Nghiên cứu nhân giống Keo lai BV32 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ CHÍNH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG KEO LAI BV32 BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2011 - 2015

Thái Nguyên, năm 2015

ii

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ CHÍNH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG KEO LAI BV32 BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: K43 - CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2011 - 2015

Giảng viên hƣớng dẫn : 1. ThS. Dƣơng Mạnh Cƣờng
2. ThS. Đào Duy Hƣng

Thái Nguyên, năm 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Thực tập tốt nghiệp là bước rất quan trọng trong quá trình học tập của
mỗi sinh viên nhằm hệ thống lại toàn bộ kiến thức đã học, vân dụng vào thực
tiễn và làm quen với nghiên cứu khoa học. Qua đó, sinh viên ra trường sẽ
hoàn thiện về kiến thức lý luận và phương pháp nghiên cứu, năng lực làm
việc nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn của công việc sau này.
Được sự giúp đỡ của Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm và Ban
chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, em đã tiến
hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân giống Keo lai BV32 bằng
phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào”.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường Đại học Nông
Lâm, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học, Lãnh đạo viện Khoa học sự
sống- Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các chuyên viên bộ môn Công nghệ
tế bào (Viện khoa học sự sống), các thầy cô giáo trong bộ môn CNSH (khoa
Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm). Đặc biệt, em xin trân trọng
cảm ơn hai thầy giáo ThS. Dương Mạnh Cường và Th.S Đào Duy Hưng đã
dành nhiều thời gian quý báu, tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực
tập và hoàn thành luận văn này.Em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè
đã giúp đỡ về mọi mặt để em hoàn thành khóa luận này.
Do thời gian cò hạn và trình độ chuyên môn còn nhiều hạn chế, bản

thân mới bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, nên đề tài
không tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong quý thầy cô giáo và bạn bè
quan tâm góp ý để đề tài được hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 30 tháng 05 năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thị Chính


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân nhanh chồi
cây Keo lai ...........................................................................................................35
Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhân nhanh
chồi cây Keo lai ...................................................................................................38
Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến
hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai ..............................................................41
Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến
hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai ..............................................................44
Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo
lai ..........................................................................................................................47
Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi cây
Keo lai ..................................................................................................................49
Bảng 4.7.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Keo lai
...............................................................................................................................51


iii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai (sau
30 ngày)................................................................................................................37
Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai .40
Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân
nhanh chồi cây Keo lai .......................................................................................43
Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả nhân
nhanh chồi cây Keo lai .......................................................................................45
Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo lai ...................48
Biểu đồ 4.6. Ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo lai .................50


iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 4.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Keo lai BV32 .....36
Hình 4.2 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh ...................................39
Hình 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến
hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai ..............................................................42
Hình 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến
hiệu quả nhân nhanh chồi cây Keo lai ..............................................................45
Hình 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo
lai ..........................................................................................................................48
Hình 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi cây
Keo lai ..................................................................................................................50
Hình 4.7:Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Keo lai
...............................................................................................................................52


v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BAP

: Benzylamino purine

IBA

: Indol butyric acid

NAA

: Naphthyl acetic acid

MS

: Murashige & Skoog Medium

MS*

: MS cải tiến (có sự thay đổi hàm lượng một số khoáng
chất và vitamin)

CT

: Công thức

ĐC

: Đối chứng

HSNC :Hệ số nhân chồi
TB

: Trung bình

W/w

: Khối lượng/thể tích

V/v

: Thể tích/thể tích


vi

MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 3
1.3 Mục đích nghiên cứu .............................................................................................. 3
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 5
2.1. Nguồn gốc của cây Keo lai giống BV32 .............................................................. 5
2.1.1. Lai giống nhân tạo ............................................................................................... 5
2.1.2. Dòng Keo lai BV32 ............................................................................................. 5
2.2. Tình hình nghiên cứu về cây Keo lai trong và ngoài nước ................................. 7
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. .................................................................... 7

