Phân lập và tối ưu một số điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn nitrate hóa từ một số mẫu nước thải tại trường đại học nông lâm thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------

HOÀNG THỊ THANH NGA

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TỐI ƢU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN SINH TRƢỞNG CỦA
VI KHUẨN NITRATE HÓA TRONG MẪU NƢỚC THẢI TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành/ngành : Công nghệ sinh học
Khoa

: CNSH & CNTP

Khóa học

: 2012 – 2016

Thái Nguyên – năm 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

--------------

HOÀNG THỊ THANH NGA

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TỐI ƢU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN SINH TRƢỞNG CỦA
VI KHUẨN NITRATE HÓA TRONG MẪU NƢỚC THẢI TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành/ngành: Công nghệ sinh học
Lớp

: 45 - CNSH

Khoa

: CNSH & CNTP

Khóa học

: 2012 – 2016

Giảng viên hƣớng dẫn: ThS. Dƣơng Mạnh Cƣờng

Thái Nguyên – năm 2016


i

LỜI CẢM ƠN
Được sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công
nghệ Sinh học-Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp, em đã tiến
hành thực hiện đề tài “Phân lập và tối ưu một số điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn
Nitrate hóa trong mẫu nước thải tại trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên”.
Sau thời gian tham gia nghiên cứu thực hiện đề tài, đến nay em đã hoàn
thành đề tài nghiên cứu của mình.
Nhân dịp này em xin bày tỏ lòng biết ơn tới: ThS. Dương Mạnh Cường,
Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Vi Đại Lâm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học
và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã dạy dỗ,
truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học trong suốt thời
gian học tập.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động
viên để em có tự tin trong học tập và thực tập tốt nghiệp.
Dù đã cố gắng nhiều, xong bài khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu
sót và hạn chế. Kính mong nhận được chỉ bảo, đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô
cùng toàn thể các bạn.
Em xin chân thành cảm ơn.
Sinh viên

Hoàng Thị Thanh Nga


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các dòng vi khuẩn nghiên cứu ..................31
Bảng 4.2. Đặc điểm tế bào các dòng vi khuẩn nghiên cứu .......................................32
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của dòng vi khuẩn A1 ...................33
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của dòng vi khuẩn B3 ....................34
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến dòng A1 ....................36
Bảng 4.6.Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy của dòng vi khuẩn B3......37
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nguồn cacbon hữu cơ đến sự sinh trưởng của dòng vi
khuẩn A1...................................................................................................38
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nguồn cacbon vô cơ kết hợp nguồn cacbon hữu cơ đến sự
phát triển của dòng vi khuẩn A1...............................................................39
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của nguồn cacbon hữu cơ đến sự sinh trưởng của dòng vi
khuẩn B3 ...................................................................................................40
Bảng 4.10. Ảnh hưởng của nguồn cacbon vô cơ kết hợp với hữu cơ đến sự sinh
trưởng của dòng vi khuẩn B3 ...................................................................42


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Chu trình Nitơ trong tự nhiên ......................................................................5
Hình 4.1. Các dòng vi khuẩn nitrate có hoạt tính trên môi trường Winogradsky I ..28
Hình 4.2. Các dòng vi khuẩn nitrate có hoạt tính trên môi trường WinogradskyII .29

Hình 4.3. Dòng vi khuẩn nitrite hóa trên môi trường có chứa thuốc thử Griss ........30
Hình 4.4. Dòng vi khuẩn nitrat hóa trên môi trường có chứa thuốc thử Griss .........30
Hình 4.5. Hình thái khuẩn lạc dòng vi khuẩn A1, B2 ...............................................31
Hình 4.6. Hình thái tế bào dòng A1, B3 ...................................................................32
Hình 4.7. Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của dòng vi khuẩn A1 .......34
Hình 4.8. Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của dòng B3.......................35
Hình 4.9. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của dòng vi khuẩn A1 ....36
Hình 4.10. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của dòng vi khuẩn B3..37
Hình 4.11. Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn hữu cơ đến sự phát triển của dòng vi
khuẩn A1...................................................................................................39
Hình 4.12. Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon vô cơ kết hợp với nguồn cacbon
hữu cơ đến sự phát triển của dòng vi khuẩn A1 .......................................40
Hình 4.13. Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn hữu cơ đến sự phát triển của dòng vi
khuẩn B3 ...................................................................................................41
Hình 4.14. Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon vô cơ kết hợp với nguồn cacbon
hữu cơ đến sự phát triển của dòng vi khuẩn B3 .......................................42


iv

DANH MỤC VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT

AMO : Amon Monoxygenase
AOB

: Ammonium

DO

: Dissolved Oxygen

ATP

: Adenosine Tri-Phosphate

h

: Giờ

ĐC

: Đối chứng

TAN

:Total amonia nitrogen

AOB

: Ammonia Oxidizing Bacteria


v

MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài .............................................................................3
1.2.1. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................3
1.2.2. Yêu cầu của đề tài .............................................................................................3

1.3. Ý nghĩa của đề tài .................................................................................................3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4
2.1. Cơ sở khoa học của đề tài ....................................................................................4
2.1.1. Chu trình Nitơ ...................................................................................................4
2.1.2. Tác hại của việc dư thừa Nitơ đối với đời sống và môi trường ........................6
2.1.3. Trạng thái tồn tại và quá trình chuyển hóa của nitơ trong nước thải ................9
2.1.4. Quá trình chuyển hóa nitơ vô cơ và vai trò của nhóm vi khuẩn nitrate hóa ...10
2.1.4.1. Quá trình Nitrate hóa ....................................................................................10
2.1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nitrate hóa ..........................................12
2.1.5. Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn tham gia quá trình nitrate hóa .....14
2.1.5.1. Các dòng vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa ................................14
2.1.5.2. Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn Nitrosomonas ...........................16
2.1.5.3. Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn Nitrobacter ..............................17
2.1.6. Hiện trạng nước thải tại trường Nông Lâm Thái Nguyên...............................19
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới .....................................................20
2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước .....................................................................20
2.2.2. Tình hình nghiên cứu thế giới .........................................................................20
PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....22
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................22
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................22
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ......................................................22
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................22


vi

3.2.2. Thời gian nghiên cứu ......................................................................................22
3.3. Dụng cụ, môi trường ..........................................................................................22
3.3.1. Dụng cụ thiết bị ...............................................................................................22
3.3.2. Môi trường ......................................................................................................23

