Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trên Hoa Lily

Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trên Hoa Lily(Lilium spp.)
Cùng với hoa cẩm chướng hoa Lily là một trong hai loại cây hoa có giá trị hàng
đầu thế giới về xuất khẩu và tiêu thụ nội địa của nhiều nước. Lily là một trong
những loài hoa cắt cành đẹp và được nhân giống thương mại trên diện rộng
Hoa Lily là cây hoa mang lại lợi nhuận lớn ở nhiều nước như Hà Lan, Nhật
bản…Ở Việt Nam, hoa Lily được trồng ở Đà Lạt từ thời Pháp thuộc. Hiện nay
nhu cầu về giống hoa Lily là rất lớn. Ở Đà Lạt, những người trồng hoa phải mua
củ giống từ Hà Lan, giá hiện tại cho một củ giống từ 7000 - 10.000 đồng tuỳ loại và màu sắc, do vậy sản
phẩm của hoa thương phẩm là rất đắc.
Ứng dụng kỷ thuật nuôi cấy mô tế bào có thể chủ động sản xuất cây giống cũng như củ giống và là
phương pháp được áp dụng nhiều nơi trên thế giới. Có thể nuôi cấy được nhiều bộ phần khác nhau của
hoa Lily. Một trong những phương đơn giản nhất là phương pháp nuôi cấy vảy củ.
Qui trình nhân giống và trồng:
Môi trường tạo mẫu ban đầu: là môi trường ½ MS.
Môi trường nhân chồi là môi trườmg MS có bổ sung 0.5 - 1 ml/l BA, 8 g/l và 30 g/l đường.
Môi trường ra rễ là môi trường ½ MS và 20 g/l đường.
Cách đưa cây ra bầu đất và chế độ chăm sóc:
Cây mô Lily ra rễ đạt chiều cao 6-8 cm, lấy cây ra ngoài rữa sạch aga và trồng vào vĩ xốp (112 lỗ). Tưới
nước dạng phun sương trong tuần đầu tiên và giữ ẩm bằng cách che bao Nylon. Sử dụng NPK phun lên lá
để cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng cho cây chóng lớn. Sau 4 tuần cây hình thành lá mới, khi đó tiến
hành chuyển cây ra bầu đất, đến tháng thứ 3 có thể chuyển cây mô trồng ra ngoài đồng ruộng.
Quy trình nuôi cấy
I. Khử trùng mẫu:
1. Nguyên liệu: Tất cả các bộ phận của cây hoa Lily
2. Khử trùng:
Ngoài box cấy: Sử dụng bông thấm nước xà phòng lau nhẹ khắp bề mặt mẫu cấy, rửa
sạch và để dưới vòi nước chảy khoảng 30 phút.
Trong box cấy: khử trùng mẫu vưói cồn 70 độ và dung dịch Thủy ngân chlorua trong
khoảng 5 đến10 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng
3. Thao tác cắt mẫu:
Thực hiện kỹ thuật cắt lấy các bộ phận trong nụ hoa, các phần lát mỏng tế bào và các đoạn

thân có chồi bên của cây Lily.
II. Nhân giống invitro:
1. Tạo mô sẹo:
Cấy các mẫu lên môi trường MS có bổ sung đường; NAA kết hợp TDZ; agar; pH: 5,8 ở nhiệt độ
20-25
o
C sau 02 tháng nuôi cấy mẫu sẽ tạo được nhiều mô sẹo.
2. Tạo phôi:
Cắt các mô sẹo cấy lên môi trường MS có bổ sung đường; NAA kết hợp cùng TDZ; agar; pH:
5,8 ở nhiệt độ 20-25
oc
để trong tối sau 02 tháng trên các mảnh mô sẹo tạo nhiều phôi Lily.
