Nghiên cứu cấu trúc di truyền một số dòng Citrus Tristeza Virus gây bệnh trên cây ăn quả chi Citrus ở Việt Nam

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lâm Đại Nhân đã
tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Lê
Trần Bình, PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã tạo điều kiện giúp đỡ và
đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành bản luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô trong Ban Giám
Hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh –
KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng
Sau đại học trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện trong
thời gian tôi học tập chương trình thạc sĩ.
Trong thời gian thực tập tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận
tình của Th.S. Đặng Thị Hƣơng, Tập thể cán bộ Phòng Công
nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học. Nhân dịp này tôi
xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè những người đã
luôn động viên, góp ý cho tôi trong thời gian qua.

Hà Nội, tháng 10 năm 2010

La Việt Hồng

1


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU

1

1. Tính cấp thiết của đề tài

1

2. Mục tiêu nghiên cứu

2

3. Nhiệm vụ nghiên cứu

2

4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

2

NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1. Nguồn gốc, phân bố và giá trị của cây có múi

3

1.2. Những bệnh thƣờng gặp ở cây có múi

5

1.2.1. Bệnh vàng lá thối rễ

5

1.2.2. Bệnh héo và chết cây do nấm Clitocybe tabessens

5

1.2.3. Bệnh vàng lá Greening

6

1.2.4. Bệnh Tristeza

7

2


1.2.4.1. Triệu chứng và phân bố của bệnh

7

1.2.4.2. Cơ chế lan truyền và trung gian truyền bệnh

10

1.2.4.3. Virus Citrus Tristeza

11

1.2.4.4. Chuẩn đoán và phòng chống bệnh

13

1.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử

15

1.3.1. Kỹ thuật RT-PCR

15

1.3.2. Kỹ thuật PCR

15

1.3.3. Kỹ thuật biến nạp plasmide vào E.coli

16

1.3.4. Kỹ thuật tách dòng

17

1.3.5. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc

19

1.3.6. Kỹ thuật xác định trình tự nucleotide

19

1.3.7. Xử lí số liệu

20

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

22

2.1. Vật liệu nghiên cứu

22

2.1.1. Vật liệu thực vật

22

2.1.2. Hóa chất và thiết bị

22

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

23

2.2.1. Sơ đồ thí nghiệm

23

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu

23

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

31

3.1. Thiết kế mồi

31

3.2. Tách RNA tổng số

32

3.3. Nhân dòng các đoạn gen

33

3


3.4. Tách dòng gen và xác định trình tự gen

34

3.4.1. Tạo plasmide tái tổ hợp

34

3.4.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

35

3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tổ hợp bằng phương pháp colony-PCR

36

3.4.4. Tách plasmide và cắt kiểm tra gen bằng enzyme giới hạn

37

3.4.5. Xác định trình tự các đoạn A, F, P của CTV ở các mẫu CT, HG,

38

HN và VL
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

45

1. Kết luận

45

2. Đề nghị

45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

46

PHỤ LỤC

52

4


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố.

5


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cam, quýt, chanh và bưởi
Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin trong quả cam, chanh, quýt, bưởi (mg/100g)
Bảng 2.1. Thành phần môi trường LB đặc, lỏng
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng tổng hợp cDNA

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại gen
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide
Bảng 2.7. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide
Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho CTV
Bảng 3.2. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide đoạn A giữa CT, HG, HN và VL
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide đoạn F giữa CT, HG, HN và VL
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide đoạn P giữa CT, HG, HN và VL

6


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Triệu chứng do virus Citrus Tristeza gây ra
Hình 1.2. Rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza
Hình 1.3. (A) Tổ chức genome của CTV kiểu dại (CTV9R), (B) Ảnh hiển vi điện tử
âm bản nucleocapsid
Hình 3.1. Kết quả điện di RNA tách từ 4 mẫu lá trên gel agarose 1%
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 0,8%; M: marker 1kb
Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch PCR; M: Marker 1 kb
Hình 3.4. Sơ đồ cấu tạo vector pBT
Hình 3.5. Khuẩn lạc màu xanh trắng sau khi nuôi qua đêm ở 370C trên môi trường
LB đặc
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR với cặp mồi pUC18 trên gel
agarose 1% các mẫu CT, HG, HN và VL, M: Marker 1 kb
Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmide pBT tái tổ hợp bằng
enzyme giới hạn đối với mẫu HG, HN, CT và VL; M: Marker 1 kb
Hình 3.8. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn A giữa các mẫu CT, HG, HN và

