Thử nghiệm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng (wssv) trên tôm sú (penaeus monodon)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
*******

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO
DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS
GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ
(Penaeus monodon)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỨC THÀNH

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2005


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

*****

THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO
DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS
GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ
(Penaeus monodon)

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

TS. Lý Thị Thanh Loan

Nguyễn Đức Thành

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2005


LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp, tôi đã gặp những khó khăn nhất định
nhưng nhờ sự hướng dẫn và giúp đỡ của mọi người khóa luận đã được hoàn thành. Tôi
xin chân thành cảm tạ:
 Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt cho
tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường.
 TS Lý Thị Thanh Loan, ThS Nguyễn Hoàng Phượng Uyên đã hết lòng hướng
dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp.
 Các anh chị tại Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường thuộc Viện
Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2 và các anh chị tại Trại Thực nghiệm Thủy
sản Thủ Đức đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian
thực tập tốt nghiệp.
 Ban Giám đốc và các anh chị công ty Nam Khoa.
 Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học 27 đã chia sẻ vui buồn trong
quá trình học tập và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.

iii

TÓM TẮT
NGUYỄN ĐỨC THÀNH, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005.
“THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG
PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG
(WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)”.
Thời gian thực hiện từ tháng 03/2005 – 08/2005.
Địa điểm: Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa
Dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 (RIA 2).
Đề tài được thực hiện trên đối tượng là virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV)
gây bệnh trên tôm sú (Penaeus monodon). Thí nghiệm được bố trí bằng cách trộn
chung dịch chiết virus WSSV với các hợp chất chiết xuất từ thảo dược ở các nồng độ
khác nhau, sau đó kiểm tra tác dụng của các hợp chất đối với virus WSSV. Sau khi
sàng lọc, tiến hành thử nghiệm hiệu quả tác dụng của các hợp chất này lên virus
WSSV bằng cách tiêm hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất vào cơ thể tôm thí
nghiệm. Đánh giá tác dụng của các hợp chất dựa vào kết quả Reatime PCR và tỷ lệ
sống của tôm thí nghiệm.
Kết quả đạt được sau khi thí nghiệm với các hợp chất ký hiệu D2, B, M:
Ở các nồng độ thử nghiệm là 2,5 (mg/ml), 5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml):
Hợp chất M chưa đủ liều lượng để có thể tác dụng lên lớp vỏ protein của virus
hoặc không có hiệu quả tác dụng đối với virus.
Hợp chất B và D2 có tác dụng lên virus WSSV ở những nồng độ 2,5 (mg/ml),
5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml).

iv


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa
Lời cảm tạ......................................................................................................... iii
Tóm tắt ..............................................................................................................vi
Mục lục .............................................................................................................. v
Danh sách các hình ......................................................................................... viii
Danh sách các bảng và sơ đồ ............................................................................ix

PHẤN 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................... 1
1.2 Mục đích, yêu cầu ............................................................................. 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
2.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới ................................................ 3
2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm ở Việt Nam. ...................................4
2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú .......................................... 6
2.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây
hội chứng đốm trắng trên tôm sú ....................................................... 7
2.4.1 Tác nhân gây bệnh ................................................................ 7
2.4.2 Khu vực phân bố...................................................................7
2.4.3 Ký chủ .................................................................................. 8
2.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền ............................... 8
2.4.5 Cơ chế xâm nhập ..................................................................9
2.4.6 Bệnh lý ................................................................................. 9
2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng hiện nay....... 10
2.5.1 Một số phương pháp phổ biến ............................................. 10
2.5.2 Sơ lược về phương pháp PCR và Realtime PCR ................. 10
2.6 Một số dạng hợp chất ở thực vật...................................................... 11

2.6.1 Alkaloid .............................................................................. 11
v


2.6.2 Flavonoid............................................................................ 12
2.7 Một số công trình nghiên cứu và sử dụng thực vật
trong phòng trị bệnh cho các đối tượng thuỷ sản.............................. 12

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 15
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ...................................................... 15
3.2 Vật liệu nghiên cứu ......................................................................... 15
3.2.1 Vật liệu sinh học ................................................................. 15
3.2.2 Dụng cụ và hoá chất ........................................................... 15
3.2.2.1 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm.......... 15
3.2.2.2 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm ướt ... 16
3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................. 16
3.3.1 Phương pháp ly trích và thu dịch chiết virus ...................... 16
3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus trên tôm .............................. 16
3.3.3 Phương pháp thu mẫu ......................................................... 16
3.3.4 Phương pháp PCR .............................................................. 16
3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính ................................... 16
3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng ................................ 17
3.3.5 Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường ................ 17
3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................ 18
3.4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược
đối với virus gây hội chứng đốm trắng ............................... 18
3.4.2 Thử nghiệm các hợp chất sàng lọc khi tiêm trực tiếp
hỗn hợp dich virus và hợp chất vào tôm ............................ 19