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước........................................................................ 8
2.3. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................................ 9
2.4. Cơ sở khoa học của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật ................... 9
2.4.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật .................................................................... 9
2.4.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật ........................................10
2.5. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................................11
2.5.1. Giai đoạn chuẩn bị .............................................................................................11
2.5.2. Giai đoạn khử trùng mẫu, cấy khởi động .......................................................11
2.5.3. Giai đoạn tạo chồi và nhân nhanh chồi............................................................12
2.5.4. Giai đoạn tạo cây mô hoàn chỉnh .....................................................................12
2.5.5. Giai đoạn chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm .........................................12
2.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả nuôi cấy mô – tế bào ...................................13
2.6.1. Điều kiện vô trùng .............................................................................................13
2.6.2. Vật liệu nuôi cấy ................................................................................................14


vii

2.6.3. Môi trường nuôi cấy ..........................................................................................15
2.7. Những vấn đề trong nhân giống in vitro.............................................................26
2.7.1. Tính bất định về mặt di truyền .........................................................................26
2.7.2.Sự nhiễm mẫu .....................................................................................................27
2.7.3. Sự hoá thuỷ tinh thể ...........................................................................................27
2.7.4. Kiểu gen..............................................................................................................28
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....29
3.1. Đối tượng (vật liệu) ..............................................................................................29
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .......................................................................29
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu .........................................................................................29
3.2.2. Thời gian nghiên cứu.........................................................................................29
3.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................29

3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng
(BAP, Kinetin, IBA, IAA) đến khả năng nhân nhanh chồi cây Keo lai ........29
3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng
(NAA, IBA) đến khả năng ra rễ của cây Keo lai .............................................29
3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến tỷ lệ sống của
cây Keo lai ...........................................................................................................30
3.4. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................30
3.4.1. Điều kiện thí nghiệm .........................................................................................30
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số
chất điều tiết sinh trưởng (BAP, Kinetin, IBA, IAA) đến khả năng nhân
nhanh chồi cây Keo lai .......................................................................................30
3.4.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số
chất điều tiết sinh trưởng (NAA, IBA) đến khả năng ra rễ của cây Keo lai..32
3.4.4. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá
thể đến tỷ lệ sống của cây Keo lai .....................................................................33


viii

3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu ...............................................................33
PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................35
4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến hiệu
quả nhân nhanh chồi cây Keo lai. ......................................................................35
4.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây
Keo lai ..................................................................................................................35
4.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhân nhanh chồi
cây Keo lai (Acacia hybrids)..............................................................................38
4.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu
quả nhân nhanh chồi cây Keo lai .......................................................................40
4.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu

quả nhân nhanh chồi cây Keo lai .......................................................................43
4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến hiệu
quả ra rễ chồi cây Keo lai. ..................................................................................46
4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo lai
...............................................................................................................................46
4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi cây Keo
lai ..........................................................................................................................49
4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Keo lai nuôi cấy mô
ngoài vườn ươm. .................................................................................................51
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................53
5.1. Kết luận ..................................................................................................................53
5.2. Kiến nghị ...............................................................................................................53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 1
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 4


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Keo lai BV32 có tên khoa học là Acacia hybrids là tên gọi của giống
lai tự nhiên giữa Keo tai tượng (Acacia mangium) và Keo lá tràm (Acacia
auriculiformis) (Lê Đình Khả, 1999). Đây là giống có nhiều đặc điểm hình
thái trung gian giữa bố và mẹ, đồng thời ưu thế lai rõ rệt về sinh trưởng
nhanh, có hiệu suất bột giấy, độ bền cơ học và độ trắng của giấy cao hơn hẳn
các loài bố mẹ (Lê Đình Khả và cs, 1997), có khả năng cố định đạm khí
quyển trong đất nhờ các nốt sần ở hệ rễ, bảo vệ độ phì nhiêu cho đất (Lê Đình
Khả, 1999). Keo lai BV32 có ưu thế là khó gây cháy rừng vì thân Keo lai có

nước nhiều, dưới rừng Keo ít có thực bì, cây Keo lại ít lá. Chống chịu bệnh
tốt, chất lượng gỗ tốt, ít cành nhánh. Năng suất đạt 15-20 m3/ha/năm ở lập địa
xấu, 20-25 m3/ha/năm ở lập địa trung bình, 30-35 m3/ha/năm ở lập địa tốt.
Cây Keo lai đã từng bước khẳng định giá trị kinh tế: Sau chu kỳ kinh
doanh 06 năm khu vực xã Đăk Rồ cho lãi cao nhất 32 124 063 đồng/ha, tiếp
đến là Cư K’Roá lãi 26 815 388 đồng/ha, thấp nhất là Quảng Khê lãi 14 830
980đồng/ha. Hiệu quả xã hội: Một chu kỳ trồng rừng Keo lai 6 năm ở Cư
K’Roá tạo ra 303 công/ha/chu kỳ; Đăk Rồ là 275 công/ha/chu kỳ; Quảng Khê
là 356 công/ha/chu kỳ (Lê Đình Khả và cs, 1997).
Keo lai tạo nên đột phá trong cơ cấu sản xuất lâm nghiệp, cơ cấu cây
trồng lâm nghiệp, không chỉ rút ngắn chu kỳ kinh doanh, trồng rừng, mang lại
hiệu quả kinh tế bước đầu khá cao mà còn góp phần cân bằng, làm phong phú
thêm nguồn tài nguyên rừng đang bị suy giảm (Lê Đình Khả, 1999).


