Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát hiện nhanh tụ cầu vàng kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN TUẤN ANH
Tên đề tài:
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TỤ CẦU
VÀNG (Staphylococcus aureus) KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính Quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2011 – 2015

Thái Nguyên, năm 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN TUẤN ANH
Tên đề tài:
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TỤ CẦU
VÀNG (Staphylococcus aureus) KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính Quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Lớp

: K43 CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2011 – 2015

Giảng viên hƣớng dẫn: 1.BS Nguyễn Thị Huyền
2. TS Nguyễn Văn Duy

Thái Nguyên, năm 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm cùng các
thầy cô đã trực tiếp giảng dạy và đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong
suốt những năm học vừa qua.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
TS. Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và
hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
BS. Nguyễn Thị Huyền, CN. Trần Trung Anh, cùng các KTV. Nguyễn Thị
Thủy, Trương Thùy Vi, Dương Minh Phương, Khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa
Khoa Trung Ương Thái Nguyên đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi và đã cung cấp các chủng
sinh vật để thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn bố mẹ và những người bạn đã luôn ở bên cạnh động
viên và giúp đỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Tuấn Anh

ii

DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

CIAA

Hỗn hợp gồm 24 chloroform : 1 isoamylalcohol (v/v)

CFU

Colony Forming Unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTPs

Deoxyribonucleotide triphosphates (Hỗn hợp gồm dATP,
dGTP, dCTP, dTTP)

OD

Optical Density - Mật độ quang

PCR

Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp chuỗi trùng
hợp - chỉ quá trình tổng khuếch đại vùng DNA đặc hiệu in vitro

RNA

Ribonucleic Acid

VSV

Vi sinh vật

BP

Môi trường Baird Parker

ELSA

Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Kỹ thuật hấp thụ miễn
dịch liên kết với enzyme

VK

Vi khuẩn

KS

Kháng sinh

MRSA

Methicillin resistant Staphylococcus aureus

WHO

Tổ chức Y tế Thế giới

VRSA

Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus

S. aureus

Staphylococcus aureus

ANSORP

mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á

PBP

Biến đổi các protein liên kết với Penicillin


iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 21
Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu ..................................... 21
Bảng 3.3: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.................................................. 22
Bảng 4.1: Kiểu hình của 17 chủng S. aureus phân lập được tại Bệnh viên Đa khoa
Trung Ương Thái Nguyên ..................................................................................... 33
Bảng 4.2. Bảng khảo sát tỷ lệ vi khuẩn S. aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều

trị tại bệnh viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên ........................................... 36
Bảng 4.3: Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ 17 chủng S. aureus phân lập được .. 39
Bảng 4.4: So sánh sự có mặt của gen mecA với kiểu hình kháng Methicillin của
các chủng Staphylococcus aureus thu thập được.................................................. 43


iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Hình thái Staphylococcus aureus ............................................................ 6
Hình 4.1: Phân lập S. aureus trên môi trường thạch máu ..................................... 31
Hình 4.2: Hình ảnh kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ với chủng S. aureus (S4) ......... 32
Hình 4.3: Điện di kiểm tra dung dịch DNA tổng số tách chiết từ một số mẫu S.
aureus .................................................................................................................... 39
Hình 4.4: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR .. 41
Hình 4.5: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm Multiplex PCR sử dụng cặp mồi
MecAF-MecAR và NucF-NucR ........................................................................... 42


v

MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề......................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ......................................................................... 3
1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 3
1.2.2. Yêu cầu của đề tài ......................................................................................... 3
1.3. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................. 3
1.3.1. Ý nghĩa trong khoa học ................................................................................. 3

1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ................................................................................. 3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4
2.1. Giới thiệu về Staphylococcus: .......................................................................... 4
2.1.1. Lịch sử phát hiện .......................................................................................... 4
2.1.2. Đặc điểm hình thái ....................................................................................... 5
2.1.3. Danh pháp và phân loại của S. aureus .......................................................... 5
2.2. Cấu trúc di truyền của S. aureus .................................................................... 6
2.3. Các chỉ thị phân tử của S. aureus ..................................................................... 7
2.4. Đặc tính sinh học của S. aureus ....................................................................... 8
2.5.Cơ chế gây bệnh ................................................................................................ 9
2.6. Tình Hình Nghiên Cứu Tính Kháng Thuốc Ở S. aureus ................................. 9
2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................ 9
2.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước................................................................ 10
2.7. Cơ chế đề kháng kháng sinh .......................................................................... 13
2.7.1. Ức chế bằng enzyme ................................................................................... 13
2.7.2. Giảm tính thấm của tế bào vi khuẩn ........................................................... 14
2.7.3. Biến đổi vị trí gắn kết .................................................................................. 15
2.7.4. Bơm đẩy ...................................................................................................... 16


vi

2.7.5. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh thuộc nhóm β-lactam ............................... 17
2.8. Các phương pháp phát hiện S. aureus kháng thuốc ....................................... 18
2.8.1. Phương pháp vi sinh .................................................................................... 18
2.8.2. Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (MIC) ....................... 18
2.8.3. Kỹ thuật PCR .............................................................................................. 19
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 20
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.................................................................. 20
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 20

