Sàng lọc và xác định đặc tính sinh học của lectin từ động vật thân mềm thuộc vùng biển nha trang, khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
----------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành Công nghệ sinh học
SÀNG LỌC VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA LECTIN TỪ ĐỘNG VẬT THÂN MỀM
THUỘC VÙNG BIỂN NHA TRANG, KHÁNH HÒA

Cán bộ hướng dẫn

: TS. LÊ ĐÌNH HÙNG
ThS. LÊ NHÃ UYÊN
Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ NGỌC KIỀU
Mã số sinh viên
: 54130650

Khánh Hòa, tháng 7 năm 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành Công nghệ sinh học
SÀNG LỌC VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA LECTIN TỪ ĐỘNG VẬT THÂN MỀM

THUỘC VÙNG BIỂN NHA TRANG, KHÁNH HÒA

Cán bộ hướng dẫn

: TS. LÊ ĐÌNH HÙNG
ThS. LÊ NHÃ UYÊN
Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ NGỌC KIỀU
Mã số sinh viên
: 54130650

Khánh Hòa, tháng 7 năm 2016


i

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Đình Hùng
(Trưởng phòng Công nghệ sinh học biển – Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ
Nha Trang) và Ths. Lê Nhã Uyên (Giảng viên Viện Công nghệ Sinh học và Môi
trường – Trường Đại học Nha Trang), những người đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn
tôi trong suốt quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp đại học.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nha
Trang, cảm ơn PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa – Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học và
Môi trường, cùng toàn thể các thầy cô giáo đã tận tình chỉ dạy và cho tôi nhiều kiến
thức quý báu trong suốt bốn năm học qua.
Tôi chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công
nghệ Nha Trang, các anh chị phòng Công nghệ sinh học biển, đặc biệt là
anh Đinh Thành Trung đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi
thực hiện đồ án này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã luôn

quan tâm, động viên, cổ vũ, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện đồ án.
Xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, tháng 7 năm 2016
Sinh viên

Trần Thị Ngọc Kiều


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ ...................................................................... vii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1. Tổng quan về vùng nghiên cứu ............................................................................3
1.2. Tổng quan về ngành động vật thân mềm (Mollusca)...........................................4
1.2.1. Đặc điểm chung của ngành (Mollusca) ........................................................4
1.2.2. Phân loại động vật thân mềm .......................................................................5
1.2.3. Ốc nón đỏ Tectus conus (Gmelin, 1791) ....................................................13
1.3. Tổng quan về lectin ............................................................................................14
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu lectin ............................................................................14
1.3.2. Sự phân bố của lectin trong sinh giới .........................................................17
1.3.2.1. Lectin trong giới thực vật .....................................................................17
1.3.2.3. Lectin có nguồn gốc vi sinh vật ............................................................18
1.3.2.4. Sự định khu của lectin trong tế bào và cơ thể sinh vật ........................18
1.3.3. Tình hình nghiên cứu lectin trên thế giới và Việt Nam ...............................19
1.3.3.1. Lectin từ nguồn biển.............................................................................19
1.3.3.2. Lectin từ động vật thân mềm biển ........................................................20

1.3.3.3. Một vài nghiên cứu khác về lectin .......................................................21
1.3.4. Cấu tạo của phân tử lectin ..........................................................................22
1.3.5. Một số tính chất hóa lí và sinh học của lectin ............................................26
1.3.5.1. Tính tan và kết tủa ................................................................................26
1.3.5.2. Khả năng tương tác với đường của lectin............................................26
1.3.5.3. Khả năng gây ngưng kết tế bào ...........................................................27
1.3.5.4. Ảnh hưởng của một số yếu tố tới hoạt độ của lectin ............................28
1.3.6. Phương pháp thu nhận lectin ......................................................................29
1.3.6.1. Các kỹ thuật chiết xuất lectin ...............................................................29


iii

1.3.6.2. Các kỹ thuật tinh chế lectin ..................................................................30
1.3.7. Ứng dụng của lectin ....................................................................................32
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu.....................................................34
2.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ............................................................34
2.2.1. Vật liệu ........................................................................................................34
2.2.2 Hóa chất .......................................................................................................34
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................35
2.3.1. Quy trình sàng lọc lectin từ động vật thân mềm biển .................................35
2.3.2. Quy trình tách chiết lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus ................................36
2.3.3. Xác định điều kiện chiết và kết tủa thích hợp để thu nhận lectin từ ốc nón
đỏ Tectus conus .....................................................................................................37
2.3.4. Xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH tới hoạt tính ngưng kết hồng cầu
của lectin từ ốc nón đỏ ..........................................................................................42
2.3.5. Xác định các đặc tính sinh học của lectin từ ốc nón đỏ..............................44
2.3.5.1. Khả năng liên kết carbohydrate ...........................................................44
2.3.5.2. Khả năng kháng khuẩn ........................................................................46
2.3.6. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry .............................47