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................... 20

4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược
đối với virus gây hội chứng đốm trắng .................................................. 20
4.1.1 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất D2 .................................. 20
4.1.2 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất B.................................... 21
4.1.3 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất M ................................... 23

vi


4.2 Kết quả thử nghiệm sau khi tiêm trên tôm hỗn hợp virus WSSV
và hợp chất D2, B ở các nồng độ khác nhau ................................. 23
4.2.1 Kết quả thử nghiệm hợp chất D2 ......................................... 27
4.2.2 Kết quả thử nghiệm hợp chất B........................................... 29

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 32

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp
dịch chiết virus được ủ với hợp chất D2 trong thời gian 2 giờ ........................ 20
Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp
dịch chiết virus được ủ với hợp chất B trong thời gian 2 giờ ......................... 21
Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp

dịch chiết virus được ủ với hợp chất M trong thời gian 2 giờ ........................ 22
H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của
hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D2 trước thí nghiệm ......................... 28
H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của
hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D2 sau thí nghiệm ............................. 28
H ình 4.5 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của
hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B trước thí nghiệm ........................... 30
H ình 4.6 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của
hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B sau thí nghiệm .............................. 30

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
BẢNG ...............................................................................................TRANG
Bảng 2.1 Tên một số quốc gia và năm xuất hiện bệnh đốm trắng .................... 3
Bảng 2.2 Đánh giá khả năng phát hiện bệnh đốm trắng bằng các phương pháp
khác nhau...................................................................................................... 10
Bảng 4.1 Các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm .......................... 24
Bảng 4.2 Kết quả ghi nhận tỷ lệ tôm chết ở các lô trong quá trình
thí nghiệm ..................................................................................................... 25
Bảng 4.3 Kết quả Realtime PCR so sánh chu kỳ ngưỡng và hàm lượng DNA
của mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất trước thí nghiệm và sau thí nghiệm 26

SƠ ĐỒ ...............................................................................................TRANG
Sơ đồ 3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo
dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). .................................. 18
Sơ đồ 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV
trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các
nồng độ khác nhau. ....................................................................................... 19

ix


1

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề.
Trong những thập kỷ qua, nhu cầu sử dụng thực phẩm có nguồn gốc động vật,
đặc biệt là các sản phẩm thủy sản ngày càng tăng cao. Vì thế, sản lượng thủy sản
không thể đáp ứng được nhu cầu thị trường, trong khi nguồn lợi thủy sản ngày càng
giảm do khai thác quá mức. Trước tình hình đó việc phát triển tự phát nghề nuôi trồng
thủy sản, đặc biệt là sự bùng phát nghề nuôi tôm biển là một thực tế khách quan và là
một nhu cầu cần thiết.
Nghề nuôi trồng thủy sản nước ta cũng phát triển mạnh trong vài thập kỷ gần
đây, đặc biệt là nghề nuôi tôm ở các tỉnh ven biển. Nghề nuôi tôm nước ta phát triển
chủ yếu mang tính tự phát, nguồn vốn và kỹ thuật nuôi còn hạn chế. Điều đó dẫn đến
sự suy thoái môi trường nuôi cùng sự bùng phát và lây lan của dịch bệnh. Khoảng 20
năm gần đây, dịch bệnh tôm xảy ra ở khắp nơi gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm.
Một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đó là bệnh đốm trắng ( White
Spot Desease ) do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). Thiệt hại có thể lên đến
100 % quần đàn từ 3 - 7 ngày kể từ khi phát hiện tôm bệnh. Có nhiều phương pháp
phòng trị bệnh đốm trắng như dùng chế phẩm sinh học, hoá chất, thuốc… nhưng còn
tồn tại nhiều mặt hạn chế và mức độ thành công chưa cao.
Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nên khu hệ thực vật rất
phong phú. Thảo dược từ xưa đã được ứng dụng phòng trị bệnh có hiệu quả trong y
học và thú y. Tuy nhiên trong lĩnh vực thuỷ sản thì chưa được ứng dụng rộng rãi. Thử

nghiệm một số hợp chất thảo dược trong phòng trị bệnh ở các đối tượng nuôi thuỷ sản
là hướng nghiên cứu mới và cần khai thác. Được sự đồng ý của Trung tâm Quốc gia
Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thuỷ sản khu vực Nam Bộ
(MCE) thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II (RIA 2) và Bộ môn Công nghệ
Sinh học Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh cùng các thầy cô hướng
dẫn, chúng tôi thực hiện khoá luận tốt nghiệp: “Thử nghiêm một số hợp chất chiết xuất
từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng
(WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)”