ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG CORDYCEPS SPP. FNA5 VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP EXOPOLYSACCHARIDE NHẰM TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
CHỦNG CORDYCEPS SPP. FNA5 VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ
ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP EXOPOLYSACCHARIDE
NHẰM TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

HÀ NỘI, 09/2016
1


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
CHỦNG CORDYCEPS SPP. FNA5 VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ
ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP EXOPOLYSACCHARIDE
NHẰM TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Họ và tên : Đỗ Thu Hương
Ngành học : Công Nghệ Sinh Học
GVHD

: TS. Bùi Văn Ngọc
TS. Phạm Thanh Huyền
TS. Nguyễn Hữu Đức

HÀ NỘI, 09/2016
2


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả trong khóa luận là do tôi trực tiếp thực
hiện. Các số liệu và kết quả trong số liệu là hoàn toàn trung thực.

3
3


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp
ngành Công nghệ sinh học, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phái
Thầy cô, bạn bè và người thân.
Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, em xin được gửi lời
cảm ơn đặc biệt tới TS. Bùi Văn Ngọc, Phòng Công nghệ sinh học trọng điểm, Viện
Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; TS. Phạm
Thanh Huyền, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học Và Công nghệ Việt Nam, là hai Thầy cô đã tạo điều kiện, tận tâm hướng
dẫn em từ những bước đi chập chững đầu tiên, những bước tiếp cận đầu tiên
trong nghiên cứu khoa học.
Em xin được gửi lời cảm ơn tới các Thầy cô giáo trong khoa Công nghệ
sinh học , các giáo viên phụ trách, các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm đã tạo mọi
điều kiện về cơ sở vật chất cũng như sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý kiến giúp
em trong suốt quá trình làm đề tài.
Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới anh Thắng, chị
Nguyên, chị Linh, chị Yến, anh Thế, anh Tâm, anh Long, anh Cường, anh Chiến,

Liên, Huyền, Hồng Anh và các bạn khác nữa làm việc trong phòng thí nghiệm, mọi
người đã dành thời gian quý giá của mình để giúp đỡ em trong suốt quá trình
thực tập để đạt được kết quả tốt nhất.
Và cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động
viên em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, giúp em vượt qua
rất nhiều khó khăn cả trong công việc và cuộc sống và hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp một cách thuận lợi nhất.
Hà Nội, ngày 29 tháng 09 năm 2016
Sinh viên
4
4


Đỗ Thu Hương

Mục lục

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Bảng phân loại khoa học
Bảng 3.1 . Một số thiết bị thường sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 3.2. Một số môi trường nuôi cấy

5
5


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.5. Chế phẩm dạng lỏng của Đông trùng hạ thảo
Hình 2.2. Mô tả hình thái nấm Cordyceps
Hình 2.3. Cấu trúc hóa học của Adenosin và Cordycepin

Hình 2.4. Chế phẩm dạng rắn của Đông trùng hạ thảo
Hình 2.1. Hình ảnh nấm Đông trùng hạ thảo

TÓM TẮT

1. Mục đích
- Định danh, nghiên cứu các đặc điểm sinh học các chủng nấm thuộc chi

Cordyceps spp..
6
6


-

Nghiên cứu tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho các chủng nấm dựa

-

trên ba môi trường đã được tìm ra trong các nghiên cứu trước đó.
Dựa trên môi trường tối ưu đã được xác định, nghiên cứu tìm ra nồng
độ thành phần trong môi trường để sự sinh tổng hợp hoạt chất sinh

học exopolysaccharide là tốt nhất.
2. Phương pháp nghiên cứu chính
- Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của một chủng nấm trên ba
-

thành phần môi trường khác nhau, tìm ra môi trường tối ưu.
Nghiên cứu tìm ra nồng độ thích hợp của từng thành phần môi trường

đến sự sinh tổng hợp hoạt chất exopolysaccharide của chủng nấm trên

môi trường tối ưu để đạt kết quả tốt nhất.
3. Kết quả nghiên cứu của đề tài

7
7


PHẦN I
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề

Ngay từ thời xa xưa, người ta chú ý nhiều đến tác dụng dược lý dùng làm

thuốc để chữa bệnh của loài nấm Cordyceps spp. (Đông trùng hạ thảo hay
Trùng thảo), gồm hai loài chính là Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris.
Cordyceps spp. là danh pháp khoa học của một chi trong ngành nấm túi
(Ascomycota), bao gồm khoảng 400 loài đã được miêu tả. Mọi loài trong chi
Cordyceps spp. đều là nấm ký sinh (loài nấm tên khoa học là: Ophiocordyceps
sinensis) trên các ấu trùng của các loài sâu thuộc chi Thiarodes, cũng như một
số dạng động vật chân khớp (Arthropoda) khác, vì thế chúng là nấm gây bệnh
cho côn trùng; một số ít loài cũng kí sinh trên các loại nấm khác. Loài nấm
Cordyceps spp. phân bố chủ yếu ở vùng núi cao thuộc dãy núi Hymalaya có độ
cao trên 4000m so với mực nước biển, như vùng cao nguyên Tây Tạng (Trung
Quốc), một số vùng thuộc Nepan và Butan. Loài Nấm Cordyceps spp. có hàm
lượng các hoạt chất hoạt tính sinh học trong quả thể như cordycepin,
adenosine, mannitol, exopolysaccharide, superoxide dismutise và nhiều thành
phần khác. Nhờ các hợp chất hóa học này giá trị dược liệu của loài nấm này
được đánh giá rất cao, tác dụng chính được các nhà khoa học thống kê như:

kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư máu, ung thư phổi, ung thư vú,...
Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có hiệu quả trong chữa trị rối
loạn chức năng của gan, sự lão hoá, các chứng viêm tấy. Ngoài ra còn có tác
dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipid, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp.
Với giá trị hết sức có ý nghĩa đối với ngành y dược như vậy thì việc nghiên cứu
đặc điểm sinh học của nấm nhằm nhân nuôi hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết
là vô cùng quan trọng, đây là cơ sở để bảo tồn được nguồn gen quý và gây
trồng quả thể trong giá thể nhân tạo.
Trên thế giới, loài Cordyceps spp. Đã được các nhà khoa học nghiên cứu và
thu được nhiều thành tựu có giá trị. Từ năm 1998, ở Tung Quốc, đã nghiên
cứu đi sâu vào các hoạt chất sinh học có trong Cordyceps, trong đó tập trung
8


