Nghien cuu cay goi tom

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ẩm ướt
quanh năm. Các nhà khoa học quốc tế đã xếp Việt Nam vào những nước
có “Rừng mưa nhiệt đới”. Với điều kiện thiên nhiên thuận lợi như vậy, hệ
thực vật Việt Nam đã phát triển rất đa dạng và phong phú với khoảng
12.000 loài thực vật bậc cao, không kể đến các loại nấm, tảo và rêu, tiềm
ẩn những hoạt chất có khả năng chữa các bệnh nan y [2, 5]. Các nhà khoa
học Việt Nam và thế giới đều đang cố gắng tìm kiếm, phát hiện và nghiên
cứu các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên với các hoạt tính sinh học cao
để ứng dụng trong y dược, nông nghiệp và các nhu cầu khác của đời sống
con người.
Với sự phát hiện ra nhiều chất có hoạt tính sinh học quí giá từ thiên
nhiên, các nhà khoa học đã và đang có những đóng góp đáng kể trong việc
tạo ra những biệt dược điều trị những bệnh nhiệt đới và các bệnh hiểm
nghèo nhằm kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lượng cuộc sống của con
người. Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu cung cấp các hoạt chất
quí hiếm để tạo ra các biệt dược mà còn cung cấp những chất đóng vai trò
dẫn đường trong việc tổng hợp ra các loại thuốc mới có ý nghĩa khoa học,
kinh tế xã hội cao. Từ những tiền chất được phân lập từ thiên nhiên, các
nhà khoa học đã chuyển hoá chúng thành những hoạt chất có khả năng trị
bệnh rất cao.
Tiếp tục các công trình nghiên cứu trong khuôn khổ hợp tác quốc tế
giữa Viện Hoá học - Viện KH&CNVN với Viện Hóa học Các hợp chất
Thiên nhiên - Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Quốc gia Pháp về việc
nghiên cứu thảm thực vật Việt Nam để sàng lọc các hợp chất có hoạt tính,
1


dựa trên kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxicity) của các phần
chiết EtOAc từ lá, vỏ, quả cây Gội tôm Chisocheton cumingianus (C. DC.)

Harms họ Xoan (Meliaceae) trên dòng tế bào KB, chúng tôi chọn loài cây
này làm đối tượng nghiên cứu của luận án với những nội dung chính là:
1. Nghiên cứu phân lập một số chất có trong dịch chiết EtOAc của vỏ
cây Gội tôm Chisocheton cumingianus (C. DC.) Harms, họ Xoan
(Meliaceae)
2. Xác định cấu trúc hoá học của các chất phân lập được.
3. Khảo sát sơ bộ và tìm hiểu về hoạt tính sinh học của các chất phân
lập được.

2


CHƢƠNG I

TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về họ Xoan (Meliaceae) [5]
Theo thống kê của các nhà thực vật học thế giới, họ Xoan (Meliaceae)
có khoảng 50 chi và 550 loài phân bố khắp các miền nhiệt đới. Theo Phạm
Hoàng Hộ và Võ Văn Chi, Việt Nam cũng có 19 chi và 82 loài [3, 5]. Chi
Chisocheton có 8 loài mọc ở Việt Nam nhưng có 3 loài thường được nói
đến, phần lớn chúng là cây gỗ, cây cùng gốc hoặc khác gốc, lá mọc so le
không có lá kèm, kép lông chim; lá chét nguyên, mọc đối hoặc gần đối.
Cụm hoa chuỳ ở nách lá; hoa đực hoa cái và hoa lưỡng tính đều dài, hẹp.
Đài hợp có 3-5 răng. Cánh hoa 4-5, dài hơn đài gấp 5-6 lần, thuôn hình dải.
Nhị 6-10, có thể ít hơn, đơn thể; ống hình trụ, có thùy dạng răng ở đỉnh; bao
phấn thuôn, hướng trong. Đĩa mật dày, nạc, thành bẹ ngắn hay dạng đấu
quanh nhụy. Bầu hình cầu có lông nhung cứng; vòi hình sợi, có lông mềm,
cũng dài bằng ống nhị; đầu nhụy phình hình cầu, nỏ; mỗi ô chứa một noãn;
noãn treo, đảo. Quả nang mở ngăn; hạt bao bởi một áo hạt hình đấu, nạc,
chứa các tế bào có nhựa dầu.

Bảng 1: Ba loài phổ biến thuộc chi Chisocheton ở Việt Nam [5]

STT

Tên Việt Nam

Tên La tinh

1

Chisocheton ceramicus (Miq) C. DC.