2

Với đă ̣c tin
́ h có thể số ng, sinh trưởng và phát triể n trên đấ t trố ng đồ i núi
trọc, đấ t thoái hoá , cằ n cỗi và nghèo dinh dưỡng nên Keo là một trong các
nhóm loài đư ợc chọn làm cây trồng rừng chính ở Việt Nam. Nhóm loài cây
này được trồng ở hầu khắp các tỉnh trung du, miền núi và đóng vai trò quan
trọng trong việc phát triển kinh tế xã hội ở Việt Nam, đặc biệt là đối với đời
sống của người dân các tỉnh miền núi. Hơn nữa, đây cũng là loài cây cho gỗ
tốt, có giá trị kinh tế cao, có thị trường về nguyên liệu giấy, dăm và đồ gỗ
xuất khẩu (Lê Đình Khả, 1999).
Ở Việt Nam, năng suất rừng trồng quảng canh chỉ đạt 5-7 m3/ha/năm,
thì năng suất trồng rừng bằng dòng vô tính các giống được cải thiện, với Keo
lai có thể đạt 20-30 m3/ha/năm tùy từng lập địa (Lê Đình Khả và cs, 2003).
Trong chương trình trồng mới 5 triệu ha rừng ở nước ta, có đến 2 triệu ha là

cây lâm nghiệp, trong đó 70% là các loài cây mọc nhanh bao gồm các loài
Keo, Bạch đàn,... Nên nhu cầu về giống, đặc biệt là giống có năng suất và
chất lượng cao cho các đối tượng này là rất lớn.
Ứng dụng Công nghệ sinh học vào lai giống là một hướng đi mới, giảm
chi phí cây giống lên cả trăm tỉ đồng mỗi năm nhờ triển khai nhân giống theo
phương pháp invitro. Cùng với lợi ích cụ thể về kinh tế, kỹ thuật sản xuất
giống invitro còn là kỹ thuật ưu việt trong việc tạo ra cây giống sạch bệnh, có
sức kháng bệnh rất cao, có thể sản xuất cây giống rất nhanh với quy mô lớn
một cách dễ dàng... Khả năng tái tạo, phục hồi các nguồn gen đã biến mất
trong tự nhiên, hạn chế khả năng mất nguồn gen, nhất là các nguồn gen có
nguy cơ xói mòn cao, các loài có nguy cơ bị tuyệt chủng (Đoàn Thị Mai và
cs, 2011).


3

Do đó, việc xác định và tối ưu hoá phương pháp nhân chồi, ra rễ và
điều kiện nuôi cấy,... Cho các giống mới được chọn tạo bằng công nghệ nuôi
cấy mô tế bào là hướng đi thích hợp nhất, cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn
trong sản xuất lâm nghiệp. Vì vậy, chúng tôi thực hiện làm đề tài: “Nghiên
cứu nhân giống Keo lai BV32 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng nhân nhanh, ra rễ và giá thể phù hợp với cây Keo
lai BV32 được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.
1.3 Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả
năng nhân nhanh chồi cây Keo lai.
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả
năng ra rễ chồi cây Keo lai.
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến tỷ lệ sống của cây Keo lai.

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa khoa học:
+ Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại kiến thức đã học.
+ Giúp sinh viên rèn luyện kỹ năng và học tập nghiên cứu khoa học.
+ Biết được các phương pháp nghiên cứu một số vấn đề khoa học, xử lý
và phân tích số liệu, cách trình bày một bài báo khoa học.
+ Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm nâng cao hệ số nhân
và chất lượng cây Keo mới.
- Ý nghĩa thực tiễn:


4

Nâng cao hiệu quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào,
làm giảm chi phí giá thành, tăng năng suất, chất lượng và đáp ứng nhu cầu
cấp giống Keo mới ra thị trường