chủ yếu vào các hợp chất polysaccharide, adenosine, cordycepin, cordycepic
acid. Các nước như Hàn quốc , Mỹ, Nhật Bản cũng đã sản xuất được nấm
Đông trùng hạ thảo trên quy mô công nghiệp từ những năm 1995, thế kỷ XX
và bán ra thị trường với giá khá cao. Trên thị trường Việt Nam cũng có bán
nhiều loại nấm Đông trùng hạ thảo, song phần lớn đều nhập từ Trung Quốc,
nguồn gốc và chất lượng không rõ ràng, giá cả lại đắt đỏ. Trong khi đó, điều
kiện,quy trình để làm ra sản phẩm này khá là phức tạp, đòi hỏi phải có sự đầu
tư kỹ lưỡng về công nghệ. Chính vì những tính chất độc đáo về dược liệu như
vậy đã thôi thúc chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng Cordyceps spp. FNA5 và khảo sát
các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide
nhằm tạo thực phẩm chức năng”. Với mục đích tìm ra môi trường nuôi cấy
phù hợp với điều kiện tại Việt Nam trong khi vẫn thu được nấm Cordyceps có
đầy đủ giá trị dược liệu để đáp ứng nhu cầu sử dụng làm vật liệu y học hỗ trợ
nâng cao sức khỏe con người, đồng thời góp một phần nhỏ bé trong công cuộc
xây dựng nền công nghiệp dược nước nhà.

2.

Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu tìm ra môi trường thích hợp cho sự sinh tổng hợp
Polysaccharide, ứng dụng cho sản xuất dược trong nước.

3.

Đối tượng và nội dung nghiên cứu
Chủng nấm FNA5 thuộc chi Cordyceps nhận được từ bộ sưu tập
chủng giống của phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện
Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn bởi những kết quả thu được

cho thấy lỏng đối với loài Cordyceps. Đồng thời mở ra những hướng đi mới
có thể phát triển sản xuất nguyên liệu thôphục vụ công nghiệp dược được
sản xuất từ chủng nấm Cordyceps phù hợp với điều kiện ở Việt Nam.

PHẦN II
9


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Tổng quan nghiên cứu về loài Cordyceps spp. trên thế giới và ở Việt Nam

1.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu về loài Cordyceps spp.
1.1.1. Phân loại khoa học
Bảng 2.1: Bảng phân loại khoa học

Giới (Regnum)
Phân giới (Subregnum)
Ngành (phylum)
Phân ngành (subphylum)
Lớp (class)
Phân lớp (subclass)
Bộ (ordo)
Họ (familia)
Chi (genus)
Loài (species)

Fungi
Dikarya
Ascomycota
Perizomycotina
Sordariomycetes
Hypocreomycetidae
Hypocreales
Ophiocordycipitaceae
Ophiocordyceps
O. sinensis

 Phân loại và tên gọi

Cordyceps spp. là danh pháp khoa học của một chi trong ngành nấm túi
(Ascomycota), bao gồm khoảng 400 loài đã được miêu tả. Loài này được Miles

Berkeley miêu tả khoa học lần đầu tiên năm 1843 như là Sphaeria sinensis
(Berkeley MJ., 1843). Pier Andrea Saccardo chuyển loài này sang chi Cordyceps
vào năm 1878 (Saccardo PA., 1878). Loài này được biết đến như là Cordyceps
sinensis cho tới năm 2007, khi phân tích phát sinh chủng loài phân tử được sử
dụng để sửa đổi phân loại của 2 họ Cordycipitaceae và Clavicipitaceae, kết quả
là tạo ra tên gọi cho một họ mới Ophiocordycipitaceae và việc chuyển một số
loài Cordyceps sang chi Ophiocordyceps (Sung GH, Hywel-Jones NL, Sung JM,
Luangsa-Ard JJ, Shrestha B, Spatafora JW. (2007)).
Trong y học cổ truyền Trung Hoa, tên gọi của nó thường được viết tắt là chong
cao (蟲草 "trùng thảo"), một tên gọi cũng áp dụng cho các loài Cordyceps khác,
như C. militaris. Trong tiếng Nhật, nó được gọi là tōchūkasō (冬 虫夏草).
1.1.2. Giới thiệu về Cordyceps spp.
10


Chi nấm Cordyceps có khoảng 400 loài khác nhau, riêng tại Trung Quốc đã
tìm thấy 60 loài tuy nhiên cho đến nay hai loài được nghiên cứu nhiều nhất và
đưa vào nuôi trồng nhiều là Cordyceps sinensis (Berk) Sacc. và Cordyceps
militaris (L. ex Fr) Link.

Hình 2.1. Hình ảnh nấm Đông trùng hạ thảo

1.1.3. Nguồn gốc
Vị thuốc này thực chất là hiện tượng ấu trùng các loài bướm thuộc chi
Thitarodes bị nấm thuộc chi Ophiocordyceps hoặc Cordyceps ký sinh. Đó là một
dạng ký sinh giữa một loài nấm túi có tên khoa học là Ophiocordyceps
sinensis(Berk.) (G.H.Sung, J.M.Sung, Hywel-Jones & Spatafora (2007), 1878) với
sâu non (ấu trùng) của một loài côn trùng thuộc chi Thitarodes. Thường gặp
nhất là sâu non của loài Thitarodes baimaensis hoặc Thitarodes armoricanus.
Ngoài ra còn 46 loài khác thuộc chi Thitarodes cũng có thể bị Ophiocordyceps

sinensis ký sinh.
Từ xa xưa khoảng 5000 năm về trước, Đông Trùng Hạ Thảo đã được dân
gian tìm thấy vào mùa hạ tại các cao nguyên có độ cao trên 4.000m. Trên cao
nguyên Thanh Tạng thuộc Tây Tạng và Tứ Xuyên Trung Hoa. Nhưng hiện nay
loài nấm thuộc chi Ophiocordyceps và Cordyceps đã được một số tổ chức, cá
nhân thuộc 5 quốc gia là Mỹ, Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc và Việt Nam đã
nuôi trồng với quy mô công nghiệp. Với mục đích là để tinh chế các cơ chất có
dược tính tốt dùng cho sức khỏe con người. Các loài nấm này phân bố rộng ở
châu Á và châu Úc với trung tâm đa dạng là vùng Đông Á.
Cơ chế xâm nhiễm của loài nấm này vào cơ thể sâu hiện giờ vẫn chưa rõ.
Vào mùa đông, nấm bắt đầu ký sinh vào sâu non và làm chết sâu non vì ăn hết
chất dinh dưỡng của chúng. Những con sâu này có thể đã ăn phải bào tử nấm
hoặc chúng mắc bệnh nấm ký sinh từ các lỗ thở. Đến khi sợi nấm phát triển
mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô vật chủ, sử dụng hoàn toàn các chất dinh
dưỡng trong cơ thể sâu. Đến một giai đoạn nhất định thường là vào mùa hè ấm
11