3.3.2.1. Môi trường Winogradsky I ..........................................................................23
3.3.2.2. Môi trường Winogradsky II .........................................................................23
3.4. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................24
3.5. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................24
3.5.1. Phương pháp thu thập mẫu..............................................................................24
3.5.2. Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa ..............................24
3.5.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn ...................................................................24
3.5.2.2. Phương pháp làm sạch và tuyển chọn dòng vi khuẩn có hoạt lực cao.........25
3.5.3. Phương pháp nhuộm gram ..............................................................................25
3.5.4. Phương pháp giữ giống ...................................................................................26
3.5.5. Phương pháp phân tích ....................................................................................26
3.5.6. Xác định một số tính chất sinh lý, sinh hóa đến các dòng vi khuẩn nitrat hóa ....27
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................28
4.2 Thử nghiệm khả năng nitrate hóa........................................................................29
4.2.1. Tuyển chọn dòng vi khuẩn có hoạt tính oxy hóa amon thành nitrite ..............29
4.2.2. Tuyển chọn dòng có hoạt tính nitrite thành nitrate .........................................30
4.3. Định danh vi khuẩn dựa trên đặc điểm hình thái ...............................................31
4.4. Tối ưu một số điều kiện pH, nhiệt độ, các nguồn dinh dưỡng đến khả năng sinh
trưởng của vi khuẩn nitrate hóa.................................................................................33
4.4.1. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi khuẩn .........................................33
4.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của dòng vi khuẩn nitrate hóa ......36
4.4.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự phát triển của vi khuẩn nitrate hóa .....38
5.1. Kết luận ..............................................................................................................44
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................45


1

PHẦN 1

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nước thải - nước sau khi sử dụng đã bị nhiễm bẩn từ sinh hoạt, hoạt động
công nghiệp, nông nghiệp được thải ra khỏi khu vực đang sử dụng về một nguồn
nhận như ao, hồ, sông, biển. Trong khi dịch chuyển, một lượng nước thải nhất định
sẽ thấm vào đất tạo ra nước ngầm cũng đem theo chất gây ô nhiễm.
Tác nhân gây ô nhiễm môi trường trong nước là các chất có khả năng chuyển
hoá thành các chất khác và các chất bền tác động đến cân bằng sinh thái trong môi
trường nước nhận. Về nguyên tắc, các chất bền trong môi trường được coi là ít độc
hại nếu nó không gây hại trực tiếp lên động vât, thực vật sống trong nước hoặc lên
con người hoặc một cách gián tiếp tới con người thông qua chuỗi thức ăn. Có nhiều
họ chất hữu cơ bền trong môi trường nhưng có tác dụng xấu như gây các loại bệnh
nan y, đột biến gen ngay với nồng độ rất thấp. Đó là một số họ chất bảo vệ thực vật,
hormon, kháng sinh, dược phẩm, cùng một số hợp chất đặc thù khác khi thâm nhập
vào cơ thể người và động vật trực tiếp hoặc qua thức ăn. Rất nhiều hợp chất gây ô
nhiễm trong nước thải có khả năng chuyển hoá cao trong môi trường nước tự nhiên
thông qua các phản ứng hoá học, sinh hoá, quang hoá và tác động đến cân bằng sinh
thái của môi trường. Các chất gây đục vô cơ có khả năng chuyển hoá không lớn, khi
tồn tại trong nguồn nước nhận sẽ gây đục, gây hiện tượng cản ánh sáng vào nước,
hạn chế sự phát triển của thuỷ thực vật sống trong đó. Hậu quả kéo theo là làm giảm
nguồn thức ăn của thuỷ động vật, làm giảm nồng độ oxy hoà tan trong nước do quá
trình quang hợp của thực vật bị hạn chế, gây khó khăn cho hoạt động của động vật
thuỷ sinh (Lê Văn Cát, 2007).
Nitơ là nguyên tố cơ bản của sự sống, có mặt ở tất cả các hoạt động liên quan
đến sự sống và trong rất nhiều ngành nghề sản xuất công nghiệp, nông nghiệp. Hợp
chất hoá học chứa nitơ là thành phần dinh dưỡng trong phạm trù nước thải và là đối
tượng gây ô nhiễm khá trầm trọng cho môi trường. Nếu như hàm lượng nitơ có
trong nước thải xả ra sông, hồ quá mức sẽ gây hiện tượng ô nhiễm, điển hình là hiện

2

tượng phú dưỡng. Trong môi trường phú dưỡng, điều kiện sống (pH, oxy tan) biến
động liên tục và mạnh là những tác nhân gây khó khăn, thậm chí là môi trường
không thể sống đối với thuỷ động vật. Thời gian hay chu kỳ sống của tảo có giới
hạn, sau khi phát triển mạnh (bùng nổ tảo hay còn gọi là nước nở hoa) tảo chết lắng
xuống lớp đáy và tiếp tục bị phân huỷ trong điều kiện yếm khí. Giống loài tảo rất
phong phú, trong đó có loài tảo độc (tiết ra độc tố), trong điều kiện phú dưỡng tỷ lệ
thành phần tảo thường thay đổi theo chiều hướng bất lợi, hình thành nhiều loại tảo
độc (C. E. Boyd, 1998), khi phát triển mạnh, tảo che chắn ánh sáng không cho thực
vật sống ở lớp dưới phát triển, gây độc và làm mất nguồn thức ăn cho thuỷ động
vật. Khi chết tảo lắng xuống đáy, bị vi sinh vật và nấm phân huỷ làm cạn kiệt nguồn
oxy hoà tan cung cấp cho các loài động vật khác. Trong khi phân huỷ tảo, các chất
dinh dưỡng và hữu cơ lại được chiết ra môi trường nước từ trầm tích, các yếu tố
trên lại thúc đẩy vi sinh vật phát triển. Vi sinh vật phát triển sẽ bám vào thân, lá
thực vật làm giảm khả năng quang hợp của thực vật.
Để giải quyết vấn đề trên, việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để xử lý
nước bị ô nhiễm đang ngày càng phổ biến. Khác với các phương pháp vật lý, hóa
học… việc sử dụng vi sinh vật giúp tăng cường khả năng phục hồi, khả năng tự làm
sạch môi trường, có tính ổn định cao và thân thiện với môi trường.
Trong tự nhiên, vi sinh vật loại bỏ hàm lượng Nitơ dư thừa trong nước bằng
cách chuyển hóa nitơ dạng hữu cơ và vô cơ thành dạng khí N2 thoát ra ngoài môi
trường. Quá trình này diễn ra chủ yếu nhờ các quá trình amon hóa, nitrate hóa và
phản nitrate hóa. Dạng tồn tại phổ biến của Nitơ trong nước là NH3 cùng các muối
NH4+. Trong đó nitrate hóa là quá trình hiếu khí ( điều kiện có O2), đầu tiên NH4+
được Oxi hóa thành nitrite NO2-, sau đó nitrite NO2- sẽ chuyển hóa thành NO3-. Các
biến đổi này được thực hiện bởi các vi sinh vật, ví dụ như vi khuẩn: Nitrobacter,
Nitrospira, Nitrococcus.... Do vậy, việc tìm ra các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitrate
và vi khuẩn phân giải nitrate có ý nghĩa quan trọng trong việc thiết lập các quy trình
phục hồi sinh học nhằm làm giảm nồng độ nitơ trong nước thải.

Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên thuộc Tổ 10, xã Quyết Thắng–Thành
Phố Thái Nguyên, nằm ở phía Tây cách trung tâm thành phố khoảng 5km, có diện


3

tích lớn, khoảng 102,85ha (TUAF, 2015). Có nhiều người dân, sinh viên, nghiên cứu
sinh sinh sống học tập và làm việc trong trường. Do đó các hoạt động sinh hoạt và
làm việc trong trường Nông Lâm thường xuyên gây phát sinh một lượng nước thải
lớn, lượng nước thải này thải ra môi trường bên ngoài phần lớn chưa qua xử lý gây ô
nhiễm nguồn nước các ao, hồ, suối xung quanh trường và ảnh hưởng tới cuộc sống
của chính những người đang sinh sống, học tập và làm việc tại trường.
Xuất phát từ thực tế đó em tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập và tối ưu
một số điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn Nitrate hóa từ một số mẫu nước thải
tại trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên”. Nhằm tiến tới xây dựng quy trình
phục hồi sinh học trong xử lý Nitơ, góp phần cải tạo môi trường, giảm thiểu ô
nhiễm và bảo vệ cảnh quan nhà trường.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu của đề tài
Phân lập các dòng vi khuẩn nitrate hóa trong một số mẫu nước, làm cơ sở để
tiến hành định danh các chủng và xây dựng các quy trình phục hồi sinh học nhằm
giảm thiểu lượng Nitơ trong các mẫu nước thải.
1.2.2. Yêu cầu của đề tài
- Thu thập một số mẫu nước tại các địa điểm trong trường Đại học Nông
Lâm Thái Nguyên.
- Phân lập được dòng vi khuẩn nitrate hóa trong các mẫu nước thải.
- Tối ưu một số điều kiện sinh trưởng của các dòng vi khuẩn nitrate hóa đã
phân lập được.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài là tài liệu tham khảo cho những nghiên cứu tiếp theo về
xử lý ô nhiễm môi trường nước. Giảm thiểu lượng nitơ trong nước thải nhằm xây
dựng các quy trình phục hồi sinh học, giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
-Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài góp phần nâng cao công tác quản lý và xử lý tốt hơn
nguồn nước thải tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cơ sở khoa học của đề tài
2.1.1. Chu trình Nitơ
Nitơ là yêu cầu của tất cả các sinh vật sống cho tăng trưởng. Nó xảy ra trong
các axit amin bao gồm tế bào protein và nucleotide tạo nên vật liệu di truyền của tế
bào. Nó cũng xuất hiện trong các vitamin có chức năng như coenzyme. Hầu hết các
nitơ trong sinh quyển không thể sử dụng đến các sinh vật cho trao đổi chất của
chúng cần bởi vì nó là một phần của các thành tạo đá mà không chuyển qua dễ
dàng. Nitơ còn là một khí nhiệt động ổn định, chiếm 78% các khí trong khí quyển.
Nitơ có thể tồn tại trong nhiều trạng thái oxy hóa xảy ra trong hệ thống đất và nước.
Những dạng nitơ được chuyển độc quyền bởi các hoạt động trao đổi chất của vi sinh
vật. Sự biến đổi khác nhau của nitơ là một phần của chu kỳ nitơ (hình 1.1), trong đó
đảm bảo rằng nitơ trong môi trường liên tục trở mình. Các quá trình này là sự amoni
hóa, nitrat hóa, khử nitơ, và cố định đạm
(Nhiều vi khuẩn)
Amino acid

Ammoniac

1. Cố định đạm
Việc chuyển đổi của khí nitơ thành NH3 được gọi là cố định nitơ và bị hạn
chế bởi sinh vật nhân sơ. Quá trình này đòi hỏi đáng kể năng lượng và giảm năng
lượng để phá vỡ các liên kết ba khí nitơ. Nó được xúc tác bởi enzyme phức tạp
nitrogenase và cần cả sắt và molypden cho hoạt động. Hai nhóm sinh vật nhân sơ
có khả năng cố định ntơ:(1)sinh vật sống tự do, đại diện bởi Azotobacter,
Clostridium,và vi khuẩn lam dạng sợi;(2) sinh vật cộng sinh,vi khuẩn cố định đạm,
đại diện bởi Rhizobium.Vi khuẩn cố định đạm xảy ra trong đất và nước nơi mà
chúng sửa chữa ntơ trước khi đưa trong tế bào vi khuẩn. Rhizobium sống trong hội
cộng sinh với cây họ đậu như cỏ đinh lăng, đậu phộng. Các vi khuẩn này xảy ra ở
gốc các nốt sần trên cây nơi mà vi khuẩn cố định đạm được sử dụng cho mực đích
dinh dưỡng. Trong quá trình trao đổi, thực vật cung cấp chất dinh dưỡng cho vi
khuẩn và một môi trường có lợi cho cố định đạm. Cộng sinh cố định đạm chiếm hầu
hết các nitơ cố định trong môi trường (Alfred Brown, Heidi Smith, 2014).


5

Hình 1.1. Chu trình Nitơ trong tự nhiên
(Nguồn Alfred Brown, Heidi Smith, 2014)
2. Sự amoni hóa
Khi các sinh vật sống chết đi, chúng vẫn còn phân hủy trong đất bởi một loạt
các vi sinh vật. Protein bị phân hủy bởi protease, giải phóng các acid amin trong đó
nhóm amin được loại bỏ bằng cách khử amin để giải phóng NH3. Acid nucleic cũng
bị phân hủy, giải phóng NH3, và chất thải động vật như acid uric cũng bị phân hủy
để sản xuất NH3. Quá trình sản xuất NH3 trong đất được gọi là sự amoni hóa.
Nitrosomonas

NH4+
Amomiunion

Nitrobacter

NO2-

NO3-

Nitrite ion

Nitrate ion

Vi khuẩn và thực vật có thể hấp thụ amoniac tổng hợp protein mới cần thiết cho
sự tăng trưởng. Một loạt các vi khuẩn thực hiện sự amoni hóa trong đất là Bacillus,
Pseudomonas, và nhiều loài vi sinh vật khác. (Alfred Brown, Heidi Smith, 2014)
3. Quá trình Nitrate hóa
Là một quá trình tự dưỡng. NH3 được oxi hóa thành NO2- và NO3- bởi các
vi khuẩn trong một điều kiện hiếu khí được gọi là quá trình nitrate hóa. Đây là


6

những vi khuẩn hóa dưỡng vô cơ lấy được của nhu cầu năng lượng từ quá trình oxy
hóa ammonia và nitrite để sửa chữa CO2 cho các yêu cầu cacbon của chúng.
Nitrosomonas oxy hóa ammonia thành nitrite sau đó nitrite bị oxy hóa bởi
Nitrobacter nitrate để hoàn tất quá trình nitrat hóa đất. Bởi vì nitrite và nitrate có thể
được sử dụng bởi các thực vật như một nguồn nitơ, các vi khuẩn đóng một vai trò
rất quan trọng trong tạo màu mỡ của đất. Người nông dân chọn các hoạt động của vi
khuẩn nitrate bằng cách cày bừa đất, tạo hiếu khí làm điều kiện thuận lợi cho quá
trình nitrate hóa (Alfred Brown, Heidi Smith, 2014)
4. Quá trình khử Nitrate