5

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nguồn gốc của cây Keo lai giống BV32
2.1.1. Lai giống nhân tạo
Lai giống (tạp giao) là phương pháp nhằm kết hợp nhiều đặc trưng, đặc
tính tốt của các giống cây trồng (Nguyễn Đức Lương và cs, 1999).
Lai giống nhân tạo bằng thụ phấn có kiểm soát là phương thức cho
phép kết hợp các tính trạng mong muốn trong một giống lai, làm cơ sở chọn
giống trong các giai đoạn kế tiếp.
Từ phương thức chọn lọc cây trội làm bố mẹ, tạo ra các tổ hợp lai cần

thiết, khảo nghiệm đánh giá và chọn lọc cây lai đời F1, và các thế hệ tiếp theo
là cách tốt nhất để tạo ra các giống lai mong muốn.
2.1.2. Dòng Keo lai BV32
Keo lai BV32 có tên khoa học là Acacia hybrids là tên gọi của giống lai
tự nhiên giữa Keo tai tượng (Acacia mangium) và Keo lá tràm (Acacia
auriculiformis) (Lê Đình Khả, 2006), có nhiều đặc điểm hình thái trung gian
giữa bố và mẹ, sinh trưởng nhanh, có hiệu suất bột giấy, độ bền cơ học và độ
trắng của giấy cao (Lê Đình Khả và cs, 1997), có khả năng cố định đạm khí quyển
trong đất, bảo vệ độ phì nhiêu cho đất (Lê Đình Khả, 2006).
 Thông tin về dòng Keo lai BV32:
- Tên thường gọi: BV32
- Tên loài: Keo lai nhân tạo
- Tên la tinh: Acacia mangium × Acacia auriculiformis
- Thuộc họ: Đậu (Fabacae)
- Thuộc phân họ: Trinh nữ (Mimosoideae)
- Lý lịch giống mới: Giống quốc gia


6

- Xuất xứ: Ba Vì- Hà Tây
- Tên chủ sở hữu: Lê Đình Khả, Nguyễn Đình Hải, Hà Duy Thịnh, và
cán bộ công nhân viên giống cây rừng.
- Vùng trồng: Tây Bắc, Đông Bắc, Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Tây
Nguyên, Đông Nam Bộ.
 So sánh về thể tích thân cây trung bình sau 5 năm trồng:
- Keo tai tượng: 103 dm3/ cây
- Keo lá tràm: 54 dm3/cây
- Keo lai dòng BV32: 179,2 dm3/cây
 Công dụng:

- Gỗ nhỏ dung làm nguyên liệu giấy, ván dăm, trụ mỏ, ván sợi úp.
- Gỗ lớn làm ván dán, ván ép…
 Đặc điểm hình thái:
- Thân, tán, lá: Cây gỗ cao đến 25-30 m, đường kính 60-80 cm. Thân
gỗ thẳng, tròn đều, tán phát triển cân đối, màu vàng trắng có vân, có giác lõi
phân biệt. Lá có 3-4 gân mặt chính, hình mác.
- Hoa, quả, hạt: Hoa lưỡng tính mọc cụm, màu trắng hơi vàng, mọc ở
nách lá.
 Đặc điểm sinh lý, sinh thái:
- Tốc độ sinh trưởng: Nhanh
- Phù hợp với: Cây ưa sáng, chủ yếu trồng trên đất xám, đất feralit.
Chịu được khô hạn, nhiệt độ trung bình. Độ cao khoảng từ 500-800 m so với
mực nước biển, độ dốc thấp.
- Cây có khả năng cải tạo đất, chống xói mòn, chống cháy rừng. Gỗ
thẳng, có tác dụng nhiều mặt.


7

2.2. Tình hình nghiên cứu về cây Keo lai trong và ngoài nƣớc
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.
Những năm gần đây, việc sử dụng tiến bộ kỹ thuật mới về công nghệ tế
bào thực vật trong công tác chọn giống cây rừng đã được thực hiện tại nhiều
nước trên thế giới như: Thụy Điển, Braxin, Úc, Trung Quốc,...
Nuôi cấy mô phân sinh Keo lai đã được Darus tiến hành đầu tiên bằng
trường

môi

cơ

bản

Murashige

và

Skooge

(MS)