3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ..................................................................................... 20
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu .................................................. 20
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................... 20
3.2.2. Thời gian nghiên cứu .................................................................................. 20
3.3. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 20
3.3.1. Các cặp mồi sử dụng trong đề tài ................................................................ 20
3.3.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài ..................................................................... 21
3.3.3. Dụng cụ, thiết bị .......................................................................................... 22
3.4. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 22
3.4.1. Khảo sát tỷ lệ vi khuẩn S. aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại
Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên ..................................................... 22
3.4.2. Phân lập vi khuẩn S. aureus kháng thuốc ................................................... 22
3.4.3. Phát hiện nhanh S. aureus kháng methicillin bằng kỹ thuật PCR .............. 22
3.5. Phương Pháp Nghiên Cứu.............................................................................. 23
3.5.1. Phương pháp phân lập S. aureus, và làm kháng sinh đồ từ các bệnh nhân
làm tại bệnh viên). ................................................................................................ 23
3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng hóa chất CTAB ................ 27
3.5.3. Phản ứng PCR ............................................................................................ 29
3.5.4. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR ........................................... 30


vii

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 31
4.1. Kết quả phân lập 17 chủng S. aureus kháng thuốc kháng sinh tại Bệnh viện
Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên ...................................................................... 31
4.2. Khảo sát tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của các chủng S. aureus trên các bệnh
nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên .......................... 36
4.3. Thử nghiệm khả năng phát hiện nhanh S. aureus kháng thuốc bằng kỹ thuật
sinh học phân tử .................................................................................................... 38

4.3.1. Tách chiết DNA tổng số.............................................................................. 38
4.3.2. Kiểm định các chủng S. aureus ................................................................... 40
4.3.3. Nghiên cứu khả năng phát hiện nhanh vi khuẩn S. aureus kháng thuốc .... 41
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 46
5.1. Kết luận .......................................................................................................... 46
5.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Loài Staphylococcus aureus là một trong số các vi khuẩn ký sinh ở
trên da và niêm mạc, nhiều nhất là ở mũi. Có khoảng 10-40% người khỏe
mạnh mang S. aureus (Trần Thị Như Hoa, 2012) [6]. Khi có những tổn
thương ở da và niêm mạc kèm theo những rối loạn về chức năng thì các
nhiễm trùng do S. aureus dễ dàng xuất hiện. Hiện nay, hiện tượng S. aureus
kháng kháng sinh trở nên khá phổ biến do tình trạng sử dụng kháng sinh ngày
càng nhiều ở cộng đồng với những kháng sinh có hoạt phổ rộng, nhiều loại
kháng sinh khác nhau với liều lượng không đúng. Hiện tượng kháng thuốc
không chỉ xuất hiện ở các vi khuẩn trong bệnh viện mà còn trên các vi khuẩn
ở cộng đồng ngoài bệnh viện. Việc nghiên cứu mức độ kháng thuốc ở vi
khuẩn là vấn đề rất cần thiết nhằm theo dõi diễn biến kháng thuốc, dự báo xu
thế kháng thuốc và đề ra những biện pháp thích hợp nhằm hạn chế mức gia
tăng tính kháng thuốc từ đó giúp cho việc sử dụng kháng sinh ở cộng đồng
hợp lý và tiết kiệm (Trần Thị Như Hoa, 2012) [6].
Theo một kết quả khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành
phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S. aureus phân lập từ bệnh

phẩm có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52%
kháng Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006)
[8]. Cũng theo một báo cáo khác từ tháng 8/2012 - tháng 8/2013, một nghiên
cứu với 143 chủng S. aureus về tỉ lệ đề kháng KS của S. aureus trong 4.299
bệnh phẩm, được phân lập tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, Viện Pasteur Thành
phố Hồ Chí Minh. Kết quả cho thấy: S. aureus chiếm 23,6%, đa số được phân
lập từ bệnh phẩm mủ (36,3%), dịch âm đạo (18,9%), nước tiểu (11,9%) và
phân (10,5%). Qua kết quả từ kháng sinh đồ (KSĐ), tỉ lệ đề kháng của S.


