Sàng lọc, tinh sạch và bước đầu nghiên cứu chất kháng viêm từ thực vật sử dụng thụ thể Toll-like 4 (TLR4)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.5 MB, 71 trang )

và
P

dẫ

ỉ

ôi hoàn

ứ
ứ
v
PG

Tôi cũ

Đặ

ứ

e
Đ

Đ

E z me

P

e

P
Đ

d

d
ứ

D

ụ

A

ĐOA

L

e

: "X

d
ụ

d

ụ

-

e

e

"
VAST03/11-13 d

P
ứ

Tô
ặ
ũ
dẫ

ỉ õ

D

ụ

Ụ

Ụ

ụ
L

L
ụ ụ
D

ụ

D

ụ

D

ụ

ẽ

Ở ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. L d
2

........................................................................................... 1

ụ

ứ ..................................................................................... 2

3

ụ

ứ .................................................................................... 2

4. Đ

............................................................................... 3

ỘI DU G ....................................................................................................... 4
ƯƠ G 1

Ổ G UA

ÀI LIỆU ........................................................... 4

1.1.

..................................................................................... 4

12

................................................................................. 5
121

e

122

e

123
ụ

.................................................................................. 8

ụ

132

1

d .......................................... 7

.................................................................................... 8

13
131

d (NSAID) ............... 6

.......................................................................... 8
ụ

ứ
De

........................................................ 8

1321

ụ

1322

ụ

- like (TLR) ................................................... 10

1323

ụ

glucocorticoid (GR) .................................................. 14

-1 ...................................................................... 8

e .................................................................................. 18

1

in vitro .................................. 19
1 1

dụ

e

ỉ

e

e

-kB

(NF-kB dependent luciferase reporter assay) ............................................ 19
1 2

dụ

ụ

1 3

dụ

ụ

1

ứ
ƯƠ G 2

d G

.................. 21

L .......................................... 23
.................................................. 25

GUYÊ LIỆU À P ƯƠ G P ÁP G IÊ

2.1. Nguyên l

ỨU ......... 28

.............................................................................................. 28

211

....................................................................... 28

2.1.2. Hóa ch t .......................................................................................... 28
22 P

ứu.......................................................................... 29

221

e ừ t

a chu t (bone

marrow-derived macrophage - BMDM) ................................................... 29
2.2.2. G

ứ

e

2.2.3. Đ

ứ

LP ..................... 30

e

d

...................................................................................................... 30
2.2.4. Đ
22

d

Đ

2.2.6. Đ

................................ 31

hi u qu ức ch
d

e

ng tín hi u MAPK .................... 31
de

2.2.7

ứ

D

D -PAGE)........32

.............................................. 33

2.2.8 P
ừ

......................................................................... 33

2.2.9 X
ƯƠ G 3
3.1 X
L
311

.................................................................................... 34
U

À

LU

d

.................................................. 35

in vitro

ụ

......................................................................................................... 35
e ừ

................................... 35

312 G
dụ

ứ

d

LP ................................................................................................... 35

313 Đ

d

31

................................ 38

d
ụ

L

...................................................................................... 39

31

d
ụ

3.2. X

e

L

................................................................... 42

d

....................... 43
B

3.2.1.

.................................................................................... 43

3.2.2.

............................................ 44

3.2.3 X

................................. 46
e

3.2.4
33 B

e

ứ

331

e

e

e ..................... 48

methyl ferulate ........ 50
eứ

e
e

........................................................... 50

3.3.2. Methyl ferulate ức ch quá trình phospho c a y u t t phân
bào b ng LPS kích thích thông qua thụ th TLR4.................................... 51

LU
DA

À ĐỀ G Ị ............................................................................. 54
Ụ

ÀI LIỆU
P Ụ LỤ

Á
A

Ô G

Ì

ỦA Á GI ...................................... 55

............................................................................... 56

....................................................................................................... 62