VL
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen A
của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank
Hình 3.10. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn F giữa các mẫu CT, HG, HN
và VL
Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen
F của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank

7


Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn P giữa các mẫu CT, HG, HN
và VL
Hình 3.13. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen
P của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank

8


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

µg

microgram

µl

microlitre

µm

micrometer

bp

base pair

BYV

Beet yellows virus

cDNA

Complementary DNA

CS

Cộng sự

CP/NCP

Protein vỏ (Coat protein/Nucleocapsid Protein)

CCM

Cây có múi

CTV

Citrus tristeza virus

CT

Cần Thơ (mẫu thu tại tỉnh Cần Thơ)

DDBJ

Ngân hàng dữ liệu gen Nhật Bản thuộc Trung tâm thông tin sinh học
có địa chỉ truy cập: www.ddbj.nig.ac.jp

DEPC

Diethyl pyro Carbonate

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid

ELISA

Kỹ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme-linked
immunosorbent assay)

EMBL

Phòng Sinh học phân tử Châu Âu thuộc Viện Thông tin Sinh học

Châu Âu có địa chỉ truy cập: www.ebi.ac.uk

HSP70

Heat shock protein 70- protein sốc nhiệt

HG

Hà Giang (mẫu thu tại tỉnh Hà Giang)

HN

Hà Nội (Mẫu thu tại Hà Nội)

IPTG

Isopropylthio-β-D-galactoside

Kb

Kilobase

LB

Luria và Bertani

M

Marker (thang đo kích thước DNA)

9


NCBI

Trung tâm Thông tin công nghệ sinh học quốc gia của Hoa Kỳ có địa
chỉ truy cập: www.NCBI.nlm.nih.gov

ng

Nanogram

nm

Nanometer

ORF

Open reading frames - khung đọc mở

PNAS

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States
of America (Kỷ yếu Viện Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ)

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

PCS

Polycloning site - vùng nhân dòng đa điểm cắt

PMF

Polymethoxylated flavones

RNA

Ribonucleic acid

RNase

Ribonuclease

RT- PCR

Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên
mã ngược)

TAE

Tris - Acetate - EDTA

Taq

Thermus aquaticus

v/p

vòng/phút

VL

Vĩnh Long (mẫu thu tại tỉnh Vĩnh Long)

X-gal

5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây có múi (CCM) là tên gọi chung của nhóm cây cam, quýt, bưởi,
chanh… cùng họ Rutaceae [45]. CCM giữ một vị trí quan trọng trong các loại

10


cây ăn quả vì đây là loại cây có giá trị dinh dưỡng cao, có hương vị thơm
ngon, được nhiều người ưa dùng. Sản phẩm của CCM được sử dụng với nhiều
mục đích khác nhau như để ăn tươi, vắt lấy nước uống, lấy mùi vị, chế biến
thức ăn, làm mứt, chế biến nước giải khát, làm hương liệu…
Trên thế giới, sản xuất CCM là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha
và sản lượng 80 triệu tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15 kg
quả/năm. Ở Việt Nam, CCM được trồng nhiều ở Đồng bằng sông Cửu Long
với diện tích cam quýt là 94.200 ha, bưởi 45.200 ha, diện tích mỗi năm tăng
bình quân gần 7%, CCM được trồng nhiều ở các tỉnh: Cần Thơ, Bến Tre,
Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang [48].
Tuy nhiên một trong những trở ngại đối với mở rộng diện tích, nâng

cao chất lượng CCM là bệnh vàng lá Greening, bệnh Tristeza… làm cho sản
lượng cũng như chất lượng quả giảm, trong đó bệnh Tristeza còn gọi bệnh tàn
lụi có tác nhân là virus Citrus Tristeza gây thiệt hại kinh tế rất lớn trên cây ăn
quả có múi [10], [40], [25].
Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza được coi là một trong hai bệnh gây
ảnh hưởng tới năng suất và phẩm chất cây ăn quả có múi cùng với bệnh
Greening. Tuy vậy, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu trong việc xác định sự đa
dạng về hệ gen của virus này.
Với những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu cấu trúc
di truyền một số dòng Citrus tristeza virus gây bệnh trên cây ăn quả chi
Citrus ở Việt Nam”
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định sự đa dạng di truyền của các dòng virus gây bệnh Tristeza ở Việt
Nam trong mối liên hệ với các dòng virus gây bệnh trong khu vực, thế giới để
có biện pháp quản lý bệnh trên cây ăn quả có múi.