3. Tạo củ con từ phôi:
Cấy các mẫu phôi lên môi trường MS có bổ sung đường; NAA kết hợp TDZ; agar; than hoạt
tính pH: 5,8 ở nhiệt độ 20-25
oc
để trong tối sau 2 tháng mỗi cụm phôi Lily sẽ hình thành 1 cụm
củ con.
4. Tạo củ bi:
Tách các cụm thành các củ con riêng rẽ và cấy lên môi trường MS có bổ sung đường; NAA kết
hợp TDZ; agar; than hoạt tính, pH: 5,8 ở nhiệt độ 20-25
oc
để trong tối sau
02 tháng mỗi củ con Lily sẽ tạo 1 củ bi.
5. Tạo củ lớn:
Giai đoạn này thực hiện ngoài vườn vào thời điểm thích hợp nhất là đầu
mùa Xuân. Các củ bi được vùi vào giá thể đất kết hợp chế độ tưới nước,
bón phân, phòng trừ sâu bệnh điều độ. Loại bỏ các bông hoa nở sớm và
duy trì sự phát triển dinh dưỡng của củ càng lâu càng tốt nhằm tạo củ
lớn. Sau 08 tháng cũng là lúc bộ lá tàn đi, củ được đào lên rửa sạch phân

loại
6. Tạo củ thương phẩm:
Củ sau khi đào lên rửa sạch và phân loại được đưa vào hệ thống xử lý
lạnh ở nhiệt độ từ -2
oc
đến 2
oc
trong thời gian phù hợp từng đối tượng
giống. Việc xử lý lạnh có vai trò phá miên trạng của củ để sau 90 ngày kể
từ lúc trồng thu hoạch được hoa thương phẩm. Đối với giống Asiatic Lily
và Longiflorum Lily thời gian phá miên trạng là liên tục 06 tuần, riêng
giống Oriental Lily thời gian xử lý lạnh là liên tục 08 tuần.
Quy trình nuôi cấy
Mở đầu
Trong khi sự an toàn của con người đối với thực phẩm biến đổi gen vẫn còn chưa được
khẳng định chắc chắn thì việc nghiên cứu hệ thống chuyển gen hiệu quả cho các loài hoa
cây cảnh từ đó chuyển được các gen mong muốn tạo ra các đặc tính mới lạ (mầu sắc, cấu
trúc hoa, hương thơm, tuổi thọ của hoa cắm, các đặc tính kháng sâu và bệnh hại, chống
chịu với điều kiện bất thuận,…) luôn là mong muốn của các nhà chọn tạo giống.
Hoa lily thuộc họ Liliaceae là một trong những loài hoa đẹp và có giá trị trên thị trường hiện
nay. Các nỗ lực chính trong nghiên cứu chuyển gen vào cây lily đã được thực hiện bởi các
phương pháp chuyển gen trực tiếp như bắn gen (Nishihara và cộng sự, 1993; Sanford và
cộng sự, 1993; Wilmink và cộng sự, 1995; Tsuchiya và cộng sự, 1996), xung điện (Miyoshi
và cộng sự, 1995) và gần đây đã tạo được cây Lilium longiflorum chuyển gen nhờ phương
pháp bắn gen [1] [2] [3]. Trong một số năm gần đây, sự thành công trong nghiên cứu
chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium đã được công bố trên một số loài thuộc họ Liliace
bao gồm: Asparagus officinalis (Kiasaka và Kameya, 1998), Allium sativum (Kondo và cộng
sự, 2000), Allium cepa (Eady và cộng sự, 2000), Agapanthus praecox (Suzuki và cộng sự,
2001) và Muscari armeniacum (Suzuki và Nakano, 2002). Gần đây nhất, Y.Hoshi và cộng sự
đã nghiên cứu thành công quy trình tạo cây chuyển gen cho cây Oriental hybrid lily, Lilium

cv. Acapulco bằng vi khuẩn Agrobacterium [9].