Các vi khuẩn kị khí như Paracoccus denitrificans và Pseudomonas sử dụng
nitrate như một chất nhận electron cuối cùng trong quá trình kỵ khí hoặc hô hấp
nitrare. Quá trình này được gọi là khử nitơ, được thải vào khí quyển. Nitrate giảm ở
hầu hết các bước sau đó được thải vào khí quyển. Quá trình này xảy ra trong đất ngập
nước vì ở đó có môi trường kỵ khí và điều đó có thể chiếm mất đáng kể các loại phân
bón nitơ áp dụng cho cấy trồng của nông dân. Quá trình này được đẩy mạnh trong xử
lý nước thải vì nó ngăn chặn sự giải phóng của nitrate và nitrite và hệ thống nước tự
nhiên nơi các ion này có thể gây độc hại đối với cá và các động vật hoang dã. Khử
nitơ là một phần quan trọng của chu kỳ vì nó đảm bảo rằng nguồn nitơ trong tự nhiên
không bị cạn kiệt, các chu kỳ tiếp tục chạy và vi khuẩn chính là các sinh vật để thực
hiện quá trình khử nitơ (Alfred Brown, Heidi Smith, 2014).
2.1.2. Tác hại của việc dư thừa Nitơ đối với đời sống và môi trường
 Tác hại của các hợp chất chứa Nitơ đối với đời sống
Trong những thập niên gần đây, mức NO3- trong nước uống tăng lên đáng kể.
Nguyên nhân là do sự sử dụng phân đạm vô cơ tăng, gây rò rỉ NO3- xuống nước
ngầm. Hàm lượng NO3- trong nước uống tăng gây ra nguy cơ về sức khoẻ đối với
cộng đồng. Ủy ban châu Âu quy định mức tối đa của NO3- trong nước uống là 50
mg/l, Mỹ là 45 mg/l, Tổ chức sức khoẻ thế giới (WHO): 100 mg/l. Bản thân NO3không gây rủi ro cho sức khỏe, tuy nhiên NO3- giảm thành NO2- do men khử nitrat
và gây độc. NO2- ảnh hưởng đến sức khoẻ với 2 khả năng sau: chứng máu
Methaemoglobin và ung thư tiềm tàng.


7

* Hội chứng Methaemo- globinaemia (hội chứng xanh xao trẻ em)
Khi có mặt NO2- thì haemoglobin của máu bị chuyển hóa thành
methaemoglobin. Đối với người trưởng thành, methaemoglobin nhanh chóng được
chuyển thành oxyhaemoglobin nhờ hệ thống khử như NADH-methaemoglobin
reductase, nhưng đối với trẻ sơ sinh 3 tháng tuổi trở xuống hệ enzyme này chưa
phát triển hoàn chỉnh. Sự hình thành methaemoglobin làm giảm khả năng vận

chuyển oxy trong máu tới các tế bào và cơ quan trong cơ thể, làm xuất hiện bệnh da
xanh (Trần Văn Nhân, Ngô Thị Nga, 1999) và dễ bị đe dọa đến cuộc sống đặc biệt
trẻ dưới 6 tháng tuổi.
* Ung thư tiềm tàng
Ở Việt Nam khác với nhiều nước trên thế giới, nước ngầm bị nhiễm NH 4+ rất
nặng. Tuy nhiên NH4+ không độc nhưng dưới tác động của vi khuẩn hiếu khí, nó dễ
dàng chuyển hóa thành NO2-, NO2- có thể chuyển hóa thành axit nitric (HNO2)
trong điều kiện pH axit. Axit nitric là một tác nhân nitro hóa mạnh, khi tiếp xúc với
các thành phần thực phẩm, kể cả axit amin dễ tạo thành nitrosamine là một tác nhân
gây ung thư (Perry, 1999). Rất nhiều nghiên cứu trên động vật như chuột, thỏ….
Cho thấy các hợp chất N-nitroso được đưa vào theo đường ăn uống trực tiếp sẽ gây
tổn thương hoại tử ở ruột, gan và tạo nên xung huyết của phổi. Phức hợp N-nitrsomethylurea cũng gây xung huyết và tổn thương dạ dày, ruột, tụy và làm ảnh hưởng
đến tủy sống. Các nghiên cứu tác động của nitrosamine tới các động vật có vú,
chim, cá và một số loài đông vật lưỡng cư khác cho thấy sự phát triển của tế bà ung
thư và chúng thường xuất hiện ở gan, thực quản, hệ hô hấp, thận…(Perry, 1999)
Ngoài ra, amoni có mặt trong nước ngầm làm giảm hiểu quả của khâu khử
trùng bằng clo, do nó phản ứng với clo để tạo thành các cloramin, có tác dụng sát
khuẩn yếu hơn nhiều so với clo (khoảng 1000 lần). Mặt khác, nó còn giảm khả
năng xủ lý sắt, mangan bằng công nghệ truyền thống. Amoni là nguồn dinh
dưỡng, tạo điều kiện cho các vi sinh vật nước, kể cả tảo, phát triển nhanh, làm
ảnh hưởng đến chất lượng nước thương phẩm, đặc biệt độ trong, mùi, vị nhiễm
khuẩn (CEEITA, 2001).


8

 Tác hại của ô nhiễm nitơ đối với môi trường nước
Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ rất dễ bị oxi hóa sinh hóa để thành CO2, H2O
dưới tác dụng của các vi sinh vật hiếu khí. Sau đó tác dụng với NO3 để tạo thành
N2, CO2,H2O thực hiện quá trình khử nitrat dưới tác dụng của các vi khuẩn khử