2

aureus với các KS là 93,7% với Penicilline G, 65,0% với Erythromycine,
60,8% với Kanamycine, 58% với Clindamycine. Tỉ lệ MRSA là 39,2%
(Nguyễn Hữu An, 2013) [1].
Với việc phát hiện tính kháng thuốc ở vi khuẩn hiện nay chủ yếu dựa
trên cơ sở nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường chứa kháng sinh. Đây là
phương pháp đã được khẳng định có độ chính xác cao nhưng tốn thời gian và
phải thực hiện nhiều thao tác nuôi cấy phức tạp. Việc phát hiện chậm tính
kháng thuốc ở vi khuẩn cũng là nguyên nhân góp phần làm cho các chủng vi
khuẩn kháng thuốc có cơ hội lây lan. Do đó, việc phát hiện nhanh vi khuẩn
kháng thuốc là một yêu cầu cần thiết góp phần giảm nguy cơ lây lan của các
vi khuẩn kháng thuốc này, đặc biệt trong môi trường bệnh viện.
Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu công bố về các chỉ thị phân tử liên
quan đến tính kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn nói chung và S. aureus nói
riêng. Đây là những tiền đề cho việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử
trong phát hiện nhanh vi khuẩn kháng thuốc.
Có nhiều phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn kháng thuốc đã được
nghiên cứu công bố như giải trình tự gen, các kỹ thuật PCR, DNA arrays,
ELISA… Trong đó PCR là kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp

nên rất thuận lợi trong việc áp dụng thực tiễn chẩn đoán.
Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên
cứu của Khoa CNSH và CNTP - Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại Học
Thái Nguyên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Bƣớc đầu nghiên cứu
phƣơng pháp phát hiện nhanh tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus)
kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR”
Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát mức
độ kháng thuốc kháng sinh của S. aureus tại các bệnh nhân điều trị tại Bệnh
viện Đa khoa Thái Nguyên trong thời gian từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 5


3

năm 2015 và bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện
nhanh vi khuẩn này kháng Methicillin - 1 trong những thuốc kháng sinh được
điều trị phổ biến và có tỷ lệ kháng thuốc cao.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát được thực trạng kháng thuốc của vi khuẩn S. aureus tại Bệnh
viện Đa khoa Thái Nguyên và bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR
phát hiện nhanh S. aureus kháng Methicillin.
1.2.2. Yêu cầu của đề tài
- Khảo sát được tỷ lệ vi khuẩn S. aureus kháng thuốc trên bệnh nhân
điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên.
- Phân lập được vi khuẩn S. aureus kháng thuốc.
- Ứng dụng được kỹ thuật PCR phát hiện nhanh S. aureus kháng thuốc.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa trong khoa học
Đánh giá được thực trạng S. aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị
tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên và nghiên cứu ứng dụng kỹ

thuật phát hiện nhanh S. aureus kháng thuốc.
1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
Nghiên cứu được kỹ thuật phát hiện nhanh S. aureus kháng thuốc bằng
kỹ thuật PCR. Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho việc xây dựng phương pháp
phát hiện nhanh vi khuẩn kháng kháng sinh góp phần điều trị có hiệu quả
bệnh nhân nhiễm trùng, hạn chế sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong
cộng đồng.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về Staphylococcus:
Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh, Staphylo (chùm nho) và
coccus (hạt).
Phân loại của vi khuẩn Staphylococcus như sau:
o Giới: Prokaryote
o Phân loại: Firmicute
o Lớp: Firmibacteria
o Họ: Micrococceae
o Giống: Staphylococcus
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người scotland Alexander Ogston đã
trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học
trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày
tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong
lâm sàng. S. aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878,
phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ
cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật (VSV) học. Năm

1926, Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan
giữa sự hiện diện của hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với
khả năng gây bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1948, phát hiện này mới
được chấp nhận rộng rãi Báo cáo của (Nguyễn Thị An. 2011) [2].


5

2.1.2. Đặc điểm hình thái
Staphylococcus là vi khuẩn gram dương, hình cầu đường kính 0,5 - 1,5
µm, có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không
đều giống như chùm nho. Đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh
bào tử, thường cư trú trên da và màng nhày của người và động vật máu nóng.
Năm 1871, Recklinghausen thu được cầu khuẩn trong thận của bệnh nhân
chết do bệnh nhiễm khuẩn huyết. Năm 1880, Alexander Ogston chứng minh
được áp-xe sinh mủ là do cầu khuẩn dạng chùm và Ogston được công nhận là
người khám phá và đặt tên cho tụ cầu - Staphylococcus vào năm 1882. Năm
1884, Rosenbach nghiên cứu và đặt tên cho cầu khuẩn tạo khuẩn lạc màu vàng là
Staphylococcus pyrogen aureus (Scott E Martin, 2000) [41].
2.1.3. Danh pháp và phân loại của S. aureus
Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp
Cocci, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài
Staphylococcus aureus, tên khoa học là Staphylococcus aureus (Baba T,
2002) [17].
Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm
chính: tụ cầu có coagulase và tụ cầu không có coagulase. S. aureus gây bệnh
ngộ độc thực phẩm là tụ cầu có coagulase. Nhờ enzyme này mà trên môi
trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng nên còn
được gọi là tụ cầu vàng (Phạm Văn Phúc, 2013) [10].