Bò nang

2

Chisocheton cumingianus (C. DC.) Harms

Gội tôm

3

Chisocheton paniculatus Hiern

Quếch-Gội nước

3


1.2. Đặc điểm thực vật loài Chisocheton cumingianus (C. DC.) Harms

[5]
Cây Gội tôm (Chisocheton cumingianus (C. DC.) Harms là cây gỗ
cao khoảng 25-30 m; nhánh non và cuống lá có lông. Lá dài 40-60 cm; lá
chét mọc đối, không lông ở mặt trên, có ít lông ở mặt dưới. Cụm hoa chuỳ
bằng lá hoặc hơi lớn hơn, gồm nhiều chùm dạng bông; cuống hoa có lông
nhung, dài 1-2 mm, hoa đực thơm, màu trắng, dài 12-13 mm, đài hợp, có
4-5 răng ngắn và tròn. Cánh hoa 4-6, dài 15 mm, thuôn dài, lõm, tròn, hơi
dai. Nhị 7, ống hình trụ, hơi phình ở đỉnh, có lông ở mặt ngoài; bao phấn 7,
hướng trong. Đĩa mật dạng vòng, dạng bẹ dính với gốc bầu. Bầu nhỏ, hình
cầu; vòi dạng sợi, đầu nhuỵ hình cầu, nhỏ, chứa trong một đấu nhỏ. Quả
nang cắt vách, tròn tròn, đường kính 4,5 cm; hạt 3-4, màu nâu đen.
Cây gội tôm thường mọc trong rừng rậm, gỗ của cây được dùng
trong xây dựng và đóng đồ dân dụng.

Hình 1 : Cành lá và quả cây Chisocheton cumigianus (C. DC.) Harms
(Meliaceae)
Cho đến nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu về thành phần
hóa học của loài này được công bố. Thử hoạt tính sinh học sơ bộ cho thấy
phần chiết EtOAc của vỏ cây này có hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng
tế bào ung thư biểu mô người KB (Human epidemoid carcinoma). Trên cơ
4


sở đó tìm kiếm và phát hiện các hợp chất hoá học có hoạt tính tương ứng
trong vỏ cây Gội tôm trên nguyên lý: phân lập và xác định cấu trúc của các
chất dựa theo kết quả thử hoạt tính sinh học.
1.3. Nghiên cứu hóa học chi Chisocheton
Cho đến nay ở Việt Nam và trên thế giới chưa có nhiều nghiên cứu về
hóa thực vật của chi Chisocheton. Sau đây là một số lớp chất chính đã được
phân lập từ chi Chisocheton.

1.3.1. Các ancaloit
Năm 2004, hai hợp chất ancaloit chitin 1 (1) và chitin 2 (2) đã được
Tzouros M. và đồng nghiệp tách ra từ lá của cây Chisocheton weinlandii
[26].
O
H
N
S

N
H

O

N
O

1

O
H
N
N
H

N
O

2

5

O


1.3.2. Các hợp chất tecpenoit
Năm 1979, từ thân gỗ của loài Chisocheton paniculatus, các nhà khoa
học thuộc khoa Hoá - Trường Đại học Tổng hợp Glasgow (Scotland) đã
phân lập ra các hợp chất chisocheton B, C, G, E và F (3-7) [19].
OH
OH
OH
O

O
OH

H 3COCO

OH

HO

H 3COCO

OH

Chisocheton C (4)

Chisocheton B (3)
O

HO

O
O

O

O
OH

O

OAc

O

OAc

OAc

O

OAc
OAc

OAc

Chisocheton G (5)

Chisocheton F (7)

Chisocheton E (6)

Hợp chất 1,2-dihydro-6-acetoxyazadirone (8) có hoạt tính chống
nấm cũng được các nhà khoa học ấn Độ tách ra từ quả của loài
Chisocheton paniculatus [22] .
O

O

OAc
OAc

1,2-dihydro-6-acetoxyazadirone (8)

6


Đến năm 1999, các dẫn xuất tecpenoit khác là diepoxy-14apotirucallene-3,7,21-triol (9), paniculatin B (10), paniculatin G (11) đã
được Yadav R.D và cộng sự phân lập từ loài Chisocheton paniculatus [29,
30].
H

H
O

O

O

O
H

H

HO

HO
H

HO

H

OR

HO

OAc

Paniculatin G (10)

R= H, Diepoxy-14-apotirucallene-3,7,21-triol (9)
R=Ac, Paniculatin B (11)

Sau khi thử hoạt tính dịch chiết lá và thân của 6 loài thuộc chi
Chisocheton về hoạt tính gây ngán ăn đối với côn trùng, P. J. Gunning và

