ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY DÀI HẠN PHÁT HIỆN CÁC BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ Ở BỆNH NHÂN ĐA U TỦY XƯƠNG TẠI VIỆN HUYẾT HỌCTRUYỀN MÁU TW

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-------oOo-------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY DÀI HẠN PHÁT
HIỆN CÁC BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ
Ở BỆNH NHÂN ĐA U TỦY XƯƠNG
TẠI VIỆN HUYẾT HỌC-TRUYỀN MÁU TW
Sinh viên thực hiện

:

Lê Thị Bích Liên

Ngành

:

Công nghệ sinh học

Giáo viên hướng dẫn

:

ThS. Trần Công Hoàng
TS. Dương Quốc Chính
Viện Huyết học-Truyền máu TW
TS. Nguyễn Hữu Đức

Học viện Nông nghiệp Việt Nam

HÀ NỘI, 2016


LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trung thực và
chưa hề được sử dụng trong bất kỳ công bố nào.
Em xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khoá luận đã được cảm ơn và
các thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2016
Sinh viên

Lê Thị Bích Liên

2


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Huyết học –
Truyền máu Trung ương đã cho phép và tạo điều kiện cho em được hoàn thành Khóa luận
Tốt nghiệp này.
Tiếp theo cho em được gửi lời chân thành cảm ơn đến TS. Nguyễn Hữu Đức,
Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện
Nông nghiệp Việt Nam, ThS. Trần Công Hoàng, Phó trưởng khoa Di truyền và Sinh học
phân tử, và TS. Dương Quốc Chính, Trưởng Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Viện
Huyết học – Truyền máu Trung ương. Các Thầy đã tận tình hướng dẫn, dạy dỗ, giúp đỡ,
chỉ bảo và truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm vô cùng quý báu trong suốt
thời gian em thực hiện Khóa luận Tốt nghiệp.

Em xin gửi lời cảm ơn với tình cảm chân thành đến tập thể cán bộ Khoa Di truyền
và Sinh học phân tử, đặc biệt là ThS.Vũ Thị Bích Hường, CN. Nguyễn Thị Hồng Vân và
CN. Kim Thị Ngọc Vân. Các anh chị đã luôn nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ, thông cảm và
tạo điều kiện cho em được học tập, thực hành các kỹ năng thí nghiệm.
Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm
khoa Công nghệ sinh học cùng toàn thể các thầy cô giáo đã truyền đạt cho em những kiến
thức vô cùng bổ ích và quý báu trong suốt bốn năm em học tập tại trường.
Cuối cùng cho em được gửi lời cảm ơn đến tất cả người thân trong gia đình, bạn bè
đã luôn dành tình cảm, ủng hộ, tạo điều kiện tốt nhất để em học tập và hoàn thành tốt
công việc trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016
Sinh viên

MỤC LỤC

3


DANH MỤC HÌNH

4


DANH MỤC BẢNG

5

PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề

Đa u tủy xương (Multiple Myeloma - MM) là một bệnh tăng sinh ác tính dòng
plasmo (Plasma cells), thuộc tuỷ xương với sự có mặt của tổn thương xương, tăng tương
bào non, xuất hiện protein đơn dòng trong huyết tương và nước tiểu, đau xương, tăng
canxi máu và thiếu máu. Tỷ lệ ĐUTX chiếm khoảng 1% trong các bệnh ung thư và hơn
10% trong ung thư máu, được cho là một bệnh có tiên lượng xấu và hiện nay chưa có khả
6


năng chữa khỏi. Tuy nhiên, do đặc tính kém tăng sinh và dẫn đến chết theo chương trình
của các tế bào plasmo ác tính khi tách ra khỏi vi môi trường tủy xương nên việc phân tích
công thức nhiễm sắc thể tủy xương thường cho kết quả bình thường (âm tính giả). Chính
vì vậy, cần phải nuôi cấy dài ngày với sự bổ sung các interleukin 4, interleukin 6 nhằm
đảm bảo các tế bào plasmo ác tính có thể phân chia và thu được các cụm nhiễm sắc thể
(NST) của dòng tế bào này. Việc phát hiện các bất thường di truyền là rất quan trọng
trong việc tiên lượng và xếp loại nhóm nguy cơ đối với bệnh nhân MM. Một số nghiên
cứu cập nhật cho với với nhóm nguy cơ trung bình và nhóm nguy cơ chuẩn thì thời gian
sống thêm trung bình lần lượt là 4-5 năm và 8-10 năm còn với nhóm nguy cơ cao, thời
gian sống thêm trung bình chỉ khoảng 2 đến 3 năm dù được sử dụng những phác đồ điều
trị liều cao với các thuốc mới nhất. Thêm vào đó, việc phát hiện chính xác các tổn thương
di truyền và đánh giá chúng không chỉ giúp tư vấn cho bệnh nhân mà còn hỗ trợ bác sỹ
lâm sàng lựa chọn thuốc và phác đồ điều trị phù hợp.
Do đó, để góp phần nâng cao chất lượng tiên lượng bệnh phục vụ cho việc điều trị,
em đã được hướng dẫn thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy dài hạn nhằm
phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể ở bệnh nhân đa u tuỷ xương tại Viện Huyết
học – Truyền máu Trung ương (NIHBT)”

1.2.

