giải trình tự adn

1.1.Khái Niệm:
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là
phương pháp xác định vị trí sắp xếp
các nucleotid trong phân tử DNA.


1.2 Ý nghĩa

Giúp xác định vị trí của gen trên
NST, cho phép kết luận về bản chất
của gen. Có ý nghĩa trong việc tìm
hiểu những chức năng cấu trúc của
gen cũng như các dòng gen.


2.2 Phương pháp Sanger

Nguyên lý: Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ
sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động
của enzyme DNA Polymerase. Với việc sử
dụng thêm các dideoxynucleotid (ddNTP) và
các deoxynucleotid thông thường.


2.2 Phương pháp Sanger

Việc tổng hợp mạch bổ sung sẽ bị dừng lại do
ddNTP không có khả năng hình thành liên kết
phosphodieste .

2.2 Phương pháp Sanger
Vật liệu:
- Primer( 20 nucleotides)
- DNA polymerase
- DNA template
- dNTP và ddNTP
- Vật liệu đánh dấu
- Hệ thống điện di

Các bước tiến hành
Bước 1: Biến tính DNA khuôn
Điện di trên gel polyacrylamid để thu các mạch
đơn DNA, dùng DNA này để tiến hành các
bước xử lý tiếp theo.


2.1 Phương pháp Sanger

Bước 2: Chuẩn bị cho phản ứng tổng hợp
DNA
Lấy 4 ống Eppendorf, cho các thành phần
cần thiết vào mỗi ống : mạch khuôn, mồi có
đánh dấu phóng xạ P32, enzyme DNA
polymerase, dNTP, dung dịch đệm thích
hợp và thêm vào mỗi ống tương ứng một
loại ddNTP nhất định.


2.2 Phương pháp Sanger

2.2 Phương pháp Sanger

Bước 3 : Thực hiện các phản ứng tổng hợp
DNA
Bước 4: Điện di kết quả, so sánh kết quả
các chuỗi mạch đơn DNA được tổng hợp
để xác định trình tự của mạch khuôn.


2.2 Phương pháp Sanger

ddTTP