đồng nghiệp thuộc trường Đại học British Columbia (Canađa) đã lựa chọn lá
cây Chisocheton microcarpus để nghiên cứu về hóa thực vật và họ đã phân
lập được hai dẫn xuất limonoit từ loài này là 6-deacetoxy-23-oxochisocheton F (12) và 6-deacetoxy-7-deacetyl-23-oxo-chisocheton F (13),
(12) và 6-deacetoxy-7-deacetyl-23-oxo-chisocheton F (13), nhưng 2 hợp
chất này lại không có hoạt tính [23].
O

O
O

O

O

OH

6-deacetoxy- 23-oxo-chisocheton F (12)

O

OAc

6-deacetoxy-7-deacetyl-23-oxo-chisocheton F (13)

7


Gần đây, trong khuôn khổ hợp tác giữa Viện Hóa học Các hợp chất
Thiên nhiên - Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Quốc gia Pháp và Khoa
Hoá của Trường Đại học tổng hợp Malaya (Malaysia), các nhà khoa học đã

tách được 5 limonoit mới có hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào
ung thư máu P-388 là erythrocarpin A-E (14-18) từ vỏ cây Chisocheton
erythrocarpus [21]. Hợp chất Erythrocarpin A có hoạt tính cao nhất với giá
trị IC50 = 2,0 mg/ml.

O

O

O

O

H

H
CO 2Me

O

CO 2Me

O

O

O

H

H

OCOC6 H5

OCOC6 H5

R= C6H5 : Erythrocarpin A (14)
R=CH=CHC6H5 : Erythrocarpin C (16)

OH

Erythrocarpin B (15)

O

O

O
H

O

H

CO2 Me

CO2 Me

O

O

OH

OH

O

OH

O

H

H

OCOCH=CHC 6H 5

OCOCH=CHC 6H 5

Erythrocarpin D ( 17)

Erythrocarpin E (18)

1.4. Một vài nét về các chất có hoạt tính đƣợc phân lập từ các chi khác
của họ Xoan (Meliaceae)
8


Các hợp chất limonoit 15-O-deacetylnimbolidin (19) và 12-Odeacetyltrichilin H (20) được tách ra từ dịch chiết MeOH của quả cây Melia

azedarach trồng ở Braxin có hoạt tính gây độc tế bào cao đối với dòng tế
bào

HeLa

S3 với

IC50 của 15-O-deacetylnimbolidin và 12-O-

deacetyltrichilin H lần lượt là 0,1 mg/ml và 0,48 mg/ml [15].
O
OH
HO

MeO2 C
OAc

O
OH
O
O

AcO

OTig

AcO

H

O
OH

O
(H 3 C) 2HCOCO

12-O-deactyltrichilin H (20)

15-O-deacetylnimbolidin (19)

Từ quả của cây Melia toosendan của họ Xoan, các nhà khoa học Nhật
Bản phân lập được ra 2 hợp chất limonoit mới là toosendanal (21), 12-Omethylvolkensin (22) và 3 hợp chất limonoit đã biết là meliatoxin B1 (23),
trichilin H (24) và toosendanin (25). Các hợp chất này đã được thử hoạt tính
độc tế bào trên dòng tế bào KB. Toosendanin và trichilin H thể hiện có hoạt
tính cao với giá trị IC50 lần lượt là 3,82 mg/ml và 0,11 mg/ml. Hợp chất 12O-methylvolkensin có giá trị IC50 = 8,72 mg/ml, hai hợp chất toosendanal và
meliatoxin B1 chỉ ra không có hoạt tính độc tế bào trên dòng tế bào này với
giá trị IC50 > 10 mg/ml [25].

9


O

O

OAc

OCH 3

O

O
O

O

H

O
H

O

O
AcO

OH

AcO

H

OH
H

Tosendanal (21)

O

12-O-Methylvolkensin (22)

O

O
OAc
O

O
OH

OH

AcO
O

H

AcO

O

O
OH

AcO

O
OH

H

O

R

O

R=OCOCH(CH3)2 Trichilin H ( 24)
R=H Tosendanin (25)

Meliatoxin B1 (23)

Năm 1990, hợp chất 7-benzoylnimbocinol (26) được tách ra từ loài
Azadirachta indica có hoạt tính gây ngán ăn đối với côn trùng [14]. Cho
đến năm 2000, cũng từ lá của loài Azadirachta indica, các nhà khoa học
thuộc Viện Nghiên cứu Hóa học của Trường Đại học Karachi (Pakistan) đã
phân lập ra được 2 tetranortritecpenoit là 6ỏ-O-acetyl-7-deacetyl nimocinol
(27) và meliacinol (28). Hợp chất 6ỏ-O-acetyl-7-deacetylnimocinol (27)
chỉ ra có độc tính đối với loài muỗi Aedes aegypti, phép thử được thực hiện
trong 24h với nồng độ LC50 là 21 ppm thì có 50% muỗi bị chết và khi nồng
độ tăng lên đến 63 ppm thì diệt được 92% muỗi [9].
10