6

 Đặc điểm cấu trúc của Staphylococcus aureus (Hình 2.1)

Hình 2.1: Hình thái Staphylococcus aureus
2.2. Cấu trúc di truyền của S. aureus
Hiện nay người ta đã thành công trong giải trình tự gen của các chủng
tụ cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476,
N315, Mn50, N315, Mu50, RF122… (Baird R.M, Lee W.H, 1995) [18] ,
Steven và cộng sự đã thành công trong việc giải trình tự bộ gen dài 2809422
bp của chủng S. aureus COL. Kết quả giải trình tự đã được đăng kí trên
Genbank với mã số: CP000046.1 cho hệ gen và CP000045 cho hệ gen
plasmid. Theo đó, trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít nhất các cặp G-C,
điều này gây ra mối quan ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng tới
các tác nhân gây bệnh Gram dương khác (Gill S. R,2005) [23].
Trong số các chủng S. aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ giống
enterotoxigenic được ước tính khoảng 25%. Tại pháp, trong số 61 chủng phân lập
từ phomat và sữ tươi có 15,9% chủng là giống enterotoxigenic. Ở pháp, trong số
332 chủng S. aureus được phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng chứa các


7

gen SEG, SEB, SEI, và SEJ suất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen SEA
và SEE, trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế (Lâm Quốc Hùng, 2009) [7].
2.3. Các chỉ thị phân tử của Staphylococcus aureus
Chủng S. aureus sản xuất ra một enzyme ngoại bào chịu nhiệt nuclease
(thermonuclease [Tnase] ) với tần số tương ứng với thời điểm mà nó sản xuất ra
coagulase (Brakstad O.G, 1992) [20]. Các Tnase là một loại protein có khối lượng

phân tử 17.000 Da. Nó là một endonuclease, làm giảm cả DNA, RNA và hoạt
động của enzyme có thể chống lại nhiệt độ 1000C trong vòng 1 giờ (Brakstad
O.G, 1992) [20]. Trong các phản ứng PCR phát hiện S. aureus, người ta thường
dùng các mồi chuyên biệt để phát hiện gen nuc mã hóa nuclease chịu nhiệt (Sasaki
T, 2010) [40]. Sasaki T. và cộng sự (2010) đã sử dụng gen nuc trong việc nhận
dạng loài Staphylococci dương tính với cogulase bằng phương pháp mulyiplexPCR (Sasaki T, 2010) [40]. Brakstad O.G. và cộng sự (1992) đã sử dụng gen nuc
làm gen chỉ thị trong phát hiện S. aureus bằng phản ứng khuếch đại gen nuc
(Brakstad O.G, 1992) [20]. Wilson I.G. và cộng sự (1991) đã sử dụng gen nuc làm
gen chỉ thị để phát hiện S. aureus trong sữa nghi ngờ bị nhiễm tụ cầu vàng
(Wilson I. G, 1991) [44]. Ngoài ra theo nghiên cứu của Pinto B. và cộng sự (2004)
cho biết có thể dùng các mồi chuyên biệt khác để phát hiện các gen mã hóa độc tố
ruột (enterotoxin), gen tst (gây hội chứng sốc), gen eta và etb (mã hóa độc tố A và
B gây mảng tróc), vùng đệm rDNA 16-23S và (Pinto B, 2005) [37]. Còn có nhiều
phương pháp dựa trên PCR được dùng để phát hiện nhanh tụ cầu như inter-IS256
PCR, spa typing (Wei H. L, 2002) [43], hay phương pháp DNA fingerprinting
cũng như phương pháp RLPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) để phân
loại các dòng S. aureus và kỹ thuật PCR-RELP (Randomly Fragment Length
Polymorphiism) để phân tích gen aroA (Pinto B, 2005) [37].


8

2.4. Đặc tính sinh học của S. aureus
S. aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme
catalase phân giải oxy già, giải phóng oxy và nước:
Catalase
H2O2

H2O + O2

S. aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra
enzyme coagulase. Đây được xem là tính chất đặc trưng của S. aureus, là tiêu
chuẩn để phân biệt S. aureus với các tụ cầu khác. Có hai dạng coagulase:
coagulase “cố định” (“bound” coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase
“tự do” (“free” coagulase) được phóng thích khỏi thành tế bào. Có hai
phương pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thử nghiệm trên lam kính
và trong ống nghiệm. Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase
“cố định” bằng cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống
nghiệm phát hiện những coagulase “tự do” bằng phản ứng dán tiếp với
fibrinogen qua cộng hợp với những yếu tố khác trong huyết tương (Sandel
M.K, 2002) [39].
Ngoài ra, chúng còn phản ứng với DNAse, phosphatase dương tính, có
khả năng lên men và sinh axit từ manitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng
S. aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi
trường chứa đến 15% muối NaCl (Sandel M.K, 2002) [39].
Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus
có mầu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5mm, quanh khuẩn lạc có vòng
sáng giộng 25mm ( do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng
thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase), (Sasaki T, 2002) [39]. Trên môi
trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn
lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường
xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol), (Sandel M.K, 2002) [39].