Mục đích và yêu cầu

1.2.1.

Mục đích
 Xây dựng được quy trình nuôi cấy dài hạn cho bệnh nhân ĐUTX nghiên cứu

tại NIHBT
 Bước đầu khảo sát các bất thường di truyền ở bệnh nhân ĐUTX.
1.2.2.

Yêu cầu
7


 Xây dựng quy trình nuôi cấy dài hạn để áp dụng thường quy cho bệnh nhân

đa u tuỷ xương tại NIHBT
 Thử nghiệm quy trình trên các mẫu nghiên cứu thu thập tại NIHBT
 Xác định tỷ lệ bệnh nhân có bất thường NST

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về bệnh lý Đa u tủy xương (Multiple Myeloma - MM)
Đa u tủy xương là bệnh lý ác tính dòng tương bào (Plasma cells) đặc trưng bởi sự
tăng sinh và tích lũy bất thường các tế bào dòng tương bào trong tủy xương, thuộc tuỷ
xương với sự có mặt của tổn thương xương, tăng tương bào non, xuất hiện protein đơn

8


dòng trong huyết tương và nước tiểu, đau xương, tăng canxi máu và thiếu máu. Đa u tủy
xương là một thể tủy của ung thư tương bào (plasma cell – neoplasma).
Bệnh MM chiếm 1% trong các bệnh ung thư nói chung, chiếm 13% bệnh máu ác
tính ở người da trắng và 3% bệnh máu ác tính ở người da đen (Longo D.L, 1998).
Tương bào là dạng tế bào trưởng thành của lympho dòng B. Nguồn gốc của tế bào
lympho B là từ tế bào gốc vạn năng tại tủy xương trải qua giai đoạn biệt hóa từ tiền
lympho B, lympho B chín, lympho B trưởng thành và cuối cùng biệt hóa thành tương bào
có khả năng tổng hợp và chế tiết các globulin miễn dịch (Ig) dưới sự kích thích của kháng
nguyên gây ra những rối loạn đặc trưng... Ngược với các tương bào bình thường, tế bào
plasmo ác tính trong MM không được biệt hoá hoàn chỉnh và có những receptor với IL-6,
khi kết hợp với IL-6 sẽ tạo thành yếu tố thuận lợi cho sự phát triển, kéo dài đời sống của
tế bào plasmo ác tính và dẫn đến lấn át các dòng tế bào sinh máu bình thường, đồng thời
phá hủy xương gây tăng canxi, acid uric máu và gây rối loạn do tăng tiết Ig bệnh lý.

Hình 2.1 Tương bào tăng sinh trong tủy xương
()

2.2. Các bất thường di truyền trong ĐUTX
Trong bệnh ĐUTX, các bất thường di truyền được chia thành 2 nhóm: nhóm đa bội
chiếm tỷ lệ 55 – 60% và nhóm không đa bội chiếm khoảng 40 – 45%. Gần một nửa các
bệnh nhân MM thuộc nhóm đa bội có 48 – 75 NST do xuất hiện nhiều trisomie nhiễm sắc
thể 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 và 21 (Fonseca R và cộng sự, 2009). Các bất thường khác như
mất 17p hoặc đột biến p53, đột biến RAS, chuyển đoạn MYC... có tần suất tương đương
nhau ở cả hai nhóm đa bội và không đa bội. Trong bệnh ĐUTX, nhóm bất thường không
đa bội chủ yếu là các đột biến của các đột biến của gene mã hóa Ig. Dạng đột biến hay
9

