.h với dung dịch chuẩn là 272
g/l.h. Nồng độ axít cuối cùng là 191 g/l, hiệu suất thu hồi đạt 91,5% [1].
Phương pháp trao đổi ion dựa trên khả năng trao đổi anion của nhựa trao đổi
ion (anionit).Khi cho dịch lên men tiếp xúc với anionit ở dạng OH, các gốc axít sẽ
thay thế các nhóm OH hoạt động có trong nhựa và bị giữ lại, axít lactic sau đó
được tách ra khỏi nhựa bằng cách cho một dung dịch điện li thích hợp tiếp xúc với
nhựa, các gốc axít sẽ bị đẩy ra khỏi nhựa bởi các anion của dung dịch điện li này
theo cùng một cơ chế.Phương pháp trao đổi ion thực ra đã được ứng dụng từ rất lâu
trong công nghiệp, chủ yếu là để tách loại như: xử lý và làm mềm nước, tách các
axít vô cơ và hữu cơ, tẩy màu, thu hồi và tinh chế các protein, do vậy phạm vi ứng
dụng khá rộng.Đối với quá trình lên men lactic liên tục, nhựa trao đổi ion ngoài việc
thu hồi axít còn được dùng để tạo độ pH thích hợp cho dịch lên men, dịch sau khi
cho qua nhựa sẽ được đưa trở lại để lên men tiếp. Năng suất của quá trình có thể lớn
gấp 5 lần so với quá trình lên men gián đoạn [67].Bản chất nhựa trao đổi ion là

polyme có chứa các nối ngang (liên kết giữa các chuỗi cacbon dài trong polyme).
Trong nhựa có chứa các nhóm hoạt động ở các vị trí có tích điện, tại những vị trí
này, các ion tích điện trái dấu có thể được hút hoặc thay thế bằng các ion khác tùy
thuộc vào nồng độ và ái lực của các ion đó so với vị trí có tích điện. Hiệu quả của
quá trình trao đổi ion phụ thuộc vào hai yếu tố là số nhóm hoạt động và khả năng
trao đổi của nhựa đối với mỗi loại ion nhất định.Mỗi loại nhựa có khả năng hấp phụ
khác nhau đối với các ion khác nhau trong dung dịch, điều đó được gọi là tính chọn
lọc của nhựa và được đặc trưng bởi hệ số chọn lọc hay nói cách khác, ái lực của các
loại ion khác nhau thì khác nhau đối với mỗi loại nhựa khác nhau [67].
21


Quá trình trao đổi giữa hai ion (một của ion và một của nhựa) là một quá
trình thuận nghịch, lấy ví dụ quá trình trao đổi cation là ví dụ:
P(RnX) + nY+p<-> n (RpY) + pX+n
Trong đó, RX là nhựa với X là ion trao đổi, Y (+) là ion trong dung dịch.
Trong quá trình trao đổi, ion Y+p vào trong nhựa còn ion X+n bị thay thế và đi
vào trong dung dịch. Cân bằng sẽ được thiết lập sau một thời gian nhất định tùy
thuộc và bản chất của nhựa và tính chất của dung dịch, sau đó sự trao đổi không xảy
ra nữa.
Có thể sử dụng nhựa để trao đổi theo hai phương pháp tĩnh hoặc phương
pháp động. Trong phương pháp tĩnh, người ta cân nhựa rồi cho tiếp xúc với một
thể tích xác định của dung dịch chứa ion cần tách. Tuy vậy trong trường hợp này
không tách được hoàn toàn ion khỏi dung dịch cần tách và quá trình trao đổi ion
là quá trình thuận nghịch và ion bị hấp phụ vẫn còn lại trong dung dịch ở nồng độ
cân bằng. Do đó, trong thực tế nghiên cứu sản xuất người ta thường dùng phương
pháp động nghĩa là tiến hành cho trao đổi ion trên cột. Cột trao đổi ion thường có
hình trụ trong có chứa hạt nhựa (đường kính và chiều cao tùy thuộc vào mục đích
nghiên cứu hay sản xuất), dung dịch nghiên cứu được cho nhảy từ trên xuống ra
khỏi đáy cột. Khi dội dung dịch qua cột, trong các điều kiện thuận lợi, ion của