DA H

Ụ

Á THUẬT GỮ V ẾT TẮT

ASP

Aspirin

BMDM

Bone marrow derived macrophage

COX

Cyclo - oxygenase

DMSO

Dimethyl sulfoxide

ELISA

Enzyme - Linked Immuno Sorbent Assay

GC

Glucocorticoid

GR

Glucocorticoid receptor

HPLC

High performed liquid chromatography

IL

Interleukin

kDa

Kilo dalton

LPS

Lipopolysaccharide

MAPK

Mitogen activated protein kinase

NF-kB

Nuclear factor kappa, light chain enhancer of activated B cell

NMR

Nuclear magnetic resonance

NSAID

Non - steroidal anti - inflammatory drug

OD

Optical density

PAGE

Polyacrylamide gel electrophoresis

SDS

Sodium dodecyl sulphate

TLC

Thin layer chromatography

TLR

Toll - like receptor
α

Tumor Necrosis Factor alpha

DA H
B

2.1 D
31 Đ

B

3 2 P ổ 1H và 13

Á B

G

d

ứ
B

Ụ

dụ

L

d

29
e

1

38
47

DA H

Ụ

Á HÌ H VẼ, ĐỒ THỊ

11

ụ

De

9

L

Hình 1.2.
Hình 1.3.

LP

Hình 1.4.

ụ

11
L

13

G

d

15

ụ

Hình 1.5.
1

-1

B

d

17

L

Hìn 1 7
1
Hình 1.9

18

dụ

e e

ỉ

dụ

ụ

d G

22

dụ

ụ

- like (TLRs)

24

e

Hình 3.1

e

e

-kB. 21

ừ

35

Hình 3.2. LPS kích thích sinh TNFα, IL6, IL10
macrophage. A. TNFα; B. IL6; C. IL10
ứ

Hình 3.3.

e

ứ

37

α

LP

1

e
ặ

d
40

Hình 3.4. K

ứ

e IL

ứ

LP

e
1

ặ

d
41

Hình 3.5. K

ứ

e IL10

ứ

LP

1

d
3.6

e

ặ
42

dụ

ụ

-like (TLR)

43

37

B

44

3 .

ừ
B

3 . P ổ

45
PL

3 10.

ừ
e

H×nh 3.11. C¸c
3 12.

e

46

e

46

methyl ferulate ừ
e

B

e

B

e

49
e

e
3 13. C

AP

50
52

Hình 3.14. Methyl ferulate ức ch quá trình phospho c a p38 (P-p38)
trong BMDM

53

1

Ở ĐẦU
do chọn đề tài
ẩ
ặ
ặ

ẩ d

d

ẫ
ặ

ẫ

ụ

é d

dẫ
…
ũ

ặ
e

D

000

2000

22

33

ứ

dùn
ũ

d

[6]

d

dụ

ứ
ứ

d

ụ

ứ
dụ

dụ

ừ
ẩ

ụ

ụ

ứ

e

ẫ
ĩ

ứ

ứ

dụ
ứ

Nam,

t
ũ

ứ
khá

Đ

dụ
ẩ

2

ứ
ỉ dừ

ứ

in vivo ổ
dụ

ũ

Đ

ũ

ít
ứ

dụ

ứ
ứ
ứ

ụ

L

G

ứ
ặ

Đặ

in vitro cho phép
ừ

nguyên

Đ

“ àn
i

t th c

t

ọc, tinh

ch à bước đầu n hi n c u ch t h n

d n th th To -like 4 (TLR4)”

d

in vitro
ứ
ụ

.

ụ

dụ

dụ

ừd

viêm

d

i

ứ
ừ

ứ

d

ẩ
d

2

c đích n hi n c u
ứ
dụ

3

ụ

-X
TLR4.

e

-like 4 (TLR4)

hiệ

ừ
.

n hi n c u
ẩ
d

d

d
in vitro

dụ

ụ

3

d

-

dụ
d

in vitro

.
ừd

- B

.

ứ
: i)

viêm

tokine

: IFN, IL6, TNF

AP .

P-p38
4 Đón
X

óp

ới của đề tài

d

viêm in vitro
dụ

IL10; ii)

ứ
ụ

L
.