gặp là chuyển đoạn nhiễm sắc thể xảy ra ở vùng chuyển đổi Ig trên nhiễm sắc thể 14q32.
Đa số các đột biến gene đều do những sai sót xảy ra ở một trong ba quá trình biến
đổi gene đặc hiệu của tế bào B: quá trình tái tổ hợp ba đoạn gene VDJ, quá trình tái tổ hợp
chuyển đổi Ig hoặc đột biến soma quá mức. Những bất thường di truyền không phải đa
bội thường liên quan đến tiên lượng không tốt gồm các chuyển đoạn liên quan đến IgH,
nhân đoạn 1q, mất đoạn 1p và mất đoạn nhiễm sắc thể 13. Các gen liên quan đến các
chuyển đoạn IgH là MMSET và FGFR3 ở 4p16, cyclin D3 ở 6p21, cyclin D1 ở 11q13, cMAF ở 16q23, MAFA ở 8q24 và MAFB ở 20q11. Trong các nghiên cứu trung tâm, tần
suất của các chuyển đoạn gene IgH trong ĐUTX khoảng 55% - 70% (Avet-Loiseau H và
cộng sự, 2002). Cho đến nay, các nghiên cứu đã phát hiện ra 7 dạng đột biến gene chuỗi
nặng IgH, gặp trong khoảng 40% các trường hợp ĐUTX. Trong giai đoạn sớm của bệnh
thường gặp bốn dạng bất thường di truyền: các chuyển đoạn gene IgH chủ yếu do những
sai sót xảy ra trong quá trình tái tổ hợp chuyển đổi hoăc đột biến soma quá mức của các tế
bào B tại trung tâm mầm và được gọi là các chuyển đoạn IgH nguyên phát, đa bội với các
trisomie, mất đoạn nhiễm sắc thể 13, và rối loạn điều khiển gene cyclin D.
Các bất thường di truyền như đột biến N-RAS, K-RAS và FGFR3 trong những trường
hợp có chuyển đoạn t(4;14), các chuyển đoạn gene MYC, bất hoạt hoặc mất gen p53 là
những sự kiện xảy ra trong quá trình tiến triển của bệnh, và được gọi là chuyển đoạn IgH
thứ phát. Ngoài ra, một số các đột biến và chuyển đoạn liên quan đến hoạt động của
đường truyền tín hiệu tế bào NF-κB (NFκB pathway) chống lại sự chết theo chương trình
cũng đóng một vai trò quan trọng trong sự phát sinh bệnh lý ĐUTX.
Bảng 1.1. Một số bất thường di truyền trong ĐUTX
Bất thường di truyền

Tỷ lệ (%)

del(13q)

50%

t(11 ;14)

15-20%

t(4 ;14)

15%

t(6 ;14)

20-25%

del(17p)

10%
(Phạm Quang Vinh, 2013)

2.3. Tương tác với vi môi trường tủy xương
10


Vi môi trường tủy xương gồm có các tế bào của hệ thống tạo máu, các tế bào không
thuộc hệ thống tạo máu, thành phần ngoài tế bào và dịch lỏng. Trong bệnh ĐUTX, sự cân
bằng giữa các thành phần tế bào, thành phần ngoài tế bào và thành phần dịch lỏng trong
tủy xương bị phá vỡ. Các bất thường di truyền dẫn đến sự thể hiện quá mức các phân tử
kết dính trên bề mặt các tế bào đa u tủy đồng thời làm cho các tế bào này nhạy cảm hơn
đối với các chất kích thích tăng trưởng. Hiện tượng kết dính và tương tác giữa tế bào
plasma ác tính với các phân tử bám dính và tế bào đệm tủy xương, khởi động và tăng quá
trình sao chép gene dẫn đến sinh tổng hợp nhiều loại cytokine và các yếu tố tăng trưởng
như : IL-6, IGF-1, VEGF, TNF-a, SDF-1a, TGF-b, bFGF, MIP-1a, SCF, HGF, IL-1b, IL3, IL-10, IL-15, và IL-21, Ang-1 và Matrix Metalloproteinases (MMP-2 và MMP-9). Các

cytokine và các yếu tố tăng trưởng có khả năng thúc đẩy quá trình tăng sinh mạch máu,
quá trình tồn tại, phân chia và tăng sinh cũng như phát triển khả năng kháng thuốc của các
tế bào ĐUTX. Một số cytokine như IL-1, IL-5, TNFα, TNF-β có khả năng làm tăng hoạt
động huỷ cốt bào đồng thời ức chế tạo cốt bào gây nên tình trạng tiêu xương, huỷ xương
và gãy xương bệnh lý.
2.4. Tiên lượng
Theo Durie - Salmon dựa trên sự kết hợp các yếu tố liên quan đến khối lượng u là
một cách đánh giá tiên lượng bệnh, tuy nhiên nhược điểm của phân loại giai đoạn theo hệ
thống này là sự phụ thuộc vào nhiều chỉ số, vốn phụ thuộc lẫn nhau, cũng như khó khăn
khi xác định chính xác số lượng xương bị tổn thương. Thời gian sống trung bình khoảng
60 tháng với BN giai đoạn IA; 14,5 tháng với những BN giai đoạn IIIB (có sự kết hợp với
giai đoạn suy thận)
Tiên lượng của BN ĐUTX phụ thuộc vào tuổi, mức độ hoạt động của BN, bất
thường, NST.