2.3.7. Phương pháp xử lí hồng cầu thỏ .................................................................48
2.3.8. Phương pháp xác định hoạt độ lectin .........................................................49
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu...........................................................................50
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................51
3.1. Kết quả sàng lọc lectin từ động vật thân mềm biển thu được tại vùng biển Nha
Trang, Khánh Hòa .....................................................................................................51
3.2. Kết quả xác định điều kiện chiết và kết tủa lectin từ ốc nón đỏ (Tectus conus) 52
3.2.1. Ảnh hưởng của dung môi chiết ...................................................................52
3.2.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi chiết ............................................................53
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian chiết ....................................................................55
3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ ammonium sulfate đến HĐR, HĐTS, MAC và hiệu
suất thu hồi lectin ..................................................................................................57


iv

3.2.5. Quy trình thu nhận lectin thô ......................................................................59
3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ ốc nón đỏ ...............62
3.4. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ ốc nón đỏ .......................63
3.5. Khả năng liên kết carbohydrate của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus ..............64
3.6. Khả năng kháng khuẩn của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus ...........................66
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................68
1. Kết luận .................................................................................................................68
2. Kiến nghị ...............................................................................................................69
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................70
PHỤ LỤC ..................................................................................................................79


v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BSA

:

Albumin huyết thanh bò

TBS

:

Tris Bufer Saline

PBS

:

Phosphate buffered saline (đệm phosphate chứa NaCl)

Cmin

:

nồng độ nhỏ nhất của đường (mM) hoặc glycoprotein
(µg/ml) mà tại đó hiện tượng NKHC do lectin gây ra bị
ức chế hoàn toàn

DC

:

dịch chiết

HA

:

hoạt độ ngưng kết hồng cầu

HI

:

giá trị nồng độ pha loãng mà tại đó hoạt độ NKHC vẫn
còn bị ức chế, sau khi lectin đã liên kết với đường hoặc
glycoprotein

HU

:

Hemagglutinin unit (đơn vị ngưng kết)

HC

:

hồng cầu

HĐR

:

hoạt độ riêng

HĐTS

:

hoạt độ tổng số

HSTH

:

hiệu suất thu hồi

NKHC

:

ngưng kết hồng cầu

OD

:

mật độ quang học

MAC

:

nồng độ protein nhỏ nhất gây NKHC

ĐVTM

:

động vật thân mềm


vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Khảo sát khả năng liên kết của lectin với một số loại đường và
glycoprotein ...............................................................................................................44
Bảng 2.2. Các vi khuẩn gây bệnh được sử dụng trong thí nghiệm khảo sát hoạt tính
kháng khuẩn của lectin từ ốc nón đỏ. ........................................................................47
Bảng 3.1. Các mẫu ĐVTM biển được điều tra lectin (Đơn vị: HU/ml)…………...51
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của dung môi chiết tới HĐR, HĐTS và MAC của lectin ......52
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ chiết tới HĐR, HĐTS và MAC của lectin ...............54
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến HĐTS, HĐR, MAC của lectin .........55
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ tủa ammonium sulfate tới MAC, HĐR, HĐTS và
hiệu suất thu hồi của lectin ........................................................................................57
Bảng 3.6 Kết quả quá trình thu dịch chiết lectin .......................................................60
Bảng 3.7 Khả năng liên kết carbohydrate của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus ......65
Bảng 3.8. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh .........66

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ
Hình 1.1. Cấu tạo cơ thể song kinh có vỏ ...................................................................6
Hình 1.2. Cấu tạo cơ thể song kinh không vỏ .............................................................7
Hình 1.3. Đại diện lớp vỏ một tấm..............................................................................8
Hình 1.4. Cấu tạo cơ thể lớp chân xẻng ......................................................................9
Hình 1.5. Đại diện lớp chân bụng .............................................................................10
Hình 1.6. Đại diện lớp hai mảnh vỏ ..........................................................................11
Hình 1.7. Đại diện lớp chân đầu................................................................................12
Hình 1.8. Ốc nón đỏ Tectus conus ............................................................................13
Hình 1.9. Cấu trúc không gian 3 chiều của lectin .....................................................23
Hình 2.1 Quy trình sàng lọc lectin ............................................................................35
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình thu nhận lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus ......................36
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát dung môi chiết ......................................38
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu:dung môi chiết ...........39
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết tối ưu .............................40
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ tủa thích hợp ...........................41
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới ..........42
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH .......................43
Hình 2.9. Lectin liên kết với hồng cầu (A), lectin liên kết với đường (B) ..............45
Hình 2.10. Đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry .....................................48
Hình 3.1. Ảnh hưởng của dung môi chiết tới HĐTS và HĐR của lectin..................53
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi chiết tới HĐTS và HĐR của lectin ..........54
Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến HĐR, HĐTS của lectin .....................56
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ tủa ammonium sulfate tới HĐR, HĐTS ............58
Hình 3.5. Quy trình công nghệ thu nhận chế phẩm lectin thô từ ốc nón đỏ Tectus
conus..........................................................................................................................61
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NKHC của lectin từ ........................62
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ NKHC của lectin .....................................64