O

O

O

OCOC6 H 5

7-Benzoylnimbocinol (26)
O

O

(H 3C)2 C=(H3 C)COC

O
O

O

OH

HO

OH

OAc

O

6-O-acetyl-7-deacetylnimocinol (27)

meliacinol (28)

Hợp chất -L-Arabinofuranosyl-(16)-[-D-glucopyranosyl-(14)]-Dglucose (29) được tách ra từ vỏ cây Melia azadirachta (Meliaceae), có hoạt
tính chống ung thư đối với dòng tế bào Sarcoma-180 [13].

CH2

O

O

O

OH
HOH 2C

OH

OH

OH
CH2 OH
O
OH

HO

OH

O
OH

29

Ancaloit lenticellarine (30) được tách từ lá của cây Dysoxylum

lenticellare (Meliaceae), có hoạt tính trừ sâu cho cây cỏ [6, 7].

11


MeOOC
MeOOC
N

MeO

Lenticellarine ( 30)

Ancaloit dehydroodorin (31) được tách ra từ lá của loài Aglaia
formosana [11] và ancaloit (+)-odorinol (32) được tách ra từ hai loài
Aglaia odorata và Aglaia roxburghiana [24] có hoạt tính đối với dòng tế
bào ung thư máu P-388 với giá trị ED50 ≤ 3,86 mg/ml.
OH O

O

NH

NH

N

N
O

O

(+)-Odorinol (32)

Dehydroodorin (31)

Hợp chất aglafolin (33) được tách ra từ lá cây Aglaia odorata và
Aglaia elliptifolia (Meliaceae) có hoạt tính đối với 6 dòng tế bào ung thư,
KB, A-549, HCT, P388, RPMI-7951 và TE-671 với giá trị IC5o= 0,0010,005 mg/ml, ngoài ra nó còn có tác dụng làm thuốc trừ sâu [28].

12


HO
OMe
HO

O
OMe

MeO

O

OMe

Aglaf olin (33)

Rocaglamid (34) có hoạt tính chống nấm được tách ra từ 4 loài thuộc
chi Aglaia là Aglaia ferruginaea, Aglaia elaeagnoidea, Aglaia edulis và

Aglaia odorata với LD50 (mus, ipr) là 300 mg/kg. Hợp chất này còn có
khả năng ức chế gây bệnh ung thư đối với 6 dòng tế bào ung thư KB, A549, HCT, P388, RPMI-7951 và TE-671 với giá trị IC5o= 0,002 - 0,007
mg/ml [16, 28].
HO

O
HO

O

CON(CH 3) 2

O

O

Rocaglamid (34)

Hợp chất 2S-naringenin (35) có hoạt tính chống ung thư là một
flavonoit có mặt trong rất nhiều loài thực vật trong đó có các loài của họ
Meliaceae [27]

13


OH

O

HO

O
OH

Naringenin (35)

14


CHƢƠNG 2

THỰC NGHIỆM
2.1. Mẫu thực vật
Mẫu cây Chisocheton cumigianus (C. DC.) Harms được TS. Trần
Ngọc Ninh và dược sỹ David Bastien thu hái vào tháng 10 năm 1996 tại
Chí Linh, Hải Dương. Mẫu tiêu bản số VN 0193 được lưu giữ tại Viện
Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện KH&CN Việt Nam.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Các phân tích sắc ký được thực hiện theo phương pháp sắc ký lớp
mỏng (TLC).
- Việc phân lập các chất sạch được tiến hành bằng phương pháp sắc
ký cột silica gel và phương pháp kết tinh lại.
- Cấu trúc của các chất được xác định bằng sự kết hợp các phương
pháp hóa lí hiện đại như phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng
từ hạt nhân một chiều và hai chiều.
2.3. Thiết bị nghiên cứu
- Điểm nóng chảy được đo trên máy HMK 70/3159.
- Phổ hồng ngoại được ghi trên máy FTIR Impact-410.
- Phổ khối lượng (EI-MS) được đo trên máy HP 5989B MS. Phổ khối
lượng phun bụi điện tử (ESI-MS) được đo trên máy sắc ký lỏng ghép

khối phổ với đầu dò MSD (LC/MSD Agilent series 1100), sử dụng mode
ESI và đầu dò DAD.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance
500 MHz với TMS là chất chuẩn nội.
2.4. Dung môi và hóa chất
15