Nhiễm sắc thể
Bất thường nhiễm
sắt thể

Nguy cơ cao

Nguy cơ trung
bình

Nguy cơ thấp

-

del(17p)

-

mất NST

-

tăng NST

-

t(14;16)

-

t(4;14)

-

t(11;14)

-

t(14;20)

-

del(13q)

-

t(6;14)

-

thêm 1p21
11


Sống trung bình

2 năm

5 năm

7-8 năm

% bệnh nhân

15%

20%

45%

(Theo Rajkumar SV. Multiple myeloma)
2.5. Nhiễm sắc thể
2.5.1. Khái niệm
Nhiễm sắc thể (NST) là cơ sở vật chất của hiện tượng di truyền ở cấp độ tế bào, nằm
trong nhân tế bào, cấu tạo chủ yếu từ DNA và protein histon, có khả năng tự nhân đôi và
biến đổi hình thái cấu trúc, có hoạt động mang tính chu kỳ trong quá trình phân bào.

Nhiễm sắc thể tồn tại trong nhân tế bào dinh dưỡng (soma) thành các cặp tương
đồng. Trong các tế bào dinh dưỡng, các nhiễm sắc thể thường tồn tại thành từng cặp, gọi
là cặp nhiễm sắc thể tương đồng (homologous pair), trong đó một chiếc là của mẹ và một
chiếc là của bố, mỗi chiếc mang cùng một số gen phân bố theo cùng thứ tự. Mỗi NST
gồm 2 nhiễm sắc tử (chromatid), trong các giao tử NST đơn bội ở dạng một nhiễm sắc tử.
Số lượng nhiễm sắc thể trong mỗi tế bào bình thường luôn là bội số của 2 và được gọi
là lưỡng bội (2n)

Hình 2.2 Nhiễm sắc thể
()

2.5.2. Hình thái và kích thước
Hình thái NST biến đổi có tính chu kì trong tế bào, nó biến đổi theo các kì trong quá
trình phân bào của tế bào. Kích thước NST phân bào kỳ trung gian tương đối ổn định,
12


thông thường NST có chiều dài khoảng 0,2 µm đến 50 µm, đường kính khoảng 0,2 µm
đến 3 µm, đồng thời có bốn hình dạng đặc trưng là hình móc, hình que, hình hạt và chữ
V. Kích thước NST của các tế bào mô trên cùng một loài có sự khác nhau, nhưng chúng
đặc trưng cho các tế bòa và cá thể.
2.5.3 Cấu trúc nhiễm sắc thể
2.5.3.1 Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể
Ở tế bào dinh dưỡng mỗi nhiễm sắc thể có một cặp giống nhau về hình dạng, kích
thước gọi là các nhiễm sắc thể tương đồng (homologous). Bộ nhiễm sắc thể có cặp gọi là
lưỡng bội (2n) và đơn bội (n) khi mỗi nhiễm sắc thể chỉ có một chiếc. Ngoài ra còn có 1
cặp NST giới tính (sex chromosome)

Hình 2.3 Cấu trúc nhiễm sắc thể
()

a.

Tâm động (Centromere)

Tâm động là nơi 2 chromatid dính vào nhau, nơi để NST trượt trên thoi vô sắc trong
quá trình phân bào. Mỗi nhiễm sắc thể có một tâm động, là điểm thắt eo chia nhiễm sắc
thể thành 2 vai, chiều dài của 2 vai phụ thuộc vào vị trí tâm động.
Vai ngắn hơn gọi là vai p và vai dài hơn gọi là vai q. Người ta thành lập chỉ số tâm động
(centrmere index – Ic) để xác định vị trí của tâm động và kiểu hình NST.

Ic =
Dựa vào vị trí của tâm động có thể phân biệt hình thái các nhiễm sắc thể:
13


-

Tâm giữa (metacentric): tâm động ở chính giữa chia 2 vai bằng nhau.

-

Tâm cận giữa (submetacentric): tâm động ở gần chính giữa.

Tâm đầu (acrocentric): tâm động ở rất gần điểm tận cùng nhiễm sắc, 2 vai
không bằng nhau.
-

Tâm mút (telocentric): tâm động nằm ngay điểm tận cùng nhiễm sắc thể.