11


- Góp thêm tư liệu khoa học cho việc xác định trình tự nucleotide toàn bộ hệ
genome của virus Citrus Tristeza ở Việt Nam, từ đó đánh giá tính đa dạng di
truyền của các chủng virus được chính xác. Bên cạnh đó còn có ý nghĩa quan
trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Xác định trình tự 3 đoạn gen của 4 dòng virus gây bệnh trên CCM ở các tỉnh
Hà Giang, Hà Nội, Cần Thơ và Vĩnh Long.
- Cây phân loại về sự đa dạng di truyền các đoạn gen của các dòng virus trên.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng: 4 mẫu lá nhiễm các dòng virus Citrus Tristeza thu tại các tỉnh Hà
Giang, Hà Nội, Cần Thơ và Vĩnh Long.

- Phạm vi: xác định trình tự nucleotide 3 đoạn gen của mỗi dòng virus, xây
dựng cây phân loại về sự đa dạng di truyền của 4 dòng virus nghiên cứu.

12


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc, phân bố và giá trị của cây có múi
CCM thuộc họ Rutaceae và có khoảng 150 chi và 1500 loài được trồng
ở vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới [43], [45]. CCM phát sinh từ vùng Đông
Nam Châu Á, trong đó sự phát triển của một số loài cam quýt được kéo dài từ
biên giới Đông Bắc của Ấn Độ qua Myanma và một số vùng phía nam của
Đảo Hải Nam. Những loài này bao gồm: chanh tây, chanh ta, thanh yên, bưởi,
cam ngọt, cam chua…[6].
Hiện nay CCM được trồng khắp nơi trên thế giới trong vùng khí hậu
nhiệt đới và Á nhiệt đới. Những vùng trồng phân bố từ vĩ độ 350 Nam đến
Bắc, những vùng thương mại chính là Á nhiệt đới tại vĩ độ cao hơn 200 Nam
hay Bắc của xích đạo. Ở Việt Nam, CCM được trồng từ Bắc tới Nam. Riêng
Đồng bằng sông Cửu Long, CCM hiện diện tập trung ở các tỉnh Tiền Giang,
Vĩnh Long, Đồng Tháp và Cần Thơ với các chủng loại đặc sản như bưởi năm
roi, bưởi da xanh, quýt tiều, quýt đường, cam mật, cam dây, cam sành…[6].
Cây ăn quả có múi là một loại cây ăn quả lâu năm, nhanh cho thu
hoạch, một số loài có thể cho thu hoạch quả vào năm thứ 2 sau khi trồng. Ở
nước ta, 1 ha cam quýt ở thời kỳ 8 tuổi năng suất trung bình có thể đạt 16 tấn.
So về giá trị kinh tế 1 ha trồng cam cho thu nhập gấp 4 – 10 lần 1 ha trồng lúa
[1].
Trên thế giới sản xuất CCM là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha
và sản lượng 80 triệu tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15 kg
quả/năm. Ở Việt Nam, CCM được trồng nhiều ở Đồng bằng sông Cửu Long
với diện tích cam quýt là 94.200 ha, bưởi 45.200 ha, diện tích mỗi năm tăng

bình quân gần 7% [48].

13


Theo tác giả Trần Thượng Tuấn và cộng sự (1994) [6], quả cam quýt
được sử dụng rộng rãi vì chứa nhiều dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể, nhất là
vitamin C (Bảng 1.1; 1.2). Vị chua nhẹ và hơi đắng giúp dễ tiêu hoá, tuần
hoàn của máu, vỏ giàu pectin được sử dụng làm mứt, kẹo, thuốc nam hay
trích lấy tinh dầu, trái được chế biến thành nhiều sản phẩm như: nước giải
khát, sirô, rượu bổ…
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cam, quýt, chanh và bưởi
Loại
quả

Nƣớc
(%)

Tro
(%)

Protein
(%)

Hydrat
cacbon
(%)

Chất
xơ

(%)

Năng
lƣợng
(%)

Muối khoáng
(mg/100g)
Ca

P

Fe

Cam

87,5

0,5

0,5

8,4

1,4

43

34

23

0,4

Chanh

87,5

0,5

0,3

3,6

1,3

18

40

22

0,6

Quýt

88,5

0,6

0,4

8,6

0,8

35

35

17

0,4

Bƣởi

83,5

0,4

0,5

15,3

0,7

30

30

19

0,7

Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin trong quả cam, chanh, quýt, bưởi (mg/100g)
Loại quả