Hoa đồng tiền là một trong những loài hoa phổ biến trên thế giới, được sử dụng làm hoa
chậu, hoa cắt cành, hoa trồng cảnh. Ở nước ta, hoa đồng tiền được trồng khá phổ biến, có
giá trị kinh tế cao và đặc biệt là hoa đồng tiền có thể ra hoa vào thời vụ mùa hè ngoài miền
Bắc là thời gian hiếm hoa trong năm. Chính vì vậy, việc nghiên cứu chọn tạo các giống hoa
đồng tiền ở nước ta sẽ hứa hẹn những đóng góp quan trọng trong nghề trồng hoa.
Đã có một số công trình công bố về nghiên cứu hệ thống tái sinh và chuyển gen cho cây hoa
đồng tiền: Teresa Orlikowska, Elzbieta Nowak, Agnieszka Marasek và Danuta Kucharska,
1999 [6]; Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Phương
Hoa, 2002 [7]; Purnima Tyagi and S L Kothari, 2004 [4]. Các tác giả V. Nagaraju, G.S.L.
Srinivas và G.Lakshmi Sita (1998) đã nghiên cứu và chuyển được các gen nptII và uidA cho
cây hoa đồng tiền dòng RCGH 164 bằng vi khuẩn Agrobacterium [8].
Các kết quả nghiên cứu trên hai đối tượng trên đã chứng tỏ chúng ta hoàn toàn có thể tạo
được cây hoa lily và cây hoa đồng tiền chuyển gen. Trong quy trình chuyển gen, việc xác
định được các yếu tố ảnh hưởng trước khi tiến hành nghiên cứu quy trình chuyển gen sẽ là
những đóng góp có tính định hướng quan trọng cho quá trình nghiên cứu tiếp theo. Chính vì
vậy để góp phần nghiên cứu chuyển tạo cây lily và cây đồng tiền chuyển gen phục vụ công
tác giống cây trồng, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xác định một số yếu tố trong
quy trình chuyển gen cho cây lily và cây đồng tiền thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens”.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu:
- Lilium Oriental hybrid “Siberia” hoa trắng, thơm
- Lilium Oriental hybrid “Stagazer” hoa đỏ, thơm
- Lilium LA hybrid (Longiflorum x Asiatic) hoa vàng, không thơm
Các giống lily trên đều có nguồn gốc từ công ty Dalat Hasfarm
- Hoa đồng tiền mầu đỏ có nguồn gốc từ Tây Tựu - ĐXTT
- Hoa đồng tiền mầu hồng có nguồn gốc từ Viện Rau quả TW - HVR
- Hoa đồng tiền mầu hồng có nguồn gốc từ Vĩnh Tuy – HVT
- Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dòng EHA mang plasmid

PCAMBIA mã hoá cho gen gus và gen kháng kháng sinh hygromycin.
Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
- Sử dụng phương pháp nghiên cứu nuôi cấy mô hiện hành
- Phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
- Phương pháp xác định sự biểu hiện tạm của gen gus theo Jefferson (1987).
Môi trường tái sinh tạo chồi lily từ vảy củ và lớp mỏng thân: MS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco,
1mg/l 2.4D, 0.2mg/l BA, 2g/l phytagel, pH = 5,3 - 5,5.
Môi trường tái sinh chồi đồng tiền: MS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 2mg/l BA, 0.3mg/l
kinetin, 0,1mg/l IAA, 2g/l phytagel, pH = 5,2.
Hai phương pháp nhiễm mẫu với vi khuẩn
· Mẫu cấy được nhúng vào dung dịch vi khuẩn trong thời gian từ 5 phút, vớt ra, để khô trên
giấy thấm vô trùng sau đó được cấy lên môi trường đồng nuôi cấy.
· Mẫu cấy được cấy trên môi trường đồng nuôi cấy sau đó dùng micropipet hút dịch vi khuẩn
trên nhỏ vào mẫu, mỗi mẫu cấy chỉ nhỏ 10ml dung dịch vi khuẩn.