1

MỞ ĐẦU
Sự đa dạng sinh học của biển đã và đang thu hút được sự quan tâm của nhiều
ngành khoa học khác nhau, trong đó có ngành công nghệ sinh học. Vi sinh vật biển,
thực vật biển, động vật biển nói chung và động vật thân mềm biển nói riêng đang là
đối tượng nghiên cứu mới. Các hợp chất thứ cấp phân lập từ sinh vật biển cho các
hoạt tính sinh học rất đa dạng như: hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng
virus… Một số hợp chất còn cho kết quả khá khả quan trong việc ức chế các loài
virus chưa có thuốc điều trị hiện nay như virus Herpes (type 1 và 2), HIV trong điều
kiện invitro [42], [51].
Lectin là một trong những hợp chất được phát hiện cách đây hơn một thế kỷ
và hiện nay vẫn đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu bởi hoạt tính và các chức
năng đặc biệt của nó. Bản chất của lectin là protein có khả năng gây ngưng kết các
tế bào hồng cầu người và động vật, một số tế bào lạ và đặc hiệu với một số loại
đường. Tuy không có nguồn gốc miễn dịch nhưng các nhà khoa học đã chứng minh
rằng chúng có vai trò trong miễn dịch của thực vật, có khả năng gây ngưng kết với
các tế bào dị thường và ác tính, vi khuẩn, virus và kháng nguyên lạ...
Hơn nữa, lectin là hợp chất phân bố rộng trong tự nhiên (có ở cả thực vật,
động vật và vi sinh vật), đặc biệt là ở động vật biển. Vì vậy, nguồn nguyên liệu để
chiết xuất lectin rất đa dạng và phong phú [63].
Cho đến nay, hàng nghìn công trình nghiên cứu về lectin đã được công bố.
Lectin có nguồn gốc động vật được phát hiện khá sớm như lectin từ huyết thanh
sam Mỹ (Limulus polyphenus, 1903) và tôm hùm Mỹ (Homarus amricanus, 1907)
[62]. Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu này được bắt đầu từ năm 1980 tại trường Đại
học Tổng hợp Hà Nội và sau đó được mở rộng.
Việt Nam có chiều dài bờ biển trên 3260 km, với một hệ sinh vật phong phú,
đây là điều kiện thuận lợi cho việc đẩy mạnh các nghiên cứu về các hợp chất thứ

cấp có nguồn gốc từ động vật biển mà đặc biệt là động vật thân mềm.


2

Do đó, việc đa dạng hóa nguồn nguyên liệu thu nhận lectin là việc cần thiết để
thực hiện các nghiên cứu sâu hơn nhằm định hướng ứng dụng trong y dược cũng
như các lĩnh vực khác.
Xuất phát từ những lí do trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Sàng lọc và xác định đặc tính sinh học của lectin từ động vật thân mềm biển
thuộc vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa.”
 Mục tiêu của đề tài
Sàng lọc nguồn lectin từ động vật thân mềm biển thuộc vùng biển Nha Trang,
Khánh Hòa và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng. Nhằm đa dạng hóa nguồn
nguyên liệu thu nhận và định hướng sử dụng lectin ứng dụng trong y dược cũng như
các lĩnh vực khác.
 Nội dung nghiên cứu
- Sàng lọc lectin từ động vật thân mềm biển thu thập được từ vùng biển Nha
Trang, Khánh Hòa bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu.
- Xác định sự ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt tính ngưng kết của dịch
chiết có chứa lectin thu nhận được từ đối tượng tuyển chọn.
- Khảo sát đặc tính sinh học của dịch chiết lectin từ đối tượng tuyển chọn:
+ Ngưng kết với hồng cầu thỏ được xử lí bằng các phương pháp khác nhau.
+ Khả năng liên kết với các loại đường và glycoprotein.
+ Hoạt tính kháng khuẩn.
 Ý nghĩa khoa học
- Thu nhận thêm thông tin khoa học về lectin động vật thân mềm biển thu thập
tại vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa.
 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Xây dựng được quy trình chiết, tách lectin thô từ động vật thân mềm và xác