- Các dung môi được sử dụng là n-hexan, diclometan, etyl axetat,
axeton, n-butanol, etanol và metanol.
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn
Silica gel 60 Merck F254 có độ dày 0,2 mm. Quan sát bản mỏng
dưới ánh sáng tử ngoại ở 2 bước sóng  254 nm và 365 nm.
- Sắc ký cột (CC) sử dụng silica gel Merck cỡ hạt 40-63 m.
- Thuốc hiện trong phân tích sắc ký lớp mỏng: Xerisunfat,
Vanilin/H2SO4 đặc.
2.5. Chuẩn bị dịch chiết và thử hoạt tính gây độc tế bào
Lá, vỏ, quả cây Gội tôm sau khi sấy khô, nghiền nhỏ (80 g) được
ngâm chiết với EtOAc trong bể siêu âm 30 phút (3 x 500 ml). Các dịch
chiết thu được đem cất loại dung môi dưới áp suất giảm, kết quả thu được
96 mg dịch chiết lá, 99 mg dịch chiết vỏ và 93 mg dịch chiết quả của cây
Gội tôm.
Thử hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết EtOAc trên dòng tế bào
ung thư biểu mô người KB tại Viện Hoá học Các hợp chất Thiên nhiên CH Pháp.
Bảng 2 : Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào KB của dịch chiết
EtOAc cây Gội tôm
Nồng độ

Kết quả

(mg/ml)

(% ức chế)

Lá

1

33,78

KB

Vỏ

1

44,91

KB

Quả

1

37,22

STT

Dòng tế bào

Mẫu cây

1

KB

2
3

Qua kết quả thử hoạt tính ở bảng 2 cho thấy dịch chiết EtOAc của
vỏ cây có phần trăm ức chế cao nhất là 44,91% đối với dòng tế bào KB.
16


2.6. Xử lý mẫu và ngâm chiết
Vỏ cây Gội tôm sau khi phơi khô, xay nhỏ (2 kg) được ngâm chiết
với EtOH trong 24 h (3 x 2000 ml). Sau khi cô cạn dung môi trên máy
quay cất chân không thì thêm 300 ml H2O và chiết phân đoạn với n-hexan
(3 x 500 ml), EtOAc (3 x 500 ml) và n-BuOH (3 x 250 ml). Các dịch chiết
được làm khan bằng Na2SO4 và cất dưới áp suất giảm để loại dung môi.
Kết quả thu được 6,5 g phần chiết n-hexan, 17,1 g phần chiết EtOAc và 5,
8 g phần chiết butanol. Qui trình ngâm chiết và phân bố được trình bày
tóm tắt trên sơ đồ 1.

Sơ đồ 1: Qui trình ngâm chiết mẫu
Vỏ cây Gội tôm
Ngâm chiết trong EtOH trong 24 h
(3 x 2000 ml)
Quay cất chân không dưới áp suất thấp
Cặn dịch EtOH

Thêm 300 ml H2O
1. Chiết với n-hexan (3 x 500 ml)
2. Chiết với EtOAc (3 x 500 ml)
3. Chiết với n-BuOH (3 x 250 ml)
Quay cất chân không
1

Phần chiết n-hexan
(6,5 g)

2

Phần chiết EtOAc
(17,1 g)

2.7. Phân lập các chất trong phần chiết EtOAc

17

3

Phần chiết n-BuOH
(5,8 g)


17,1 g phần chiết EtOAc được hoà với CH2Cl2 và MeOH vừa đủ cho
tan hết. Dung dịch thu được đem trộn với 18 g silica gel, làm bay hơi dung
môi đến khô thu được một hỗn hợp bột tơi màu nâu đen. Hỗn hợp này
được tiến hành sắc ký cột trên silica gel cỡ hạt 40-63 mm giải hấp bằng hệ
dung môi CH2Cl2-MeOH, tăng dần lượng MeOH từ 0 - 40 %. Kết quả thu

được 5 phân đoạn chính là Fr 7-8, Fr 12-25, Fr 26-30, Fr 32-37 và Fr 4446.
Các phân đoạn này tiếp tục làm sạch bằng sắc ký cột và kết tinh lại
cho 6 chất sạch như trong sơ đồ 2.
Sơ đồ 2: Qui trình phân lập phần chiết EtOAc
Phần chiết EtOAc
(17,1 g)
CC, silica gel (CH2Cl2 / MeOH gradient)

Fr 7-8

Fr 12-25

CC, silica gel
CH2Cl2 / MeOH
(gradient)

Stigmasterol
(30 mg)