Vitamin A

Cam

0,30

0,08

0,03

0,20

48

Chanh

0,30

0,04

0,01

0,01

50

Quýt

0,60

0,08

0,03

0,02

55

Bƣởi

0,02

0,05

0,01

0,10

42

Vitamin B1

Vitamin B2

Vitamin PP

Vitamin C

Tinh dầu được cất từ vỏ quả, lá và hoa được dùng trong công nghiệp
thực phẩm và công nghiệp mỹ phẩm. Trên thị trường quốc tế tinh dầu có giá
trị rất cao (1 kg tinh dầu có giá trị trên dưới 300 USD) [1].

14


Ngoài ra, những loại quả thuộc nhóm Citrus còn được dùng làm thuốc
chữa bệnh. Các thầy thuốc Ấn Độ, Trung Quốc đã dùng vỏ quả cam để phòng
bệnh dịch hạch, chữa bệnh phổi và bệnh chảy máu dưới da. Ở Mỹ vào những
năm 30 của thế kỷ 20 các thầy thuốc đã dùng vỏ cam quýt kết hợp với insulin
để trị bệnh tiểu đường. Ở Nga bắt đầu thế kỷ 11, các loại quả CCM được sử
dụng để phòng ngừa và chữa trị bệnh y học trong nhân gian. Ở nước ta, nhân
dân đã dùng cây lá và hoa quả các loại cây ăn quả có múi để phòng và chữa
bệnh từ xa xưa, như vỏ quýt có tên dược liệu là “trần bì”, được sử dụng nhiều
trong một số bài thuốc y học cổ truyền [1]. Nghiên cứu mới đây của các nhà
khoa học Hoa Kỳ cho thấy hợp chất được chiết xuất từ vỏ cam quít có tên
khoa học là polymethoxylated flavones (PMF) - là những yếu tố chống oxy
hóa tích cực thuộc nhóm flavonoid, có khả năng hạn chế gan xuất tiết loại
cholesterol độc hại LDL - gây ra các bệnh tim mạch [50]. Một thử nghiệm của
các nhà khoa học Israel (Học viện Công nghệ Technion) trên chuột cũng cho
thấy tác dụng rất tốt của dịch chiết từ vỏ quả cam, chanh, quýt có tác dụng
chữa hen suyễn do dịch chiết này có chứa limonene [50].
1.2. Những bệnh thƣờng gặp ở cây có múi
1.2.1. Bệnh vàng lá thối rễ

Bệnh vàng lá thối rễ là một trong những bệnh quan trọng trên CCM,
nhất là trên cam sành và quýt tiều. Bệnh thường gây hại nặng trong mùa mưa
lũ, gân lá có màu vàng trắng, phiến lá ngả màu vàng xanh và sau đó rụng đi
nhất là sau các cơn gió lớn. Lúc đầu chỉ có một vài cành bị bệnh và biểu hiện
sự rụng lá, sau đó toàn lá cây bị rụng. Khi đào rễ lên ở phía lá vàng và rụng
thấy rễ bị thối, vỏ rễ tuột khỏi phần gỗ, gỗ bị sọc nâu lan dần lên phần rễ
chính. Bệnh cũng xuất hiện trên cây bưởi, tuy nhiên mức độ bệnh ở bưởi ít
hơn so với cam sành và quýt tiều. Bệnh chủ yếu do nấm Fusarium solani tấn