định được những tính chất hóa lý đặc trưng của lectin này, từ đó có thể thu nhận
lectin ở quy mô lớn để đưa vào ứng dụng thực tế.
- Từ nguồn lectin đã được nghiên cứu đặc tính có thể đề xuất ra các hướng
ứng dụng khác nhau.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về vùng nghiên cứu
Vị trí địa lý thủy văn của Nha Trang, Khánh Hòa.
Khánh Hòa là một tỉnh ven biển miền Trung và nằm trong khu vực nhiệt đới
gió mùa, trong khoảng 11o41’53’’ – 12o52’10’’ vĩ độ Bắc và 18o40’42’’ –
109o30’00’’ kinh Đông. Độ dài bờ biển xấp xỉ 200 km. Khánh Hòa có khoảng 200
hòn đảo với tổng diện tích khoảng 600 km2. Các vịnh và đầm phá phân bố liên tục
và dọc theo đường bờ biển của Khánh Hòa: Vũng Rô – Đại Lãnh, Vũng Bến Gói –
Vịnh Vân Phong, Vịnh Bình Cang, Đầm Nha Phu và Đầm Thủy Triều – Vịnh Cam
Ranh. Hệ thống vịnh góp phần vào đặc trưng về địa mạo, trầm tích cũng như các
yếu tố thủy động lực làm cho Khánh Hòa phức tạp, đa dạng và phong phú về nguồn
lợi sinh vật [3], [12]. Khí hậu Khánh Hòa mang tính gió mùa của Nam Trung Bộ.
Mùa mưa chính bắt đầu từ tháng 9 đến tháng 11 với lượng mưa đạt từ 250 – 350
mm, từ tháng 5 đến tháng 6 là thời kỳ mưa tiểu mãn (lượng mưa đạt từ 60 – 120
mm). Mùa khô kéo dài từ tháng 3 đến tháng 8. Chế độ gió mùa đã ảnh hưởng lớn
đến chế độ dòng chảy ở đây. Gió mùa Tây-Nam từ tháng 6 đến tháng 9 và gió mùa
Đông Bắc từ tháng 11 đến tháng 3 [12].
Vịnh Nha Trang là một vịnh nhỏ nằm sâu trong nội địa, xung quanh được bao
bọc bởi các đảo vừa và nhỏ, đảo lớn nhất là đảo Hòn Tre. Vịnh Nha Trang rộng
khoảng 124 km2, giới hạn tọa độ địa lý 12o09’ – 12o22’ Bắc và 109o12 – 109o22’
Đông. Phía lục địa giới hạn bởi đường bờ, dài khoảng 28 km từ mũi Hòn Khô đến
mũi Cù Linh. Phần biển ngoài khơi giới hạn bởi đường đẳng sâu 50m và có hàng

trục đảo lớn nhỏ tạo thành vành đai che chắn bên ngoài. Ở phía nam vịnh, địa hình
đáy dốc hơn phía Bắc. Giữa vịnh có một rãnh sâu (kênh ngầm) chạy theo hướng
Tây Bắc – Đông Nam. Phần cửa vịnh phía đông có dải san hô ngầm “Grandbanc”,
án ngữ như một kè chắn sóng tự nhiên bảo vệ cho bãi tắm dọc thành phố
Nha Trang.
Vịnh Nha Trang có nhiệt độ nước trung bình 26oC (dao động 24 – 29oC), ấm
áp quanh năm. Nhiệt độ cao nhất vào 6, 7 và 8. Lạnh nhất vào tháng 9 và 1.


4

Tốc độ gió trung bình là 2,6 m/s (dao động 2 – 5 m/s), chưa vượt quá giới hạn
bất lợi cho hoạt động con người. Hệ thống thủy văn động lực mang tính hỗn hợp.
Sóng cao trung bình 0,4 m, độ cao sóng cực đại là 4,0 - 4,5m, chu kỳ trung bình 5,5
– 6,0s. Do địa hình tương đối dốc, nên sóng tác động mạnh, đặc biệt là vào thời gian
từ tháng 9 cho đến tháng 4 năm sau. Vùng cửa vịnh Nha Trang có hiện tượng nước
trồi với tốc độ trồi dưới nước sâu lên đạt giá trị 10-3cm/s. Hiện tượng này đã tạo ra
những đặc trưng hải dương học, sinh thái học hết sức đặc biệt và thú vị, có giá trị
khoa học và thực tiễn lớn [9].
1.2. Tổng quan về ngành động vật thân mềm (Mollusca)
Việt Nam là nước nằm trong vùng nhiệt đới. Phía Đông và Nam đều giáp biển,
có nhiều vũng, vịnh, cửa sông đổ ra biển, nền đáy đa dạng… tạo nên khu hệ động
vật phong phú về thành phần loài. Động vật thân mềm là một trong các loài đem lại
lợi ích kinh tế cao. Do đó việc nghiên cứu động vật Thân mềm được tiến hành sâu
rộng từ thế kỉ XX, nhất là sau khi viện Hải Dương học Nha Trang được thành lập
(năm 1922). Năm 1996, Nguyễn Chính nghiên cứu, tổng kết và giới thiệu 88 loài
Thân mềm có giá trị kinh tế ở biển Việt Nam [5].
1.2.1. Đặc điểm chung của ngành (Mollusca) [2]
Năm 1798 nhà Động vật học người Pháp Cuvier sử dụng tên Mollusca (tiếng
La-tinh là Mollis có nghĩa là mềm) lần đầu tiên để mô tả Mực Ống (squid) và Mực

Nang (cuttlefish), loài động vật vỏ thoái hóa và có vỏ trong hoặc không có vỏ. Sau
đó các nhà khoa học mới phát hiện sự liên quan thực sự giữa nhóm này với các loài
Mollusca khác như ốc, hai mảnh vỏ.
Mollusca là một nhóm có tính thích ứng rất cao. Tính thích ứng thể hiện qua
số lượng loài và sự đa dạng về môi trường sống, Mollusca là một trong ba nhóm có
tính thích ứng cao nhất trong giới động vật. Đã có hơn 160.000 loài được mô tả,
trong đó có khoảng 130.000 loài còn sống đến nay và khoảng 35.000 loài ở dạng
hóa thạch.
Mollusca phân bố ở hầu như tất cả các môi trường sống. Ở biển chúng phân
bố từ vực sâu của đại dương đến vùng triều. Chúng có thể sống trong nước ngọt