dung dịch sẽ bị hấp phụ hoàn toàn bởi ionit và dung dịch trong quá trình chảy qua
cột sẽ dần dần tiếp xúc với các lớp nhựa mới.Chu kỳ trao đổi ion trên cột thường
diễn ra theo hai giai đoạn: giai đoạn hấp phụ ion trên ionit và giai đoạn giải hấp
hay còn gọi là giai đoạn tách rửa. Dung dịch chất diện ly dùng để tách ion bị hấp
phụ ra khỏi cột gọi là chất tách rửa [67].
Phương pháp thu hồi bằng hóa học là phương pháp khá cổ điển song nó lại
thích hợp cho việc thu hồi axít từ dịch lên men chứa nhiều tạp chất. Phương pháp
này gồm các công đoạn: xử lý dịch lên men, kết tinh thu nhận muối canxi, axít hóa,
tẩy màu, loại bỏ tạp chất và cô đặc.Trong quá trình lên men, ngoài sự tạo axít, vi
khuẩn lactic còn sinh tổng hợp ra các enzyme ngoại bào, các axít nucleic và các axít
hữu cơ khác, các chất này cản trở quá trình kết tinh thu nhận muối canxi và ảnh
hưởng tới độ tinh khiết của sản phẩm. Vì vậy dịch lên men phải được xử lý nhằm
loại bỏ sơ bộ các tạp chất này. Thông thường dịch lên men được điều chỉnh pH tới
10- 12 bằng Ca(OH)2 và gia nhiệt có các chất keo tụ protein, kết lắng cùng với xác
tế bào vi khuẩn, tạp chất. Sau đó được lọc tách cặn, thu nhận dịch muối canxi
trong.Kết tinh là quá trình tách chất rắn hòa tan trong dung dịch, là một trong những
phương pháp chủ yếu để thu được chất rắn ở dạng nguyên chất. Kết tinh các chất
22


rắn hòa tan trong dung dịch dựa vào độ hòa tan hạn chế của chất rắn. Khi độ hòa tan
của chất rắn đạt cực đại, dung dịch dần đạt đến trạng thái bão hòa và quá bão hòa.
Cuối cùng, tinh thể muối canxi nhận được từ quá trình kết tinh được hoàn nguyên
thành axít nhờ tác nhân axít mạnh. Phản ứng xảy ra như sau:
(R-COO)2Ca.5H2O + H2SO42R-COOH +CaSO4 + 5H2O
Kết tủa canxi sunfat được tách loại bằng phương pháp lọc để thu được dịch
trong chứa axít phenyllactic. Hiệu suất thu hồi axít lactic đạt 68,94% khi sử dụng
phương pháp này với điều kiện pH đạt 11, nhiệt độ kết tinh 5-10ºC và khuấy với tốc
độ 35 vòng/phút [1].
1.1.5. Ứng dụng của axít phenyllactic