-

Hình 2.4 Các kiểu hình nhiễm sắc thể
()

A, metacentric, B, submetacentric, C, acrocentric và D, telocentric
b. Thể mút (Telomere)

Mỗi nhiễm sắc thể chứa một phân tử ADN liên kết với protein thành sợi nhiễm sắc,
gấp khúc chạy suốt NST. Đầu tận cùng của phân thử ADN ở đầu tận cùng của NST gọi là
thể mút (telomere). Người ta còn gọi thể mút là “mũ bảo vệ” trên đầu của NST.
Cấu trúc và thành phần đặc thù của thể mút gồm các đoạn lặp nucleotit, khác nhau ở
tùy loại nhưng thường thể hiện theo phương thức 5’ – T 1-4A0-1G1-8 – 3’ (Nguyễn Như Hiền,
2005). Ví dụ ở người trong tế bào dinh dưỡng lành (không bị ung thư) thể mút thường
chứa 500 – 3000 đoạn lặp lại TTAGGG.
Thể mút có ba chức năng chính:
(1) Ngăn cản các NST trong bộ không dính kết
(2) Ngăn cản enzyme deoxiribonuclease không phân giải đầu tận cùng của phân tử

AND
(3) Sự tái bản AND ở đầu cuối của phân tử tái bản được thuận lợi.

14


2.5.3.2 Cấu trúc siêu hiển vi của nhiễm sắc thể
Trong nhiễm sắc thể chứa phân tử AND mạch kép, có đường kính 2nm. AND liên
kết với protein tạo sợi nhiễm sắc (chromonema) có cấu trúc xoắn nhiều cấp. Sợi nhiễm
sắc có đường kính 11nm, là chuỗi hạt cườm gọi là sợi nucleosome (nucleosome fiber).
Mỗi hạt cườm là một nucleosome có đường kính 11nm gồm lõi cấu tạo bởi 8 phân tử
histon (2H2A, 2H2B, 2H3, và 2H4), sợi AND xoắn kép cuốn quan lõi histon chứa khoảng

146 cặp nucleotide với 1 vòng. Giữa hai nucleosome kế tiếp nhau là một đoạn ADN và 1
phân tử histon. Các nucleosome nối nhau qua sợi xoắn kép AND dài khoảng 60 nucleotid.
Chuỗi nucleosome tạo thành sợi cơ bản có chiều ngang 11 nm. Sợi cơ bản cuộn
xoắn bậc 2 tạo thành sợi nhiễm sắc có đường kính khoảng 30 nm gọi là sợi solenoid
(solenoid fiber).
Sợi nhiễm sắc lại xếp cuộn lần nữa tạo nên sợi có cấp độ đường kính khoảng 300
nm chứa các vòng bên (looped domains). Các sợi có đường kính 300 nm xoắn tiếp lại
thành cromatit có đường kính khoảng 700 nm. NST tại kỳ giữa của phân bào ở trạng thái
kép có 2 cromatit nên đường kính có thể đạt đến 1400nm. Với cấu trúc cuộn xoắn, chiều
dài NST có thể thu ngắn từ 15000 – 20000 lần. Sự thu gọn cấu trúc không gian của NST
thuận lợi cho sự phân li và tổ hợp các nhNST trong quá trình phân bào, đảm bào sự duy
trì ổn định cấu trúc qua các thế hệ tế bào và cơ thể. Ngoài protein histon, trong NST còn
có nhiều protein axit điều hòa hoạt động của gen.

15


Hình 2.5 Cấu trúc siêu hiển vi của nhiễm sắc thể
()

2.6. Kỹ thuật di truyền nuôi cấy dài hạn tế bào trong bệnh lý ĐUTX
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào và phân tích công thức nhiễm sắc thể được ứng dụng đầu
tiên để phân tích các biến đổi di truyền trong bệnh ĐUTX. Việc phát hiện bộ nhiễm sắc
thể bất thường không những phản ánh sự tăng sinh cao mà còn cho thấy sự phát triển
không phụ thuộc vào các tế bào đệm tủy xương của các tế bào plamo ác tính. Tuy nhiên,
do đặc tính kém tăng sinh và dẫn đến chết theo chương trình của tương bào ác tính khi
tách ra khỏi vi môi trường tủy xương nên việc phân tích công thức nhiễm sắc thể tủy
xương thường cho kết quả bình thường (âm tính giả). Khi sử dụng kỹ thuật nuôi cấy dài
hạn có bổ sung các cytokine như IL-6, IL-4 và GM-CSF thì tỷ lệ phát hiện bất thường
nhiễm sắc thể được cải thiện và có thể lên đến 40%.

