Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy vi khuẩn lactobacillus reuteri bằng phương pháp tối ưu bề mặt

ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM

HỒNG VĂN TÀI
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI KHUẨN
LACTOBACILLUS REUTERI BẰNG PHƢƠNG PHÁP
TỐI ƢU BỀ MẶT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học
Khoa

: CNSH & CNTP

Lớp

: 44 - CNSH

Khóa học

: 2012 – 2016

Thái Nguyên - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM

HỒNG VĂN TÀI
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI KHUẨN
LACTOBACILLUS REUTERI BẰNG PHƢƠNG PHÁP
TỐI ƢU BỀ MẶT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học
Khoa

: CNSH & CNTP

Lớp

: 44 - CNSH

Khóa học

: 2012 – 2016

Giảng viên hƣớng dẫn: Th.S Bùi Tuấn Hà

Thái Nguyên - 2016


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học của bản thân
tôi, không sao chép của ai. Nội dung khóa luận có tham khảo và sử dụng các
tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và các trang web
theo danh mục tài liệu tham khảo của khóa luận.
Thái nguyên, ngày 19 tháng 5 năm 2016
Ngƣời viết cam đoan

Hoàng Văn Tài


ii

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt q trình thực tập tại phịng Công nghệ Lên men, Khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ Ban chủ nhiệm Khoa
CNSH - CNTP, thầy cô hướng dẫn, bạn bè và gia đình.
Trước hết, em xin chân thành cảm ơn Th.S Bùi Tuấn Hà, giảng viên
Khoa CNSH - CNTP, đã tạo điều kiện, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em
hồn thành khố luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Dương Mạnh Cường, ThS. Vi Đại
Lâm giảng viên Khoa CNSH - CNTP, người đã hướng dẫn em các thao tác thực
hành và chỉ ra cho em những sai lầm giúp em hồn thành tốt khố luận.
Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa CNSH - CNTP,

trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong
quá trình học tập và hồn thành khố luận này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người
đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện
khoá luận.
Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài khơng tránh khỏi
những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cơ và các
bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái nguyên, ngày 19 tháng 05 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Hoàng Văn Tài


iii

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 25
Bảng 3.2. Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ............................................ 25
Bảng 3.3. Mơi trường thạch MRS (de Man,Rogosa and Sharpes) (g/l) ......... 26
Bảng 3.4. pH nuôi cấy ..................................................................................... 31
Bảng 3.5. Nhiệt độ nuôi cấy ( 0C ) .................................................................. 32
Bảng 3.6. Tốc độ lắc ( vòng/phút) .................................................................. 32
Bảng 3.7. Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu................................................... 33
Bảng 3.8. Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu chất lượng sản phẩm .................... 33
Bảng 4.1: Khả năng đồng hóa của vi khuẩn Lactobacillus reuteri trên các
môi trường đường. ........................................................................... 36
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đên nuôi cấy vi khuẩn L. reuteri ............. 37
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của pH đến nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri ........ 39

Bảng 4.4 : Ảnh hưởng của tốc độ lắc đên nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri .. 40
Bảng 4.5. Kết quả mật độ của vi khuẩn L. reuteri trong sản phẩm ................ 42
Bảng 4.6. Lack of Fit tests ( Kiểm tra tính phù hợp của mơ hình) ................. 43
Bảng 4.7. Tổng hợp phân tích mơ hình ( model summary statistics) ............. 43
Bảng 4.8. Kết quả phân tích ANOVA cho mơ hình mật độ vi sinh vật trong
q trình ni cấy ............................................................................ 44
Bảng 4.9. Các giá trị của biến độc lập để đạt được giá trị tối ưu của chỉ tiêu ....... 45


iv

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn L. reuteri .................................... 7
Hình 2.2. Hình thái tế bào vi khuẩn L. reuteri qua kính hiển vi ...................... 7
Hình 2.3. Bề mặt đáp ứng khơng có độ cong .................................................. 19
Hình 2.4. Bề mặt đáp ứng có độ cong ............................................................. 19
Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc L. reuteri ......................................................... 35
Hình 4.2. Hình thái tế bào vi khuẩn L. reuteri ................................................ 35
Hình 4.3. Biểu đồ mật độ tế bào vi khuẩn trên các mơi trường đường .......... 36
Hình 4.4. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật đố vi khuẩn L. reuteri .... 38
Hình 4.5. Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến mật độ tế bào vi khuẩn L.
reuteri ............................................................................................... 39
Hình 4.6. Biểu đồ ảnh hưởng của tốc độ lắc đến mật độ vi khuẩn L.
reuteri ............................................................................................... 41
Hình 4.7. a và b : ảnh hưởng của nhiệt độ,pH và tốc độ lắc đến mật độ vi
khuẩn Lactobaciluss reuteri ............................................................. 46