PLA đã được chứng minh là có khả năng ức chế sinh trưởng và sự phát
triển của một số loài vi khuẩn gram âm, gram dương, cùng nhiều loài nấm men,
nấm mốc gây hại thực phẩm [62][99]. Lavermicocca và cộng sự đã nghiên cứu
và chỉ ra rằng PLA được sinh ra từ chủng Lactobacillus plantarum có khả năng
ức chế sinh trưởng và phát triển của 23 chủng nấm mốc thuộc 14 loài của 3 chi
Aspergillus, Penicillium và Fusarium, đặc biệt có những loài sinh độc tố như
Aspergillus ochraceus, Aspergillus flavus, Penicillium roquefoti, Penicillium
verrucosum và Penicillium citrium phân lập từ các sản phẩm như bánh, bột, ngũ
cốc. Với liều lượng thấp hơn 7,5 mg/ml PLA có khả năng ức chế phần lớn sự
phát triển của các chủng này [35][54].
Ngoài ra, PLA cũng được chứng minh là có khả năng ức chế Listeria
monocytogenes ở liều lượng 13 mg/ml và ở nồng độ 20 mg/ml ức chế một số vi
khuẩn gây bệnh ở người là Escherichia coli, và Aeromonas hydrophila [62][64].
Một nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng ở nồng độ 7mg/ml, PLA có thể tiêu diệt được
Listeria monocytogenes trên môi trường dịch chiết đậu tương và dịch chiết nấm
men (TSB – YE). Mật độ Listeria monocytogenes đã giảm 100 lần so với ban
đầu sau 4 ngày nuôi cấy ở 25ºC trên môi trường TSB – YE có PLA.Mật độ của
vi khuẩn này cũng giảm 1.000 lần khi có mặt PLA trong giai đoạn vi khuẩn đang
tăng trưởng. PLA có tác dụng ức chế vi khuẩn trong sữa, lượng vi khuẩn giảm
4,5 lần so với lượng vi khuẩn ban đầu kiểm tra trong sữa [63].
PLA được sản sinh trong quá trình lên men của vi khuẩn L.plantarum
trong sản xuất bánh mỳ đã chỉ ra có khả năng ức chế rất tốt vi khuẩn gây hỏng
bánh Bacillus subtilis, kéo dài thời gian bảo quản bánh mỳ tới 7 ngày trong khi
bánh không xử lý sau 3 ngày mật độ Bacillus subtilis đã lên tới 10 9 cfu/g [99].
23


Bên cạnh đó, sử dụng chủng L. plantarum sinh PLA làm chủng khởi động lên
men bột làm bánh đã kéo dài thời gian bảo quản bánh tới 7 ngày và ức chế sự
phát triển của nhiều loài nấm mốc gây hại [53]. Mặc dù mới được phát hiện và

nghiên cứu trong thời gian gần đây nhưng tiềm năng ứng dụng của PLA trong
bảo quản nông sản, thực phẩm là rất lớn. Nhiều nghiên cứu, khảo sát quy mô
phòng thí nghiệm đã chỉ cho thấy PLA có nhiều triển vọng ứng dụng trên sản
phẩm thực phẩm quy mô lớn [86].
Như vậy, axít phenyllactic là chất kháng vi sinh vật đang được các nhà khoa
học trên thế giới quan tâm nghiên cứu để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.
Những công bố về sản xuất PLA bằng phương pháp lên men chủ yếu là ở qui mô
nhỏ phòng thí nghiệm. Kết quả thử nghiệm hiệu quả kháng vi sinh vật của PLA chủ
yếu là tác dụng của PLA tới các chủng vi sinh vật nuôi cấy trên thạch đĩa và môi
trường nhân tạo mà ít có các thử nghiệm trên rau quả. Ở Việt Nam trên thị trường
hiện vẫn chưa có sản phẩm axít phenyllactic. Vì thế, việc chủ động sản xuất chế
phẩm PLA bằng con đường sinh học thông qua quá trình lên men của vi khuẩn
lactic sử dụng thiết bị sẵn có trong nước để ứng dụng trong bảo quản nông sản thực
phẩm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn rất lớn.
1.2. Chế biến tối thiểu rau quả
1.2.1. Tình hình sản xuất rau quả chế biến tối thiểu trên thế giới
1.2.1.1. Khái niệm và vai trò của chế biến tối thiểu trong công nghiệp chế biến rau
quả và tiêu dùng
Hiệp hội sản phẩm cắt quốc tế (IFPA) định nghĩa sản phẩm cắt là rau quả đã
được làm sạch, gọt vỏ, cắt và đóng gói để đem đến cho người tiêu dùng những sản
phẩm tiện dụng có dinh dưỡng và hương vị cao mà vẫn giữ được độ tươi ngon [38].
Công nghệ CBTT đang ngày càng phát triển do xu hướng hiểu biết về sức khỏe và sự
quan tâm đến vai trò của thực phẩm trong duy trì và nâng cao chất lượng cuộc sống
của người tiêu dùng [34]. CBTT mô tả những công nghệ chế biến thực phẩm không
sử dụng nhiệt đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo quản cũng như duy trì những đặc
tính của rau quả càng tươi càng tốt. Những đặc điểm trực quan của sản phẩm rau quả
cắt là một trong những thông số quan trọng nhất để đánh giá chất lượng tổng thể của
sản phẩm bởi người tiêu dùng. Trong bảo quản, tiêu chí đánh giá sản phẩm là có hay
không hiện tượng biến màu (nâu hóa bề mặt cắt, úa vàng hay bạc màu của rau xanh,
…), tổn thương cơ học cũng như thối hỏng do vi sinh vật gây ra [48].