Fr 26-30

CC, silica gel
CH2Cl2 / MeOH
(gradient)

ECC1 (80mg)
ECC2 (8,7mg)

Fr 32-37

CC, silica gel
CH2Cl2 / MeOH
(gradient)

ECC1 (30 mg)
ECC2 (13 mg)

Fr 44-46

CC, silica gel
CH2Cl2 / MeOH
(gradient)

ECC3( 20 mg)
ECC4 (16mg)
õ-sitosterol glucozit
(15 mg)

2. 8. Hằng số vật lí và dữ kiện phổ của các chất phân lập đƣợc
18

CC, silica gel
CH2Cl2 / MeOH
(gradient)


Hai hợp chất stigmasterol và õ-sitosterol glucozit đã được so sánh
bằng TLC với chất chuẩn đã được tách ra ở phòng thí nghiệm, sau đó được
đem đi đo điểm chảy để kiểm tra.

2.8.1. Stigmasterol
Tinh thể hình kim màu trắng (n-hexan/EtOAc), đnc: 167oC; Rf = 0,58
(n-hexan-EtOAc 8:2); Tài liệu tham khảo [1]: đnc. 165 oC (n-hexan).
2.8.2. õ-Sitosterol glucozit
Chất

rắn

vô

định

hình

màu

trắng

đnc:

282oC;

Rf =

0,53

(CH2Cl2-MeOH 8,5:1,5); Tài liệu tham khảo [4]: đnc. 282-283oC (EtOH).
2.8.3. Axit psoromic (ECC1)
Tinh thể hình kim màu trắng (axeton), đnc: 265 oC.
FT-IR (KBr) max (cm-1): 3592, 3463, 2976, 2926, 1735, 1646, 1565, 1491,

1427, 1255, 1200, 1131, 810, 724, 600.
1

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): ọ (ppm) 2,19 (3H, s, 9-CH3); 2,45 (3H, s,

1-CH3); 3,83 (3H, s, 8-OCH3); 6,84 (1H, s, H-2); 7,09 (1H, s, H-7); 10,43
(1H, s, 4-CHO); 12,09 (1H, s, 6-COOH).
13

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): ọ (ppm) 193,8 (CHO); 166,0 (COOH);

164,7 (C-4a); 163,9 (C-3); 160,9 (C-11); 154,6 (C-8); 152,6 (C-1); 143,3
(C-9a); 142,4 (C-5a); 123,3 (C-6); 122,7 (C-9); 117,3 (C-2); 111,8 (C11a); 110,8 (C-4); 107,6 (C-7); 56,2 (OCH3); 21,5 (1-CH3); 9,6 (9-CH3).
EI-MS: m/z 358 [M]+ (C18H14O8), 341, 314, 286 (pic cơ bản), 271, 243,
177.

2.8.4. Axit conpsoromic (ECC2)
19


Tinh thể hình kim màu trắng (axeton), đnc: 285 oC.
FT-IR (KBr) max (cm-1): 3368, 3307, 2929, 1698, 1654, 1579, 1436, 1357,
1269, 1117, 873, 799, 587.
1

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): ọ (ppm) 2,17 (3H, s, 9-CH3); 2,46 (3H, s,

1-CH3); 6,83 (1H, s, H-2); 7,01 (1H, s, H-7); 10,19 (1H, s, OH); 10,44 (1H,
s, 4-CHO); 12,10 (1H, s, 6-COOH).
13

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): ọ (ppm) 194,1 (CHO); 165,9 (COOH);

165,0 (C-4a); 163,9 (C-3); 161,1 (C-11); 153,1(C-8); 152,6 (C-1); 143,6
(C-9a); 141,4 (C-5a); 122,8 (C-6); 121,2 (C-9); 117,1 (C-2); 111,9 (C11a); 111,7 (C-7); 110,8 (C-4); 21,5 (1-CH3); 9,7 (9-CH3).
EI-MS: m/z 344 [M]+ (C17H12O8), 326, 258 (pic cơ bản), 243, 177.
2.8.5. Axit 3,4-dihydroxybenzoic (ECC3)
Tinh thể hình kim màu trắng (MeOH), đnc: 195 C.
FT-IR (KBr) max (cm-1): 3542, 3470, 2926, 1675, 1600, 1470, 1420, 1296,
1097, 944, 764, 557.
1

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): ọ (ppm) 6,78 (1H, d, J = 8 Hz, H-5); 7,29

(1H, dd, J = 8 Hz, 2 Hz, H-6); 7,34 (1H, d, J = 2 Hz, H-2).
13

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): ọ (ppm) 167,3 (COOH); 149,9 (C-4);