v

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

MRS

: de Man, Rogosa and Sharpes

LAB

: Lactic acid Bacteria

FAD

: Flavin Adenin Dinuclecotit

EC

: Ủy ban khoa học châu Âu

VSV

: Vi sinh vật


vi

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ iii
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... iv
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT .......................................................... v
MỤC LỤC ........................................................................................................ vi
Phần 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu của đề tài .................................................................................. 2
1.2.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................... 3
1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3
1.3.1. Ý nghĩa trong khoa học ........................................................................... 3
1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ........................................................................... 3
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus reuteri ............................................ 4
2.1.1. Lịch sử phát hiện ..................................................................................... 4
2.1.2. Đặc điểm phân loại và phân bố của vi khuẩn Lactobacillus reuteri ...... 4
2.1.3. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus reuteri .......................... 5
2.1.4. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus reuteri ......................... 7
2.1.5. Đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri.................................. 8
2.1.6. Tác đụng của Lactobacillus reuteri ....................................................... 10
2.2. Ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus reuteri - Probiotics ..................... 12
2.2.1. Lịch sử nghiên cứu Probiotics............................................................... 12
2.2.2. Ứng dụng của probiotic......................................................................... 14


vii

2.3. Khả năng tạo probiotic của vi khuẩn Lactobacillus reuteri.................... 16
2.4. Phương pháp bề mặt chỉ tiêu .................................................................... 17
2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước .............................................. 20

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................... 20
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ......................................................... 23
Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ...................................................................................................... 25
3.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 25
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành ............................................................... 25
3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng ..................................................................... 25
3.3.1. Hóa chất................................................................................................. 25
3.3.2. Thiết bị sử dụng..................................................................................... 25
3.4. Môi trường sử dụng .................................................................................. 26
3.5. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 26
3.6. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 27
3.6.1. Thí nghiệm cho nội dung 1: Phương pháp nghên cứu đặc điểm sinh
học của vi khuẩn L.reuteri. ................................................................... 27
3.6.2. Thí nghiệm cho nội dung 2: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng
của pH tới sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus reuteri. ................ 31
3.6.3. Thí nghiệm cho nội dung 3: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng
của nhiệt độ tới sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus reuteri. ........ 32
3.6.4. Thí nghiệm cho nội dung 4: Phương pháp kiểm tra tốc độ lắc tới sự
phát triển của vi khuẩn Lactobacillus reuteri. ....................................... 32
3.6.5. Thí nghiệm cho nội dung 5: Tối ưu hóa điều kiện ni cấy vi
khuẩn Lactobacillus reuteri................................................................... 32
3.7 Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 34
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 35


viii

4.1. Hình thái của vi khuẩn Lactobacillus reuteri .......................................... 35
4.1.1. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Lactobacillus reuteri ........................ 35

4.1.2. Hình thái tế bào vi khuẩn L. reuteri ...................................................... 35
4. 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến nuôi cấy vi khuẩn L. reuteri ..................... 37
4.3. Ảnh hưởng của pH đến nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri ........... 38
4.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đên nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri......... 40
4.5. Kết quả tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri
bằng phương pháp bề mặt chỉ tiêu. ....................................................... 41
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 47
5.1. Kết luận .................................................................................................... 47
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Lactobacillus reuteri thuộc chi Lactobacillus là một vi khuẩn Gram
dương được tìm thấy chủ yếu trong ruột của động vật có vú và chim.
L. reuteri chứa Probiotics BioGaia. Nó là một trong những chủng vi
khuẩn sản sinh ra probiotic tốt nhất, có khả năng sinh kháng sinh rất
mạnh, có thể kháng lại hoặc ức chế các loại sinh vật có hại trong hệ tiêu
hóa. Một số chủng L. reuteri được sử dụng như chế phẩm sinh học để tăng
lợi khuẩn, bảo vệ sức khỏe cho con người và cho vật nuôi.
Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi tiêu thụ vào cơ thể một
lượng đầy đủ sẽ có lợi về mặt sức khỏe cho người sử dụng. Probiotic có ích
hỗ trợ khơi phục lại sự cân bằng trong đường ruột. Chính vì vậy, các chế
phẩm sinh học chứa lợi khuẩn probiotic có vai trị quan trọng đối với sức
khỏe. Nó có thể duy trì trạng thái cân bằng vi khuẩn đường ruột, tăng cường
sức khỏe đường ruột, nhưng cũng có thể tăng cường hệ thống miễn dịch.