15


công làm hư bộ rễ, tuy nhiên bên cạnh đó còn nhiều tác nhân khác như
Phytophthora, Pythium, Slerotium, Thielaviopsis… Trong một số trường hợp
do tuyến trùng gây hại và tạo vết thương cho nấm bệnh tấn công. Các loài
tuyến trùng như: Pratylenchus, Radopholus, Tylenchulus.
1.2.2. Bệnh héo và chết cây do nấm Clitocybe tabessens
Bệnh héo và chết cây do nấm Clitocybe tabessens thường xảy ra trong
vườn trồng bưởi năm roi và quýt tiều. Triệu chứng biểu hiện qua hiện tượng
lá đọt héo như thiếu nước, khi bệnh nặng thường héo toàn cây, lá khô. Bệnh
nặng trong mùa nắng, bưởi năm roi là bị hại nặng nhất.
1.2.3. Bệnh vàng lá Greening
Là một bệnh gây thiệt hại nặng đến nền sản xuất CCM thế giới nhất là
Châu Phi và Châu Á. Ở Trung Quốc người ta gọi là “Huanglongbing”, Nam
Phi gọi là Greening. Tuy chưa có một báo cáo chính thức thiệt hại của bệnh,
nhưng ở Philippines người ta đánh giá mức độ nhiễm lên đến 7 triệu CCM
[8]. Thái lan có khoảng 95% cây bị nhiễm bệnh ở các tỉnh phía Bắc và Đông
[12], nhiều nước khác cũng cho thấy thiệt hại của Greening. Ở Việt Nam,
bệnh này cũng gây thiệt hại nặng từ Bắc chí Nam. Có hai dòng chủ yếu gây
bệnh này: dòng Châu Phi phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ 20 - 250C,

dòng Châu Á phát triển cả trong điều kiện lạnh và nóng (lên đến 350C) [38].
Vi khuẩn Liberibacters gây bệnh Greening có thể nhiễm trên tất cả CCM, cam
mật, quýt và các dòng lai của quýt là nhiễm nặng nhất. Bưởi chùm, chanh
Rangpus, chanh núm và bưởi nhiễm ít hơn. Chanh giấy, cam ba lá và các
dòng lai có xu hướng chống chịu tốt hơn. Tuy nhiên, không có giống nào
kháng lại bệnh này cả.
Triệu chứng trên lá: sơ khởi với phiến lá biến màu vàng, nhưng kích
thước lá bình thường, đôi khi hình thành những đốm vàng. Những lá mới sau

16


đó nhỏ hơn kích thước bình thường và mọc thẳng đứng, lá bị vàng như triệu
chứng thiếu kẽm và sắt. Kết quả phân tích lá cho thấy hàm lượmg kali cao,
nhưng hàm lượng canxi, magie và kẽm thấp [17], [24].
Triệu chứng trên quả: quả trên cây nhiễm bệnh trở nên nhỏ lại, biến
dạng và có vị đắng hơn, có thể do hàm lượng axit cao và hàm lượng đường
giảm thấp. Quả thường rụng sớm, những quả còn lại thường vẫn giữ được
màu xanh [28], có thể vì lý do này nên người ta gọi theo triệu chứng bệnh là
Greening. Quả phát triển lệch tâm, hạt trên quả bị hỏng và phát triển không
bình thường.
Theo báo cáo của Garnier và cộng sự (1984) [18], bệnh Greening do vi
khuẩn Gram âm hiện diện trong mô libe gây ra, vi khuẩn này chưa nuôi cấy
được trong phòng thí nghiệm. Đặc tính của dòng vi khuẩn được xác định
thông qua việc định chuỗi gen 16S ribosome DNA và protein trong ribosome.
Kết quả cho thấy vi khuẩn này thuộc chi Alphaproteobacteria (vi khuẩn Gram
âm) và có tên khoa học “Candidatus Liberibacter”. Loài gây hại ở Châu Phi là
Candidatus Liberibacter africanus. Loài gây hại ở Châu Á (gồm cả Việt Nam)
là Candidatus Liberibacter asiaticus.
Theo các tác giả van Lelyveld LJ và van Vuuren SP (1988) [39], khi

cây bị bệnh greening thì hoạt độ của enzyme peroxidase bị giảm, hoạt động
của enzyme này tương quan nghịch với độ nhạy cảm với bệnh greening của
loài, do đó có thể sử dụng chỉ tiêu hoạt độ enzyme peroxidase trong lá như
một “chỉ thị” đánh giá khả năng chống chịu bệnh và độ nhạy cảm với
greening.
1.2.4. Bệnh Tristeza
1.2.4.1. Triệu chứng và phân bố của bệnh