nitơ. Sau đó là quá trình phân hủy yếm khí tạo ra CH4, H2S gây sự ô nhiễm (Nguyễn
Thị Kim Thái, Lê Thị Hiền Thảo, 2003).
Sự có mặt của các hợp chất chứa nitơ và phospho với hàm lượng lớn trong
các nguồn nước mặt như sông, hồ gây nên hiện tượng phú dưỡng ở nước
Hiện tượng phú dưỡng là sự dư thừa dinh dưỡng trong môi trường nước, nó
diễn ra chậm, dẫn đến sự phát triển bùng phát nhanh chóng của một số loài thực vật
thủy sinh bậc thấp như tảo, rong, rêu... ảnh hưởng tới cân bằng sinh học nước.
Những thực vật phát triển trong điều kiện phú dưỡng khi chết sẽ tạo nên khối
lượng lớn các chợp chất hữu cơ. Những chất hữu cơ này trong quá trình oxi hóa sẽ
tiêu thụ nhiều oxi hòa tan trong nước (nhờ quá trình khuếch tán bề mặt từ khí
quyển). Điều này dẫn đến sự thiếu hụt oxi nghiêm trọng. Quá trình phân giải chất
hữu cơ xảy ra theo hướng kỵ khí, làm biến đổi hình thái của một số hợp chất vô cơ
trong nước như tăng nồng độ các chất có tính khử (H2S, NH3,...) chuyển hóa các ion
kim loại (Fe,Pb,Zn,Cr...) tích tụ cặn lắng ở dạng khó hòa tan do liên kết với các gôc
anino (PO43- ;NO3-...) làm tăng tính độc của nguồn nước. Sự tích tụ xác động thực
vật thủy sinh do thiếu oxi làm tăng chiều dày bùn đáy. Thủy vực bị lấp đầy dần trở
nên lầy hóa. Cân bằng sinh học bị phá vỡ với sự biến mất của nhiều loài động, thực
vật và một số loài tảo mới xuất hiện (Lê Văn Khoa, 2007).
Nguyên nhân của hiện tượng phú dưỡng là nguồn nước thải có chứa Nitơ và
Phospho. Sự phú dưỡng nước ao, hồ và các sông kênh dẫn nước thải gần các thành
phố lớn đã trở thành hiện tượng phổ biến ở hầu hết các nước trên thế giới. Hiện
tượng phú dưỡng hồ và kênh thoát nước thải tác động tiêu cực tới hoạt động văn
hoá, làm biến đổi hệ sinh thái nước ao, hồ, tăng thêm mức độ ô nhiễm không khí
trong khu vực.


9

Hiện nay, phú dưỡng thường gặp trong các hồ đô thị, các sông và kênh dẫn
nước thải. Đặc biệt là tại khu vực Hà Nội, sông Sét, sông Lừ, sông Tô Lịch đều có

màu xanh đen hoặc đen, có mùi hôi thối do thoát khí H2S. Hiện tượng này tác động
tiêu cực tới hoạt động sống của dân cư đô thị, làm biến đổi hệ sinh thái của nước hồ,
tăng thêm mức độ ô nhiễm không khí của khu dân cư.
2.1.3. Trạng thái tồn tại và quá trình chuyển hóa của nitơ trong nước thải
Trong nước thải, các hợp chất của nitơ tồn tại dưới 3 dạng: các hợp chất hữu
cơ, amoni và các hợp chất dạng oxy hoá (NO2-, NO3-)(Trần Đức Hạ,2006). Các
dạng này là các khâu trong chuỗi phân hủy hợp chất chứa Nitơ hữu cơ, ví dụ:
protein và hợp phần của protein.
Các hợp chất chứa Nitơ là các chất dinh dưỡng, chúng luôn luôn chuyển hóa
trong tự nhiên.
Các hợp chất hữu cơ chưa nitơ được phân hủy bởi nhóm vi khuẩn Amon hóa,
Amoni ở môi trường nước gây độc cho cá tôm và các vi sinh vật thủy sinh khác.
Nếu trong môi trường nước chứa nhiều hợp chất hữu cơ và Amoni thì chứng tỏ mới
bị ô nhiễm. Amoni trong điều kiện kỵ khí cũng có thể hình thành từ các ion nitrate
(NO3-) do quá trình hô hấp kỵ khí còn gọi là quá trình amon hóa nitrate

Vi khuẩn
nitrobacte
r

Hình 1.2. Chuỗi phân hủy các hợp chất Nito hữu cơ
(Nguồn acc-biotech.com)


10

Quá trình chuyển hóa từ Amoni thành nitrite (NO2- ) cần thời gian để các vi
sinh vật phân hủy, do đó nếu trong môi trường nước có chứa hàm lượng Nitrite
(NO2- ) là chủ yếu thì thì nước đã bị ô nhiễm một thời gian dài. Các ion nitrite
(NO2) là sản phẩm trung gian của quá trình oxy hóa amoniac nhờ các vi khuẩn

nitrosomonas, tuy nhiên nó cũng có thể là sản phẩm chung gian của quá trình khử
nitrate trong điều kiện kỵ khí
Nếu môi trường nước chứa nhiều hợp chất dạng nitrate (NO3-) thì chứng tỏ
quá trình phân hủy nitơ đã ở giai đoạn cuối, nitrate là sản phẩm cuối cùng của quá
trình oxy hóa các hợp chất hữu cơ chứa nitơ trong nước thải. Các ion nitrate (NO3-)
bền vững trong điều kiện hiếu khí, chúng dễ dàng được tảo, rêu và các thực vật thủy
sinh hấp thụ. Trong điều kiện kỵ khí các ion nitrate (NO3- ) dễ bị khử thành N2O,
NO và Nitơ phân tử và hòa vào không khí.
2.1.4. Quá trình chuyển hóa nitơ vô cơ và vai trò của nhóm vi khuẩn nitrate hóa
2.1.4.1. Quá trình Nitrate hóa
Quá trình nitrate hoá là quá trình oxy hoá các muối amon thành muối
nitrate nhờ sự hoạt động của một nhóm vi sinh vật được gọi chung là nhóm vi
khuẩn nitrate hoá. Đây là nhóm vi khuẩn hiếu khí tự dưỡng hoá năng và bao gồm
hai nhóm nhỏ tham gia vào hai giai đoạn của quá trình này. Người đầu tiên
nghiên cứu về vi khuẩn nitrate hóa và hoạt động sinh lý của chúng là nhà khoa học
Nga Winogradsky. Năm 1889, ông chứng minh vi khuẩn nitrate hóa là những loài vi
sinh vật dinh dưỡng vô cơ bằng tổng hợp hóa học. Ông cũng khẳng định quá trình
nitrate hóa gồm 2 giai đoạn: oxy hóa muối amonium thành nitrite và oxy
hóa nitrite thành nitrate. Hai giai đoạn này được thực hiện do hai loài vi
khuẩn khác nhau. Vi khuẩn oxy hóa muối amonium thành nitrite có ba nhóm
chính là Nitrosomonas, Nitrisocytis và Nitrosopira. Nitrosomonas có hình cầu
hoặc hình bầu dục ngắn, Gram âm, không sinh bào tử. Nitrosopira là loài biến đổi
nhiều hình thái, nhưng dạng điển hình là trực khuẩn... (Lê Xuân Phương, 2008).
Quá trình nitrate hoá là quá trình oxy hoá các muối NH4+ thành NO3- nhờ sự hoạt
động của một nhóm vi sinh vật được gọi chung là nhóm vi khuẩn nitrate hoá. Đây
là nhóm vi khuẩn hiếu khí tự dưỡng hoá năng và bao gồm hai nhóm nhỏ tham gia