áp, nấm bắt đầu mọc ra khỏi sâu như một ngọn cỏ và vươn lên khỏi mặt đất
phát triển thành dạng cây (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử.
1.1.4. Đặc điểm hình thái
Đông trùng hạ thảo khi còn sống, người ta có thể trông rõ hình con sâu,
với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá. Khi sấy khô, nó có mùi tanh như cá, đốt lên có
mùi thơm. Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 – 11 cm do sợi
nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành. Đầu sâu non giống như con tằm,
dài chừng 3–5 cm, đường kính khoảng 0,3 - 0,8 cm. Bên ngoài có màu vàng sẫm
hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn. Phần
đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống như đuôi con tằm, có tất cả 8 cặp chân, nhưng 4
đôi ở giữa là rõ nhất. Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài
hơn sâu non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng

hơi vàng; chất đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà.

Hình 2.2. Mô tả hình thái nấm Cordyceps

1.1.5. Một số hoạt tính có hoạt chất sinh học thu nhận từ nấm Cordyceps
Các thành phần hóa học chứa trong nấm Cordyceps, quan trọng nhất là
nhóm chất cordycepic acid, cordycepin và polysaccharide cso tác dụng rất tốt
trong điều trị bệnh ung thưvà các bệnh do virus. Ngoài ba thành phần trên khi
phân tích nấm người ta còn phát hiện nhiều hợp chất có giá trị Nacetylgalactosamine,

adenosine,

ergosterol
12

và

ergosterol

esters,


bioxanthracenes, hypoxanthine, exopolysaccharide, chitinase, cicadapeptins và
mỉiosin, các chất có hoạt tính sinh học là saccharide (trehalose và
polysaccharide) nucleosides (adenosine, inosine, cordycepin) manitol và sterols
(ergosterol).
1.1.5.1. Cordycepin
Cordycepin lần đầu tiên được tách ra từ C.militaris năm 1950 do
Cunningham và cộng sự thực hiện, sau đó chúng cũng được tìm thấy ở C.
sinensis và C.kyushuensis. Mặc dù Cordycepin có thể được tổng hợp hóa học

nhưng chỉ cho sản lượng thấp. Cordyceps tự nhiên chứa lượng cordycepin vào
khoảng 0.006-6.36 mg/g. Trong dinh khối sinh nấm nuôi và quả thể của
Corsyceps, hàm lượng Cordycepin ở giai đoạn đầu sau khi được tách và nuôi
thường thấp với hàm lượng từ 0.006-1.64 mg/g . Các nhà khoa học cho biết khi
thu nhận trong tự nhiên hàm lượng cordycepin trong quả thể C.militaris cao
hơn C.sinensis với hàm lượng lần lượt 2.65 và 1.64 mg/g, trong khi nuôi cấy
trong các bình lên men hàm lượng các chất thu được là 1.59 mg/g tương tự
C.sinensis trong tự nhiên.

Hình 2.3. Cấu trúc hóa học của Adenosin và Cordycepin

Cordycepin là một dẫn xuất của nucleoside adenosine mà tại vị trí 3’ không
có O khác với thực thể ribose. Trọng lượng phân tử của cordycepin C 10H13N5O3 là
251, có nhiệt độ nóng chảy là 230-231 oC, độ hấp thụ cao nhất 259nm (Doctoral
thesis, 2009). Cordycepin có thể tan trong saline, cồn ấm hoặc methanol, nhưng
hông tan trong benzene, ether hoặc chloroform. Các nhà khoa học thường sử
dụng saline để khử trùng và đệm phosphate để hòa tan cordycepin. Cordycepin
có khả năng kháng nấm, kháng ung thư và kháng virus. Gần đây, cordycepin
13


cũng cho thấy khả nưng điều hòa sản sản phẩm interleukins trong tế bào
lympho T ( Mina M, Eriko U, Akihiko Si, Mikio S., 2005). Cordycepin phát huy tác
dụng gây độc tế bào thông qua methyl hóa acid nucleic, ức chế sự phát triển của
Clostridium paraputrificum và Clostridium pefringens nhưng không có tác động
nào tới Bifidobacterium spp. và Lactobacillus spp. do Ahn và cộng sự đã chứng
minh năm 2000.
1.1.5.2. Adenosine
Adenosine xuất hiện khá nhiều trong quả thểvà được cho là phong phú ở
tất cả các loài Cordyceps với hàm lượng dao động từ 0,28 đến 14,15 mg/g. Khi

thu nhận nấm Cordyceps trong tự nhiên, nồng độ adenosine là 2,45 ± 0,03 mg/g
trong quả thể và ở nấm C.militaris cao hơn C.sinensis, ở C.sinensis hàm lượng
chỉ có 1,643±0,03 mg/g, trong khi đó, hàm lượng trong sợi nấm C.militaris lên
men là 1,592±0,03 mg/g gần tương tự C.sinensis trong tự nhiên. Adenosine được
cho là có trác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch.
1.1.5.3. Nucleotides