có

thêm

6-

BenzyllaminoPyrine (BAP) 0,5 mg/l và cho ra rễ trong phòng thành công
(Gamborg.O.L và cs, 1995).
Darus H. Ahmas thuộc viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia đã nuôi
cấy mô tế bào cây Keo tai tượng bằng môi trường MS có bổ sung 3% đường;
0,6% thạch và 0,5 mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi. Những chồi có chiều
cao >0,5 cm được cấy vào môi trường tạo rễ và chất điều hoà sinh trưởng tốt
nhất cho tạo rễ là IBA 1000 ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% (Gamborg.O.L và cs,
1995).
W.Nitiwattanachai và cộng sự (1990) đã nuôi cấy thành công cây Keo
lá tràm (Acacia auriculiformis). Môi trường nhân nhanh chồi là MS (1962) +
10 μM BAP + 0,5 μM IBA, môi trường sử dụng cho tạo rễ là White (1963) +
2 μM IBA + 1 μM NAA ( Trindate. H và cs, 1990).
Cũng với cây Keo tai tượng, Hartney và cộng sự đã sản xuất cây con

thành công bằng nuôi cấy chồi in vitro. Môi trường nuôi cấy được sử dụng là
WPM + 3% Sucrose + 0,8 % Agar + 1 μM BAP + 1 μM NAA. Nhiệt độ trong
quá trình nuôi cấy duy trì ở 25 oC (± 4 oC), giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật
liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối Hypoclorite 4% và khử trùng trong thời
gian 20 phút (Sharma.J.K, 1994).
Có thể nói phương pháp nhân giống sinh dưỡng cho cây lâm nghiệp
đang được áp dụng trên quy mô lớn ở nhiều nước trên thế giới. Đây là công


8

cụ tối ưu để nâng cao năng suất rừng trồng trong các chương trình chọn giống
cho cây rừng.
2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam nuôi cấy mô được phát triển từ những năm 70 và những cơ
sở hiện nay đang nhân giống trong nuôi cấy mô ở quy mô lớn như: Viện
CNSH, Viện KHKT NN, Viện di truyền Nông nghiệp, Viện lúa ĐBSCL, Viện
nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh, Phú Thọ, Trung tâm ứng dụng
KHSX nông lâm nghiệp Quảng Ninh, Xí nghiệp giống lâm nghiệp thành phố
Hồ Chí Minh,... Nghiên cứu ứng dụng thành công cho một số loài cây trồng
đặc biệt là cây nông nghiệp và cây cảnh (Lê Đình Khả và cs, 2006).
Tuy nhiên, các ứng dụng về nuôi cấy mô trong lâm nghiệp còn nhiều
hạn chế, diện tích rừng trồng từ cây mô chưa nhiều vì có những đặc điểm
như: Cây rừng có chu kỳ sống dài ngày, hệ gen phức tạp, phản ứng của các
kiểu gen rất khác nhau đối với cùng một điều kiện môi trường nên trong cùng
một loài các dòng khác nhau thì hiệu quả nhân giống cũng rất khác nhau,
thậm chí có những dòng khả năng nhân giống là bằng không. Mặt khác giá
thành cây con sản xuất từ nuôi cấy mô thường cao hơn 3- 4 lần so với cây
hom và 8-10 lần so với cây con từ hạt (Lê Đình Khả, 2006).
Nuôi cấy mô ở nước ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống

một số giống Keo lai có năng suất cao. Ngoài những nghiên cứu nuôi cấy mô
Keo lai đã được giới thiệu khi tổng kết đề tài KH03.03 năm 1996 trên cơ sở
kế thừa các nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự (1996), nhóm
nghiên cứu nuôi cấy mô của Đoàn Thị Mai đã thực hiện nghiên cứu bổ sung
cho một số dòng Keo lai và thu được một số kết quả như sau: Khử trùng mẫu
vật bằng HgCl2 0,1% với thời gian 2, 4, 6, 8, 10, 12 phút trong tháng 2, 5, 8,
10 và 12 cho thấy trong 8 - 10 phút cho kết quả tốt. Ảnh hưởng của chất điều
hoà sinh trưởng đến khả năng nảy chồi là BAP (2 ppm) và BAP (2 ppm) + Kn