17


Tristeza là một bệnh nguy hại trên CCM với tác nhân gây bệnh là virus
thuộc họ closterovirus. Triệu chứng bệnh xuất hiện trên CCM tuỳ theo giống,
dòng virus nhiễm (Hình 1.1), được phân loại như sau [44]:
 Mức nhẹ: không gây ảnh hưởng nhiều đến năng suất cây, chỉ gây gân
trong hoặc lõm thân nhẹ trên chanh giấy (Citrus aurantifolia).
 Vàng lùn cây con: gây vàng và lùn trên cây cam chua (sour orange,
Citrus aurantium), chanh giấy (Citrus limon), và bưởi chùm (Citrus
paradisi).
 Chết nhanh trên cam chua: ghép cam mật (Citrus sinensis) trên gốc
ghép cam chua sẽ cho cây bị lùn, vàng, lõm thân và chết nhanh.
 Lõm thân trên bưởi: cây bị lùn, cả thân và nhánh cây bị lõm nặng khi
bóc vỏ khỏi thân. Giảm năng suất và kích thước quả, cành trở nên giòn
và dễ gãy.
 Gây lõm thân trên chanh tàu: cây vẫn sinh trưởng bình thường, thân
chính và cành bị quặc quẹo, khi bóc vỏ thân, phần gỗ bị lõm vào rất
nhiều.
 Gây vàng nửa dưới quả gặp ở quýt đường: cây vẫn sinh trưởng và xanh
tốt, tuy nhiên khi quả đạt kích thước bằng quả bóng bàn thì quả bị vàng
phần nửa dưới lên cuống quả, quả rụng hàng loạt, gây thất thoát nặng

cho nhà vườn.
Dịch bệnh gây thiệt hại cây với cây cam chua lần đầu tiên được báo cáo
ở Nam Phi trong những năm đầu của thế kỷ 20, và ở Argentina và Brazil
trong thập niên 30 thế kỷ trước sau khi các nước này nhập khẩu các CCM
nhiễm bệnh và rệp truyền bệnh Toxoptera citricida. Hơn 80 triệu cây ghép
trên gốc cam chua (Citrus aurantium) đã bị chết hoặc không sinh sản được
bởi CTV. Các thiệt hại gây ra tại Argentina (hơn 10 triệu cây), Brazil (hơn 6
triệu cây) và Hoa Kỳ (hơn 3 triệu cây) [14]. Chỉ riêng ở Tây Ban Nha có hơn

18


40 triệu cây, chủ yếu là cam ngọt (Citrus sinensis) và quýt (Citrus reticulata)
được ghép với cam chua cũng giảm khả năng sinh sản [15]. Ngoài ra, CTV có
thể gây ra thân rỗ ở một số giống CCM bất kể gốc ghép được sử dụng, đó là
nguyên nhân quan trọng dẫn đến sự suy giảm của năng suất và chất lượng
quả. Đã có rất nhiều nghiên cứu về bệnh citrus tristeza virus ở vườn cây ăn
quả có múi ở Châu Âu [15], [21], [22]. Khi cây bị bệnh tàn lụi cho ra rất
nhiều hoa và quả nhưng chỉ vài năm cây tàn lụi và chết nhanh chóng [7].
Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza thấy xuất hiện trên các vườn quýt với
triệu chứng quả bị vàng nửa dưới, còn trên chanh giấy với triệu chứng gân
trong và dòng virus gây lõm thân trên chanh tàu [3], [44].

19


Hình 1.1. Triệu chứng do virus Citrus Tristeza gây ra

20

(A) Bệnh úa vàng trên cây cam ngọt ghép với gốc cam chua bị nhiễm bệnh do CTV, so
với cây bình thường ở giữa.
(B) Tristeza gây ra sự suy giảm nhanh chóng của cây cam ngọt trên gốc ghép cam chua
(cây ở giữa) bao quanh là các cây với các trạng thái bệnh khác nhau suy giảm chậm.
(C và D) thân của cây cam ngọt nhiễm CTV khi ghép với gốc cam chua, và có dạng tổ ong
ở mặt trong của vỏ cây của các gốc cam chua dưới đoạn chồi của cây bị nhiễm Tristeza.
(E, F và G) Tristeza là cho quả nhỏ (so với một loại trái cây bình thường trên bàn tay) các
cành và thân của một cây bưởi bị rỗ.