Nucleotides (gồm có adenosine, uridine và guanosine) là các thành phần

khá đa dạng trong nấm Cordyceps. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, guanosine có
hàm lượng cao nhất trong tất cả các mẫu tự nhiên, khi nuôi cấy trong điều kiện
nhân tạo hàm lượng nucleotide thường cao hơn Cordyceps spp. trong tựn nhiên.
Nucleotides trong Cordyceps tự nhiên bắt nguồn từ sự phân rã nucleoside trong
suốt quá trình bảo quản, tiếp đó các nhà nghiên cứu cũng đã tìm ra rằng độ ẩm
có thê làm tăng đáng kể hàm lượng nucleotide trong Cordyceps khi nuôi trong
môi trường rắn.
1.1.6. Các hợp chất có hoạt tính chống oxy-hoá của Cordyceps spp.
Hoạt tính chống oxy-hóa là hoạt tính sinh học quan trọng xuất hiện trong
các chủng thuộc ngành nấm Basidiomycetes. Mặc dù đã có nhiều nhà nghiên
cứu đã khảo sát đặc tính chống oxy-hóa phổ rộng của các quả thể nấm, nhưng
chỉ có số ít được chú ý và tiến hành thu nhận các chất chống oxy hóa này nhờ lên
men chìm. Một trong số các nghiên cứu được thực hiện bởi Badalyan khi lên
men trên môi trường lỏng để thu nhận dịch sau lên men, dịch chiết sinh khối
nấm và các sinh khối của 14 chủng nấm (Cordycep comatus, C.disseminatus,
C.micaceus, Hypholoma fasciculare, Lentinus edodes, Lepista personat,
Marasmius oreades, Pholiota alnicola, Pleuronata versicolor, Stropharia
14


coronilla, Suillusltuteus, Schizophyllum commune, Trimetes versicolor và

Vorvariella bombycina) đều cho thấy có chứa các chất chống oxy hóa có khả
năng ức chế gốc tự do trong phản ứng peroxide hóa lipid khi thí nghiệm trên
não chuột. Hiệu quả loại bỏ gốc tự do thu nhận từ sinh khối các chủng nấm từ
môi trường nuôi cấy, các chất khô của dịch lọc sau lên men, các hợp chất chiết
khi sử dụng dung môi chiết khác nhau thu nhận từ nấm Antrodia camphorata
trong lên men chìm. Kết quả thu được trong dịch chiết sinh khối có tác động tích
cực với khả năng loại bỏ gốc tự do, đặc biệt hơn khi chiết sinh khối nấm bằng
nước cũng cho thấy khả năng và hoạt tính chống oxy hóa. Ngay cả dịch sau lên
men sau khi đã loại bỏ sinh khối cũng có hiệu quả loại bỏ gốc tự do nhưng với
hiệu quả thấp hơn. Các nhà nghiên cứu đã chứng minh được mối quan hệ tuyến
tính giữa sự ức chế quá trình peroxy hóa chất béo và hàm lượng polyphenol
tổng thu nhận được từ dịch lên men của các chủng nấm Antrodia camphorata.
Hơn nữa, họ cũng tìm ra sự tương quan cao giữa sự ức chế quá trình peroxy
hóa chất béo và hàm lượng triterpenoids thô trong dịch chiết bởi dung môi
methanol, ethyl acetate.
Mặc dù các nghiên cứu đều đã chứng minh được rằng nấm Cordyceps có
hoạt tính chống oxy hóa, nhưng để chắc chắn hợp chất nào đảm nhiệm công
việc này lại chưa có một kết luận rõ ràng. Chưa thể kết luận được rằng bất cứ
thành phần nào như polysaccharides, manitol và cordycepin ở C.sinensis có tác
động chính là chống oxy-hóa.
1.1.6.1. Sterol
Ergosterol là sterol duy nhất của nấm và là tiền chất thiết yếu của vitamin
D2, có giá trị dược liệu quan trọng. Hàm lượng ergosterol trong quả thể nhân
tạo của Cordyceps rất cao (10,68 mg/g), cao hơn nhiều so với hệ sợi nấm chỉ có
1,44 mg/g. Ergosterol trong C.sinensis có thể được xác định bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (High Performace Liquid Chromatography) do
Li và cộng sựthực hiện năm 1991, đưoực cho là chất ophiocordin, ở
C.pseudomilitaris là chất bioxanthracenes và tập hợp bốn exopolysaccharide với
các trọng lượng phân tử từ 50 kDa tới 2260 tìm thấy ở C.militaris.
1.1.6.2. Protein và các amino acid

15


Nấm Cordyceps có hàm lượng protein thô trong khoảng 29,1-33%. Protein
này bao gồm 18 loại amino acid, gồm có aspartic, threonin, serine, glutamate,
proline, glycine, valine, methionine, isoleukin, leucin, tyrocine, phenylalanine,
lysine, histidine, cystine, cysteine và tryptophan. Hàm lượng amino acid sau khi
thủy phân hầu hết là 20-25%, lượng thấp nhất là 5,53%, cao nhất là 39,22%.
Hàm lượng cao nhất là glutamate, arginine và aspartic acid, các thành phần có
tác dụng dược lý chính là arginine, glutamate, tryptophan và tyrosine. Các
chủng Cordyceps cũng chứa các loại protein, peptides, polyamines và tất cả các
amino acid thiết yếu. Thêm nữa, Cordyceps cũng chứa các loại dipeptide vòng
hiếm gặp, có vòng gồm có cyclo-[Gly-Pro], cyclo-[Leu-Pro], cyclo-[Val-Pro], cyclo[Ala-Leu], cyclo-[Ala-Val], cyclo-[Thr-Leu].
1.1.6.3. Polysaccharide
Nấm Cordyceps spp. được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng trong sản
xuất thực phẩm chức năng và sản xuất thuốc trong phòng và chữa bệnh. Chúng
chứa rất nhiều loại đường, bao gồm mono-, di- và oligosaccharide, và nhiều
polysaccharides phức tạp (gồm có cyclofurans (đường có 5C, mạch vòng, chưa
rõ chức năng), beta-glucans, beta-mannans, và phức hợp polysaccharides có cả
đường 5 và 6C cùng tham gia vào các chuỗi nhánh, dùng cả cầu nối alpha-,
beta-).
Vách tế bào nấm là nguồn cung cấp chính của polysaccharide đã được
chứng minh kháng khối u, trong khi đó polysaccharide thu nhận từ thực vật lại
không có đặc điểm này, điều này chỉ giải thích được thông qua sự khác nhau
trong cấu trúc hóa học của các polysaccharide. Các polysaccharide có khả năng
chống lại hoạt động của tế bào ung thư bao gồm homopolyme có cấu tạo đơn
giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, manose, xylose, arabinose,
fucose, ribose và glucuronic acid. Trong một số loài nấm, polysaccharide liên kết
với các protein hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide-protein hoặc

polysaccharide-peptide cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn. Cấu trúc 1/3β-glucans có khả năng kháng khối u được biết đến nhiều nhất, theo các nghiên
cứu cho biết những glucan có được hoạt tính sinh học này là trong cấu tạo phân
tử mạch thẳng hoặc phân nhánh có cấu trúc chính là phân tử đường glucose
liên kết với các đơn vị trong chuỗi tại các vị trí khác nhau, với các chuỗi beenbao
16