Probiotic cịn có khả năng cạnh tranh các chất dinh dưỡng cới các vi sinh vật
gây bệnh. Sử dụng probiotic giúp tăng cường đáp ứng miễn dịch, nhất là
miễn dịch tự nhiên, làm tăng dung nạp của cơ thể với lactose, giúp trẻ tránh
khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều
lactose. Ngoài ra tác dụng của probiotic là cung cấp các chất quan trọng cho
cơ thể như folic acid, niacin, riboflavin, vitamin B6 và B12.
Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ
khoa học đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn. Càng ngày
đời sống vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng
cao đòi hỏi những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình
để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho


2

người sử dụng sản phẩm, bảo vệ môi trường người ta hạn chế hoặc cấm sử
dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thay thế thuốc kháng
sinh bằng các chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học là một dạng thức ăn bổ
sung vi sinh vật sống, tác động có lợi đến động vật thơng qua việc cải tiến cân
bằng vi sinh vật đường ruột. Vì vậy việc nuôi cấy vi sinh vật để thu sinh khối
là rất quan trọng trong việc sản xuất các loại chế phẩm sinh học cũng như vi
khuẩn L. reuteri.
Các phương pháp nghiên cứu truyền thống, độc lập các yếu tố ảnh
hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cịn nhiều hạn
chế khó tìm ra điều kiện tối ưu cho q trình ni cấy, rất tốn thời gian cũng
như chi phí để ni cấy. Ngày nay, thường sử dụng phương pháp bề mặt chỉ
tiêu là quá trình đi tìm giá trị của các biến độc lập để đạt kết quả tối ưu của
các tiêu chí cần tối ưu, kết hợp với các phần mềm máy tính để đạt hiệu quả
cao trong q trình ni cấy vi sinh vật. Trong thiết kế, xây dựng, sản
xuất…các công nghệ và quản lý được tiến hành ở các bước khác nhau của q

trình nhằm giảm tối đa chi phí đầu vào và tối đa hố sản phẩm và lợi ích đầu
ra. Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tối ưu
điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri bằng phương pháp tối ưu
bề mặt ’’ .
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu của đề tài
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn Lactobacillus reuteri.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của vi khuẩn
Lactobacillus reuteri.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của vi khuẩn
Lactobacillus reuteri.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc tới sự phát triển của vi khuẩn
Lactobacillus reuteri.


3

- Tối ưu điều kiện nuôi cấy vi khuẩn L. reuteri bằng phương pháp bề
mặt chỉ tiêu.
1.2.2. Mục đích nghiên cứu
- Ngiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri
bằng phương pháp tối ưu bề mặt.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa trong khoa học
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa kiến thức đã học vào nghiên
cứu khoa học.
- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân
tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học.
1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
- Tìm ra điều kiện tối ưu để nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri

bằng phương pháp tối ưu bề mặt.
- Tạo tiền đề cho việc sản xuất các sản phẩm từ vi khuẩn Lactobacillus reuteri.