1.2.4.2. Cơ chế lan truyền và trung gian truyền bệnh
Tác nhân truyền bệnh CTV từ cây bị nhiễm bệnh sang cây khoẻ mạnh
là rầy mềm Toxoptera citricida, Aphis gossypii, Aphis spiraecola, Toxoptera
aurantii và Myzus persicae (Hình 1.2) [46]. Nhiều tác giả cho rằng rầy mềm
Myzus persicae chỉ truyền virus thuộc dòng nhẹ, nên ta có thể dựa vào đó để
lây truyền dòng nhẹ phục vụ cho phương pháp bảo vệ chéo (Crossprotection). Ngoài ra virus còn được truyền qua việc chiết ghép.
Sự xâm nhiễm của virus trong thực vật được cho là liên quan đến hai
quá trình: di chuyển từ tế bào này sang tế bào xung quanh (khoảng cách ngắn)
và di chuyển giữa các bộ phận của cây (khoảng cách dài). Svetlana Y. F. và
cộng sự (2008) [35] đã kiểm tra hệ thống xâm nhiễm của CTV ở các loài
CCM khác nhau. Bằng cách sử dụng một dòng CCM “sạch bệnh” CTV và
virus gắn protein huỳnh quang màu xanh (green fluorescent protein-labeled
virus), kết quả cho thấy có sự di chuyển từ tế bào tới tế bào và di chuyển
khoảng cách dài, hai con đường này thường không bị giới hạn, và khả năng di
chuyển thay đổi tuỳ theo cây chủ. Tập trung phân tích sự xâm nhiễm ở hai
loài cây có múi khác nhau, Citrus macrophylla (loài ít nhạy cảm với CTV) và
cam chua (loài nhạy cảm hơn với CTV), đã cho thấy rằng trong các cây chủ
nhạy cảm hơn có các điểm xâm nhiễm bao gồm một nhóm các tế bào, trong
khi ở những loài CCM ít nhạy cảm với CTV thường là duy nhất một tế bào.

21


Hình 1.2. Rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza

1.2.4.3. Virus Citrus Tristeza
Virus Citrus Tristeza (CTV) có nguồn gốc ở Châu Á và đã lan truyền
đến tất cả các nước đang phát triển CCM. CTV thuộc chi Closterovirus có
kích thước khoảng 2000 x 12 nm [23], [13], [33] (Hình 1.3 B). Genome là sợi
RNA đơn dương, không phân đoạn. Vỏ protein bao gồm hai phân tử protein
CP và CPm có kích thước phân tử tương ứng khoảng 25 kDa (chiếm 95%) và
27 kDa (chiếm 5%) [41]. Protein CP cấu tạo nên phần thân của virus còn
protein CPm cấu tạo nên phần đuôi ngắn của virus. Hình thành hạt virion có
cấu trúc “rắn đuôi chuông” ở đầu 5’ của hạt virion. Cấu trúc virion bất thườn
này lần đầu tiên được phát hiện ở BVY (Beet yellows virus) [19]. Những
phân tích hoá sinh và di truyền cho thấy hai protein này giữ những chức năng
khác nhau trong hạt virion virus.
Bộ gen của CTV có kích thước khoảng 19,3 kb (Hình 1.3 A) bao gồm
12 khung đọc mở (ORF - open reading frames) và hai vùng không mã hoá
(UTR) đầu 5’ và đầu 3’, mã hoá cho ít nhất 19 protein bao gồm 2 enzyme
protease tương tự papain, các protein liên quan tới sự tái bản (RNA
polymerase, helicase, methyltransferase), protein giống với heat shock protein
Hsp70 homolog (Hsp70h), 2 protein vỏ CP và CPm, protein p23 tương tác với
RNA, protein p20 được tích luỹ trong thể vùi. Một số protein chưa rõ chức

22


năng như p61, p13, p18 [32], [33], [34], [47]. Hsp70h đóng vai trò kép liên
quan đến việc hình thành đuôi của virion, và sự chuyển động của virus từ tế

bào này sang tế bào khác [10].
Trình tự bộ genome hoàn chỉnh của một vài dòng CTV đã được công
bố [23], [35], [30], [27], [40], [8], [42], … Các chủng CTV khác nhau trên thế
giới có độ tương đồng gen là không giống nhau, độ bảo thủ CTV giảm dần từ
đầu 3’-5’ [10].

Hình 1.3. (A) Tổ chức genome của CTV kiểu dại (CTV9R): PRO: protein giống papain,
MT: methyl transferase, HEL: helicase, RdRp: RNA - dependent RNA polymerase.
(B) Ảnh hiển vi điện tử âm bản nucleocapsid rộng và nhỏ của CTV (trái), và nucleocapsid
được xử lí bằng kháng thể đặc hiệu CPm, được gắn vào đó là các hạt vàng 10 nm (phải).