gồm các đơn vị như acid glucuronic, xylose, galactose, manose, arabinose hoặc
ribose. Heteroglycans là một nhó lớn polysaccharide lớn hoạt tính sinh học đa
dạng được phân loại là galactans, fucans, xylans và mannans.
1.1.7. Tác dụng dược lý của Đông trùng hạ thảo
Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc được ghi chép trong tài liệu thuốc
đông y từ thế kỷ XVIII trong bộ “bản thảo cương mục thập di” (năm 1765). Theo
tài liệu đông y cổ, Đông trùng hạ thảo có vị ngọt, tính ôn, quy vào hai kinh phế
và thận, tác dụng ích phế, thận, bổ tinh tủy, cầm máu, hóa đờm, dùng chữa hư
lao sinh ho, ho ra máu, liệt dương, lưng gối đau mỏi, di tinh, xuất tinh sớm.
a. Tác dụng tăng cường sức khỏe
Các nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ đông trùng hạ thảo có tác dụng tăng
cường hoạt động các enzym superoxid dismutase, glutathion peroxidase và
catalase (các enzym tham gia loại bỏ gốc tự do trong cơ thể), giảm quá trình
peroxide lipid dẫn đến có tác dụng chống lại các nhân tố có hại như căng thẳng,
tuổi tác.
b. Tác dụng miễn dịch
Các nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng đã cho thấy Đông trùng hạ thảo có
khả năng tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào cũng như miễn dịch dịch thể.
Cụ thể là tác dụng nâng cao hoạt tính của đại thực bào và tế bào miễn dịch tự
nhiên (natural killer cell), điều tiết phản ứng của tế bào lympho B, tăng cường
một cách có chọn lọc hoạt tính của tế bào T, ức chế, làm tăng nồng độ các kháng
thể IgG, IgM trong huyết thanh của cơ thể người.
c. Tác dụng chống oxy hóa

Dịch chiết từ Đông trùng hạ thảo cho tác dụng chống oxy hóa tương tự như
quá trình peroxide chất béo, men xanthin oxidase.
d. Tác dụng chống ung thư
Thành phần polysaccharides có trong nấm đông trùng hạ thảo (cordyglucan
– β – glucan) cũng như vài loài nấm khác được cho là có tác dụng ức chế các
khối u, do hai cơ chế sau:
(1) trực tiếp gây độc cho tế bào ung thư, làm cho tế bào ung thư bị yếu đi;
(2) gián tiếp ức chế thông qua hệ miễn dịch tự miễn của cơ thể người.
e. Tác dụng chống viêm
Nấm Đông trùng hạ thảo tác dụng ức chế việc sản sinh các tác nhân gây
viêm như gốc tự do NO, các cytokine TNF α và IL 12, ức chế sự mất hạt nhỏ và
phát triển của bạch cầu trong cơ thể.
f. Tác dụng bảo vệ thận, phổi, gan
17


Nấm Đông trùng hạ thảo có công dụng nhanh trong việc phục hồi và làm
giảm các triệu chứng viêm thận mãn, suy thận, liệt dương, di tinh, mệt mỏi, đau
lưng, các vấn đề của đường hô hấp: ho, đờm, suyễn, viêm/ hen phế quản, lao
phổi…Tác dụng bảo vệ gan thông qua việc làm tăng hoạt tính của các loại men
AST, ALT, γ GTP, ALP, LDH.
1.1.8. Một số chế phẩm chứa Đông trùng hạ thảo
Hiện nay không thể thống kê hết được có bao nhiêu chế phẩm có chứa đông
trùng hạ thảo được bán trên thị trường. Đông trùng hạ thảo được đưa vào
trong các chế phẩm một thành phần hoặc kết hợp với một số dược liệu khác,
quý hiếm khác như nhân sâm, tam thất, tổ yến. Các dạng bào chế thường gặp là
dạng như: viên nang, viên hoàn, gói bột và dạng lỏng như: nước uống, cao lỏng.
Có thể kể tên một vài chế phẩm có chứa nấm đông trùng hạ thảo như sau:
- Dạng rắn: viên nang Pure cordyceps capsule, viên Đông trùng hạ thảo
Tenken, bột Cordyceps extract…

Hình 2.4. Chế phẩm dạng rắn của Đông trùng hạ thảo

-

Dạng lỏng: cao lỏng đông trùng hạ thảo tam thất, nước Yến Đông trùng
hạ thảo, nước uống Đông trùng hạ thảo He Yuan Tang – King of
cordyceps, nước cốt gà Đông trùng hạ thảo…

Hình 2.5. Chế phẩm dạng lỏng của Đông trùng hạ thảo

Những nghiên cứu về kỹ thuật nuôi Cordyceps
Theo tài liệu công bố của Holliday và cộng sự (2004).Về mặt đa
2.

dạng của loài Cordyceps (Đông trùng hạ thảo), những loài mà hiện nay
được nuôi trồng vì mục đích y học và được sử dụng trong hỗ trợ sức khoẻ
18