5

cũng như trên cạn. Vì vậy, trong suốt quá trình tiến hóa chúng trở nên thích ứng và
sống tốt trong mọi sinh cảnh. Ngành Mollusca được chia làm 2 phân ngành gồm 7
lớp với mức độ quan trọng khác nhau. Lớp quan trọng nhất trong các loài Động vật
thân mềm là chân bụng, bao gồm hơn 80% loài Động vật thân mềm còn sống đến
nay. Lớp chân đầu hiện nay vẫn còn nhiều loài sống sót, những bằng chứng hóa
thạch cho thấy trước đây chúng phong phú hơn hiện nay và có lẽ chúng là nhóm
động vật chiếm ưu thế ở kỷ Ordovic (500 triệu năm trước).
Đặc điểm chung của ngành Mollusca
- Cơ thể đối xứng hai bên (trừ Gastropoda), không phân đốt và thường có đầu
phát triển.
- Mặt lưng của cơ thể có cơ chân chủ yếu dùng để điều khiển chân khi di
chuyển.
- Mặt bụng của cơ thể có màng áo khép kín tạo thành xoang màng áo, biến đổi
thành mang hoặc phổi và tiết ra vỏ (trừ một số loài không có vỏ).
- Trên bề mặt của biểu mô có tiêm mao, tuyến tiết chất nhầy và cơ quan cảm
giác.

- Xoang cơ thể thường rất nhỏ là vùng bao quanh tim (xoang bao tim).
- Hệ thống tiêu hóa phức tạp, thường có cơ quan nghiền thức ăn là lưỡi sừng
ngoại trừ Bivalvia (không có lưỡi sừng).
- Hệ thống tuần hoàn hở, gồm tim, mạch máu và xoang máu.
- Trao đổi khí xảy ra ở mang, phổi, màng áo hoặc bề mặt cơ thể.
- Các cơ quan cảm giác gồm: xúc giác, khứu giác, vị giác, thính giác và thị giác
(một số loài). Mắt của Cephalopoda phát triển.
1.2.2. Phân loại động vật thân mềm [2]
Phân loại ĐVTM chủ yếu dựa vào sơ đồ cấu tạo cơ thể, sự thích ứng với các
lối sống khác nhau. ĐVTM được chia làm 2 phân ngành, 7 lớp.
 Phân ngành song kinh (Amphyneura): gồm 2 lớp
- Lớp song kinh có vỏ (Loricata)
- Lớp song kinh không vỏ (Aplacophora)


6

Đặc điểm phân ngành Song kinh
- Sống bám, gần bờ
- Đầu và nội quan nhập thành 1 khối, khác khối chân
- Tính chất nguyên thuỷ: Nhiều đặc điểm phân đốt (8 mảnh vỏ lưng), thần kinh
dạng dây
- Phân tính, phát triển qua giai đoạn ấu trùng con quay
- Trên 1100 loài đã biết, gồm 2 lớp: Loricata và Aplacophora.

Hình 1.1. Cấu tạo cơ thể song kinh có vỏ [2]
Cơ thể song kinh có vỏ nhìn từ mặt bụng (A) và cấu tạo trong (B – Nhìn bên; C –
Nhìn từ lưng sau khi gỡ tấm vỏ và mô bì vạt áo; D – Hệ thần kinh nhìn từ lưng, từ
Pechenik). 1. Đầu; 2. Miệng; 3. Chân; 4,5. Tuyến tiêu hóa; 6. Ruột; 7. Ống bài tiết;

7

8. Lỗ sinh dục; 9. Lỗ thận; 10. Rãnh mang; 11. Hậu môn; 12. Tâm thất; 13. Tâm
nhĩ; 14. Tấm vỏ; 15. Vạt áo; 16. Tuyến sinh dục; 17. Dạ dày; 18. Mạch lưng; 19.
Lưỡi bào; 20. Vòng não; 21. Gờ vạt áo; 22. Khoang áo; 23. Mang; 24. Tuyến nước
bọt; 25. Khoang miệng; 26. Cơ xiên. 27. Thận; 28. Khoang bao tim; 29. Ống dẫn
trứng; 30. Cơ co lưng; 31. Vách; 32. Hạch miệng; 33. Hạch dưới lưỡi bào; 34. Dây
thần kinh bên – tạng; 35. Dây thần kinh chân.

Hình 1.2. Cấu tạo cơ thể song kinh không vỏ [2]
Hình thái ngoài và cấu tạo trong của song kinh không vỏ
(A,B từ Dogel; C,D theo Pruvot; E,G từ Pechenik)
A - Chetoderma nitidulum; B - Neomenia carinata; C - Trưởng thành;
D. 2 giai đoạn ấu trùng; E,G. Sơ đồ phần phía trước cơ thể Limifossor
talpoideus.
1. Mang; 2. Miệng; 3. Rãnh bụng; 4. Gai; 5. Tấm vỏ; 6. Tiền đình; 7. Tuyến;
8. Não; 9. Dây thần kinh bên; 10. Ruột giữa; 11. Dây thần kinh chân; 12. Lưỡi
bào; 13. Hố chân; 14. Tuyến nước bọt; 15. Tầng cuticun; 16. Dạ dày; 17. Mạch
lưng; 18. Tuyến sinh dục; 19. Tuyến tiêu hóa; 20. Sụn nâng lưỡi; 21. Thực
quản; 22. Giáp miệng.