11

vào hai giai đoạn của quá trình này. Giai đoạn 1 là giai đoạn oxy hoá NH4+ thành
NO2- được gọi là giai đoạn nitrite hoá. Giai đoạn 2 là giai đoạn oxy hoá NO2thành NO3- được gọi là giai đoạn nitrate hoá (Cole, 1994).
Ý nghĩa của quá trình nitrate hóa trong việc làm sạch nước: nó phản ánh mức
độ khoáng hóa của các hợp chất hữu cơ có trong nước thải, quan trọng hơn qua quá
trình này có thể tích lũy một lượng oxy dự trữ có thể ứng dụng để oxy hóa các chất
hữu cơ không chứa nitơ khi lượng oxy tự do (lượng oxy hòa tan) đã tiêu hao hoàn
toàn trong quá trình đó. Sự có mặt của nitrate trong nước thải phản ánh mức độ
khoáng hóa hoàn toàn của các chất hữu cơ.
 Giai đoạn nitrite hoá
Nitrite hóa là quá trình oxy hóa amon thành nitrite nhờ enzym
Amonmonoxygenaza (AMO) của vi khuẩn xúc tác trong điều kiện hiếu khí.
NH4+ +1/2 O2 → NO2 + 2H+ + 2H2O + Q
Năng lượng này được vi khuẩn sử dụng để đồng hoá CO2 thành
cacbon hữu cơ (sinh khối vi khuẩn). Nhóm vi khuẩn nitrite hoá bao gồm 4 giống
khác nhau: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosobrio, Nitrozolobus

và

Nitrosospira (D.Barnes, 1983).
Đầu tiên amon bị oxy hóa thành hydroxylamin nhờ enzym AMO
NH3

+ O2 + 2e + 2H+ →

NH2OH + H2O

Quá trình này không giải phóng năng lượng ở dạng ATP, nhưng lại đòi hỏi
nguồn điện từ để tạo ra hydroxylamin. Nguồn điện từ có được do sinh ra khi oxy
hóa NADH2 thành NAD+ và truyền qua cytochroen. Một phần nguồn điện từ trong
quá trình oxy hóa amon thành hydroxylamin đi vào chuỗi truyền điện tử trong màng

nguyên sinh chất của vi khuẩn Nitrosomonas, phần còn lại dùng để oxy hóa
hydroxylamin thành nitrite. Cơ chất của Amon monoxyenaza sử dụng là NH3,
không dùng NH4+.
 Giai đoạn nitrate hoá
NO2- tạo thành trong giai đoạn nitrite hoá sẽ tiếp tục bị oxy hoá thành NO3nhờ một nhóm vi khuẩn khác theo phương trình:
NO2- + O2 → NO3- + Q


12

Nhóm vi khuẩn thực hiện nitrate hoá này bao gồm 3 giống: Nitrobacter,
Nitrospira và Nitrococcus. Vi khuẩn nitrate hóa phân bố rất ít trong các thủy vực
sạch, nghèo dinh dưỡng, trong các thủy vực giàu dinh dưỡng số lượng của chúng có
nhiều hơn, nhưng cao nhất cũng chỉ khoảng 10 tế bào/ml nước. Số lượng của chúng
trong thủy vực dao động theo mùa rõ rệt: các cực tiểu thường thấy vào mùa đông
hoặc đầu mùa xuân, còn các cực đại thì trong mùa hè. Quá trình nitrate hoá là một
khâu quan trọng trong vòng tuần hoàn nitơ trong thủy vực. Quá trình này có tầm
quan trọng trong quản lý chất lượng nước trong nuôi trồng thủy sản. Khi quá trình
này xảy ra mạnh chất thải amon độc hại sẽ được chuyển hoá nhanh sang dạng nitrat
không độc. (Lê Xuân Phương, 2008).
Vi khuẩn tham gia vào quá trình phản nitrate hóa bao gồm các loại vi khuẩn
kỵ khí không bắt buộc như: Pseudomonas, Bacillus…Trong điều kiện hiếu khí,
chúng oxy hóa các chất hữu cơ bằng oxy của không khí. Còn trong điều kiện kỵ khí,
chúng tiến hành oxy hóa các hợp chất hữu cơ bằng con đường khử hydro để chuyển
hydro cho nitrate và nitrite. Quá trình này không có lợi vì nó làm mất nitơ trong
thủy vực và tạo thành các chất độc đối với thủy sinh vật như NH3, NO2-. Trong đa
số sinh cảnh, vi sinh chỉ có thể khử nitrate thành nitrite, chứ không có thể khử tiếp
thành các dạng hợp chất khác. Do đó, ở đâu có quá trình phản nitrate hóa xảy ra
mạnh thì ở đó có nhiều nitrite.
2.1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nitrate hóa

Các vi khuẩn hoá năng vô cơ nói chung sở hữu những cơ chế hoá sinh đặc
biệt giúp chúng tồn tại và phân bố trong một khoảng không gian rất rộng ở
mặt đất và dưới nước. Người ta cũng phân lập được chúng trong cát và nước
mưa. Do là vi sinh vật tự dưỡng, nên chúng có khả năng tự tổng hợp sinh khối
nhờ có cơ chế sinh hoá chứa đủ hệ enzyme phân giải các chất vô cơ, ví dụ như một
số loài có thể đồng thời oxi hoá urea và methane cùng lúc với dị hoá rất nhiều loại
hydrocarbon khác nhau. Hơn nữa, các tế bào này có khả năng duy trì sự sống
trong điều kiện thiếu nguồn cơ chất bằng nhờ giảm hoạt động hô hấp nội bào và
đồng hoá xuống mức thấp nhất (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2012). Ta sẽ xem xét các
yếu tố ảnh hưởng cụ thể như sau:


13

 Nồng độ ammonia
Theo nghiên cứu của Anthonisen và cộng sự (1976) thì khi hàm lượng
ammonia vượt quá từ 10 đến 150 mg/l thì sẽ ức chế quá trình nitrite hoá. Quá trình
nitrate hoá nhạy cảm hơn, nếu ammonia vượt hơn mức 0,1 đến 1 mg/l thì vi khuẩn
nitrate hoá đã bị ức chế. Đối với nồng độ ion NO2- thì từ 0,22 đến 2,8 mg/l sẽ ức chế
quá trình nitrate hoá. Hiện chưa có nghiên cứu nào ghi nhận nồng độ NO3- ở mức
nào sẽ ức chế quá trình nitrate hoá. Nồng độ oxy hoà tan (DO) Tuy vi khuẩn nitrate
hoá là loài hiếu khí bắt buộc nhưng chúng có thể sống trong thời gian dài ở điều
kiện thiếu oxy dưới các tầng nước phía đáy hồ, trong các bể xử lý nước thải và bùn
hoạt tính. Người ta đã ghi nhận được mật độ 102 tế bào/ml vi khuẩn nitrite hoá
trong một bể xử lý kị khí có nồng độ TAN 52 mg/l. Ở các bể xử lý nước thải liên
tục thì nồng độ vi khuẩn nitrite hoá đạt tối ưu ở nồng độ oxi hoà tan khoảng 0,2
mg/l. Quá trình nitrite hoá vẫn xảy ra ở mức độ oxi hoà tan thấp 0,05 mg/l mà vẫn
phân giải được một lượng đáng kể ammonia. Đối với vi khuẩn nitrate hoá thì có sức
sống tương tự như vậy, trong một số trường hợp mật độ tế bào còn nhiều hơn vi
khuẩn nitrite hoá vài lần. Việc phát triển các bể xử lý hiếu khí kín có một vài khu