4

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus reuteri
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Lactobacillus reuteri được phát hiện lần đầu tiên trong ruột của lợn,
cừu, gà và các loại gặm nhấm.Vi sinh vật học người Đức Gerhard Reuter lần
đầu tiên phân lập L. reuteri từ L. fermentum trong các mẫu ruột và phân của
người trong những năm 1960. Walter Dobrogosz, Ivan Casas, và các đồng
nghiệp của họ đã tiến hành nghiên cứu bổ sung vào đầu những năm 1980. Họ
phát hiện ra rằng L. reuteri có khả năng lên men glycerol vì vậy dẫn đến việc
tìm ra một chất kháng sinh phổ rộng. Dobrogosz và các đồng nghiệp của ơng
đặt tên là “reuterin”. L. reuteri được tìm thấy tồn tại trong một số thực phẩm,
bao gồm cả các sản phẩm thịt và sữa.
Năm 2008, L. reuteri được xác đinh là có khả năng sản xuất reuterin ở
đường tiêu hóa, nó rất hiệu quả trong việc làm giảm sự tang trưởng của vi
khuẩn E. coli có hại. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, một số
chủng L. reuteri được sử dụng như chế phẩm sinh học.
2.1.2. Đặc điểm phân loại và phân bố của vi khuẩn Lactobacillus reuteri
* Đặc điểm phân loại
Bộ : Lactobacillales
Họ : Lactobacillaceae
Chi : Lactobacillus
Loài : L. reuteri
* Đặc điểm phân bố: Vi khuẩn Lactobacillus reuteri có mặt trong các

sản phẩm bổ sung probiotics đường ruột, ở tự nhiên chúng phân bố chủ yếu
trong hệ tiêu hóa mà chủ yếu là đường ruột và trong một số thực phẩm bao
gồm cả thịt và sữa. />

5

2.1.3. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus reuteri
Lactobacillus reuteri là vi khuẩn Gram dương (+), không tạo bào tử,
hầu hết không di động, thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và
sinh axit lactic dưới dạng D (-), L (+) hoặc DL (Nguyễn Lân Dũng và cs,
2009)[2].
Có khả năng lên men hiếu khí và kỵ khí, thường có mặt ở ruột non và
giúp giữ cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, được xem như là một chất
kháng sinh tự nhiên chống các vi sinh vật có hại.
2.1.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon
Vi khuẩn L. reuteri có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các
monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza,
maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn
cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất
cho quá trình lên men tổng hợp các axit hữu cơ.
2.1.3.2. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Phần lớn vi khuẩn L. reuteri không tự tổng hợp được các hợp chất
chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử
dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn L.
reuteri có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân
casein từ sữa, pepton.
2.1.3.3. Nhu cầu về vitamin
Vitamin đóng vai trị là các coenzyme trong q trình trao đổi chất của
tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi
khuẩn L. reuteri khơng có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ

sung vào mơi trường các loại vitamin.
Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây,
ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…


6

2.1.3.4. Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác
Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu
cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ. Một số axit hữu
cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như axit
xitric, axit oleic.
Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của axit oleic,
axit axetic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các
chủng vi khuẩn lactic.
2.1.3.5. Nhu cầu các muối vô cơ khác
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn L. reuteri
rất cần các muối vô cơ.
Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali,
photpho, lưu huỳnh, magiê đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa
quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào.
2.1.3.6. Nhu cầu dinh dưỡng oxi
Vi khuẩn L. reuteri vừa có khả năng sống được trong mơi trường có
oxy và vừa sống được trong mơi trường khơng có oxy.
+ Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn
so với điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy
hóa hồn tồn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử
glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP.
+ Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó
lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn.

7

2.1.4. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus reuteri
2.1.4.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Hình 2.1. Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn L. reuteri
Sau khi phân lập và tuyển chọn giống thuần trên môi trường MRS –
agar, L. reuteri có khuẩn lạc màu trắng đục, trịn, nhơ cao, đường kính khuẩn
lạc 0.9 – 1.2 mm rìa khuẩn lạc trơn và bề mặt khuẩn lạc khô (Huỳnh Ngọc
Thạch và cs, 2002)[11].
2.1.4.2. Hình thái tế bào

Hình 2.2. Hình thái tế bào vi khuẩn L. reuteri qua kính hiển vi


8

L. reuteri là trực khuẩn, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước 0.5 –
0.8

x 1.5 – 3

, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả

năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn nằm giữa tế
bào (Huỳnh Ngọc Thạch và cs, 2002)[11].
2.1.5. Đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri
- Môi trường ni cấy: khó ni cấy, cần những hợp chất phức tạp để phát