Để tiến hành kỹ thuật này, cần các tế bào đang ở kỳ giữa của quá trình phân bào vì ở
kỳ giữa trong quá trình phân chia của tế bào, NST có số lượng và hình dạng co xoắn, cô
đặc, co ngắn tối đa, thời điểm quan sát hình dạng đặc trưng nhất.
Với mẫu bệnh phẩm dùng heparin để chống đông, sử dụng môi trường nuôi cấy giàu
chất dinh dưỡng, gồm nhiều acid amin, các yếu tố vi lượng, huyết thanh bê (FBS), khi tế
bào nhân lên rồi thực hiện kỹ thuật chuẩn bị tiêu bản NST. Nguyên lý của kỹ thuật này là
tế bào plasmo từ tuỷ xương sẽ phân chia dưới sự kích thích của IL-4 và IL-6. Sự phân
chia tế bào dưới sự kích thích của các interleukin sẽ xảy ra mạnh nhất sau 120 tiếng trong
điều kiện nuôi cấy 37°C. Môi trường nuôi cấy được xử lý với colcemid để ức chế phân
bào, giữ tế bào ở trung kỳ và tế bào được thu hoạch bằng cách sử dụng phương pháp xử lý
nhược trương và cố định lên tiêu bản NST.
Tiến hành nhuộm NST để phân tích NST. Các NST khi được nhuộm Giemsa sẽ bắt
màu nhuộm, phương pháp nhuộm Giemsa cổ điển cho phép phân tích NST bằng kích
thước và chỉ số tâm động. Tuy nhiên, có những NST có kích thước và chỉ số tâm gần
giống nhau thì người ta sử dụng kỹ thuật nhuộm băng G để nhận dạng cá NST và phát
hiện các bất thường NST. Kỹ thuật nhuộm bằng G được sử dụng để nhuộm NST ở kỳ
giữa được xử lý bằng enzyme phân giải protein và được nhuộm với Giemsa. Băng tối là
đoạn ADN giàu A, T, băng sang là những đoạn giàu G, C. Phương pháp cho hình ảnh
NST có các băng đậm nhạt, số lượng, thứ tự và đặc điểm các băng đặc thù cho từng NST.
16


Hình 2.6 Bộ NST người nhuộm băng G
()

2.7. Phân tích kết quả
Lam sau khi nhuộm Giêmsa sẽ được quét trên hệ thống Metafer, và phân tích bằng
phần mềm Ikaros. Hoặc lưu tọa độ, vẽ lại cụm nhiễm sắc thể quan sát được bằng kính
hiển vi thường. Sau đó phân tích về số lượng và cấu trúc NST
2.7.1. Phân loại NST

Bộ nhiễm sắc thể người có 46 NST, chia thành 23 cặp, gồm 22 cặp NST thường ký hiệu
từ 1 đến 22 và 1 cặp NST giới tính là XX ở nữ và XY ở nam.

(A)

(B)
Hình 2.7 46, XX (A); 46, XY (B)

17


Việc xác định và phân loại từng NST được thực hiện dựa trên các đặc điểm sau của mỗi
NST:
Chiều dài NST:

2.7.1.1.

Căn cứ xếp số thứ tự NST là theo nguyên tắc chiều dài giảm dần. Căn cứ vào chiều dài và
chỉ số tâm của NST (tỷ lệ phần trăm giữa độ dài cánh ngắn và độ dài toàn bộ NST), NST
chia thành 7 nhóm, kí hiệu là A, B, C, D, E, F và G:
-

Nhóm A (NST 1-3): NST kích thước lớn NHẤT, tâm giữa hoặc gần giữa.
Nhóm B (NST 4-5): kích thước lớn và không phân biệt được về chiều dài,
tâm gần giữa.
Nhóm C ( NST 6-12 và NST X) : kích thước trung bình, tâm giữa hoặc gần
giữa, khó phân biệt giữa các NST với nhau.
Nhóm D (13-15): kích thước trung bình, tâm đầu, có vệ tinh gắn vào cánh
ngắn.
Nhóm E ( 16-18): kích thước khá nhỏ, tâm giữa ( NST 16), tâm lệch ( NST

17 và 18).
Nhóm F (19-20): NST nhỏ, tâm giữa
Nhóm G (21-22 và NST Y): NST nhỏ, tâm đầu và có vệ tinh. NST Y không
có vệ tinh.

Hình 2.8 Các nhóm NST
( />
18


2.7.1.2.

Sự phân bố của các băng sáng tối trên NST

Sau khi nhuộm băng, NST sẽ có các vùng đậm, nhạt đặc trưng cho từng NST, trên các
cánh có các vùng, vùng được đánh số từ 1 trở đi và từ tâm ra ngoài. Trong mỗi vùng có
các băng, các băng trong vùng cũng được đánh số từ 1 và từ phía tâm ra. Ngoài ra, các
dưới băng của cùng một băng cũng được đánh số từ 1 trở đi và từ phía tâm ra ngoài.