9

Đa số các dòng S. aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin
trong môi trường có nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở
nhiệt độ 35-370C (Trần Linh Thước, 2002) [11].
2.5. Cơ chế gây bệnh:

Bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây
bệnh và vật chủ là sự bám dính của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật
chủ các bề mặt này bao gồm:
- Da, niêm mạc: Khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu.
- Các tổ chức sâu hơn: Tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt
phế nang, tổ chức nội mô.
S. aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất
polypeptide.
Tác nhân gây bệnh như S. aureus mới có khả năng khởi động các quá
trình sinh hóa đặc hiệu như: tăng sinh, bài tiết đôc tố, xâm nhập và hoạt hóa
các chuỗi tín hiệu tế bào vật chủ.
S. aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzyme như:
hyaluronidase, hemolysin, leukocidin… phá hủy các thành phần tế bào vật chủ.
Ước tính khoảng 0,1µg S. aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở
người (Nguyễn Hữu An, 2013) [1].
2.6. Tình hình nghiên cứu tính kháng thuốc ở Staphylococcus aureus
2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Tụ cầu kháng Methicilline (MRSA). Được phân lập tại Châu Âu đầu
tiên năm 1960, phát tán nhanh ở Mỹ và trở thành dịch ở nhiều bệnh viện tại
Mỹ ở thập niên 1980 (MRSA gặp với tỷ lệ 10-40%). Ở Canada gặp đầu tiên:
1979, trở thành dịch năm 1981. Từ năm 1995 đến năm 2004 tỷ lệ tăng từ
0,46/1000 ca lên 5,9/1000 ca. Nghiên cứu năm 2006 ở 48 BV tại Canada cho


10

thấy : 11.700 /29.000 bệnh nhân nhập viện có mang MRSA gây bệnh nhiễm
trùng (Baba T, 2002) [16].
Một báo cáo mới nhất của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công bố ngày
30/4/2014 cho thấy hầu như tất cả các khu vực đều cho kết quả kháng cao với

methicillin trong điều trị S. aureus (MRSA); trong đó, Đông Nam Á hơn
25%, Đông Địa Trung Hải hơn 50%, châu Âu 60%, châu Phi 80%, Tây Thái
Bình Dương 80%, châu Mỹ 90% (Tổ chức Y tế thế giới, 2014) [12].
Những phân tích gần đây cho thấy tại Hoa Kỳ hàng năm có khoảng
48000 người tử vong vì MRSA (Methicillin resistant S. aureus). Ước tính có
khoảng 19000 người Mỹ tử vong vì MRSA trong năm 2005.
2.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, hầu hết các cơ sở khám, chữa bệnh đang phải đối mặt với
tốc độ lan rộng của các vi khuẩn kháng với nhiều loại kháng sinh. Mức độ và
tốc độ kháng thuốc ngày càng gia tăng, đang ở mức báo động. Gánh nặng do
kháng thuốc ngày càng tăng do chi phí điều trị tăng lên, thời gian điều trị kéo
dài, ảnh hưởng đến sức khỏe người bệnh, cộng đồng và sự phát triển chung
của xã hội. Trong tương lai, các quốc gia có thể sẽ phải đối mặt với khả năng
không có thuốc để điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm nếu không có các
biện pháp can thiệp phù hợp.
Hiện nay, kháng thuốc không phải là vấn đề mới, nhưng đã trở nên
nguy hiểm, cấp bách, đòi hỏi phải có sự nỗ lực tổng hợp nhằm giúp nhân loại
tránh khỏi nguy cơ quay trở lại thời kỳ chưa có kháng sinh. Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO) nhận định, chúng ta đang sống trong kỷ nguyên phụ thuộc kháng
sinh và yêu cầu toàn cầu có trách nhiệm bảo vệ nguồn thuốc kháng sinh quý
giá cho thế hệ sau (Trường Đại Học Y Khoa-nhà xuất bản Y học, 1974) [13].
Một khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí
Minh năm 2005 cho thấy các chủng S. aureus phân lập từ bệnh phẩm cho


11

thấy có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin,
52% kháng Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs,
2006) [8].