Để xác định trình tự genome có vai trò trong việc biểu hiện bệnh,
Albiach và cộng sự (2010) [9] sử dụng phương pháp lai phân tử từ hai chủng
T36 gây vàng cây ghép (seedling yellows syndrome) và T30 không gây triệu
chứng này để xác định trình tự liên quan. Các tổ hợp lai T36/T30 được tạo ra
bằng cách thay thế một số vùng trình tự T30 vào các vùng khác nhau genome
đầu 3’ của chủng T36, sau đó tái bản trong tế bào trần thuốc lá. Các hạt virion
được hình thành được nhiễm vào Citrus macrophylla, làm tương tự với chủng

23


T36 để làm đối chứng. Các mẫu này sau đó được ghép lên cam chua. Kết quả
cho thấy, với tổ hợp lai T36/T30 được thay thế bởi trình tự T30 ở vùng không
được dịch mã p23-3’ (vị trí nucleotide từ 18.394-19.296) không có triệu
chứng vàng cây ghép hoặc chỉ có rất ít triệu chứng này.
Tác giả Ngô Ngọc Lan và cộng sự [3] đã tách dòng và xác định trình tự
gen mã hoá protein vỏ CP và CPm của hai dòng virus gây bệnh ở cây quýt
trồng tại Cần Thơ và cây cam sành trồng tại Vĩnh Long, đã thu được gen CP
có kích thước 672 nucleotide và gen CPm có kích thước 723 nucleotide. Hai

gen này có mức độ tương đồng cao so với 10 dòng CTV ở các nước khác
nhau, hai dòng CTV của Việt Nam được xếp chung vào một nhóm cùng với
dòng NuagA (Nhật Bản), B165 (Hoa Kỳ), SY 568 (Hoa Kỳ), VT (Israel),
T318A (Tây Ban Nha) trên cây phát sinh chủng loại.
CTV được chia thành 5 chủng chính [46]:
 Virus seedling yellows
 Virus grapefruit pitting
 Virus grapefruit stunt bush
 Virus lime die-back
 Virus Ellendale mandarin decline
1.2.4.4. Chuẩn đoán và phòng chống bệnh
Bệnh Tristeza gây ra từ nhiều dòng virus khác nhau, việc hiểu rõ dòng
virus gây hại giúp cho việc quản lý bệnh dễ dàng hơn, các dòng CTV khác
nhau thì gây bệnh khác nhau và chúng có thể chứa các genome “biến thể” tùy
thuộc loài rệp truyền bệnh và loại gốc ghép. Các dòng này có thể được phân
biệt bằng các xét nghiệm các mẫu RNA mạch kép [29] hoặc bằng cách sử

24


dụng kháng thể huyết thanh đơn dòng đặc hiệu [16] hoặc các kháng thể đơn
dòng MCA13 [31]. Có thể sử dụng một số phương pháp sau để giám định:
- Phương pháp giám định bệnh đơn giản nhất là ghép mắt bệnh lên cây
chanh giấy, nếu triệu chứng gân trong xuất hiện trên lá non chứng tỏ
cây đã nhiễm bệnh.
- Phương pháp hữu hiệu nhất có thể sử dụng là dùng kháng thể để giám
định bệnh thông qua ELISA, Immuno Sorbent Eletron Microcopy
(ISEM), Dot Immuno Blot Assay (DIBA) hoặc que thử nhanh.
- Phương pháp RT-PCR cũng được sử dụng rộng rãi trong việc giám
định bệnh.

- Sự phát triển của Tissue print-ELISA [15], [20], để phát hiện CTV
trong các mặt cắt của nguyên liệu thực vật trên màng nitrocellulose,
cho phép kiểm tra với độ nhạy cảm cao của hàng ngàn mẫu một cách
đơn giản mà không cần phải chiết xuất.
Để phòng chống bệnh Tristeza, nhiều phương pháp có thể được áp
dụng như loại trừ cây bệnh, thay đổi phương pháp canh tác như trồng xen
canh với ổi. Biện pháp phòng trừ sinh học như sử dụng dòng nhẹ để bảo vệ
chéo, sử dụng gốc ghép kháng bệnh, sử dụng công nghệ sinh học thông qua
chuyển gen, cụ thể như:
- Dùng dòng gây bệnh nhẹ để chủng lên cây và cây sẽ chống chịu tốt khi
có dòng khác độc hơn tấn công (cơ chế bảo vệ chéo - Mild strain crossprotection)
- Sử dụng giống kháng hoặc gốc ghép kháng: nhiều giống CCM tỏ ra
chống chịu bệnh này nghĩa là virus vẫn tồn tại trên cây nhưng không lộ
triệu chứng. Một số giống khác kháng lại bệnh cũng có nghĩa là virus

25