9

(0,05 ppm) và môi trường MS là công thức cho mẫu vật đẻ chồi nhiều nhất.
Ảnh hưởng của chất kích thích ra rễ đến khả năng ra rễ của các dòng Keo lai
riêng biệt là: IBA (3 ppm) cho tỷ lệ ra rễ cao (80-92) đối với BV10, BV29,
BV32, BV33. Nồng độ IBA 1ppm ra rễ tốt cho dòng BV16 (65%), BV5
(50%) (Đoàn Thị Mai và cs, 2011); Lê Đình Khả và cs, 2006).
Để đáp ứng nhu cầu gây trồng Keo lai và phát triển các dòng được
tuyển chọn, việc tiến hành nhân nhanh một khối lượng lớn bằng phương pháp
nuôi cấy mô là phương thức rất có ý nghĩa.
2.3. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào là phương pháp nhân giống được
thực hiện bằng nuôi cấy cơ quan, mô (thậm chí là tế bào) trong môi trường
dinh dưỡng đặc biệt hoàn toàn vô trùng và được kiểm soát. Vì vật liệu nuôi
cấy thường rất nhỏ và thực hiện trong môi trường nhân tạo nên phương pháp
nhân giống này còn được gọi là vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân
giống in vitro (Ngô Xuân Bình và cs, 2003).
Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật:
- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (nuôi cấy chop đỉnh và chồi bên)
- Nuôi cấy mô sẹo

- Nuôi cấy tế bào đơn thu nhận các chất có hoạt tính sinh học
- Nuôi cấy protoplast - chuyển gen
- Nuôi cấy hạt phấn
2.4. Cơ sở khoa học của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.4.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào được coi là nền tảng của việc
nuôi cấy mô. Điều này được nhà thực vật học người Đức Haberlandt đề xuất
lần đầu tiên vào năm 1902. Tác giả cho rằng mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh
vật nào cũng mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ về cá thể


10

đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá
thể hoàn chỉnh. Giả thuyết đó đến nay đã được thực nghiệm chứng minh trên
nhiều loài thực vật bậc cao (Vũ Văn Vụ và cs, 2005).
2.4.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật
Sự phân hoá và phản phân hoá cũng là cơ sở quan trọng trong nuôi cấy
mô tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là một thể thống nhất bao gồm nhiều
cơ quan chức năng, tất cả các loại tế bào đó đều có nguồn gốc từ tế bào phôi
sinh và được tạo nên bởi quá trình phân hóa. Đó là sự chuyển các tế bào phôi
sinh thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau
trong cơ thể (Vũ Văn Vụ và cs, 2005).
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các mô chức năng chúng
không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia của mình. Nếu tách một tế bào
hoặc một nhóm tế bào ra khỏi cơ thể và nuôi cấy chúng trong những điều kịên
môi trường thích hợp, chúng lại quay trở lại dạng tế bào phôi sinh ban đầu và
lại có khả năng phân chia mạnh mẽ và phân hóa để tái sinh cây hoàn chỉnh.
Quá trình này gọi là phản phân hoá (Phan Hữu Tôn (2005).
Về bản chất, sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt

hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số
gen được hoạt hoá (trước đó bị ức chế) giúp cơ thể biểu hiện tính trạng mới,
một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động (Đặng Ngọc Hùng, 2009). Sự phân
hóa và phản phân hóa được biểu thị bằng sơ đồ:


11

Phân hóa

Tế bào phôi

Tế bào dãn

Tế bào chuyển

Phản phân hóa

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức
chế bởi các tế bào xung quanh nên không thể biểu hiện các đặc tính mới. Nếu
các tế bào này được tách riêng rẽ và gặp điều kiện môi trường thuận lợi thì bộ
gen được hoạt hoá, quá trình phân hoá và phản phân hoá xảy ra theo một
chương trình đã được định sẵn trong genom.
2.5. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.5.1. Giai đoạn chuẩn bị
Giai đoạn này được xem như một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy. Vật
liệu nuôi cấy (cây giống) được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên hoặc ra khỏi
các khu khảo nghiệm để chúng thích ứng với môi trường mới, giảm bớt nguồn
bệnh và tạo điều kiện chủ động về nguồn mẫu vật cho công tác nuôi cấy.
Trong điều kiện cần thiết có thể tác động các biện pháp trẻ hoá vật liệu nhân

giống hoặc thụ phấn nhân tạo cho những loài rất khó thụ phấn trong điều kiện
tự nhiên (Đoàn Thị Mai và cs, 2011).
2.5.2. Giai đoạn khử trùng mẫu, cấy khởi động
Mục tiêu của giai đoạn này là tạo được mẫu sạch và non trẻ cho các
giai đoạn nuôi cấy tiếp theo nên cần đảm bảo tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống
cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Bộ phận của cây được chọn làm mẫu cấy
phụ thuộc vào hình thức nhân giống thích hợp cho từng loài cây và đặc biệt
đúng giai đoạn phát triển. Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng cho thí