8

 Phân ngành vỏ liền (Conchifera)
- Cơ thể được bọc trong 1 vỏ liền hoặc phân 2 mảnh
- Thân nhô cao về phía lưng; thần kinh dạng hạch phân tán.
- 5 lớp: Vỏ 1 tấm; Chân bụng; Chân xẻng; Chân rìu (Vỏ 2 mảnh) và Chân đầu.
Lớp vỏ một tấm (Monoplacophora)

Trước 1952 lớp này chỉ biết dưới dạng hóa thạch. Năm 1952 gặp đại diện đang
sống đầu tiên Neopilina galatheae ở ven Thái Bình Dương gần bờ Mehico, chỗ sâu
5000m. Từ đó đến nay đã phát hiện được 19 loài đang sống, tất cả đều ở đáy biển
sâu trên 2000m. Trong số các loài đang sống, lớn nhất là Neopilina galatheae, dài
37mm và bé nhất là Micropilina arntzi dài dưới 1mm.
Trưởng thành có hình vỏ nón, có vết bám của cơ sắp xếp phân đốt ở mặt
trong. Thân ẩn dưới vỏ. Chân hình đĩa. Đầu ở trước chân không phân rõ với phần
thân. Hai bên chân là rãnh áo có 3, 5 hoặc 6 đôi mang lá đối. Tận cùng có nhú hậu
môn.
Cạnh lỗ miệng có 2 tua miệng hình thùy ở hai bên. Không có mắt. Giữa tua
miệng và bờ trước của chân có cơ quan chia nhánh có lẽ giữ nhiệm vụ khứu giác.

Hình 1.3. Đại diện lớp vỏ một tấm [2]
Hình dạng ngoài và cấu tạo trong của Neopilina galatheae
(theo Lemche và Vingstrand)


9

Lớp chân xẻng (Scaphopoda)
Có khoảng 300 loài, sống chui rúc trong bùn biển. Cơ thể đối xứng hai bên. Vỏ
dạng ống chứa thân.

Hình 1.4. Cấu tạo cơ thể lớp chân xẻng [2]
Sơ đồ cắt dọc cơ thể (A) và các giai đoạn phát triển của Dentalium (B-E)
(A từ Dogel; B-E từ Barnes).
1. Lỗ đỉnh vỏ và lỗ khoang áo; 2. Tuyến sinh dục; 3. Gan; 4. Thận; 5. Bao tim; 6.
Hạch não; 7. Vỏ; 8. Vạt áo; 9. Tua bắt mồi; 10. Miệng; 11. Chân; 12. Hạch chân;
13. Bình nang; 14. Khoang áo; 15. Hậu môn; 16. Dạ dày; 17. Màng bơi; 18. Vỏ và
vạt áo.

10

Lớp chân bụng (Gastropoda)
- Hầu hết mất đối xứng; đầu có xúc tu cảm giác, mắt
- Có 1 mảnh vỏ xoắn hình chóp
- Thân được phủ lớp áo – Xoang áo thông ngoài & chứa các hệ cơ quan - Phức hệ
cơ quan áo.
- Hầu có lưỡi gai; thần kinh dạng hạch phân tán (các đôi: Não-Chân-Mang-ÁoPhủ tạng).
- Đa số đơn tính, thụ tinh trong. Nhóm có phổi phát triển trực tiếp, họ ốc vặn đẻ con.
- Đã biết 90.000 loài (có 15.000 loài hoá thạch), chia 3 phân lớp: mang trước,
mang sau, có phổi.
- Đại diện:
- Prosobranchia: Bào ngư (Haliotis sp.), ốc xà cừ, ốc nước lợ, ốc nhồi (Pila
polita), ốc rạ (Cypangopaludina lecythoides), ốc vặn (Angulyagra polyjonata)…
- Pulmonata: Ốc tai (Lymnaea auricularia; L. viridis), ốc đĩa (Gyraulus chinensis,
Polypylis hemisphoerula), ốc sên (Achatina fulica)…

A

B
Hình 1.5. Đại diện lớp chân bụng
A – Ốc nón; B - Ốc bàn tay quéo


11

Lớp 2 mảnh vỏ (Bivalvia)
- Còn đối xứng 2 bên

- Đầu tiêu giảm, thân dẹp bên, chân phát triển
- Vỏ 2 mảnh - tiết xà cừ (ngọc trai), đính mặt lưng (dây chằng và khớp)
- Mang: Dãy, sợi, phiến, vách
- Phân tính
- Đại diện: Sò (Acra granosa), hầu sông (Ostrea vivularis); hến (Corbicula sp.),
ngao (Meretrix sp.), trai sông (Sinanodonta elliptica), trai ngọc (Pincdata
martensi); hà biển (Teredo mani).