triển như: pepton, cao thịt, cao nấm men. Mơi trường ni cấy thích hợp: MRS.
- Các yếu tố ảnh hƣởng đến vi khuẩn L. reuteri
* Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ của mơi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đối với vi sinh vật.
Trên thực tế, do vi sinh vật thường là các sinh vật đơn bào cho nên chúng rất
mẫn cảm với sự biến hóa của nhiết độ, và thường bị biến hóa cùng với sự biến
hóa về nhiết độ của mơi trường xung quanh. Trong phạm vi nhiệt độ thấp, khi
nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, vì phản ứng
xúc tác của enzym cũng giống như các phản ứng hóa học nói chung, khi nhiết
độ tăng lên 10 oC tốc độ phản ứng tăng gấp đôi. Vì các phản ứng trong tế bào
đều tăng cho nên toàn bộ hoạt động trao đổi chất sẽ tăng lên khi nhiệt độ cao
hơn, và sinh vật sẽ sinh trưởng nhanh hơn. Lúc nhiệt độ tăng đến một mức độ
nhất định thì nhiệt độ càng tăng tốc độ sinh trưởng càng giảm .Vi khuẩn
L. reuteri trong cơ thể người phát triển tốt nhất ở 36 - 38 oC. Nhiết độ tối
ưu cho sự phát triển của L. reuteri từ 30 – 40 oC. Theo nghiên cứu của
Toqeer Ahmed, Rashida và Najma Ayub nhiệt độ phát triển tốt nhất của
L. reuteri là 37 oC.
* Ảnh hƣởng của pH
pH là chỉ số đo độ hoạt động (hoạt độ) của các ion hiđrô (H+)
trong dung dịch và vì vậy là độ axít hay bazơ của nó, thang pH thay đổi từ 0 –
14. Mỗi vi sinh vật đều có một phạm vi pH sinh trưởng nhất định.


9

Khi pH môi trường thay đổi tương đối lớn, vi sinh vật vẫn có phương
pháp thích nghi ở một giới hạn cho phép. Phần lớn pH nội bào cảu vi sinh vật
vẫn giữ trung tính, nguyên nhân là do tính thấm H+ qua màng sinh chất tương
đối thấp. Vi sinh vật trung tính thơng qua hệ thống vận chuyển đã sử dụng K+
thay cho H+. Vi sinh vật ưu kiềm cực đoan dùng Na+ thay cho H+ từ môi

trường bên ngoài. Ngoài ra hệ thống chất đệm nội bào cũng có tác dụng ổn
định pH nội bào. Trong q trình trao đổi chất cảu vi sinh vật sinh ra các chất
có tính axit hoặc base gúp trung hịa pH mơi trường. Chẳng hạn, Thiobacillus
có thể oxy hóa các hợp chất chứa lưu huỳnh tạo acid sulfuric, một số vi khuẩn
phân giải acid amin tạo NH3 làm kiềm hóa mơi trường.
Vi khuẩn L. reuteri có thể phát triển được trong mơi trường acid,
khoảng pH của chúng có thể từ 4.5 – 8.5, pH tối ưu là 6.5. Khi pH thấp hơn 4
sẽ ức chế các vi khuẩn tạp nhiễm, tuy nhiên nó cũng sẽ ức chế sự phát triển vi
khuẩn L. reuteri. Do đó cần phải theo dõi suốt q trình nuôi cấy. L. reuteri
qua kết quả khảo sát pH = 6 là tối ưu nhất cho sự sinh trưởng và phát triển.
* Ảnh hƣởng của oxy
Oxy là chất có vai trò quan trọng trong sinh trưởng của vi sinh vật, tuy
vậy oxy có thể rất cần cho nhóm vi sinh vật này nhưng lại gây độc với nhóm
sinh vật khác. Căn cứ vào sự thích ứng với oxy của vi sinh vật, người ta chia
vi sinh vật thàng 3 nhóm:
+ Vi sinh vật hiếu khí: có thể sinh trưởng trong khí quyển chứa 21%
O2. Chúng cần nhiều năng lượng hơn từ sự oxy hóa chất dinh dưỡng so với
các nhóm vi sinh vật khác, do đó khi oxy bị hạn chế thì sinh trưởng của nhóm
này bị chậm lại. Vi sinh vật hiếu khí sinh trưởng tốt ở nồng độ oxy 1- 15%.
Với nhóm vi sinh vật này cần cung cấp thường xun và đầy đủ O2, các bình
chứa mơi trường được lắc thường xun trong q trình ni để cung cấp
thêm oxi cho vi sinh vật, nếu nuôi cấy trong mơi trường có khối lượng lớn
phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ.


