Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ SỐ: 304

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN LACTIC
CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN
TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN

Sinh viên thực hiện
ĐẶNG THỊ THU THẢO
MSSV: 0753040084
LỚP: ĐH NTTS K2

Cần Thơ, 2011

1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ SỐ: 304

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN LACTIC

CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN
TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN

Cán bộ hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

PGs.Ts. NGUYỄN VĂN BÁ
ThS. NGUYỄN THÀNH TÂM

ĐẶNG THỊ THU THẢO

2011

2


XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Luận văn kèm theo đây với tựa đề: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có
khả năng kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men”.
Do sinh viên Đặng Thị Thu Thảo thực hiện và báo cáo đã được Hội đồng chấm
luận văn thông qua.
Ủy viên

Phản biện

Cần Thơ, ngày 13 tháng 07 năm 2011
Chủ tịch hội đồng

3


LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Tây Đô đã tạo điều
kiện tốt cho tôi học tập và sinh hoạt. Cảm ơn quý Thầy Cô Khoa Sinh Học Ứng
Dụng đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu về
cơ sở ngành cũng như chuyên ngành từ những ngày đầu bước chân vào trường
đến nay.
Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn từ
các sản phẩm thủy sản lên men” được kết thúc thành công. Tôi xin chân thành
cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Thầy Nguyễn Văn Bá đã hỗ trợ môi trường
nuôi cấy và các dụng cụ đặc trưng cho thí nghiệm, Thầy Nguyễn Thành Tâm
luôn theo sát hướng dẫn đề tài và cung cấp một số tài liệu liên quan. Cảm ơn Cô
Trần Ngọc Huyền – cán bộ phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để
đề tài kết thúc đúng thời hạn và xin cảm ơn anh
Lê Văn Toàn (lớp ĐH NTTS K2) cùng hai em Nguyễn Thị Thùy Trang và
Dương Thị Bé Ba (lớp ĐH NTTS K3) đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện.
Cảm ơn Thầy cố vấn học tập Tạ Văn Phương , Thầy Nguyễn Lê Hoài Phương
(Khoa cơ bản) và các thành viên lớp ĐH NTTS K2 đã sát cánh cùng tôi trong
suốt quá trình học tập tại trường.
Chân thành cảm ơn!

Đặng Thị Thu Thảo

4


TÓM TẮT

Vi khuẩn lactic có ý nghĩa rất quan trọng trong các quá trình lên men thực
phẩm. Chúng sinh ra nhiều chất để bảo vệ thực phẩm như: axít lactic, H2O2 và
chất kháng khuẩn. Do đó, việc tìm ra những chất kháng khuẩn sinh ra từ vi
khuẩn lactic nhằm bổ sung cho những nghiên cứu về chất kháng khuẩn và ứng
dụng chất kháng khuẩn vào trong nuôi trồng thủy sản. Nghiên cứu sử dụng môi
trường MRS để phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic, sử dụng phương pháp
trực tiếp để kiểm tra sự kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus. Kết quả
cho thấy có tổng số 83 dòng vi khuẩn lactic được phân lập từ 37 mẫu mắm và
nước mắm (thu ngẫu nhiên ở những chợ thuộc vùng nước ngọt và nước lợ mặn)
và có 19 dòng cho vòng kháng khuẩn đối với dòng chỉ thị. Độ dày vòng kháng
khuẩn từ 0,1 – 0,85 cm, trong đó có 9 dòng vi khuẩn lactic cho bề dày vòng
kháng khuẩn lớn nhất (hơn 0,6 cm), 1 dòng cho bề dày vòng kháng khuẩn
0,1 cm là nhỏ nhất. Như vậy, có thể sử dụng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên
men thủy sản để kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus.
Từ khóa: Vi khuẩn lactic, Chất kháng khuẩn, Phương pháp trực tiếp,
Pediococcus pentosakeus.

5


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................... i
TÓM TẮT........................................................................................................................ ii
MỤC LỤC.......................................................................................................................iii
DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................................... v
DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................................... vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................................... vii
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................... 1
1.1 Giới thiệu .................................................................................................................... 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................... 2
1.3 Nội dung nghiên cứu................................................................................................... 2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU....................................................................... 3
2.1 Một số quy trình lên men thủy sản.............................................................................. 3
2.2 Vi khuẩn lactic ............................................................................................................ 7
2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn lên men axit lactic ......................................................... 7
2.2.2 Cơ chế của quá trinh lên men axit lactic............................................................. 8
2.3 Mối quan hệ giữ axit lactic với cá và các sản phẩm từ cá .......................................... 8
2.4 Chất kháng khuẩn ....................................................................................................... 9
2.5 Dòng chỉ thị Pediococcus pentosakeus..................................................................... 12
2.6 Những nghiên cứu trong và ngoài nước.................................................................... 13
2.6.1 Những nghiên cứu trong nước ......................................................................... 13
2.6.2 Những nghiên cứu ngoài nước......................................................................... 14
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 15
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện................................................................................ 15
3.1.1 Địa điểm........................................................................................................... 15
3.1.2 Thời gian thực hiện .......................................................................................... 15
3.2 Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................... 15
3.3 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 17
3.3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu .................................................................. 17
3.3.2 Phương pháp phân lập VKL từ mẫu mắm ....................................................... 18
3.4 Phân tích và xử lý số liệu .......................................................................................... 20
3.4.1 Phân tích VKL ................................................................................................. 20
3.4.2 Phân tích khả năng kháng khuẩn ..................................................................... 20
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ..................................................................... 21
4.1 Phân lập một số dòng VKL từ các sản phẩm thủy sản lên men................................ 21
4.1.1 Thu mẫu ........................................................................................................... 21
4.1.2 Tăng sinh mẫu lần 1 ......................................................................................... 21
4.1.3 Cấy ria trên đĩa pêtri ........................................................................................ 23