Từ tháng 8/2012 - đến tháng 8/2013, một nghiên cứu với 143 chủng
S. aureus về tỉ lệ đề kháng KS của S. aureus trong 4.299 bệnh phẩm, được
phân lập tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh.
Kết quả cho thấy: S. aureus chiếm 23,6% , đa số được phân lập từ bệnh phẩm
mủ (36,3%), dịch âm đạo (18,9%), nước tiểu (11,9%) và phân (10,5%). Qua
kết quả từ kháng sinh đồ (KSĐ), tỉ lệ đề kháng của S. aureus với các KS là
93,7% với Penicilline G, 65,0% với Erythromycine, 60,8% với Kanamycine,
58% với Clindamycine. Cho tỉ lệ MRSA là 39,2% (Nguyễn Hữu An, 2013) [1].
Trong một nghiêm cứu khác cũng cho thấy tỉ lệ kháng kháng sinh của
S. aureus khác nhau giữa các bệnh viện và giữa các kháng sinh xét nghiệm.
Có tới 68,8% các chủng phân lập tại bệnh viện Chợ Rẫy kháng với
Gentamicin. Tỉ lệ kháng Oxacillin cao nhất tại Bệnh viện Đa khoa Trung
ương Huế với 63,8% . Theo báo cáo của Bệnh viện Chợ Rẫy năm 2008, có
8% số chủng S. aureus phân lập được đề kháng với Vancomycin. Tuy nhiên,
đến năm 2009, phần lớn các bệnh viện kể cả Chợ Rẫy không có chủng S.
aureus nào đề kháng với Vancomycin trừ một số bệnh viện tỉnh và bệnh viện
trực thuộc Sở y tế cho kết quả đáng nghi ngờ về tỉ lệ kháng Vancomycin của
tụ cầu vàng ví dụ như 60,9% S. aureus kháng Vancomycin tại bệnh viện
Uông Bí, 24,1% tại bệnh viện Bình Định và 15,6% tại bệnh viện Xanh Pôn.
(Nguyễn Văn Duy, 2011) [3].
Theo một nghiên cứu khác cho thấy tình trạng kháng kháng sinh ở Việt
Nam đã ở mức độ cao. Trong số các nước thuộc mạng lưới giám sát các căn
nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP), Việt Nam có mức độ kháng
Penicillin cao nhất (71,4%) và kháng Erythromycin (92,1%) (Wei H. L,


12

(2002) [42]. Do tỉ lệ kháng cao, nhiều liệu pháp kháng sinh được khuyến cáo
trong các tài liệu hướng dẫn điều trị đã không còn hiệu lực. Mặc dù khó đánh

giá một cách định lượng nhưng rõ ràng thực trạng kháng kháng sinh đã, đang
và sẽ gây ra những tác động tiêu cực đối với ngành y tế và kinh tế Việt Nam.
Thực trạng này là hậu quả tất yếu của mức độ sử dụng kháng sinh cao cả trên
người và trong nông nghiệp, mà đa phần là tình trạng sử dụng không hợp lý.
Theo báo cáo của một nghiên cứu dựa trên cộng đồng tiến hành năm 1999,
78% kháng sinh được mua từ các nhà thuốc tư mà không có đơn, 67% khách
hàng tham khảo tư vấn của nhân viên bán thuốc trong khi 11% tự quyết định
về việc sử dụng kháng sinh. Chỉ có 27% số nhân viên bán thuốc có kiến thức
về sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh (Larsson, M., et al, 2000) [29].
Mặc dù có các quy chế và các tài liệu hướng dẫn về kháng sinh, việc bán
kháng sinh không có đơn vẫn là tình trạng diễn ra phổ biến ở Việt Nam
(Lewis R, 2009) [30]. Theo một nghiên cứu khác tại cộng đồng năm 2006 cho
thấy tình trạng sử dụng kháng sinh không cần thiết trong điều trị nhiễm khuẩn
đường hô hấp cấp thể nhẹ ở trẻ em dưới năm tuổi tại khu vực nông thôn Việt
Nam, 63% trẻ nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp thể nhẹ đã được điều trị với
kháng sinh (Kareen N.H, 2013) [25].
Một nghiên cứu khác cũng cho thấy từ khi sử dụng Penicillin vào
những năm 1940, tính kháng thuốc đã hình thành ở tụ cầu trong thời gian rất
ngắn. Nhiều dòng vi khuẩn hiện nay đã kháng với hầu hết kháng sinh thông
thường, và sắp tới sẽ kháng cả những kháng sinh mới. Thật sự là trong hai
năm gần đây, việc thay thế kháng sinh cũ bằng Vancomycin dẫn đến sự gia
tăng các dòng kháng Vancomycin VRSA (Kumarasamy K.K et al, 2010) [27].