10

+ Vi sinh vật kỵ khí: khơng thể sinh trưởng trong mơi trường có oxy,
thậm chí một số vi sinh vật bị chết khi tiếp xúc với oxy. Hạn chế sự tiếp xúc
với oxi bằng cách; Đổ lên bềmặt môi trường parafin, dầu vazơlin; Cấy trích

sâu vào mơi trường đặc. Ni cấy trong bình hút chân khơng. Ni trong ống
nghiệm đặc biệt sau khi rút hết khơng khí và hàn kín lại .Đun sơi mơi trường
một thời gian để loại hết O2. Để nguội 45 oC. Dùng ống hút cấy vi sinh vật
vào đáy ống nghiệm. Làm nguội thật nhanh rồi đổ vazơlin lên bềmặt để hạn
chế sự tiếp xúc với O2.
+ Vi sinh vật tùy tiện: có thể sinh trưởng trong mơi trường có đủ hoặc
thiếu oxy, có hoặc khơng có oxy. Trong điều kiện khơng có oxy chúng có
năng lượng bằng sự lên men.
Vi khuẩn Lactocillus reuteri thuộc nhóm vi khuẩn lactic, chúng hơ hấp
tùy tiện, khơng có hệ enzyme hô hấp xitocrom cũng như hệ catalaza. Tuy vậy,
chúng có khả năng oxy hóa rất nhiều hệ FAD (Flavin Adenin Dinuclecotit).
L. reuteri phát triển tốt ở 37 oC trong điều kiện yếm khí.
* Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng.
Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn sinh tổng hợp, nồng độ
đường càng cao thì axit sinh ra càng nhiều. Tuy nhiên, nồng độ đường quá
cao làm cho áp suất thẩm thấu môi trường cao dẫn đến hiện tượng co nguyên
sinh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào vi khuẩn. Glucose là nguồn
cacbon ưa thích nhất của L. reuteri, tuy nhiên nó vẫn có khả năng sử dụng
đường maltose, lactose, galactose, sucrose…
2.1.6. Tác đụng của Lactobacillus reuteri
- Lactobacillus reuteri được tìm thấy trong sữa người, nó đã được tìm
thấy trong sữa của các bà mẹ đang cho con bú. Người ta thấy rằng nếu bổ
sung L. reuteri cho các bà mẹ đang mang thai và cho con cái của họ trong
năm đầu tiên thì con cái của họ sẽ giảm thiểu các bệnh liên quan đến đường


11

ruột. L. reuteri cũng đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc làm giảm
cả viêm nứu và mảng bám răng ở bệnh nhân viêm lợi nặng, cho thấy cải thiện

sức khỏe răng miệng ( Gabriela Sinkiewicz, 2010)[17].
- Việc sử dụng chế phẩm sinh học để phòng ngừa ung thư trực tràng
đang được sử dụng ngày càng rộng rãi. Các chủng Lactobacillus reuteri với
hoạt động tăng sinh chống lại các tế bào ung thư đại trực tràng. Các nhà khoa
học đã nghiên cứu tác dụng của việc tăng sinh và hiệu quả của các chuỗi axit
béo chuỗi ngắn được tiết ra bởi các chủng L. reuteri. Năm chủng L. reuteri đã
được sàng lọc và tiết ra axit béo chuỗi ngắn, tăng sinh trên Caco-2 colon
chống lại tế bào ung thư ruột kết (Kahouli và cs, 2015)[18].
- Reuterin là một hợp chất kháng sinh được tạo ra trong quá trình lên
men kỵ khí glycerol. Reuterin được sản xuất bởi một số chủng Lactobacillus
reuteri, với hoạt tính kháng khuẩn, kháng nhiều loại mầm bệnh, bao gồm cả
nấm men, nấm mốc, vi khuẩn Gram dương ví dụ, Bacillus cereus,
Staphilococcus aureus, Listeria monocytogenes và vi khuẩn gram âm ví dụ,
Escherichia coli, Yersinia enterocolitica và Pseudomonas fluorescens trong
môi trường (A. Mohamadi Sani và cs,2005)[14].
- Việc bổ sung L.reuteri đã giúp cải thiện đáng kể các triệu chứng đau
bụng co thắt ở những trẻ được nuôi bằng sữa mẹ, so với phương pháp điều trị
chuẩn bằng simethicone, trong vòng 7 ngày điều trị. Tỷ lệ đáp ứng điều trị với
L.reuteri là 95%, trong khi chỉ có 7% trẻ đáp ứng với simethicone. Lợi ích
của việc bổ sung probiotic trong nghiên cứu này có thể có liên quan đến việc
cân bằng lại sự thay đổi của lactobacilli đường ruột ở trẻ sơ sinh bị đau bụng
co thắt. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, việc điều chỉnh lại hệ vi sinh vật
bằng probiotics, bao gồm cả L.reuteri, có thể chuyển hệ sinh thái đường ruột
từ hệ vi khuẩn có hại tiềm tàng sang hệ vi khuẩn có lợi là chủ yếu cho vật
chủ, giảm nguy cơ nhiễm trùng đường tiêu hóa và các bệnh dị ứng. Việc bổ