Hình 2.9 Sự phân bố các băng trên NST
()
Để biểu thị một điểm trên NST, người ta dùng các ký tự: số của NST, ký hiệu cánh, số
của vùng, số của băng. Bốn ký tự viết liên tục, nếu có thêm dưới băng thì sau bốn ký tự
trên là dấu chấm rồi đến số của dưới băng.
Ví dụ: 8q21.1 là chỉ vị trị ở dưới băng 1, băng 1, vùng 2, cánh dài NST số 8.
2.7.1. Phân tích kết quả xét nghiệm công thức NST (bằng Karyotype)
Để mô tả toàn bộ NST của một tế bào thì đầu tiên là viết số lượng NST kể cả NST giới,
tiếp là dấu (,) rồi đến NST giới. Nêu có bất thường thì thêm dấu (,) rồi đến ký hiệu bất
thường và NST bị bất thường. Nếu nhiều NST bị bất thường hoặc một bất thường liên
quan tới nhiều NST thì thứ tự các mô tả bất thường là: NST giới, NST có số thứ tự nhỏ

viết trước ( trừ xen đoạn hoặc chuyển đoạn liên quan tới ba NST trở lên).
2.7.2. Các bất thường NST và ký hiệu:
19


Đến nay có rất nhiều loại bất thường NST đã được mô tả, sau đây là một số kí hiệu bất
thường hay gặp.
del (deletion): mất đoạn
der (derivative chromosomes): hậu quả các bất thường tạo ra ( do chuyển đoạn, do cấu tạo
lại).
dup (duplication) : Nhân đoạn
i (isochromosome) và ider( isoderivative chromosomes) là đẳng NST: NST có 2 cánh
bằng nhau.
Ins (insertion) : chèn đoạn
inv (inversion): đảo đoạn có hai điểm gãy trên một NST và đoạn giữa đảo một vòng 180°
rồi nối trở lại.
mar ( marker chromosomes): chỉ một NST bất thường nhưng không rõ nguồn gốc các
phần của NST đó.
r (ring chromosome): NST hình nhẫn
ter : Đầu tận cùng (cũng có thể được viết pter hoặc qter để mô tả đầu tận cùng của nhánh
ngắn hoặc nhánh dài).
+ / - : Được đặt trước số NST chỉ thêm (+) hoặc bớt (-) NST đó. Nếu được đặt sau ký
hiệu cánh NST : tăng thêm hoặc giảm chiều dài cánh.
Ví dụ: 47, XY, +21: bộ NST nam, thừa NST 21.
46, XX, 5q-: bộ NST nữ có 46 NST, trong đó độ dài của cánh dài NST số 5 ngăn hơn
bình thường.
t : Chuyển đoạn (translocation): hai NST bị gãy và trao đổi phần không tâm cho nhau
ví dụ: t(8;21)(q22;q22): NST số 8 bị gãy ở vị trí 8q22, NST 21 bị gãy ở 21q22, hai đoạn
cuối rời nhau sẽ trao đổi với nhau (hình 3)

20


Hình 2.10 t(8;21) (q22;q22) trong thể M2 ( theo Heim và Mitelman, 1987)

21


PHẦN III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian tiến hành: Khóa luận được thực hiện trong thời gian từ ngày 1/8/2016
đến ngày.
- Địa điểm nghiên cứu : Khoa Di truyền và Sinh học phân tử - Viện Huyết học –
Truyền máu Trung ương – 14 Trần Thái Tông, Yên Hoà, Cầu Giấy, Hà Nội.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
Dịch tủy được hút ra từ các khoang tủy sinh máu cho vào ống chống đông Heparin
Sodium 5000 UI/ml: từ 2- 4ml tại Khoa Tế bào- Tổ chức học, Viện Huyết học - Truyền
máu Trung ương.

Hình 3.1: Mẫu dịch hút tủy xương của bệnh nhân
3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Trang thiết bị,dụng cụ và hóa chất thí nghiệm được trình bày trong các bảng sau.
Bảng 3.1: Trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
STT

Thiết bị, dụng cụ

Hãng sản xuất (nước)

1

Máy ly tâm centrifuge

Eppendorf (Đức)

2

Cân phân tích

Mettler (Đức)

3

Tủ lạnh sâu -20°C, tủ lạnh 4°C

Sanyo (Nhật)

4

Tủ an toàn sinh học cấp 2

Esco (Mỹ)

6

Ống Heparin Sodium

7

Chai nuôi cấy vô trùng

SPL (Hàn Quốc)

8

Pipet nhựa vô trùng

Samco Scientific (Mexico)