13

2.7. Cơ chế đề kháng kháng sinh
2.7.1. Ức chế bằng enzyme
Vi khuẩn sản xuất ra enzyme gây phân hủy hoặc làm bất hoạt kháng sinh.
Sự sản xuất enzyme có thể được cảm ứng bỏi một yếu tố bên ngoài (một KS

khác) hoặc bất biến (không bị ảnh hưởng bởi kích thích bên ngoài).
Sự sinh men beta-lactamase:
- Các Beta-lactamase là các men do VK sinh ra và lây truyền theo đường
nhiễm sắc thể hoặc plasmid. Các men này đề kháng KS rất hiệu quả. Chúng làm
bất hoạt các thuốc nhóm Beta-lactamine bằng cách phá hủy nối amide của vòng
Beta-lactam. Trên toàn cầu, KS họ Beta-Lactamines được sử dụng nhiều nhất
trong tất cả các nhóm, vì thế vấn đề đề kháng với KS nhóm này rất đáng lo ngại
(Mary K, 2002) [33], (B M Madison, 1983) [31], (Zmantar T, 2013) [46]. Trong
số các VK gram dương, tụ cầu vàng : S. aureus và các cầu khuẩn gram dương
đường ruột là các tác nhân gây bệnh thường sinh men Beta-lactamase lây truyền
qua plasmid nhất và chúng gây thủy phân KS nhóm Penicillines hoặc
Cephalosporines. Các trực khuẩn (TK) gram âm, đặc biệt là TK gram âm đường
ruột, sản xuất nhiều loại men Beta-lactamases, được phân thành nhiều nhóm
nhỏ, và chúng liên tục được phát hiện ra các nhóm mới (Mary K, 2002) [33].
- Vào đầu thập niên 1980, các Cephalosporines thế hệ thứ 3 được lưu
hành trên thị trường, nhưng sau khi được sử dụng rộng rãi trong điều trị nhiều
bệnh nhiễm trùng, các biến đổi nhỏ trong chuỗi gene gốc đã làm thay đổi đáng
kể tính ái lực của các enzyme đối với cơ chất, và đã hình thành một nhóm
enzyme Beta-lactamase phổ rộng, hay còn được gọi là ESBL (Extend Spectra
Beta-Lactamases). Phần lớn các ESBL này đến từ phổ TEM-1 và SHV-1
(Sandel M.K, 2010) [38].
- Sự đề kháng này diễn biến nhanh, và việc thay thế một lượng nhỏ acid
amine của các men Beta-lactamase làm cho VK càng đề kháng cao hơn nữa, đó


14

là các men Beta-lactamases trung bình có gene ampC hoặc các men
Cephalosporinases cấp độ cao. Gần đây, việc sản xuất quá mức các men
Cephalosporines từ nhiễm sắc thể ở cấp độ rất cao đã tạo nên một loại mới đề

kháng với các Cephalosporine thế hệ 3. Các men này không phân hủy KS mà ức
chế sự tiếp cận của KS tại vị trí tác dụng. Chúng được sinh ra ở các loài VK tự
nhiên sản sinh men cephalosporinases do cảm ứng (trực khuẩn đường ruột,
Pseudomonas aeruginosa), sau khi xãy ra đột biến, các VK sản xuất ra một
lượng rất lớn các men này, đó chính là kiểu hình: “tăng sản cephalosporinases”
hoặc “Cephalosporines bức phá” (Sandel M.K, 2002) [38]. Thêm nữa, việc sản
sinh các men carbapenemases hoặc metallo-beta-lactamases bởi các VK gram
âm có thể làm cho VK đề kháng với tất cả các thuốc nhóm Beta-lactamine, bao
gồm cả KS nhóm Carbapenemes.
Tóm lại, việc tăng dần đề kháng với các KS nhóm Penicillines, với nhóm
Cephalosporine thế hệ 1, 2 và 3, cùng với sự xuất hiện men ESBL, và làm giảm
hiệu quả các các thuốc ức chế men Beta-lactamase (Acid clavulanic, sulbactam),
đồng thời với việc sản sinh men Carbapenemases gây thu hẹp đáng kể kho vũ
khí điều trị chúng ta hiện có và làm cho việc điều trị KS cho các bệnh nhiễm
trùng ngày càng phức tạp (Sandel M.K, 2002) [38].
2.7.2. Giảm tính thấm của tế bào vi khuẩn
Các VK là các vi sinh vật đơn bào: màng tế bào chất phân cách tế bào chất
với môi trường bên ngoài. Các VK gram âm còn được trang bị thêm một vỏ bên
ngoài, gọi là thành ngoài, có tác dụng như một hàng rào che chở cho các PBP
(biến đổi các protein liên kết với Penicillin) nằm ở bên trong. Chất dinh dưỡng
và KS phải đi ngang qua lớp vỏ này để thấm vào bên trong VK, theo cách thức
khuếch tán thụ động ngang qua các kênh (lỗ nhỏ) [38]. Sự giảm tính thấm của tế
bào làm giảm lượng KS đi vào bên trong đến đích tác dụng, nguyên nhân do
biến đổi tính thấm lớp màng bên trong hoặc bên ngoài VK. Sự biến đổi các lỗ