6


4.1.4 Thử catalase và nhuộm Gram .......................................................................... 25
4.1.5 Tăng sinh mẫu lần 2 ......................................................................................... 26
4.1.6 Lưu trữ mẫu ..................................................................................................... 26
4.2 Kiểm tra khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được........................................ 26
4.2.1 Tối ưu hóa quy trình ........................................................................................ 26
4.2.2 Thử khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được ...................................... 27
CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ ĐỀ XUẤT............................................................................ 31
5.1 Kết quả ...................................................................................................................... 31
5.2 Đề xuất ...................................................................................................................... 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 32
PHỤ LỤC A.................................................................................................................... A
PHỤ LỤC B .....................................................................................................................B
PHỤ LỤC C.................................................................................................................... C
PHỤ LỤC D.................................................................................................................. D1
PHỤ LỤC E .....................................................................................................................E
PHỤ LỤC F ...................................................................................................................F1
PHỤ LỤC G.................................................................................................................... G

7


DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Các đặc tính CKK của VKL ................................................................ 10
Bảng 3.1: Tên và địa điểm thu mẫu...................................................................... 17
Bảng 4.1: Địa điểm và số lượng mẫu thu ............................................................. 21
Bảng 4.2: Kết quả tăng sinh lần 1 ........................................................................ 22

Bảng 4.3: Kết quả cấy ria VKL trên đĩa thạch ..................................................... 23
Bảng 4.4: Kết quả thử khả năng sinh chất kháng khuẩn ...................................... 28
Bảng 4.5: Kết quả thử với Pediococcus pentosakeus........................................... 30
Bảng A1: Thành phần môi trường MRS_broth..................................................... A
Bảng A2: Thành phần môi trường MRS_agar ...................................................... A
Bảng D1: Bảng mã mẫu ...................................................................................... D1
Bảng D2: Kết quả thử khả năng sinh CKK của VKL phân lập được ................. D3
Bảng F1: Quan sát khuẩn lạc................................................................................ F1

8


DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1: Quy trình sản xuất mắm cá..................................................................... 3
Hình 2.2: Quy trình sản xuất mắm tép ................................................................... 4
Hình 2.3: Quy trình sản xuất mắm tôm .................................................................. 5
Hình 2.4: Quy trình sản xuất mắm ruốc ................................................................. 5
Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm ................................................................ 6
Hình 2.6: Pediococcus.......................................................................................... 12
Hình 3.1: Quy trình phân lập mẫu mắm............................................................... 19
Hình 3.2: Tối ưu hóa quy trình............................................................................. 19
Hình 3.3: Phương pháp trực tiếp .......................................................................... 20
Hình 4.1: Cách xác định sự phát triển của VKL .................................................. 21
Hình 4.2: Khuẩn lạc có khả năng phân giải CaCO3 ............................................. 25
Hình 4.3: Vi khuẩn Gram dương (vật kính 100X) và mẫu thử catalase âm tính . 25
Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn của mẫu ................................................................. 27
Hình 4.5: Vòng kháng khuẩn sinh ra từ VKL ...................................................... 30

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

VKL: Vi khuẩn lactic
CKK: Chất kháng khuẩn

9


CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Ở nước ta, nuôi trồng thủy sản ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh
tế. Trong những năm gần đây, nhằm nâng cao năng suất thủy sản phục vụ nhu
cầu xuất khẩu nên mức độ nuôi thâm canh hóa ngày càng cao. Bệnh trên tôm, cá
và các loài thủy đặc sản khác cũng xuất hiện ngày càng nhiều. Bệnh đã gây
nhiều tổn thất cho nghề nuôi thủy sản. Sản phẩm làm ra không được tiêu thụ
hoặc chất lượng sản phẩm giảm, không đảm bảo cho tiêu dùng và xuất khẩu.
Do đó, công tác phòng trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản đang đòi hỏi cấp bách.
(Bùi Quang Tề, 2008). Tuy nhiên, nhiều sản phẩm thuốc thủy sản hiện nay đã
dần mất tác dụng với các loại mầm bệnh quen thuộc do việc sử dụng thuốc quá
mức và không đảm bảo liều lượng theo yêu cầu dẫn đến tình trạng kháng thuốc
của các loại mầm bệnh ngày một gia tăng. Việc sử dụng các dòng vi khuẩn có
lợi để ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh hiện đang được chú trọng, đặc biệt
là nhóm vi khuẩn lactic (VKL).
VKL là tên gọi của nhóm vi khuẩn sinh ra axit lactic như là sản phẩm chính
trong quá trình chuyển hoá chất bột đường và chúng được xếp vào họ
Lactobacteriaceae (Lê Văn Nhương và csv., 2009). VKL có ứng dụng rộng rãi
trong thực tiễn với axit lactic là nguyên liệu rất cần thiết của nhiều ngành công
nghiệp. Đặc biệt, trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm như sữa
chua, các loại dưa từ rau củ, các loại sản phẩm thủy sản lên men
(Lương Đức Phẩm, 2004). Trong quá trình lên men, VKL sinh ra các axit hữu
cơ, chúng tạo ra môi trường không thích hợp cho sự phát triển của những vi sinh

vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi
khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế
bào, ức chế quá trình vận chuyển chủ động của màng tế bào. Axit lactic dễ dàng
thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào hoặc tự oxi hoá, làm dừng quá
trình trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm với nó (Lê Văn Nhương và
csv., 2009).
Nhằm làm tiền đề cho việc nghiên cứu dòng VKL có khả năng sinh chất kháng
khuẩn tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản hiện nay, đề tài
“Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm thủy
sản lên men có khả năng kháng khuẩn ” được thực hiện.

10