và thuốc y dược trên thế giới bao gồm: Cordyceps sinensis, Cordyceps
militaris,

Cordyceps

sobolifera,

Cordycepssubsessilus,

Cordyceps

ophiolosoides và các loại khác. Phương pháp nuôi cấy loài Cordyceps
(Đông trùng hạ thảo) này là rất đa dạng. Khuẩn ty của nó được nuôi cấy
trên một tập hợp các môi trường, đáng chú ý nhất là ấu trùng côn trùng
(xác tằm) và vô số các hạt ngũ cốc. Loại nấm này, sau một số khó khăn ban
đầu, đã được ra quả thể từ cả hai ấu trùng tằm và hạt dựa vào các cơ chất.
Như tài liệu phân tích, khuẩn ty rất giống với cơ thể thực vật tự nhiên, vì
vậy việc ra quả thể là không cần thiết để đạt được một sản phẩm y học
chất lượng. Vì sự hiếm hoi và giá cả đắt đỏ của các loại đã thu thập được
từ tự nhiên, các nỗ lực cũng đã được thực hiện để nuôi cấy Cordyceps
(Đông trùng hạ thảo). Sau nhiều sự thất vọng ban đầu trong nỗ lực nuôi
cấy, các phương pháp đa dạng có tính chất thương mại cuối cùng đã đạt
được vào cuối những năm 70. Vào giữa những năm 80, đa số các chủng
Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) có sẵn trên thị trường thế giới được nuôi
cấy nhân tạo. Bởi vì sự phát triển của các phương pháp nuôi cấy dựa trên
công nghệ sinh học hiện đại, nên các hoạt chất sinh học hiếm có trước đây
đã tăng đáng kể trong hai mươi năm qua. Ngày nay Đông trùng hạ thảo
bán rộng trên thị trường phần lớn là dạng nhân nuôi và là dạng lên men
sợi. Dạng lên men sợi nấm nếu theo một quy trình, thông số nghiêm ngặt
sẽ cho sản phẩm tương đương với dạng tự nhiên. Với phát triển của công
nghệ sinh học hiện đại người ta có thể nhân nuôi để tạo ra nhiều hoạt tính
sinh học quý hiếm trong Đông trùng hạ thảo như Cordycepin, acid
cordicepic, hydroxypethybadnosin, adenosin và polysaccharide. Hiện nay
Mỹ và Nhật phần lớn đi theo con đường nhân nuôi nhân tạo.
Nhân nuôi nhân tạo có 2 cách chính là dùng môi trường lỏng và môi
trường rắn. Mỗi một loại môi trường đểu cho kết quả khác nhau và ưu
điểm khác nhau. Nhân nuôi trên môi trường lỏng sử dụng nuôi trồng hoặc
công nghệ lên men, phương pháp này thường được sử dụng ở Trung Quốc,
nấm được cấy vào các thùng lên men có môi trường đã được tiệt trùng.
Môi trường có đầy đủ các chất dinh dưỡng để bảo đảm cho các sợi nấm

19


phát triển nhanh. Sau khi các sợi nấm mọc trong môi trường lỏng, nó
được thu hoạch bằng biện pháp sàng lọc loại bỏ môi trường còn lại các sợi
nấm và sau đó đem sấy khô. Phương pháp này có ưu điểm là nhanh, thu
hoạch được sinh khôi lớn, tuy nhiên hạn chế là các chất tiết từ ngoại bào bị
rò rỉ trong chu trình phát triển của nấm ra môi trường và sau đó bị loại bỏ
cùng với môi trường gây thất thoát. Nhiều chất có hoạt tính sinh học được
sinh ra từ ngoại bào với nồng độ ít và chúng được phát hiện ở các sợi nấm.
Ở đây có một vấn đề tranh luận, có tác giả đưa ra rằng hoạt tính sinh học
của Đông trùng hạ thảo chỉ có ỏ phần nấm, còn phần sâu rất ít. Nhưng
theo dõi ở nuôi nhân tạo ở thể môi trường lỏng, các hoạt tính sinh học do
ngoại bào rò rỉ ra môi trường nuôi cấy rất nhiều, bị loại bỏ khi chỉ thu
hoạch sợi nấm. Tương tự như vậy, nếu ta chỉ thu hoạch nấm mọc trên sâu,
là ta đã bỏ đi rất nhiều hoạt chất sinh học được tiết ra từ ngoại bào vi nấm
trong xác sâu chứa đầy sợi nấm, trong khi sử dụng sâu làm môi trường, ở
đó sợi nấm đã tiết ra rất nhiều chất sinh học từ ngoại tế bào có hoạt tính
sính học vào xác sâu và sâu như cái kho chứa đựng các chất trên, về mặt
acid amin có trong nấm và sâu của Đông trùng hạ thảo Isaria sp., các
nghiên cứu cho thấy ở nấm và sâu đều có 17 acid amin và hàm lượng
không khác nhau mấy. Vởi lý do trên đã giải thích tại sao Đông trùng hạ
thảo hoang dại dùng cả con tốt hơn loại nuôi trồng chỉ dùng nấm.
Phương pháp thứ 2 là môi trường rắn, phương pháp này dùng các
chất rắn có hàm lượng dinh dưỡng cao đã tiệt trùng để nuôi trồng nấm.
Thường là các hạt ngũ cốc gạo, lúa mạch, lúa mạch đen và có khi hỗn hợp
các sinh vật khác như tằm. So với phương pháp lỏng nó có sự phát triển
chậm hơn nhưng ngược lại các môi trưòng làm giá thể (gạo, lúa mạch)
thường được sử dụng hết và thu được khối lượng lớn, nấm ít để lại dư
lượng trong môi trường rắn, việc thu hoạch nấm cũng dễ dàng hơn. Ở

phương pháp này, gần như các chất sinh học có giá trị của Đông trùng hạ
thảo do ngoại bào tiết ra được thu nhận hết, chúng sinh ra qua quá trình
phát triển của nấm. Ở quá trình lên men môi trường chất lỏng chúng rò rỉ
ra môi trường và bị loại bỏ qua quá trình sàng lọc chỉ lấy sợi nấm. Môi
20


trường rắn có thể dùng tằm, với tằm đã cho thấy nấm phát triển nhanh và
chất lượng nấm rất tốt. Môi trường tằm thường được dùng ở Trung Quốc,
Nhật Bản. Ở Mỹ tằm chưa được sử dụng do Cơ quan Quản lý Thuốc và
Thực phẩm Mỹ (FDA) chưa coi tằm là thực phẩm thông thường vì tằm là
một loại côn trùng. Mỹ thường dùng môi trường gạo, lúa mạch, lúa mạch
đen. Đối với đậu tương đã có thử nghiệm để trồng nấm Đông trùng hạ
thảo nhưng không đạt kết quả. Việc trồng nấm Đông trùng hạ thảo có chất
lượng cao và biomas (sinh khối) lớn phụ thuộc vào chủng nấm, môi
trường nuôi cấy, thông số kỹ thuật (nhiệt độ, độ ẩm, oxy, €02 và ánh sáng
…) và kinh nghiệm. Hiện nay Trung Quốc, Nhật Bản và Mỹ đều có các bằng
sáng chế về nhân nuôi Đông trùng hạ thảo và đòi hỏi phải mua bản quyền.
Ở nước ta, đã có các nghiên cứu nuôi thử : Đông trùng hạ thảo Isaria
cerambycidea, kết quả bước đầu thấy sợi nấm phát triển, theo GS.TSKH
2.1.