Hình 1.6. Đại diện lớp hai mảnh vỏ


12

Lớp Chân đầu (Cephalopoda)
Có khoảng 6.000 loài hiện sống và 7.000 loài hoá thạch. Phần lớn chân đầu
bơi giỏi, sống ở biển. Cơ thể có đối xứng hai bên. Về đặc điểm cấu tạo có nhiều
biến đổi so với sơ đồ cấu trúc chung của thân mềm như chân biến đổi thành cơ quan
bắt mồi và phễu thoát nước.
Vỏ chuyển vào trong cơ thể hay tiêu giảm. Nhiều loài chân đầu là thức ăn
ngon và phổ biến ở nhiều nước.
- Thích ứng điều kiện vận động tích cực, biến đổi
- Chân có tua ở phần đầu (để bắt mồi), lõm tạo phễu
- Vỏ tiêu giảm (mực), mất hẳn (Duốc bể, Bạch tuộc), còn ở ốc Anh Vũ.
- Não có bao sụn. Giác quan phát triển (mắt)
- Tuần hoàn kín. Tim: 1 tâm thất, 2 thất nhĩ
- Phân tính. Thụ tinh trong xoang áo. Phát triển thẳng.
- Đại diện: Ốc Anh Vũ (Nautlus pompilus); mực thẻ (Logigo edulis), mực ống
(L. beka), mực nang (Sepia sabaculenta); bạch tuộc (Octopus vulgaris)

A

B

Hình 1.7. Đại diện lớp chân đầu [93]
A - Ốc Anh Vũ; B – Mực


13

1.2.3. Ốc nón đỏ Tectus conus (Gmelin, 1791) [45]
Là loài có hoạt tính sinh học cao được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.
Trong đề tài này, đây là loài cho hoạt tính lectin cao nhất.
Ốc nón đỏ Tectus conus còn có tên gọi khác Trochus conus (Gmelin, 1791)
Tectus conus là một loài ốc biển thuộc ngành thân mềm sống ở rạn san hô với
phân bố rộng ở vùng Ấn Độ - Thái Bình Dương, từ phía bắc đến phía nam Nhật Bản
và phía nam Indonesia.

Hình 1.8. Ốc nón đỏ Tectus conus [93]
Phân loại khoa học:
Giới (Regnum): Động vật
Ngành (Phylum): Động vật thân mềm
Lớp (Class): Chân bụng
Họ (Familia): Turbinidae
Chi (Genus): Tectus
Loài (Species): T. conus


14

Đặc điểm:

Loài ốc này có vỏ hình chóp, có một lớp xà cừ dày, trên vòng xoắn có vòng
nhô cao, từ vòng xoắn thứ hai đến đỉnh vỏ, gờ này có dạng hình ống có lỗ ở đầu. Ở
đế vỏ có những đường xoắn ốc xếp đều nhau từ trong miệng ốc chạy ra đến mép vỏ.
Kích thước: chiều dài vỏ tối đa 8cm, phổ biến là 6cm.
Môi trường sống: gần rạn san hô, từ vùng triều thấp đến độ sâu 5m.
Là loài ốc ăn được, vỏ xà cừ được sử dụng làm vật liệu trong sơn, cúc áo, mỹ
phẩm, đồ gỗ và một số ngành công nghiệp khác. Chúng đã được người dân các
nước ở Úc, Đông Nam Á và vùng Thái Bình Dương khai thác cho mục đích thương
mại từ lâu. Ở Khánh Hòa, sự hiện diện của loài ốc này rất phong phú.
1.3. Tổng quan về lectin
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu lectin
Cho đến những năm cuối thế kỷ 19, bắt đầu có sự tích lũy những bằng chứng
đầu tiên về sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu. Tuy
nhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào việc làm sáng
tỏ nguyên lý gây độc của các loại hạt có chứa thành phần gây độc này nhằm sử
dụng cho các mục đích y tế. Năm 1884 Warden và Waddel đã giải thích nguyên lý
gây độc của các hạt cam thảo dây Aprus precatoriu [91], đến năm 1887 Dixson đã
xác định được một dịch lỏng có độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus
precatorius là một protein [55]. Những protein như vậy được đề cập dưới tên gọi là
hemagglutinin hay agglutinin thực vật, vì ban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết
từ thực vật. Các nhà khoa học sau này đều cho rằng những mô tả đầu tiên và đầy đủ
nhất về hemagglutinin là từ luận văn tiến sĩ của Peter Hermann Stillmark thực hiện
tại trường Dorpat (nay là trường Tartu, Estonia) vào năm 1888. Chất hemagglutinin
được Stillmark tách chiết từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis và được đặt tên
là ricin, một độc tố mà sau đó được xác định là có bản chất protein [71].
Kể từ đó quá trình nghiên cứu lectin được chia làm 3 giai đoạn chính:
Giai đoạn đầu từ cuối thế kỷ XIX đến nửa đầu thế kỷ XX: đây là giai đoạn
mang tính điều tra cơ bản về lectin trong sinh giới. Ngoài công trình nghiên cứu của