144,8 (C-3); 121,8 (C-6); 121,6 (C-1); 116,5 (C-2); 115,1 (C-5).
EI-MS: m/z 154 [M]+ (C7H6O4), 137 (pic cơ bản).
2.8.6. Chisocheton B (ECC4)
Tinh thể hình kim màu trắng (MeOH), đnc 205 C.
FT-IR (KBr) max (cm-1): 3437, 2931, 2867, 1687, 1604, 1455, 1415, 1309,
1027, 604, 572.
1

H-NMR (500 MHz, CDCl3+CD3OD): ọ (ppm) 0,85 (3H, s, CH3-28);

0,92 (3H, s, CH3-29); 0,94 (3H, s, CH3-19); 1,02 (3H, s, CH3-18); 1,10

20


(3H, s, CH3-30); 1,22 (3H, s, CH3-26); 1,23 (3H, s, CH3-27); 1,29 (1H, dd,
J=13; 3,5 Hz, H-1b); 1,41 (1H, dt, J=13; 3,5 Hz, H-1a); 1,50-1,59 (4H, m,
H-2b + H11b + H-12b + H-20); 1,67-1,71 (2H, m, H-6b + H-11a); 1,80
(1H, td, J=9; 2,3 Hz, H-6a); 1,89-1,95 (3H, m, H-12a + H-2a + H-22b);
1,99-2,06 (4H, m, H-9 + H5 + H-17 + H-22a); 2,06 (3H, s, OCOCH3); 2,12
(1H, m, H-16b); 2,30 (1H, m, H-16a); 2,87 (1H, d, J= 9 Hz, H-24); 3,45
(1H, dd, J= 11,5; 2,5 Hz, H-21b); 3,83 (1H, m, H-23); 4,63 (1H, t, J=2,5
Hz, H-7); 4,00 (1H, d, J= 11,5 Hz, H-21a); 4,63 (1H, t, J= 2,5 Hz, H-3);
5,47 (1H, d, J=2,5 Hz, H-15).
13

C-NMR (125 MHz, CDCl3+CD3OD): ọ (ppm) 172,7 (C=O); 162,6 (C-

14); 120,7 (C-15); 87,6 (C-24); 79,7 (C-3); 74,3 (C-25); 73,9 (C-7); 71,1
(C-21); 65,5 (C-23); 53,7 (C-17); 47,7 (C-13); 45,2 (C-8); 43,2 (C-5); 42,9
(C-9); 38,6 (C-10); 37,4 (C-22); 37,3 (C-4); 37,12 (C-20); 35,9 (C-16);
35,7 (C-12); 34,5 (C-1); 28,5 (C-30); 28,0 (C-28); 27,8 (C-26); 25,3 (C-6);
24,6 (C-27); 23,7 (C-2); 22,2 (C-29); 21,2 (OCOCH3); 19,5 (C-18); 17,6
(C-11); 15,8 (C-19).
ESI-MS: m/z 533 [M+H] + C32H52O6.
2.9. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các hợp
chất đƣợc phân lập từ phần chiết EtOAc
 Các chủng vi khuẩn và vi nấm kiểm định:
- Vi khuẩn Gram (-) : Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa,
- Vi khuẩn Gram (+) : Bacillus subtilis và Staphylococcus aureu,
- Nấm men : Candida albicans.

* Các bước tiến hành như sau:

21


- Pha loãng mẫu thử bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ:
Mẫu ban đầu có nồng độ 20 mg/ml được pha loãng thành các nồng
độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng từ nồng độ 128; 32; 8; 2 và
0,5 g/ml đối với chất sạch 256; 64; 16; 4 và 1 g/ml đối với dịch chiết.
- Thử hoạt tính:
Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.10 5 khi tiến
hành thử. Lấy 10 l dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha
loãng thêm 200 l dung dịch vi sinh vật hoặc nấm, ủ ở 37 0C sau 24 giờ
đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Đọc độ đục tế bào trên máy Tecan, xử lý
số liệu và tính toán giá trị IC50. Giá trị MBC thu được sau khi cấy dung
dịch trên đĩa thạch agar ủ ở 37 0C sau 24 giờ.
2.10. Phƣơng pháp thử hoạt tính chống ôxy hóa các hợp chất đƣợc
phân lập từ phần chiết EtOAc
* Phương pháp tiến hành :
- Chuẩn bị chất thử:
Mẫu ban đầu có nồng độ 20 mg/ml được pha loãng thành các nồng
độ khác nhau để thử hoạt tính với enzym từ nồng độ 128; 32; 8; 2 và 0,5
g/ml đối với chất sạch và từ nồng độ 256; 64; 16; 4 và 1 g/ml đối với
dịch chiết.
- Phản ứng:
Mẫu thử có các nồng độ trong phản ứng như trên.
- Enzym máu người: 60 l; đệm acetat natri pH 4,7: 60 l ; indigocamin:
20 l; H2O2: 60 l.