12

nghiệm nuôi cấy mô ở hầu hết các loại cây trồng. Ngoài ra, chóp đỉnh và chồi
non nảy mầm từ hạt cũng được sử dụng. Mẫu trước khi cấy vào môi trường
cơ bản được làm sạch nguồn bệnh bằng cách rửa nhiều lần bằng nước sạch,
sau đó ngâm trong dung dịch khử trùng ở nồng độ thích hợp để làm sạch
nguồn bệnh. Tuỳ thuộc vào từng vật liệu mà chọn loại hoá chất, nồng độ và
thời gian khử trùng thích hợp. Trong quá trình khử trùng mẫu cấy phải hết sức
thận trọng để không làm ảnh hưởng đến sức sống của mẫu cấy. Sau đó đặt
mẫu vào môi trường tùy từng cây như MS, NN… Khi nuôi cấy cần chú ý điều
kiện ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm và có thể hàm lượng CO2 thích hợp (Nguyễn
Văn Uyển, 1993).
2.5.3. Giai đoạn tạo chồi và nhân nhanh chồi
Đây là giai đoạn cực kỳ quan trọng và quyết định sự thành công của
toàn bộ quá trình nhân giống. Trong giai đoạn này, vai trò của chất điều hoà
sinh trưởng là cực kỳ quan trọng để sản sinh ra lượng chồi tối đa mà vẫn đảm
bảo sức sống và bản chất di truyền của vật liệu nuôi cấy (Trần Thị Lệ và cs,
2008).
2.5.4. Giai đoạn tạo cây mô hoàn chỉnh
Tạo rễ là giai đoạn quan trọng để có được cây con hoàn chỉnh. Khi tạo

rễ cần loại bỏ các chất kích thích tạo chồi, phân chia chồi và thay vào đó là
một số Auxin kích thích tạo rễ. Tuỳ theo loài cây mà sử dụng loại và nồng độ
Auxin cho phù hợp. Thông thường các chất IBA, NAA, IAA với hàm lượng
từ 1- 5 mg/l thích hợp trong quá trình kích thích tạo rễ cho nhiều loài cây thân
gỗ. Một số trường hợp đặc biệt nếu chồi tạo được quá nhỏ và ngắn, có thể sử
dụng 1-5 mg/l GA3 và một số hợp chất hữu cơ như nước dừa non,... Bổ sung
vào môi trường để đạt tiêu chuẩn cây con trước khi chuyển sang khu huấn
luyện (Đoàn Thị Mai và cs, 2011).
2.5.5. Giai đoạn chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm


13

Cây con đạt được những tiêu chuẩn về hình thái nhất định (số lá, số rễ,
chiều cao cây) sẽ được chuyển dần từ ống nghiệm ra nhà kính hay nhà lưới,
sau đó chuyển ra vườn ươm. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn
định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vô trùng tốt nên khi
chuyển ra ngoài với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng
thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ bị
stress, dễ mất nước và mau héo (Phan Hữu Tôn, 2005).
Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải thoáng mát, cường
độ chiếu sáng thấp, ẩm độ cao,... Cây con thường được cấy trong luống ươm
cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm. Trong những ngày đầu
cần phải được phủ nilon để giảm quá trình thoát nước ở lá (thường 7- 10 ngày
kể từ ngày cấy) (Đặng Ngọc Hùng, 2009).
2.6. Các yếu tố ảnh hƣởng tới kết quả nuôi cấy mô – tế bào
2.6.1. Điều kiện vô trùng
Trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm bảo điều kiện vô
trùng tuyệt đối. Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp
khử trùng mẫu thích hợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng và bốt

cấy vô trùng.
Dụng cụ khử trùng cơ bản gồm:
- Nồi hấp tiệt trùng: Sử dụng cho việc khử trùng môi trường nuôi cấy,
dụng cụ nuôi cấy bằng hơi nước có áp suất và nhiệt độ cao (1,2- 1,5 atm; 120130oC).
- Tủ sấy (60-600oC): Để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy.
- Dung dịch khử trùng: Để khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy người
ta thường sử dụng các dung dịch như: HgCl2, NaClO (hypoclorit natri);
Ca(OCl)2 (hypoclorit canxi); H2O2 (oxy già),... Cồn dùng để khử trùng mẫu sơ
bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy.