vực kị khí cục bộ đã cho phép tiến hành đồng thời quá trình nitrate hoá và phản
nitrate hoá, chuyển từ ammonia ra đến N2. Nồng độ oxi hoà tan tối ưu cho hệ vi
khuẩn nitrate hoá phát triển tốt là 3-4 mg/l O2.
 Nhiệt độ
Vi khuẩn nitrate hoá là loại vi khuẩn ưa ấm, nhiệt độ tối thích cho chúng phát
triển trong khoảng 25-30°C. Đối với quá trình nitrite hoá vẫn diễn ra ở nhiệt độ từ
7-35°C trong khi quá trình nitrate hoá thì nhiệt độ diễn ra rộng hơn từ 5-42°C.
 pH
Hầu hết các vi khuẩn nitrate hoá có giá trị pH tối ưu dao động trong khoảng
7,5 -8,0. Tại giá trị pH nhỏ hơn 6 hoặc lớn hơn 10 thì quá trình nitrate hoá
diễn ra rất chậm và bị ức chế. Quá trình oxi hoá ammonia bởi vi khuẩn nitrite hoá
làm giảm tính kiềm của môi trường. Vi khuẩn Nitrosomonas thì hoạt động trong
khoảng pH = 6,7-9,2 trong khi vi khuẩn Nitrobacter thì hoạt động trong khoảng


14

pH 8 -9,2. Sự thích nghi của vi khuẩn đối với giá trị pH quá cao hoặc quá thấp
đều đòi hỏi phải có một khoảng thời gian. Trong nhiều nghiên cứu cho thấy
các chủng vi khuẩn tự dưỡng có thể thích nghi được ở cả giá trị pH rất thấp như 34 hoặc giá trị pH rất cao 11-12. Trong các nguồn nước thải thường có pH nằm trong
dải trung tính và kiềm nhẹ, vì thế quá trình nitrate hoá vẫn diễn ra thuận lợi mà ít
cần sự tác động chỉnh pH về pH tối thích. Sự có mặt của các chất độc Nitrosomonas
sp. và Nitrobacter sp. đều nhạy cảm với một vài hợp chất độc thường gặp trong
nước thải. Tuy nhiên, mức độ nhạy cảm của Nitrosmonas sp. thường cao hơn với
Nitrobacter sp., các hợp chất này gây ngừng quá trình nitrate hoá vì ức chế các hệ
enzyme trên màng của tế bào. Hầu hết các hợp chất diệt khuẩn đều tác động
nghiêm trọng đến hoạt động sống của vi khuẩn nitrate hoá.
2.1.5. Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn tham gia quá trình nitrate hóa
2.1.5.1. Các dòng vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa
 Vi khuẩn nitrite hóa

Vi khuẩn có khả năng oxy hóa amon thành nitrite hầu hết thuộc nhóm vi
khuẩn hiếu khí bắt buộc. Các vi khuẩn này không lấy năng lượng từ sự oxy hóa chất
hữu cơ mà lấy năng lượng từ sự oxy hóa các hợp chất chứa nitơ vô cơ. Chúng thuộc
nhóm vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, tế bào hình cầu, hình que, hình xoắn.
Một số đại diện đặc trưng cho nhóm này là giống Nitrosomonas,
Nitrococcus, Nitrozolobus, Nitrosospira (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2012). Trong số đó
giống Nitrosomonas mà đặc biệt là loài Nitrosomonas europaea được áp dụng nhiều
nhất trong quá trình nitrite hóa. Đó là những vi khuẩn hình bầu dục, nhỏ bé kích
thước từ 0,4 - 0,6

1 - 1,8 µm, không sinh bào tử, có thể có tiêu mao khá dài, có

khả năng tích lũy nhiều chất nhầy quanh tế bào. Cơ chất oxy hóa của Nitrosomonas
là amoniac, ure, guanin,... các cơ chất hữu cơ không được sử dụng làm nguồn oxy
hóa (Hoàng Phương Hà và cs, 2010)
 Vi khuẩn nitrate hóa
Cũng như các loại vi khuẩn tự dưỡng khác, vi khuẩn nitrate hóa dùng năng
lượng sinh ra để khử CO2 của không khí và tạo nên các chất hữu cơ cần thiết cho cơ


15

thể chúng. Loại vi khuẩn nitrate hóa điển hình nhất là Nitrobacter. Chúng là những
tế bào hình que nhỏ, kích thước khoảng 0,8×1,0µm, Gram âm (-), không sinh bào
tử. Hai loài Nitrobacter chủ yếu là N. Winogradski( không di động) và N. Agilic (di
động). Cơ chất oxy hóa duy nhất của Nitrobacter là nitrite (Trần Hiếu Nhuệ và cs,
1996). Nitrobacter cũng có thể sinh trưởng và phát triển trên các môi trường có
chứa chất hữu cơ, hoặc chất hữu cơ có kích thích sự sinh trưởng và phát triển cũng
như hoạt tính chuyển hoá của chúng (Lê Văn Khoa, 1995). Nitrobacter rất nhạy
cảm với điều kiện không thuận lợi của môi trường, nồng độ NaNO2 0.5 g/l bắt đầu

kìm hãm sự sinh trưởng của chúng.
Năng lượng thu được từ quá trình oxy hóa NH4+ sẽ được các vi khuẩn sử
dụng để sinh tổng hợp vật chất của tế bào từ CO32-. Do chỉ nhận được rất ít năng
lượng từ quá trình oxy hóa nên tốc độ phát triển của các vi khuẩn oxy hóa amon và
oxy hóa nitrit tự dưỡng là hết sức chậm chạp. Thời gian thế hệ là 0,4-2,5 ngày đối
với Nitrosomonas và 0,3-1,5 ngày đối với Nitrobacter ( Cole J.A de Graaf, 1994).
 Các vi khuẩn dị dƣỡng tham gia vào quá trình nitrite hóa
Trong những năm gần đây, bên cạnh các vi khuẩn tự dưỡng bắt buộc người
ta đã phát hiện ra một số vi khuẩn dị dưỡng có khả năng oxy hóa NH4+ và các hợp
chất hữu cơ chứa nitơ thành NO2-, NO3- như: Methylomonsa, Methanica, Ethylosinus
trichosprium, Methylococcus capsulatus, Pseudomonas methanicus, Thiosphaera
pantotropha, Thibacillus novellus. Cơ chế hóa sinh của quá trình nitrate hóa do vi
khuẩn dị dưỡng vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ. Có lẽ sự oxy hóa nitơ có thể xảy ra
theo cả hai con đường vô cơ và hữu cơ.
Quá trình nitrate hóa nhờ các vi khuẩn dị dưỡng có tầm quan trọng đặc biệt
bởi nó dễ sinh trưởng và phát triển ở mọi môi trường, cả ở những nơi giàu hay
nghèo chất hữu cơ. Trong khi đó các vi khuẩn tự dưỡng thường có mặt ở những nơi
có ít chất hữu cơ. Mặc dù khả năng oxy hóa NH4+, các vi khuẩn tự dưỡng nhỏ hơn
từ 103-104 lần khả năng oxy hóa NH4+ của các vi khuẩn tự dưỡng, nhưng bù lại đó
chúng có khả năng phát triển nhanh hơn nhiều lần. Hơn nữa ngoài khả năng oxy hóa
NH4+, các vi khuẩn tự dưỡng còn có cả enzyme khử nitrate thành nitơ phân tử, ngay