Đái Duy Ban, TS.Lưu Tham Mưu, nhà xuất bản y học 2009.
Phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng
Phương pháp này được sử dụng ở Trung Quốc, được biết đến như
môi trường chất lỏng (Liquid Culture) hay lên men (Fermentation), trong
đó một lượng nhỏ mô Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) được cấy vào một
môi trường chất lỏng vô trùng. Nó tăng trưởng trong môi trường chất
lỏng này rất nhanh và thông thường sẵn sàng cho việc thu hoạch trong
khọảng 5 ngày. Khuẩn ty Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) được thu hoạch

bằng cách lọc ra khỏi canh trường, sau đó được sấy khô và được trồng
trong bột sạch. Sau khi nó được sấy, nó có thể được sử dụng, hay điều chế
khác bằng cách chiết với nước nóng hay một số các dung môi khác, kết
quả là đoạn chiết hoặc là cung cấp chất lỏng hoặc là lại sấy khô và nghiền
thành bột. Đa số các Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) hiện có trên thị
trường là được nuôi cấy từ môi trường chất lỏng theo cách này. Điều này
dẫn đến một sản phẩm khá tốt, vì đây là một phương pháp rất kinh tế cho
việc sản xuất trên phương diện rộng, việc xử lý các thông số tăng trưởng ở
các bình đựng chất lỏng rộng, kín dẫn đến một sản phẩm rất nhất quán
với một chút dao động về chất lượng từ lô này đến lô kia. Tuy nhiên có một
21


nhược điểm lớn đối với Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) lên men đó là việc
bị mất các hợp chất ngoại bào (extra – cellular) mà Cordyceps (Đông
trùng hạ thảo) sản sinh ra. Khi khuẩn ty được lọc ra khỏi canh trường
nuôi cấy và chất lỏng dư, thừa được loại bỏ, tất cả các hợp chất ngoại bào
có hoạt tính sinh học đã sản sinh ra trong quá trình nuôi bị mất đi. Có rất
nhiều chất chuyên hoá thứ cấp độc nhất vô nhị được sản sinh bởi
Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) mà có một số hiệu quả về y học nhất định.
Trong vương quốc nấm gần như mọi thứ có tính quan trọng về sinh học
xảy ra bên ngoài màng vách tế bào. Điều này hẳn là phải như vậy, vì nấm
không có miệng. Để cho nó ăn, khuẩn ty tăng trưởng cùng với nguồn thức
ăn và rò rỉ ra khỏi hợp chất bức vách tế bào để tiêu hoá thức ăn đó, sau đó
nó ứa ra các hợp chất khác đóng vai trò như là các phân tử chuyến tiếp,
cái thì đưa dưỡng chất trở lại bức vách tế bào và đi vào các tế bào để sử
dụng. Và trong khi tất cả rò rỉ các hợp chất kháng vi sinh vật để giữ cho
các cơ quan khác cạnh tranh về thức ăn với nó (có những hợp chất đề cập
đến như là kháng sinh). Và các hợp chất khác đóng vai trò theo cách riêng
như là điều chỉnh độ pH của môi trường xung quanh. Có thể là khoảng

90% trong số các hợp chất có hoạt tính sinh học đáng quan tâm mà
Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) sản sinh ra là các chất lỏng đã bị thải ra
sau khi thu hoạch khuẩn ty. Đối với Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) thu
thập từ thiên nhiên, cơ thể bướm, được thu hoạch cùng với thân cây, được
ướp hoàn toàn với khuẩn ty Cordyceps (Đông trùng hạ thảo). Nhưng quan
trọng hơn, nó đóng vai trò như là bể chứa tự nhiên cho tất cả các hoạt
chất đã bị rò rỉ mà đã được sản sinh. Hợp chất mà bị rò rỉ bên ngoài khuẩn
ty vẫn còn lại trong cơ thế bướm. Có thể là lý do chính là tại sao Cordyceps
(Đông trùng hạ thảo) thu thập từ thiên nhiên được cho là có hiệu quả hơn
so với Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) được nuôi cấy. Đó là sự có mặt của
những hoạt chất ngoại bào này mà bị mất trong quá trình thu hoạch của
2.2.

loại nuôi cấy trong chất lỏng.
Phương pháp nuôi cấy trên cơ chất rắn

22


Phương pháp thứ hai của việc thực hiện nuôi cấy Cordyceps(đông
trùng hạ thảo) được gọi là phương pháp cơ chất rắn (solid – substrate)
hay phương pháp sinh khối. Trong loại nuôi cấy này, Cordyceps (Đông
trùng hạ thảo) được cấy trên nguồn dinh dưỡng rắn vô trùng nào đó,
thường thường là một loại hạt ngũ cốc hay các hạt lẫn. Nó tăng trưởng
chậm hơn nhiều so với nuôi trong chất lỏng, nhưng cuối cùng mức tăng
trưởng của khuẩn ty tiêu thụ hầu hết tất cả cơ chất và sẵn sàng để thu
hoạch. Ở điểm này, toàn bộ bên trong của thùng nuôi được thu hoạch và
làm khô, khuẩn ty, cơ chất dư thừa và toàn bộ phối hợp của các hợp chất
ngoại bào mà đã được sản sinh trong quá trình tăng trưởng. Theo cách
này, nó có thể giữ lại được các hợp chất độc nhất vô nhị này mà tự nhiên bị

mất đi khi được nuôi cấy bằng kỹ thuật lên men. Tiềm lực về chất lượng sẽ
có thể lớn hơn nhiều khi được nuôi cấy theo phương thức cơ chất rắn so
với phương thức lên mên chất lỏng. Tuy nhiên nó luôn không đơn giản như
khi nói Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) được sản xuất bởi một phương
pháp tốt hơn các phương pháp khác. Chất lượng cuối cùng của Cordyceps
(Đông trùng hạ thảo) được xác định bằng một số nhân tố, trong số đó
quan trọng nhất là chuỗi đặc biệt được chọn cho nuôi cấy, cấu tạo cơ chất,
thông số môi trường nuôi cấy (như là nhiệt độ và hàm lương ôxy) và
khoảng thời gian mà nó tăng trưởng. Khi tất cả các điều kiện đều chính
xác, có ít hơn 5% cơ chất dư thừa trong cơ chất rắn tăng trưởng đa dạng,
và hơn 95% nguyên liệu Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) bao gồm tất cả
các hợp chất thêm tế bào. Khi nuôi cấy theo cách này chất lượng thực sự
cao, thường là vượt hiệu quả hơn so với Cordyceps (Đông trùng hạ thảo)
thu thập từ thiên nhiên bởi mỗi nhân tố gấp 5 lần. Vì thời gian nuôi cấy
yêu cầu dài hơn để sản sinh ra Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) bằng
phương pháp nhân tạo nên trên thị trường giá bán khá đắt. Trong một số
trường hợp chất ngũ cốc dư thừa có trong Cordyceps (Đông trùng hạ
thảo) cơ chất rắn lớn hơn 80%. Hiện nay sự phân tích chuẩn các loại nấm
Đông trùng hạ thảo không phải là chuyện tầm thường, nhưng nó trở lên
ngày càng nhiều, vì ngày càng có nhiều người được giáo dục theo cách sử
23