Phương pháp rửa vi khuẩn: Vi khuẩn được rửa 2-3 lần bằng nước cất vô trùng hoặc môi
trường MS vô trùng.
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Thí nghiệm 1. Xác định môi trường đồng nuôi cấy thích hợp vừa cho sự tái sinh của mẫu cấy
lily đồng thời cho phép vi khuẩn sinh trưởng và phát triển.
Kết quả nghiên cứu của Y.Hoshi và cộng sự khi nghiên cứu quy trình tạo cây chuyển gen cho
cây Oriental hybrid lily, Lilium cv. Acapulco bằng vi khuẩn Agrobacterium (2004) cho thấy:
Thành phần môi trường đồng nuôi cấy trong đó có thành phần khoáng NH4NO3 có ảnh
hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Agrobacterium. Bên cạnh đó,
cassamino acid và L-glutamine cũng có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển
của vi khuẩn. Ở thí nghiệm này chúng tôi tiến hành lây nhiễm bằng cả 2 phương pháp nhỏ
giọt và ngâm trong dịch vi khuẩn 5 phút, nguồn mẫu cấy không qua tiền nuôi cấy. Kết quả
thí nghiệm được thể hiện ở bảng 1.
Bảng 1. Ảnh hưởng của nền môi trường đồng nuôi cấy đến sự sinh trưởng của vi khuẩn
Agrobacterium trên một số giống lily

Stt Nền môi trường Giống Phương pháp lây nhiễm Tỷ lệ sống của mẫu cấy (%) Biểu hiện vi
khuẩn
Sau 8 ngày Sau 30 ngày
Nhỏ giọt Ngâm Không Có Không Có
1. MSI Ly trắng + 100 + +
2. Ly đỏ + 100 + +
3. Ly vàng + 100 + +
4. MSII Ly trắng + 100 + +
5. Ly đỏ + 100 + +
6. Ly vàng + 100 + +
Ghí chú: Mẫu cấy là vẩy củ, lớp mỏng thân
MSI: MS (1962) 20mg/l AS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 1mg/l 2.4D, 0.2mg/l BA, 3g
phytagel, pH = 5,2.
MSII: MS (1962) không có NH4NO3, 20mg/l AS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 1mg/l 2.4D,
0.2mg/l BA, 1g/l cassamino acid, 700mg/l L-glutamine, 2g/l phytagel, pH = 5,2.
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy:
Thành phần NH4NO3, cassamino acid và L-glutamine có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng
của vi khuẩn Agrobacterium khi được đồng nuôi cấy với vảy củ và lớp mỏng thân của các
giống lily. Sau 30 ngày theo dõi, vi khuẩn không thể phát triển được khi được đồng nuôi cấy
trên môi trường MSI. Trong khi đó trên nền môi trường đồng nuôi cấy MSII chỉ sau 8 ngày
vi khuẩn đã xuất hiện. Như vậy, chúng tôi sẽ sử dụng nền môi trường là MSII cho các
nghiên cứu tiếp theo.