15

của lớp thành tế bào VK gram âm có thể làm giảm hoặc ngăn cản sự khuyếch
tán của KS vào vị trí tác dụng. Dạng đề kháng này nói chung xảy ra đối với

nhiều KS của nhiều nhóm khác nhau, do có khi các KS khác nhau nhưng có thể
dùng chung một loại lỗ. Mặt khác, sự đề kháng này là đặc hiệu khi một KS chỉ
dùng riêng một loại lỗ. Ví dụ sự đề kháng của Pseudomonas aeruginosa với
imipenem là sự đề kháng đặc hiệu gây ra do mất đi các lỗ riêng dành cho các
carbapeneme (Sandel M.K, 2002) [38].
Các đột biến của các lỗ đóng vai trò quan trọng trong việc phát tán đề
kháng, đặc biệt tiếp theo sự giảm kích thước lỗ hoặc giảm số lượng các lỗ. Tính
thấm liên quan đến các lỗ thường phối hợp với việc tổng hợp các betalactamases và tạo nên sự đề kháng cho VK. Đôi khi, có Vk chỉ trở nên đề kháng
khi xãy ra đồng thời hai hiện tượng trên. Ví dụ, với VK Enterobacter sp. và VK
Serratia sp, sự đề kháng với imipeneme là do sự biến đổi đồng thời tính thấm tế
bào và tăng tổng hợp các men beta-lactamases ở nhiễm sắc thể (Sandel M.K,
2002) [38].
2.7.3. Biến đổi vị trí gắn kết
Hiện tượng này là do nguồn gốc từ nhiễm sắc thể hoặc plasmide, theo cơ
chế làm giảm độ ái lực của KS tại vị trí tác dụng. Ví dụ:
a. Biến đổi các protein liên kết với Penicillin (PBP):
Giảm ái lực của các PBP với các thuốc nhóm beta-lactamines có thể do
đột biến gene ở nhiễm sắc thể, hoặc do mắc phải gene bên ngoài có các PBP
mới. Cơ chế này thường gặp với các cầu khuẩn gram dương, như S. aureus và
Streptococcus pneumonia, nhưng rất hiếm gặp ở VK gram âm. Trong số các VK
gram âm, cơ chế đề kháng này được thấy ở VK Neisseria và hiếm gặp hơn ở
Haemophilus influenza (Mary K, 2002) [33].


16

b. Biến đổi vị trí gắn kết ở ribosom:
Biến đổi bên trong tế bào VK ở tiểu đơn vị ribosom đích có thể làm giảm
hoạt tính của KS Macrolides, Clindamycine, nhóm Aminosides hoặc
Chloramphenicol. Sự biến đổi này làm cho KS không đủ khả năng ức chế tổng

hợp protein cũng như sự tăng trưởng của VK, do không thể gắn kết vào vị trí tác
dụng ở ribosom (Mary K, 2002) [33].
c. Biến đổi men DNA-gyrase và men topoisomerase:
DNA-gyrase là men cần thiết cho hoạt tính của các quinolone. Sự đột biến
nhất thời ở duy nhất một acid amine của DNA-gyrase gây ra đề kháng. Tương tự
như vậy đối với các đột biến ở men topoisomerase (Mary K, 2002) [33].
d. Biến đổi các tiền chất đích ở thành tế bào VK:
Hiện tượng này có thể bị xảy ra khi dùng vancomycine, như trường hợp
các cầu khuẩn đề kháng với vancomycine (Mary K, 2002) [33].
e. Biến đổi các enzyme đích:
Sự biến đổi của men dihydropteroate synthetase kháng lại sự gắn kết với
sulfamide và của men dihydropteroate reductase làm mất nhạy cảm với
trimetoprime đồng thời gây ra kháng thuốc. Sự đề kháng của các VK gram âm
đối với các sulfamide là do plasmide tạo các enzyme đề kháng.
2.7.4. Bơm đẩy
KS không thể đạt đến vị trí tác dụng do bơm đẩy chủ động đẩy KS ra khỏi
tế bào VK (efflux). Các chất vận chuyển đẩy thuốc ra là các thành phần bình
thường của tế bào VK và góp phần lớn cho tính đề kháng nội sinh của VK chống
lại nhiều thuốc KS. Các bơm này cần năng lượng. Việc tiếp xúc với thuốc KS
làm thuận lợi cho việc tăng số lượng bơm do đột biến các chất mang, làm tăng
mạnh tính đề kháng của VK. Đây cũng có thể là nguyên nhân gây đề kháng
chéo. Ví dụ, Ciprofloxacine có thể làm thuận lợi việc phát tán đề kháng với
Cephalosporine theo cơ chế bơm đẩy. Các VK gây bệnh quan trọng trên lâm