12

sung probiotic trong giai đoạn đầu đời nhằm mục đích cung cấp sự kích thích

hệ miễn dịch cịn non nớt của trẻ một cách an toàn và ức chế cơn đau nội
tạng, điều chỉnh viêm liên quan đến phản ứng quá mẫn cảm nội tạng bằng
cách tác động trực tiếp đến các dây thần kinh ruột (Francesco savino và cs,
2006)[19].
2.2. Ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus reuteri - Probiotics
2.2.1. Lịch sử nghiên cứu Probiotics
Khái niệm probiotic đầu tiên được mô tả như là hệ VSV trong thức ăn
bổ sung cho người và vật nuôi.
Năm 1925, Beach là người đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm
về thức ăn có chứa các VK "Lactobacillus acidophiỉus".
Năm 1965, thuật ngữ probiotic được đưa ra đầu tiên bởi Lilly và
Stillwell, nhằm mô tả những VSV có khả năng kích thích sinh trưởng của một
số vật nuôi.
Năm 1968, King đã nghiên cứu thành công trong việc kích thích sự
tăng trưởng của heo bằng thức ăn có bổ sung Lactobacillus acidophilus.
Năm 1989, Fuller (Anh), cùng nhiều nhà khoa học khác như Lee
(Singapore), Nomoto (Nhật), Salminen (Phần lan), Gorbach (Anh) (1999) đều
thống nhất trong định nghĩa : "Probiotic là chế phẩm sinh học hay là thức ăn
bổ sung có chứa VSV sống có ảnh hưởng tốt cho sức khỏe của vật chủ bằng
cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột".
2.2.2.1. Tác động kháng khuẩn
Giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn các mầm bệnh cụ thể là: Tiết ra
các chất kháng khuẩn: Vi khuẩn Probiotic tạo ra các chất đa dạng có thể ức
chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-), gồm có các acid hữu cơ, hydrogen
peroxide và chất diệt khuẩn. Những hợp chất này có thể làm giảm khơng chỉ
những sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà cịn ảnh hưởng đến sự


13

trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố. Điều này được thực hiện
bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid beo chuỗi ngắn
dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic.
Cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và
cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh.
2.2.2.2. Tác động trên mơ biểu bì ruột
+ Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mơ.
+ Giảm việc kích thích bài tiết và những hậu quả do bị viêm của sự lây
nhiễm vi khuẩn.
+ Đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy.
2.2.2.3. Tác động miễn dịch
Probiotic được xem như là phương tiện phân phát các phân tử kháng
viêm cho đường ruột. Cụ thể:
+ Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm.
+ Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng.
+ Cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón.
2.2.2.4. Tác động đến vi khuẩn đường ruột
Điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột: khi tập trung ở
khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái đường ruột.
Chế phẩm probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật
đường ruột. Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo
cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của sinh vật đường ruột.
Đồng thời tăng sự dung nạp đường lactose: giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi,
khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều đường lactose và làm
tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn gây hại.
Vi khuẩn probiotic như Lactobacillus reuteri điều hòa hoạt động trao
đổi chất của sinh vật đường ruột. Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận


14

tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme
của sinh vật đường ruột. Đồng thời tăng sự dung nạp đường lactose: giúp
tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa
nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn gây hại.
Nghiên cứu cho thấy sử dụng Lactobacillus acidophilus và L. reuteri sẽ
làm giảm ½ số trẻ bị tiêu chảy do Rotavirus và giúp tăng cường hệ thống
miễn dịch IgA của cơ thể... Khi sử dụng Lactobacillus rhamnosus dưới dạng
sữa lên men hoặc dạng đơng khơ cho trẻ em thì khoảng 95% trẻ em sẽ giảm
thời gian tiêu chảy ngay sau ngày đầu tiên và ít nơn mửa, khơng tiêu ra máu
ngay sau ngày thứ hai chữa trị. (J. Walter và cs,1998)[28].
2.2.2. Ứng dụng của probiotic
2.2.2.1. Trong nông nghiệp
Việc sử dụng probiotic ở động vật và nuôi trồng thủy sản được đánh giá
cao. Probiotic giúp cải thiện sức khỏe của động vật, giúp tăng trọng, giảm tỉ lệ
chết non và ngăn chặn tác nhân gây bệnh. Sự lạm dụng kháng sinh trong
ngành chăn nuôi và khả năng đề kháng kháng sinh đã làm tăng mối quan tâm
đến probiotics.
Việc sử dụng probiotics trong thực phẩm được để xuất rằng có thể làm
giảm nguy cơ gây bệnh từ thực phẩm sang người. Ủy ban khoa học châu Âu
(EC) về dinh dưỡng động vật (2003) đã khuyến cáo rằng: những giống vi
khuẩn trước đây có thể chấp nhận như một probiotic động vật thì bản chất của
gen đề kháng kháng sinh phải được xác định và những chủng mang gen đề
kháng kháng sinh được sử dụng trong y dược thì khơng nên bổ sung vào thức
ăn chăn ni trừ khi vi khuẩn đó có đột biến trên gen đề kháng kháng sinh.
Chính sách này sẽ ngăn chặn được việc sử dụng các vi khuẩn có khả năng
truyền gen kháng kháng sinh sang các vi khuẩn khác làm probiotic bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi. Điều này cũng hạn chế ứng dụng của probiotic cho người.

15

Thực tế thì probiotic cần thiết được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi
trong nông nghiệp và nuôi trồng thủy sản và an tồn đối với con người. Sự
bám dính lên niêm mạc đường tiêu hóa của vi khuẩn probiotic được xem là cơ
chế quan trọng để ngăn các tác nhân gây bệnh.
Về Gia súc:
+ Tăng tỉ lệ tiêu hóa thức ăn, giảm bệnh tiêu chảy và những xáo trộn
tiêu hóa khác.
+ Tăng sản lượng trứng, sữa và kích thích sự thèm ăn.
+ Tăng trọng nhanh
+ Giảm mùi hôi chuồng nuôi
+ Giảm bệnh đường ruột gây ra bởi các sinh vật như E.coli, Salmonella
và Clostridium. Đặc biệt có thể tiêu diệt mầm bệnh vi khuẩn sống ở ruột gia
cầm, do đó giúp loại bỏ mối đe dọa sự ngộ độc thực phẩm vi khuẩn từ chuỗi
thức ăn.
+ Phòng bệnh sưng phù đầu cho lợn.
Về gia cầm:
Những nghiên cứu trên gia cầm tại tại các trường đại học của Maryland
và phía Bắc bang Carolina, sử dụng một sản phẩm có tên là Primalac cho thấy
là probiotic định cư ở ruột với những vi khuẩn có lợi và loại trừ bệnh gây ra
bởi các sinh vật như E.coli, Salmonella và Clostridium ở những vị trí lơng
nhung của ruột non, nơi mà vi khuẩn có hại sẽ phá hủy lơng nhung.
Probiotic gia tăng sự kháng bệnh bằng cách tăng độ cao của lông
nhung và tăng độ sâu của các khe nằm giữa lông nhung, theo cách đó sẽ gia
tăng được diện tích bề mặt hấp thu chất dinh dưỡng. Vì vậy sẽ gia tăng hiệu
quả hấp thụ thức ăn. Nghiên cứu cũng cho thấy Primalac giúp động vật
chống lại sự lây nhiễm trùng cầu (Eimeria acervulina), chúng phá hủy
những đàn gà giống.