ứ

protein

4

Ộ DU G
HƯ
1.1. Khái niệ

G

TỔ G QUA TÀ

ỆU

ề i

Viêm (inflammation

n gây
ứ

ổ

ứ

ứ

dẫ
ổ
ứ

(tumor), nóng (calor)

(rubor)

(dolor).
ổ
e

ặ

ặ d

ứ

ổ

d

ổ

ổ

d
3

ứ
ổ

:
d

ứ

ỉ

ổ

Nguyên nhân gây viêm

ứ

2

- Nguyên nhân ngoại sinh: d

:

ẩ
c

d
d

ze
ứ

), c

- Nguyên nhân nội sinh: d
ổ

gâ
trong

ẩ

).
( e

acid uric trong

goutte), do h
ứ

do p

ổ

ứ

hay do viêm xung

5

h
ũ

ổ

e

ặ

ứ

do

lâm

ổ
ứ

ẽ

ổ

d

d

PG

e

PA

hóa

e e
e e

e

L

e

d
ụ

-1
e z me "d

e

:

dẹ "

proteaza, interleukin, cytokine, superoxide, hydroperoxide …
ổ

é
d
dẫ

d

ẹ

dẫ

é d

ũ

ẽ dẫ

d
ụ
ẽ

ẽ

ụ

dẫ

ặ

ổ
d

ứ

[35].
1.2. Các ch t h n

i

Các ch

c quá trình viêm mà chỉ làm

gi i h n hoặc ch m quá trình này b ng cách ức ch vi c s n xu t các ch t
e ….

trung gian gây viêm
3

:

6

2

c ch t h n

i

h n có b n ch t t oid
e

AD

d non-steroidal anti-

dụ

inflammatory drug - NSAID)

ng

steroid
aspirin, ibuprofen, diclofenac, và naproxen
dụ

ừ

Đặ

AID

dụ

ỉ
dụ

dụ
AID

dụ
(PG d ứ

khác nhau

ng viêm chung là ứ
e

e

-

e

ổ

X

prostaglandin
ổ

e d

PG

enzyme
dụ

trong quá trì

e

ng viêm. Ngoài ra NSAID còn

ứ
ứ

enzyme ứ

ứ

d

ứ

-

e
dụ

dụ

ng viêm.

dụ

ng viêm,

AID
ứ

ổ

dụ

teroid

ụ

d d

PG nên

e

d d

D

-

AID

d

ổ
Ngoài ra, các

AID

d
d

AID
ổ

ứ

7

e

e

-

e

leukotrien ổ

dụ
22

é Vì

AID
c ch t h n
e

i

ứ

dụ

ụ

có b n ch t t oid

d

é

ặ ổ

ứ ừ 17

cacbon

e
e
d

corticoid (
ặ

de
e

e

e

d

ed

e

ặ

ed
e

de G
d d

d

e, hydrocortisone,

e

e

e

d

e
d ứ

ỳ

d

e
ẩ

dĩ

dụ

d

d

dụ

ặ ứ

e e

GM-CSF), e
ừ

d

d

e

e

;

ổ

e
Glucocorticoid còn

ứ

d

e

glycosaminglycan dẫ

Đ

ứ

ũ
ứ

Ngoài ra glucocorticoid
ứ

ổ
dụ

d

dụ

ứ
ẩ

ứ

enzyme
d

d

ày góp

.

ứ

d

ứ
ứ

8

23

c ch t h c
d

olchicin. Colchicin
ứ

ứ

ứ
ứ

ứ

e

te t

e

e z me

dụ

lysosome

ứ

ặ
00 Da Đ

glycoprotei

e
e

các
e [42].
1.3.

h i niệ

3

Th th

ề th th
à phân o i

ụ

e

ụ

sinh (ligand

:

- Thụ thể hướng ion (ionotropic receptor):
.
- Thụ thể hướng chuyển hóa (metabotropic receptor):
ứ
1.3.2.

c th th t on đ p n

i

1.3.2.1. Th th D ctin-1
e

Dectin-1
e2
1

t
ụ

C6H9(NO3).

1

ụ

De

e2

ụ

1

d

-1
d

Dectin-1

e

-

e
De

trò quan tr
ụ

e

d

e

[40].

2 kDa

ứ
e

ứ

-1

ặ

β-glucan
ặ

ẽ

9

dẫ

e

e

e

(ROS) và quá trình nit
[4040]. N

ứ

De

e

-1 trong

ứ

Mycobacterium tuberculosis [25].
ụ

D
ừ

De

-1

ứ

ứ
ặ

ẳ

ừ

1

2

cytokine, quá trình phospho h
activated protein kinase)
ụ

De

ứ

APK - mitogen
d (ROS) thông qu

-1 [15].