9

Ống Falcon 15 ml

10

Ống Falcon 50 ml

11

Ống tan máu

12

Tuýp Eppendord 1.7ml

22


Bảng 3.2: Hóa chất thí nghiệm
ST

T

Tên hóa chất

Hãng sản xuất

1

Môi trường RPMI 1640

Gibco

3

Huyết thanh bào thai bê

Gibco hoặc Biowest

4

Kháng sinh: Streptomicin – Penecillin

Gibco

Acid acetic 5 %

5
6

Demecolcine Solution 10µg / ml

Sigma

7 Dung dịch nhược trương KCL 0.075M (pH 7.4)
8

Acid acetic đậm đặc

Merk

9

Methanol tuyệt đối

Merk

3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp nuôi cấy dài ngày tế bào
Mẫu bệnh phẩm sau khi được lấy chuyển đến phòng xét nghiệm trong vòng 1 tiếng đồng
hồ. Cấy 0,5-1,2ml dịch tủy xương vào trong 10ml môi trường RPMI-1640 chứ 10% FBS,
1% kháng sinh, bổ sung 100 μl IL-4 và 100 μl IL-6. Chú ý phải lắc nhẹ và đều sản phẩm
nuôi cấy. Mẫu được nuôi cấy ở 37°C, 5% CO2 trong 120 giờ.
Trong thời gian nuôi cấy cần kiểm tra và lắc nhẹ chai Rough từ một đến hai lần . Điều này
sẽ làm hồng cầu lắng xuống đáy và tế bào plasma phân chia nhiều hơn (Kannan và cộng
sự, 2006).
3.4.2. Kỹ thuật thu hoạch
Sau 120 giờ nuôi cấy đặt vào tủ ấm 370C thì tiến hành thu hoạch.
(1) Cho 50 μl Colcemid vào tuyp nuôi cấy rồi ủ ở ấm 370C khoảng 35 phút .
(2) Chuyển toàn bộ huyền dịch qua ống Corning 15 ml. Ly tâm 1000 vòng/10 phút.

Loại bỏ dịch nổi cách cặn 0,5 ml.
(3) Tái huyền dịch và cho 10 ml nhược trương, trộn nhẹ rồi ủ ở tủ ấm 37 0C trong 20

phút.

23


(4) Cho 0,5 – 1 ml dung dịch Cornoy II. Trộn nhẹ nhàng. Cho ở nhiệt độ 37 0C thêm 2 -

5 phút.
(5) Ly tâm ở 1000 vòng/10 phút lấy cặn, hút bỏ dịch nổi phía trên. Cho 8 – 10 ml

Cornoy II vào trộn đều. Và chờ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
(6) Ly tâm ở 1000 vòng/ 10 phút. Tái huyền dịch thích hợp.
(7) Lặp lại bước 6 đến khi cặn tế bào màu trắng.
 Nhỏ tiêu bản

-

Các lam kính sạch rửa sạch ngâm qua nước cất, ngâm lại vào cồn 100 0, chuyển
sang ngâm nước cất để lên giá lam, lau lam cho sạch.

-

Đặt giá lam vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 10 phút, sau đó lấy ra để nghiêng 20 – 30 0
trên giấy thấm

-

Nhỏ huyền dịch vừa pha lên lam. Chú ý khi nhỏ tiêu bản để đầu pipet cao hơn mặt
phiến kính từ 10-20 cm

-

Để tiêu bản khô tự nhiên.nhuộm

3.4.3. Nhuộm NST với Giemsa
 Nhuộm Giêmsa:

-

Pha Giêmsa 10% từ Giêmsa mẹ nhuộm lam 5-10phút.

-

Rửa dưới vòi nước.

-

Sấy khô trong tủ sấy 60◦C.

 Nhuộm băng G: dung để nhận dạng các NST bất thường như chuyển đoạn NST do
dựa vào các băng sang tối trên mỗi NST.
-

Hóa chất: Trypsin; Đệm pH 6,8 (KH2PO4: 9,1g/l + N2HPO4.2H2O: 11,5g/l);
Nước muối 0,9%, huyết thanh bào thai bê.

-

Chuẩn bị hóa chất:
+) Cốc 1: pha trypsin 1g/50ml nước muối 0,9%
+) Cốc 2: pha 100ml huyết thanh bào thai bê 2%
+) Cốc 3: Nước muối 0,9%
24


+) Cốc 4: Nước muối 0,9%
+) Cốc 5: Pha Giêm sa 10% trong đệm Ph 6,8
+) Cốc 6: Đệm pH 6,8
-

Tiến hành kĩ thuật
+) Nhúng lam trong cốc 1 từ 3-4 phút
+) Chuyển lam sang cốc 2 trong 30 giây
+) Chuyển lam sang cốc 3 trong 15 giây
+) Chuyển lam sang cố 4 trong 15 giây
+) Chuyển lam sang cố 5 trong 10 phút
+) Chuyển lam sang cố 6 trong 15 giây
+) Rửa dưới vòi nước chảy
+) Sấy khô trong tủ sấy 60°C

3.4.4. Phân tích kết quả
Lam sau khi nhuộm Giêmsa sẽ được quét trên hệ thống Metafer, và phân
tích bằng phần mềm Ikaros (MetaSystems, Đức). Sau đó phân tích về số lượng và
cấu trúc NST. Đối với mỗi mẫu bệnh nhân, trung bình 20 tế bào được phân tích.

25