24


Rau quả cắt hấp dẫn người tiêu dùng bởi chúng tươi, dinh dưỡng, giá thành
không cao và ăn được ngay. Vì vậy, nhiều sản phẩm rau quả CBTT đã được phát
triển để đáp ứng nhu cầu sử dụng những sản phẩm nhanh và tiện dụng của người
tiêu dùng. CBTT nâng cao giá trị của sản phẩm cắt nhờ tính tiện dụng và tiết kiệm
thời gian, mặc dù một vài rào cản gặp phải như rất khó giữ được độ tươi trong suốt
quá trình bảo quản [50].
1.2.1.2. Các sản phẩm rau quả chế biến tối thiểu phổ biến trong thương mại
Thị trường rau quả chế biến tối thiểu (CBTT) đã có những bước phát triển
vượt bậc trong những năm gần đây, được khuyến khích lớn bởi nhu cầu cần sử dụng
những sản phẩm tươi, ngon, bổ dưỡng, tiện dụng và không sử dụng phụ gia đảm
bảo an toàn cho người tiêu dùng. Người tiêu dùng đang ngày càng quan tâm đến thị
trường quốc tế về sản phẩm cắt với những vị mới và lạ. Những sản phẩm rau quả
cắt nhiệt đới có sức hấp dẫn đặc biệt đối với những người tiêu dùng trẻ, những
người thích sử dụng những sản phẩm nhẹ ăn liền. Những nhà sản xuất ở nhiều nước
nhiệt đới nắm bắt được nhu cầu phát triển này đã tập trung sản xuất nhiều loại sản
phẩm cắt cho xuất khẩu [47].
Rau quả CBTT đang ngày càng đóng vai trò quan trọng trong hệ thống phục
vụ thực phẩm ở Mỹ. Năm 2006, 27% sản phẩm cắt ở Mỹ được bán trên hệ thống
phân phối thực phẩm, trong khi 73% được bán ở hệ thống bán lẻ. Doanh thu của sản
phẩm cắt tăng từ 3,3 tỷ USD năm 1999 lên đến 15,5 tỷ USD năm 2007 [26].
Trong khi đó, công nghiệp rau quả cắt ở Châu Âu phát triển vượt bậc từ
những năm 80. Theo Rabobank (2009), người tiêu dùng đã chú ý đến tính tiện dụng
và sức khoẻ cuộc sống là hai yếu tố chủ yếu quyết định sự phát triển rau quả cắt với
việc bán lẻ như là kênh phân phối chính. Một số nước như Hà Lan, Thuỵ Sỹ, Ý và
Tây Ban Nha đã thiết lập thị trường và phát triển mạnh mẽ kinh doanh sản phẩm rau
quả cắt. Ý nổi lên là một trong những thị trường kinh doanh rau quả cắt hàng đầu

của Châu Âu, nơi mà rau và quả CBTT hưng thịnh nhất trong những năm gần đây
và hiện tại đứng thứ hai chỉ sau Anh về mặt hàng này [47].
Rau quả cắt cũng được bán nhiều ở các chợ và gian hàng thực phẩm và siêu
thị ở nhiều nước Châu Á. Thị trường rau quả cắt ở Nhật Bản và Hàn Quốc phát triển
từ cuối những năm 80 và đầu những năm 90. Khi ngành công nghiệp dịch vụ thực
phẩm cho nhà hàng và trường học sử dụng sản phẩm rau quả cắt là chủ yếu ở những
nước này thì nhu cầu sử dụng rau quả cắt cũng phát triển ở thị trường bán lẻ. Cùng
với nhu cầu của người tiêu dùng về những sản phẩm rau quả sẵn sàng để ăn ngày

25