Hình 1.1

ơ chế ho t độn của th th D ctin-1 [50]

10

1.3.2.2. Th th họ to –like (TLR)
Đ

ứ

ứ

ẩ

ứ

ặ

1

e
e

d

Drosophila

ỉ

ứ

ừ

[27]
õ
ứ

11

ứ
d

e e e

e

ẩ

Ở

12

L
L

ụ

L 1 - L 12

L

e

d

ứ

I

ng

ứ
e
L

d

ụ

ụ

P

d
Đ

ừ

ặ

ặ
e

gram (-

d

nh

z

ẩ

ụ

ẩ
L

L

ỉ

ứ

e

d

LP

d

ẩ

e

ẩ

+

ẩ

e

e

de

L

ẫ

PA P

L

ụ

d

ẽ
L
L

L

dụ LP

các

de

e
e

e

de

ẩ

L

e

e e
e

protein kinases-

AP

ứ

e
[29] B

e - activated
L

11

d

ứ

e

L

d
de

ẩ

LP

d

ứ

ặ

dA Đ

ph

d

ứ

ẩ

L
d

e

MyD88 (myeloid differentiation primary response protein 88)
d

D

ẳ

L 2

ụ

toàn vào MyD88 (myeloid differentiation primary response protein 88), hay
L

ụ
ụ

e
toll/IL-1

ứ

Hình 1.2

ứ

d

ứ
e

D

/ I

I AP
e e

[30].

ơ chế ho t độn của

ột ố T R [49]

ặ
A

12

L

ặ

ẽ
:

é

ứ

ẫ

d

ĩ
ứ

d

ặ

r
ụ [14]
LP

e

ụ

m

ẽ
d
ặ

ứ
0%

ẩ

ổ

LP

ứ
d

goài ra, Bhattacheriee và Akira ũ

thụ thể nhận dạng đặc hiệu LPS

TLR là

ứ

ặ

LPS khô

ứ
ẩ

L

ẩ

ứ

LP [10]. V

ứ

ẩ
L

1 3). Ch

TLR4

ứ
ặ

B

LP

d
ặ

LPS ũ
d

ặ

ứ

dụ

LP

ứ
[10]

rình si
L

e

TLR4 là MD-2

d

gâ

ụ

L 4

ứ

Đ

13

Hình 1.3
L
ứ

ơ chế ho t độn

h n

d

P của T R4 [46]
ứ

3 / eJ

ứ

ứ

7BL/10

LP

ứ

[29]. Các

L
[18]

L

ẩ

ứ

L

[43]

d

ũ
ứ
ẩ

: Neisseria meningitides, E. coli, Haemophilus

influenzae, Klebsiella pneumoniae, Brucella abortus, S. pneumoniae và
ẩ

Mycobacteria tuberculosis
L

[37]. L

ũ

d
[23]

,

ứ
e
e

leukemia virus) [34]

L

14

ặ

ẩ

ẩ

é [17], [21], [39].
1.3.2.3 Th th

ucoco ticoid GR

ụ

d

ẫ

e

e e

-P

ụ

- like, lectin và dectin-1
d

e - asociated molecular

patterns- PA P
ụ

ẩ

d

ẽ
ed

e
d

P

e

e

ứ

bà

[11], [20] B

ụ
ụ

Schäcke

d
d de
G

e

AD

d G

[36].

d

d
G

d

d G

ụ
[36]

3

:

ứ2

ụ

d G

ụ

s

e
ụ

d

ứ

d de

e

AD

ứ3

d [22]
ụ

ặ

d

ụ

d
ổ

ặ

d

AD

e e

ụ

Ở

d
0 70

0

ẽ

ứ
ặ

ụ

e
d

15

ẽ

ổ

d

ẽ

e
AD

ứ
element-G E

d
e

d e
ặ

gene
e

d
ụ

AP-1
d

ổ

e

e
e

e

1

ụ
ặ

AD

NF

- kB (nuclear factor kappa) (Hình 1.4).

Hình 1.4
G

ơ chế ho t độn của th th G ucoco ticoid t on tế bào [48]
d
d
ẳ
ứ

quá trìn

G

d

d
ứ