Thí nghiệm 2. Xác định ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy mẫu, phương pháp lây nhiễm
đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium trên một số giống lily
Bảng 2. Ảnh hưởng của tiền nuôi cấy, phương pháp lây nhiễm đến sự sinh trưởng của vi
khuẩn Agrobacterium trên một số giống lily (theo dõi sau đồng nuôi cấy 4 ngày)
Stt Giống Thời gian tiền nuôi cấy (ngày) Phương pháp lây nhiễm Tỷ lệ sống của mẫu cấy
(%) Biểu hiện vi khuẩn
5 3 2 0 Nhỏ giọt Ngâm Không Có
1. Ly trắng + + 100 +

2. Ly trắng + + 100 +
3. Ly trắng + + 100 +
4. Ly trắng + + 100 +
5. Ly trắng + + 100 +
6. Ly trắng + + 100 +
7. Ly trắng + + 100 +
8. Ly trắng + + 100 +
9. Ly đỏ + + 100 +
10. Ly vàng + + 100 +
Bảng 3. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy mẫu, phương pháp lây nhiễm đến sự sinh
trưởng của vi khuẩn Agrobacterium trên một số giống lily (theo dõi sau đồng nuôi cấy 6
ngày)
Stt Giống Thời gian tiền nuôi cấy (ngày) Phương pháp lây nhiễm Tỷ lệ sống của mẫu cấy
(%) Biểu hiện vi khuẩn
5 3 2 0 Nhỏ giọt Ngâm Không Có
1. Ly trắng + + 100 +
2. Ly trắng + + 100 +
3. Ly trắng + + 100 +
4. Ly trắng + + 100 +
5. Ly trắng + + 100 +
6. Ly trắng + + 100 +
7. Ly trắng + + 100 +
8. Ly trắng + + 100 +
9. Ly đỏ + + 100 +
10. Ly vàng + + 100 +
Kết quả nghiên cứu trên bảng 2 và bảng 3 cho thấy:
Mẫu cấy lily có ảnh hưởng rất mạnh đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
Agrobacterium. Sau đồng nuôi cấy 4 ngày (96 giờ), chưa có mẫu cấy nào có biểu hiện của vi
khuẩn. Tiếp tục theo dõi sau 6 ngày đồng nuôi cấy. Kết quả được thể hiện trên bảng 3 cho
thấy:

- Sự xuất hiện của vi khuẩn chịu ảnh hưởng rất lớn bởi thời gian tiền nuôi cấy cũng như
phương pháp lây nhiễm. Nhìn chung, lây nhiễm bằng phương pháp nhỏ giọt cho phép vi
khuẩn sinh trưởng và phát triển nhanh hơn so với phương pháp ngâm 5 phút trong dung
dịch vi khuẩn.
- Tiền nuôi cấy mẫu trước khi lây nhiễm cũng có ảnh hưởng lớn đến sự xuất hiện của vi
khuẩn Agrobacterium. Chỉ có các công thức lây nhiễm bằng phương pháp nhỏ giọt kết hợp
với tiền nuôi cấy 3 hoặc 5 ngày mới cho sự xuất hiện của vi khuẩn Agrobacterium. Vi khuẩn
Agrobacterium không xuất hiện khi được đồng nuôi cấy cùng với các mẫu giống lily khi các
mẫu cấy này chưa qua tiền nuôi cấy. Như vậy, thời gian tiền nuôi cấy mẫu lily để vi khuẩn
Agrobacterium có thể sinh trưởng phát triển là từ 3 – 5 ngày trước khi tiến hành lây nhiễm.
Thí nghiệm 3. Xác định ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy mẫu, phương pháp lây nhiễm
đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium trên một số giống đồng tiền
Kết quả bảng trên bảng 4 cho thấy:
Sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium khi được đồng nuôi cấy với mẫu cấy đồng tiền
không phụ thuộc vào: (1) thời gian tiền nuôi cấy, (2) Phương pháp lây nhiễm, (3) Các
nguồn mẫu giống khác nhau. Rõ ràng, trên đối tượng đồng tiền, vi khuẩn Agrobacterium đã
dễ dàng để có thể sinh trưởng và phát triển rất mạnh. Đây là một thuận lợi cho quá trình
lây nhiễm nhưng lại là khó khăn ở giai đoạn kế tiếp. Thông thường, nếu vi khuẩn sinh
trưởng và phát triển mạnh trong quá trình đồng nuôi cấy, quá trình phục hồi cũng như chọn
lọc sau này sẽ rất khó khăn để loại bỏ được chính vi khuẩn này.
Bảng 4. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy mẫu, phương pháp lây nhiễm đến sự sinh
trưởng của vi khuẩn Agrobacterium trên một số giống đồng tiền (theo dõi sau đồng nuôi cấy