16

cả trong điều kiện có oxy bởi vậy chúng là những vi khuẩn lý tưởng trong xử lý các
môi trường bị ô nhiễm bởi NH4+, NO2-, NO3-.
2.1.5.2. Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn Nitrosomonas
Nitrosomonas là một trong 5 giống vi khuẩn oxy hóa ammonium (AOB)
gồm: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosocossus, Nitrosogloea và Nitrosospira

(Stanley và Mandel, 1971). Tất cả các vi sinh vật này đều giống nhau về mặt sinh
lý-sinh hóa nhưng khác nhau về mặt đặc điểm hình thái học và cấu trúc học. Vi
khuẩn Nitrosomonas là nhóm vi khuẩn tự dưỡng hoá năng và hiếu khí bắt buộc.
Chúng sử dụng NH3 như nguồn năng lượng chủ yếu cho hoạt động tổng hợp carbon từ
CO2 để đáp ứng nhu cầu cacbon của chúng AOB thuộc 2 nhóm là γ-Proteobacteria
chỉ có giống Nitrosococcus với 2 loài Nitrosococcus oceani và Nitrosococcus halophilus
và nhóm β-Proteobacteria với 2 giống Nitrosomonas sp. và Nitrosospira sp ( Thomas
B, 1994). Các loài thuộc giống Nitrosococcus chỉ có thể được tìm thấy trong môi trường
nước mặn. Nitrosospira phân bố chủ yếu và chiếm ưu thế ở nội địa. Giống Nitrosomonas
thường phân bố rộng rãi trong đất, bùn nước ngọt và nước lợ, trong đó N. europaea
chiếm số lượng cao. Phần lớn những loài vi khuẩn thuộc giống Nitrosomonas không
có khả năng di động nên cần phải bám vào bề mặt giá thể như đá, cát, giá thể sinh học…
giúp chúng phát triển thuận lợi. Khả năng bám là nhờ chúng tiết ra chất nhầy từ màng bao
bên ngoài cho biết N. europaea có khả năng di động.
Nitrosomonas thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, đều có hình que nhưng các tế
bào vi khuẩn khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau. Có 3 hình dạng cơ
bản được xác định: hình que rất ngắn rộng 0,8 µm và dài 1 - 2 µm, hình que rộng 1
- 1,3 µm và dài 2 - 2,5 µm, hình dạng thứ ba là những tế bào rộng 1,2 µm và dài 2 2,5 µm Những đặc điểm về hình dạng tế bào như mô tả trên giúp phân biệt với
giống Nitrosospira là những tế bào dạng sợi xoắn, vòng xoắn hay thể xoắn, trong
khi đó Nitrosococcus có hình cầu và các tế bào dính chặt với nhau (Smith A.C,
2005). Nitrosomonas sống ở những nơi giàu NH3 và các muối vô cơ như trong bùn
đáy ao, nước cống, nước ngọt, trên tường của các tòa nhà cũ, các thủy vực bị ô
nhiễm chứa nhiều hợp chất nitơ nhằm tránh ánh sáng. Chúng sinh sản bằng


17

cách phân đôi. Dưới các điều kiện thích hợp có thể tăng lên gấp đôi sau 7 giờ. Ở
điều kiện bình thường, chúng tăng lên gấp đôi sau 15 - 20 giờ. Nitrosomonas
không hình thành bào tử, có vách tế bào phức tạp được bao quanh bởi lớp màng

nhầy. Không giống với các loài vi khuẩn dị dưỡng khác chúng không thể sống
trong môi trường khô. Trong nước, chúng có thể sống sót một giai đoạn ngắn ở các
điều kiện bất lợi nhờ vào việc dùng các vật chất dự trữ bên trong tế bào. Khi các vật
chất này hết chúng sẽ chết.

 Các thông số sinh lý của vi khuẩn Nitrosomonas
Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của Nitrosomonas khoảng 25 – 30°C. Tỉ
lệ sinh trưởng bị giảm 50% ở 18°C. Ngưng hoạt động ở 4°C. Khả năng chịu đựng ở
nhiệt độ thấp của Nitrosomonas cao hơn ở Nitrobacter. Vì vậy trong các thủy vực
nước lạnh xảy ra trường hợp tích lũy NO2- khoảng pH thích hợp là 7,8 - 8,0. Tại
mức pH thấp hơn 7, Nitrosomonas sẽ phát triển chậm và làm tăng lượng NH3 trong
thủy vực. Sự phát triển của chúng bị ức chế ở pH = 6,5. Tại mức pH đó hầu hết NH3
trong nước sẽ trở thành chất độc ôn hòa, ở trạng thái ion hóa NH3. Nhu cầu oxy hòa
tan (DO): quá trình nitrite hóa sẽ đạt cao nhất nếu DO ở mức lớn hơn 80% trạng thái
bão hòa và sẽ không xảy ra nếu nồng độ DO = 2 mg/L hoặc thấp hơn. Hàm lượng
chất dinh dưỡng tối thiểu: tất cả các vi khuẩn nitrate hóa đều cần một lượng chất
dinh dưỡng vô cơ tối thiểu, trong số đó cần thiết và quan trọng nhất là phosphorus
để sản xuất ra ATP (Adenosine Tri-Phosphate). Sự chuyển hóa ATP cung cấp
năng lượng cho các chức năng của tế bào. Phosphorus thông thường có sẵn trong
nước dưới dạng lân hòa tan PO43-. Tất cả các loài thuộc giống Nitrosomonas sử
dụng NH3 như là nguồn năng lượng cho sự chuyển hóa thành NO2- Amonia đầu
tiên bị khử hydro thành amine (NH2) sau đó bị oxy hóa thành NO2-. Tiến trình
chuyển hóa đó cho phép Nitrosomonas sử dụng một số hợp chất của amine. Một
vài loài của Nitrosomonas có khả năng sử dụng urea như nguồn năng lượng như vi
khuẩn N. nitrosa, N. ureae, N. Marina.
2.1.5.3. Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn Nitrobacter
Giống Nitrobacter gồm hai loài đã được phát hiện: loài N.agilis do
Wignogradsky phân lập từ đất năm 1890. Sự hình thành NO3- là giai đoạn quan