dụng và tiềm năng của loại thảo dược này. Thời gian trôi đi, chúng ta có
thể mong đợi nhìn thấy toàn bộ chất lượng của Cordyceps (Đông trùng hạ
thảo) được nuôi cấy tiếp tục tăng.
2.3. Môi trường và các điều kiện nuôi cấy
Về vật liệu (môi trường), để gìn giữ những môi trường nuôi cấy gốc,
người ta trộn lẫn thạch trắng dinh dưõng thông thường. Đáng chú ý là
Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) luôn luôn nhanh thích nghi với một môi

trường mới, mà trong đó có cái tốt và có cáí xấu. Cái tốt là môí trường sẽ
hỗ trợ cho mức tăng trưởng, nhưng cái xấu là trong đó sinh vật nhanh
chóng phát triển qua các thế hệ enzym đặc trưng đối với đặc tính của môi
trường đặc biệt đó, điều này sẽ dẫn đến việc môi trường nuôi cấy bị mất đi
sự tăng trưởng mạnh mẽ trong một thời gian khi chuyển sang môi trường
khác. Điều này cũng dẫn đến sự già yếu của môi trường nuôi cấy ban đầu.
Cách dễ nhất xung quanh vấn đề này là thách thức liên miên đối với môi
trường bằng cách chuyển nó sang một môi trường mới với mỗi thế hệ liên
tiếp. Theo cách này, môi trường bắt buộc phải gìn giữ một phổ enzym tiêu
hoá rộng hơn để giải quyết những nguồn thức ăn đa dạng xảy ra rất nhiều
trong thiên nhiên. Nó cũng cần được sự giúp đỡ trong việc đưa vào một số
cơ chất cuối cùng trên đó Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) được nuôi cây
trong môi trường ổn định. Ví dụ, nếu Cordyceps (Đông trùng hạ thảo)
được nuôi cấy trên cơ chất gạo vàng, thì nó cần thêm một ít thạch trắng
mà môi trường đang dự trữ. Một số trong số các môi trường thạch trắng
dinh dưỡng được tìm thấy đã hỗ trợ cho mức tăng trưởng tốt của nấm là:
chất thạch trắng có chiết xuất từ mạch nha chuẩn, chất thạch trắng
dextrose từ khoai tây chuẩn, thạch trắng catfood (l0g catfood khô và
20gam thạch trắng trên lít nước). Thạch trắng dogfood (l0g dogfood khô
và 20g thạch trắng trên lít nưốc). Thạch trắng ovaltin (l0g ovaltin khô và
20gam thạch trắng trên lít nước).
Về cơ chất: cơ chất được sử dụng cho việc nuôi cấy bán Cordyceps
(Đông trùng hạ thảo) ban đầu là từ xác nhộng tằm (ở Trung Quốc, Hàn
Quốc và Nhật Bản), hay từ hạt ngũ cốc ở các nước châu Âu và châu Mỹ.
Trong khi cả hai cơ chất đều tốt để sản xuất ra Cordyceps (Đông trùng hạ
24


thảo) chất lượng cao. Những cơ chất có nguồn gốc từ côn trùng, thực ra
mà nói là không được cho phép ở Mỹ dưới sự hướng dẫn của FDA. Những

cơ chất được sử dụng để nuôi cấy Cordyceps(đông trùng hạ thảo) sẽ trở
nên ngày càng chuẩn hoá giữa các nhà nuôi cấy. Các hạt ngũ cốc sẽ trở
thành loại chiếm ưu thế.
Về nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu cho mức tăng trưởng của nấm là phụ
thuộc vào mục đích của các nhà nuôi cấy, 21°-27°C cho việc nhanh sản
sinh, hay 3-5°C cho mức tăng trưởng chậm hơn nhấn mạnh về việc sản
xuất các hợp chất y học quan trọng như là Cordycepin (3’ deoxyadenosine)
hay Hydroxyethyladenosin.
Về độ ẩm tương đối: 95 – 100% với hàm lượng ẩm cơ chất của 4550% cho mức tăng trưỏng cơ chất rắn.
Về khoảng thời gian: trong môi trường chất lỏng, việc sản xuất
khuẩn ty thoả mãn có thể xảy ra ít nhất là 84-96 giờ khi được nuôi ở 2122°C với không khí và độ nóng vừa đủ. Nếu nhiệt độ của môi trưởng tăng
giảm xuống đến 4°c, chu kỳ tăng trưởng sẽ kéo dài khoảng 70 ngày để có
thể đạt được số lương cân bằng của khuẩn ty, nhưng sản sinh ra sự đậm
đặc của Cordycepin lớn hơn nhiều lần. Trong môi trường cơ chất rắn, việc
thu hoạch khuẩn ty thường thường là ngày 18 và ngày 25, trừ khi việc sản
xuất các hợp chất quan trọng đặc biệt khác là mục tiêu, nơi mà trường
hợp mức tăng trưởng có thể lên đến 180 ngày, hay thậm chí là lâu hơn tùy
thuộc vào mục đích của các hợp chất mong muốn.
Về sự đậm đặc tối ưu nhất của CO2: điều này hoàn toàn phụ thuộc
vào kết quả mong muốn của mức tăng trưởng. Trong khi Cordyceps (Đông
trùng hạ thảo) sẽ trồng dưới điều kiện ưa khí và kị khí, chất chuyến hoá
thứ cấp khác hoàn toàn khi tăng trưởng dưới những điều kiện khác nhau.
Mỗi nhà nuôi cấy đều có hệ thống riêng của mình, và người này khác
người kia. Một số nhà nuôi cấy nhận thấy rằng đó là việc cô đặc CO2 thấp
ở mức ban đầu, nhờ có việc sản sinh của loại hợp chất adanosin, tiếp theo
đó là một môi trường có nồng độ CO và CO2 cao đã sản xuất ra được một
thành phẩm chất lượng cao hơn. Rất khó để khái quát hoá về sự cô đặc tối
25