15

Stillmark vào năm 1888 thì cũng tại trường đại học Tartu, vào năm 1891, H. Hellin
tìm thấy một hemagglutinin độc ở cây đậu Abrus precatorius, gọi là abrin. Sự phát
hiện ra ricin, crotin, abrin đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Đáng chú ý
là nghiên cứu của Paul Erlich ở Viện nghiên cứu hoàng gia Experieinental Therapy,
ông đã sử dụng chúng làm kháng nguyên mô hình cho các nghiên cứu miễn dịch, từ
đó ông xây dựng một số nguyên lý cơ bản về miễn dịch học vào những năm 1890 [63].
Cùng với các hemagglutinin thực vật, các hemagglutinin động vật cũng dần
được khám phá. Những công trình nghiên cứu lectin động vật đầu tiên chủ yếu
trong ngành động vật không xương sống. Năm 1898, Edfstand cho rằng các tế bào
mô của một số loài động vật không xương sống có chứa các chất có hoạt tính tương
tự như ricin, gây ngưng kết hồng cầu của một số loài động vật như lợn, bò.
Nouguchi phát hiện chất gây ngưng kết ở sam Mỹ (Limulus polyphenus, 1903) và
tôm hùm Mỹ (Homarus amricanus, 1907) [62].
Trong suốt những năm sau đó, các hợp chất có tính chất đặc biệt có khả năng
gây ngưng kết tế bào hồng cầu người và một số loài động vật được phát hiện ngày
một nhiều trong giới sinh vật từ virus đến con người.
Trong những năm 1950 đến năm 1970: năm 1954, Boyd và Shapleigh đã sử
dụng thuật ngữ “Lectin” (thuật ngữ Lectin bắt nguồn từ chữ “Lectus”, dạng quá khứ
của động từ “Legre”, trong tiếng Latin có nghĩa là “lựa chọn”) để chỉ nhóm các
“chất gây ngưng kết” thực vật có khả năng ngưng kết đặc hiệu nhóm máu [48], đây
có thể được coi là khái niệm đầu tiên về lectin. Trong hai thập kỷ này, bên cạnh các
công trình mang tính điều tra về sự hiện diện của lectin trong sinh giới, phần lớn các
nhà khoa học đã tập trung vào việc tinh chế lectin để nghiên cứu cấu trúc và ảnh
hưởng của các yếu tố môi trường đến hoạt tính của lectin, trên cơ sở đó tìm cách sử
dụng lectin nhằm phục vụ cho đời sống con người.
Từ năm 1970 đến nay: giai đoạn này, tiến độ nghiên cứu lectin được đẩy
nhanh. Nhiều kết quả thú vị đã được công bố như việc tìm thấy lectin ở nấm nhầy
và ở cơ thể người [71].

Năm 1980, Goldstein và các cộng sự đã đưa ra định nghĩa “Lectin là những
protein hoặc glycoprotein có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu” [62]. Khái


16

niệm này đồng nhất với định nghĩa về Lectin mà Houston và Dooley đã đưa ra năm
1982 : “Lectin là protein tương tác đặc hiệu đường, đặc tính cơ bản của nó là khả
năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu” [71].
Năm 1991, Balzarini J. đã phát hiện ra lectin của một số loài thuộc họ Thủy
tiên (Amaryllidaceae) và họ Lan (Orchidaceae) có tác dụng kìm hãm sự phát triển
của virus HIV [46].
Năm 1995, Peuman và Van Dame đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu trúc
liên quan đến tính chất của lectin: “Lectin là protein mà cấu trúc phân tử có chứa ít
nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường” [82].
Dựa vào cấu trúc phân tử và biểu hiện hoạt tính sinh học, Peuman và
cộng sự đã chia lectin thành 3 loại:
- Merolectin có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và chỉ có một trung tâm
liên kết đường, do đó không có đặc tính ngưng kết tế bào và không gây kết tủa các
hợp chất liên kết đường. Thuộc về loại này là một số protein của các cây họ Lan
(Orchidaceae).
- Hololectin có chứa ít nhất hai trung tâm liên kết với đường, do đó có khả
năng gây ngưng kết tế bào và gây kết tủa, do tương tác với nhiều hợp chất cộng
đường. Đó chính là các lectin quen thuộc đã được nghiên cứu nhiều nhất và dễ được
phát hiện bởi khả năng gây ngưng kết tế bào của chúng và thường được gọi là
hemagglutinin.
- Chimerolectin là những phân tử trong đó có ít nhất một vị trí liên kết với
đường và có một vùng chức năng sinh học khác (có thể là chức năng xúc tác sinh
học). Thuộc về loại này là protein kìm hãm riboxom type 2 (RIP, Type 2) có trong
hạt Thầu dầu (Ricinus communis

L.)

hoặc

hạt cây Cam thảo dây

(Abrus precatorius L.).
Song song với các hướng nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học vẫn đi sâu
vào tìm hiểu cấu trúc cũng như tính chất của các lectin để sử dụng chúng một cách
thiết thực và có hiệu quả hơn. Hiện nay các nhà khoa học cũng đã biết khá nhiều về
bản chất của lectin. Khoa học hiện đại đã đưa ra một định nghĩa mới nhất về lectin
như sau: “Lectin là glycoprotein hoặc protein không có nguồn gốc miễn dịch, có