22

Để thời gian phản ứng 20 phút. Hoạt động của enzym được đánh giá
nhờ lượng cơ chất bị chuyển hoá trong phản ứng oxy hóa đọc trên máy
spectrophotometer. IC50 được tính bằng chương trình Raw data.

23


CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập đƣợc

3.1.1. Stigmasterol và õ-sitosterol glucozit
Hai hợp chất stigmasterol và õ-sitosterol glucozit đã được so sánh
bằng TLC với chất chuẩn đã được tách ra ở phòng thí nghiệm, sau đó được
đem đi đo điểm nóng chảy để kiểm tra. Kết quả cho thấy chúng có điểm
chảy phù hợp với stigmasterol và õ-sitosterol glucozit [1, 4].

HO

GlcO

-Sitosterol glucozit

Stigmasterol

3.1.2 Axit prosomic (ECC1)
Phân đoạn F 12-25 sau khi đã được tinh chế trên cột silica gel và kết
tinh lại trong axeton cho 80 mg chất ECC1 dưới dạng tinh thể hình kim

màu trắng đnc. 265oC.
Phổ hồng ngoại có các đỉnh hấp thụ mạnh ở 1735, 1646 cm-1 đặc
trưng cho nhóm cacbonyl; ở 3592, 3463 cm-1 đặc trưng cho nhóm OH và
1565, 1491 cm-1 đặc trưng cho vòng thơm. Phổ khối lượng va chạm
electron (EI-MS) của ECC1 cho pic ion phân tử m/z 358 [M]+ ứng với
công thức phân tử là C18H14O8.
24


Phổ 13C-NMR của ECC1 trong DMSO-d6 cho biết sự có mặt của 18
nguyên tử cacbon trong phân tử bao gồm 1 nhóm anđehit ở 193,8 ppm, 1
nhóm cacbonyl C=O của axit ở 166,0 ppm, 1 nhóm cacbonyl C=O ở 160,9
ppm, 2 nhóm metyl ở 21,5 và 9,6 ppm, 2 cacbon metin ở 117,3 và 107,6
ppm, 1 nhóm OCH3 ở 56,2 ppm và 10 cacbon bậc 4 trong đó có 5 cacbon
bậc bốn nối với O ở 164,7, 163,9, 154,6, 143,3, và 142,4 ppm .
Trên phổ 1H-NMR, có tín hiệu của 1 nhóm OH của axit ở 12,09
ppm, 1 proton của anđehit ở 10,43 ppm, 2 proton vòng thơm ở 6,84 ppm
(s, 1H) và 7,09 ppm (s, 1H), 1 nhóm metoxy ở 3,83 ppm, 2 nhóm metyl ở
2,19 ppm và 2,45 ppm.
Trên phổ HMQC có sự tương tác trực tiếp của C-2 (117,3 ppm) với
H-2 (6,84 ppm); C-7 (107,6 ppm) với H-7 (7,09 ppm); proton của nhóm
metyl (2,19 ppm) với cacbon metyl (9,6 ppm); proton của nhóm metyl
(2,45 ppm) với cacbon metyl (21,5 ppm); proton của nhóm metoxy (3,83
ppm) với cacbon của nhóm metoxy (56,2 ppm). Trên phổ HMBC có sự
tương tác xa (2J, 3J) của 1 proton metyl với C-11a, C-2, C-1 và proton
metyl còn lại tương tác với C-8, C-9, C-9a, chứng tỏ rằng 2 nhóm metyl
nối với C-1 và C-9; proton của nhóm OCH3 tương tác với C-8 chứng tỏ
rằng nhóm metoxy nối với C-8; proton andehit tương tác với C-4, C-4a và
C-3 chứng tỏ nhóm CHO nối với C-4; proton H-7 tương tác với C-6, C-5a,
C-9, C-8 và COOH; proton H-2 tương tác với C-4, CH3-C1, C-3.

So sánh các phổ NMR với các tài liệu đã được công bố [17,18] cho
thấy chất ECC1 là axit psoromic. Hợp chất này có mặt trong một số loài
địa y [17,18] và nó cũng được tách ra từ vỏ cây Zanthoxylum
conspersipunctatum họ Cam quýt (Rutaceae) [12]. Các nhà khoa học Nhật
Bản thuộc Trường Đại học Tổng hợp Tokyo đã nghiên cứu về hoạt tính

25