14

- Màng lọc: Dùng để loại bỏ các tác nhân lây nhiễm có kích thước
0,025-10 µm khỏi môi trường nuôi cấy, nước cất… Đây là phương pháp phù
hợp với những môi trường mà thành phần của chúng bị phân hủy bởi nhiệt độ
cao. Những môi trường đó được lọc vô trùng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm qua
các màng có lỗ siêu nhỏ. Có hai loại màng phổ biến: Màng lọc bằng thép
không rò rỉ (màng Swinney); màng lọc bằng polypropylene (màng Swinex),
đây là loại màng chỉ dung một lần rồi bỏ (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
- Buồng cấy và bốt cấy vô trùng:
+ Buồng vô trùng: Nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo sạch sẽ. Buồng
phải được tiệt trùng liên tục trước và sau khi làm việc.
+ Bốt cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bốt cấy Laminair Flow box,
thiết bị này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi
không khí vô trùng về phía người ngồi thao tác.
- Buồng nuôi cấy: Là buồng đặt các mẫu nuôi cấy. Buồng này cần đảm
bảo các điều kiện: Nhiệt độ 25-30oC, ánh sáng đạt 2000- 3000 lux, sạch sẽ và
tránh tiếp xúc với bên ngoài (Đoàn Thị Mai và cs, 2009).
2.6.2. Vật liệu nuôi cấy

Về nguyên tắc mọi tế bào của mô chuyên hoá như thân, rễ, lá, chồi...
Trên cơ thể sinh vật đều có khả năng làm vật liệu nuôi cấy. Tuy nhiên, thực tế
cho thấy tuỳ từng loại tế bào và các loại mô khác nhau mà mức độ nuôi cấy
thành công khác nhau. Vật liệu nuôi cấy ở giai đoạn non tốt hơn giai đoạn già,
mức độ tinh khiết càng cao thì hiệu quả nuôi cấy thành công càng cao. Khi
lấy mẫu làm thí nghiệm nuôi cấy cần chú ý đến các yếu tố như mùa vụ lấy vật
liệu, kích thước vật liệu, tuổi cây mẹ, vị trí lấy mẫu trên cây mẹ và dòng cây
mẹ (Trần Thị Lệ và sc, 2008).
- Mùa vụ lấy vật liệu: Thường lấy mẫu ở thời điểm cây sinh trưởng và
phát triển mạnh nhất: Mùa xuân hay đầu mùa hè. Các mùa khác lấy mẫu


15

sinh trưởng kém hơn, đồng thời mang nhiều mầm bệnh (Phan Hữu Tôn,
2005).
- Kích thước và vị trí mẫu cấy: Kích thước của mẫu cấy ảnh hưởng trực
tiếp đến phản ứng của mô với môi trường nuôi cấy. Mẫu có kích thước càng
nhỏ càng khó nuôi cấy. Thường trên cây, mẫu ở vị trí cao sẽ ít mầm bệnh hơn,
các mô, cơ quan tiếp xúc với nước, đất như rễ, củ, thân ngầm có lượng vi sinh
vật rất cao và khó loại bỏ hoàn toàn chúng ra khỏi nguồn mẫu.
- Chất lượng cây cho mẫu: Lấy từ những cây có đặc điểm ưu việt mà ta
quan tâm: Sinh trưởng và phát triển mạnh, chống chịu tốt với điều kiện bất lợi
hoặc sâu bệnh, cho sản lượng và chất lượng ngon của củ, quả… (Dương Công
Kiên, 2002).
- Mục đích và khả năng nuôi cấy: Để phục vụ cho nhân giống vô tính
thường chọn chồi ngọn, chồi bên (chồi muộn). Nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy
phôi: có thể sử dụng là mầm, trụ là mầm, thân, là, phôi… Để thu cây đơn bội
phục vụ cho lai tạo giống dùng bao phấn và hạt phấn cho nuôi cấy.
- Phụ thuộc vào mẫu có nuôi cấy thành công hay không. Nếu nuôi cấy

mô sẹo hay nuôi cấy phôi không thể thực hiện với một đối tượng nào đó thì
phải chuyển sang chọn đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy và ngược lại … ( Nguyễn
Kim Thanh và cs, 2005).
2.6.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy bao gồm cả môi trường hóa học và điều kiện bên
ngoài được xem là vấn đề quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy.
2.6.3.1. Môi trường hoá học
Môi trường hóa học được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh
dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi
cấy in vitro. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh: Thành phần, hàm
lượng các chất trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng