Nghiên cứu khả năng kháng pepsin của một số đột biến điểm trên bề mặt phytase từ bacillus subtilis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
===============

VŨ PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG PEPSIN
CỦA MỘT SỐ ĐỘT BIẾN ĐIỂM
TRÊN BỀ MẶT PHYTASE TỪ Bacillus subtilis

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

HÀ NỘI - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
===============

VŨ PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG PEPSIN
CỦA MỘT SỐ ĐỘT BIẾN ĐIỂM
TRÊN BỀ MẶT PHYTASE TỪ Bacillus subtilis
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60.42.01.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. TRẦN THỊ THÚY

HÀ NỘI - 2015


Lời cảm ơn!
===**===
Qua một thời gian làm việc tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh
học – Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, tôi đã hoàn thành
luận văn thạc sĩ: “Nghiên cứu khả năng kháng pepsin của một số đột biến điểm
trên bề mặt phytase từ Bacillus subtilis”
Để hoàn thành được công trình này, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, chỉ
bảo và đóng góp ý kiến quý báu từ các thầy cô, gia đình và các bạn đồng nghiệp.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Thị Thúy, người đã dạy dỗ
em trong quá trình học tập, người đã dìu dắt em những bước đi đầu tiên trong con
đường khoa học và luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình thực hiện các
nội dung nghiên cứu của đề tài.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy, cô giáo trong Bộ môn Công nghệ
Sinh học – Vi sinh, những người đã dạy dỗ, luôn quan tâm, động viên khuyến khích và
có những ý kiến đóng góp quý báu cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn cô Đỗ Thị Hồng – cán bộ Bộ môn Hóa sinh Tế
bào cùng các bạn trong nhóm nghiên cứu Sinh học phân tử và tất cả các anh, chị,
em nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên của Phòng thí nghiệm Công nghệ
Sinh học – Vi sinh đã nhiệt tình giúp đỡ và chia sẻ với em trong suốt thời gian qua.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tình yêu thương tới gia đình, những
người luôn sát cánh, động viên tôi vượt qua khó khăn trong suốt thời gian học tập
và nghiên cứu. Cảm ơn con gái bé nhỏ Thùy Dương của mẹ.
Ngoài ra, các nội dung nghiên cứu của luận văn được tài trợ bởi Quỹ phát
triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.06 –
2012.86. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến quỹ NAFOSTED.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Học viên

Vũ Phương Liên


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Axit phytic và phytate .............................................................................. 3
1.1.1. Axit phytic............................................................................................ 3
1.1.2. Phytate................................................................................................. 4
1.2. Phytase....................................................................................................... 5
1.2.1. Phân loại phytase ................................................................................ 6
1.2.2. Đặc tính lí hóa của phytase................................................................. 8
1.3. Phytase kiềm (β-propller phytase-BPP) từ Bacillus sp....................... 10
1.3.1. Vài nét về chi Bacillus ....................................................................... 10
1.3.2. Phytase từ Bacillus ............................................................................ 10
1.4. Ứng dụng của phytase............................................................................ 12
1.5. Một số thành tựu nghiên cứu gây đột biến điểm trên phytase .......... 14
1.6. Pepsin....................................................................................................... 15
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 19
2.1. Vật liệu và hóa chất ................................................................................ 19
2.1.1. Hóa chất ............................................................................................ 19
2.1.2. Thiết bị .............................................................................................. 19
2.1.3. Chủng giống vi sinh vật .................................................................... 20
2.1.4. Plasmid .............................................................................................. 20
2.1.5. Môi trường nuôi cấy và dung dịch đệm ............................................ 20

2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 21
2.2.1. Phương pháp tin sinh học ................................................................. 21
2.2.2. Phương pháp vi sinh ......................................................................... 22


2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử ......................................................... 23
2.2.4. Phương pháp hóa sinh ...................................................................... 28
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 34
3.1. Thiết kế các cặp mồi mang đột biến điểm trên bề mặt của
phytase kiềm .................................................................................................. 34
3.2. Tách chiết plasmid tái tổ hợp mang gen phyC từ E. coli NovaBlue...... 36
3.3. Sinh tổng hợp gen đột biến bằng phản ứng PCR................................ 38
3.4. Chuyển plasmid mang cấu trúc đột biến vào tế bào biểu hiện E.
coli BL21(DE3) .............................................................................................. 39
3.5. Kiểm tra sự có mặt của điểm đột biến trên gen phyC ........................ 41
3.6. Biểu hiện phytase kiềm từ Bacillus subtilis .......................................... 42
3.7. Đánh giá sự biểu hiện gen phyC thông qua hoạt tính phytase ........... 43
3.7.1. Đánh giá hoạt tính phytase tái tổ hợp được biểu hiện ở E. coli
BL21(DE3) mang cấu trúc phyC không đột biến ....................................... 43
3.7.2. Đánh giá hoạt tính phytase tái tổ hợp được biểu hiện ở E. coli
BL21(DE3) mang đột biến Y143P trên gen phyC ...................................... 44
3.7.3. Đánh giá hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E. coli
BL21(DE3) mang đột biến E189P trên gen phyC ...................................... 45
3.7.4. Đánh giá hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E. coli
BL21(DE3) mang đột biến E297P trên gen phyC ...................................... 46
3.8. Đánh giá tính kháng pepsin của các phytase kiềm đột biến .............. 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 52
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................... 54
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Tên đầy đủ

aa

Axit amin

Bp

Base pairs

cs

Cộng sự

EDTA

Ethylendiamin tetra acetic acid

IU

International Unit

Kb

Kilo bases

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria- Betani

PCR

Polymerase Chain Reaction

Pvc

Phốt phát vô cơ

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate – Poly Arcrylamide Gel

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại phytase theo Hiệp hội các nhà hóa sinh học Quốc tế ..... 6
Bảng 1.2. Phân loại một số phytase đã được nghiên cứu ................................ 7
Bảng 1.3. Nhiệt độ và pH tối ưu của một số phytase ...................................... 9
Bảng 2.1. Xử lý sản phẩm PCR đột biến ....................................................... 24

Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR tuyển chọn .................................. 27
Bảng 3.1. Các vị trí có khả năng bị thủy phân cao bởi enzyme pepsin
trên phytase kiềm từ Bacillus subtilis ........................................... 34
Bảng 3.2. Các axit amin cần đột biến và bộ ba mã hóa thay thế ................... 36
Bảng 3.3. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR gây đột biến................. 36
Bảng 3 4. Phản ứng PCR sinh tổng hợp các plasmid mang đột biến trên
gen phyC........................................................................................ 38
Bảng 3.5. Kết quả cô đặc enzyme ................................................................. 49
Bảng 3.6. Kết quả thử nghiệm điều kiện tiếp xúc của phytase kiềm chưa
đột biến với pepsin ........................................................................ 49
Bảng 3.7. Khả năng kháng pepsin của các cấu trúc phytase kiềm trước
và sau đột biến ............................................................................... 50


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1.

Cấu tạo phân tử phytate liên kết với các ion kim loại và protein .......... 5

Hình 1.2.

Phản ứng thủy phân phytate bởi phytase ...................................... 6

Hình 1.3.

Cấu trúc của BPP phytase ........................................................... 11

Hình 1.4.

Sơ đồ minh họa cơ chế tác dụng của các protease với cơ chất ....... 16

Hình 2.1.

Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng BSA
(μg/ml) với độ hấp thụ quang A595 ............................................. 29

Hình 2.2.

Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ
NaH2PO4 hay Pvc (mM) với độ hấp thụ quang A700.................... 32

Hình 3.1.

Minh họa các điểm trên bề mặt phân tử 1POO có khả năng
bị cắt bởi pepsin bằng phần mềm Pymol ................................... 35

Hình 3.2.

Kiểm tra plasmid mang gen mã hóa phytase kiềm tách chiết
từ E. coli NovaBlue .................................................................... 37

Hình 3.3.

Sản phẩm PCR sinh tổng hợp các cấu trúc đột biến .................. 39

Hình 3.4.

Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen phyC trong các dòng E.
coli BL21(DE3) đã được biến nạp các cấu trúc đột biến ............. 40

Hình 3.5.

Kết quả điện di tách các mẫu plasmid mang cấu trúc đột biến ....... 41

Hình 3.6.

Kết quả đọc trình tự các cấu trúc đột biến .................................. 42

Hình 3.7.

Đồ thị sinh trưởng của các dòng tế bào E. coli mang và
không mang đột biến .................................................................. 43

Hình 3.8.

Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E. coli BL21(DE3)
mang cấu trúc phyC không đột biến ........................................... 44

Hình 3.9.

Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E. coli BL21(DE3)
mang đột biến Y143P trên gen phyC.......................................... 44

Hình 3.10. Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E. coli BL21(DE3)
mang đột biến E189P trên gen phyC .......................................... 45
Hình 3.11. Hoạt tính phytase tái tổ hợp biểu hiện ở E. coli BL21(DE3)
mang đột biến E297P trên gen phyC .......................................... 46
Hình 3.12. Sự biểu hiện gen phyC ra ngoài môi trường nuôi cấy được
đánh giá trên bản điện di SDS- PAGE ....................................... 47

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Phytase là enzyme được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi nhằm loại
bỏ chất kháng dinh dưỡng - phytate trong các loại bột ngũ cốc, thành phần
chính của thức ăn chăn nuôi.
Phytate (myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphosphate) trong các hạt
ngũ cốc và các loại hạt đậu là nguồn dự trữ phốt pho chính yếu của hạt
(chiếm 60% tổng số phốt pho của hạt) [33]. Mặc dù đóng vai trò quan trọng
trong quá trình chín, nảy mầm của hạt, phytate (dạng muối của axit phytic)
lại tạo liên kết chặt chẽ với axit amin, protein, tinh bột và các khoáng kim
loại quan trọng (như kẽm, sắt, canxi, magiê…) gây ra hiệu ứng kháng dinh
dưỡng, làm giảm giá trị dinh dưỡng của các chất này [13]. Đường ruột của
động vật dạ dày đơn như lợn, gia cầm và cá không có khả năng chuyển hóa
phytate, do vậy, việc bổ sung phytase vào thức ăn chăn nuôi nhằm giảm
lượng axit phytic, sẽ giúp tận dụng tối đa nguồn phốt phát, ion kim loại và
protein sẵn có trong thức ăn; đồng thời giảm thiểu ô nhiễm môi trường do
phốt phát thải ra từ phân động vật nuôi [24].
Phytase là loại enzyme xúc tác thủy phân đặc hiệu phytate thành các
myo-inositol phốt phát bậc thấp và các gốc phốt phát vô cơ (Pvc) tự do, giúp
động vật hấp thu một cách dễ dàng [24]. Các phytase thương mại hiện nay
chủ yếu là các phytase axit (từ nấm mốc, nấm men và vi khuẩn E. coli), chúng
hoạt động tốt ở pH thấp của dạ dày nhưng hoạt động kém ở pH trung tính và
hơi kiềm của ruột non, đặc biệt không chịu được nhiệt độ cao [24, 49].
Phytase kiềm (từ Bacillus và phấn hoa của một số loài thực vật) hoạt động
tốt ở môi trường trung tính và hơi kiềm của ruột non; enzyme này chịu
nhiệt và pH axit (chịu được nhiệt độ cao trong quá trình ép viên thức ăn

1

công nghiệp và môi trường axit trong dạ dày), tuy nhiên, chúng hoạt động
kém ở pH dạ dày và thường nhạy cảm với pepsin, loại enzyme tiêu hóa có
trong dạ dày [46]. Do vậy, cần có các nghiên cứu nhằm tăng cường các đặc
tính của phytase kiềm cho phù hợp với ứng dụng của ngành chăn nuôi (bền
nhiệt, hoạt động ở dải pH rộng, kháng lại các enzyme trong đường tiêu hóa
của động vật nuôi).
Pepsin là enzyme tiêu hóa quan trọng và chủ đạo trong dạ dày người và
động vật dạ dày đơn, chúng thủy phân đặc hiệu đối với các cấu trúc dạng
vòng xoắn trên bề mặt phân tử protein có chứa các axit amin kị nước [30].
Loại bỏ được các điểm nhạy cảm này trên bề mặt phytase kiềm sẽ giúp nâng
cao khả năng kháng lại pepsin cho phytase kiềm khi đưa chúng vào thức ăn
và vào đường tiêu hóa của động vật nuôi.
Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng
kháng pepsin của một số đột biến điểm trên bề mặt phytase từ Bacillus subtilis”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Sinh tổng hợp được một số cấu trúc mang đột biến điểm trên bề mặt
phytase từ Bacillus subtilis và đánh giá được khả năng kháng pepsin của các
phytase đột biến này.
3. Nội dung nghiên cứu
1/ Tổng hợp 3 cấu trúc ADN tái tổ hợp mã hóa phytase kiềm từ
Bacillus subtilis mang một điểm đột biến.
2/ Tách và kiểm tra các plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa cho
phytase kiềm đột biến.
3/ Biến nạp các plasmid tái tổ hợp mang đột biến điểm vào E. coli, tiến
hành biểu hiện các phytase đột biến.
4/ Đánh giá hoạt tính và tính kháng pepsin của các phytase đột biến.

2

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Axit phytic và phytate
1.1.1. Axit phytic
Một trong số những nguyên tố khoáng đa lượng rất cần cho sự phát
triển của người và vật nuôi là phốt pho. Cũng giống như nitơ, phốt pho là một
trong những thành phần cơ bản tạo nên axit nucleic và các hợp chất sinh học
khác. Đối với người cũng như động vật, phốt pho và các nguyên tố khoáng
cần thiết khác được cung cấp chủ yếu qua con đường thức ăn. Thành phần
chính trong thức ăn của người và động vật là các hạt ngũ cốc; chúng đều có
chứa phốt pho nhưng phần lớn ở dạng muối phytate hoặc axit phytic.
Khoảng hơn 60% lượng phốt pho trong các loại hạt ngũ cốc tồn tại
dưới dạng axit phytic (myo-inositolhexadihydrogenphosphate). Đây là hợp
chất rất khó hấp thu [15] bởi vòng myo-inositol của nó liên kết với 6 gốc phốt
phát, tích điện âm trong phổ pH rộng.
Ở pH sinh lý, axit phytic là một chất kiềm mạnh, nó trở thành dạng đa
ion tích điện âm, dễ dàng kết hợp với các ion kim loại như Fe, Mg2+, Ca2+,
Zn2+,... ngăn cản khả năng kết hợp của các ion kim loại này với các axit béo
không no, làm giảm khả năng tiêu hóa các kim loại thiết yếu này trong thức
ăn của động vật, gây ra hiệu ứng kháng dinh dưỡng. Điều này dẫn đến sự
thiếu hụt một số loại dinh dưỡng khoáng cho nhu cầu cơ thể con người, đặc
biệt là thiếu sắt và kẽm [10, 11]. Thiếu sắt, kẽm là bệnh thường gặp ở trẻ em,
phụ nữ mang thai đây là nguyên nhân dẫn đến tình trạng thiếu máu nếu tình
trạng này kéo dài sẽ làm cho cơ thể suy yếu, gây ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng và phát triển của cơ thể, thậm chí có thể gây tử vong [7]. Mặt khác, do
không hấp thu được lượng phốt pho có sẵn trong axit phytic nên thức ăn cho

3

động vật dạ dày đơn thường phải bổ sung thêm Pvc. Lượng phốt phát không
được động vật tiêu hóa hết bị thải ra ngoài theo phân gây ô nhiễm phốt phát
trong môi trường, là nguyên nhân gây bùng phát hiện tượng tảo nở hoa, ảnh
hưởng đến sự phát triển của các loài thủy sinh [39].
1.1.2. Phytate
Phytate (myo - inositol (1,2,3,4,5,6) hexakis phosphate), là dạng
muối của axit phytic. Phytate thường chiếm từ 1 đến vài phần trăm trọng
lượng khô của hạt, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chín, nảy mầm của
hạt [25, 15]. Không có hạt trưởng thành nào mà không có phytate mặc dù nó
có thể không có ở một số mô hạt nhất định nào đó. Phytate cũng được tìm
thấy ở hạt phấn, bào tử túi và mô sinh dưỡng như rễ, cuống và lá. Phytate
chứa 14 - 25% phốt pho; 1,2 - 2% canxi; 1 - 2% kẽm và sắt. Trong các loại
hạt ngũ cốc, các loại hạt đậu chứa hàm lượng phytate cao nhất (5,92 –
9,15%); tiếp đó là hạt ngô/bắp (0,83 – 2,22%) [33]. Phytate làm giảm khả
năng hấp thụ protein, tinh bột và lipit vì chúng tạo phức với protein làm cho
protein kém tan và kháng lại sự phân giải protein trong đường tiêu hóa của
động vật nuôi và người. Ở pH thấp 4,0 - 5,0; axit phytic mang điện tích âm
mạnh do các nhóm phốt phát không phân ly hoàn toàn. Trong điều kiện này,
axit phytic gây ảnh hưởng đến khả năng hòa tan protein vì liên kết ion giữa
các nhóm phốt phát của chúng với các gốc axit amin bị ion hóa (lysyl,
histidyl, arginyl). Ở pH 6,0 - 8,0; axit phytic và protein thực vật đều có điện
tích âm nhưng phức hợp giữa axit phytic và protein vẫn được hình thành
thông qua cầu nối liên kết với các ion kim loại, làm giảm giá trị dinh dưỡng
của protein trong thực phẩm [27].
Phytate còn có khả năng ảnh hưởng đến sự tiêu hóa tinh bột, protein
thông qua sự liên kết với tinh bột và canxi tham gia hoạt hóa enzyme
amylase. Phytate tạo phức với protein (Hình 1.1) và ức chế trypsinogen. Vì

4


vậy, phytate được coi là chất kháng dinh dưỡng (Anti-nutrient factor, ANF)
trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử phytate liên kết với các ion kim loại và protein [52]
1.2. Phytase
Phytase là enzyme thủy phân đặc hiệu phytate; do vậy, nó có khả năng
làm giảm tính kháng dưỡng của thức ăn có hàm lượng phytate cao. Phytase
tồn tại ở vi sinh vật, thực vật và mô động vật. Enzyme này được phân lập chủ
yếu từ thực vật [33] vi khuẩn [35] và nấm [31] để bổ sung vào thức ăn chăn
nuôi, làm tăng hiệu quả hấp thụ phốt phát, canxi thêm khoảng 60%. Do đó,
enzyme này đóng vai trò quan trọng trong cải thiện tốc độ tăng trưởng của vật
nuôi và tăng cường hiệu quả hấp thu thức ăn.
Phytase xúc tác quá trình thủy phân các liên kết ester của phytate (myoinositol 1, 2, 3, 4, 5, 6-hexakisphosphate; IP6), lần lượt tạo ra các dẫn xuất ít
phốt phát hơn của myo-inositolphosphate, đồng thời giải phóng Pvc (Hình
1.2)[24]. Các chất này dễ dàng được hấp thụ bởi các động vật dạ dày đơn.
Chính vì vậy, việc bổ sung phytase vào thức ăn cho vật nuôi không những cho
phép chúng đồng hóa tốt thành phần phốt phát sẵn có trong thức ăn, mà còn
làm tăng hấp thu protein và các nguyên tố khoáng [16].

5


Hình 1.2. Phản ứng thủy phân phytate bởi phytase [24]
1.2.1. Phân loại phytase
Theo Hiệp hội các nhà hóa sinh học thế giới (The International Union
of Biochemists), có 2 loại phytase chủ yếu là: 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6phytase (EC 3.1.3.26). Chúng khác biệt nhau ở vị trí của gốc phốt phát trên
vòng inositol mà chúng bắt đầu tấn công để xúc tác thủy phân.

Bảng 1.1. Phân loại phytase theo Hiệp hội các nhà hóa sinh học Quốc tế
[12, 34]
Kí hiệu
Tên
thông thường
Tên
hệ thống
Vị trí
thủy phân
liên kết phosphodieste đầu tiên
Sản phẩm
đầu tiên

Đối tượng

Phytase-3-phosphatase
EC 3.1.3.8

Phytase-6-phosphatase
EC 3.1.3.26

3 – phytase

6 – phytase

myo - inositolhexakis
phosphate - 3 –
phosphohydrolase
vị trí gốc phốt phát thứ
3 của myoinositolhexakis

phosphate
D-myo-inositol1,2,4,5,6-pentakis
phosphate và phốt phát
vô cơ
Phytase có nguồn gốc từ
vi sinh vật (ngoại trừ
phytase từ đậu nành là 3phytase

myo- inositolhexakis
phosphate - 6 –
phosphohydrolase

6

vị trí gốc phốt phát thứ 6 của
myo- inositolhexakis
phosphate
D- myo- inositol- 1,2,3,4,5pentakis phosphate và phốt
phát vô cơ
Phytase có nguồn gốc thực vật
và nấm mốc (ngoại trừ
phytase từ E. coli là 6phytase)


Một số tổ chức nghiên cứu và các nhà khoa học khác như Trung tâm
thông tin sinh học quốc gia Hoa Kỳ (NCBI) đã phân chia phytase thành 3
nhóm [47].
Nhóm thứ 1 (EC 3.1.3.2): bao gồm các axit phosphatase hoặc histidin axit
phosphatase (HAPs). Đặc điểm chung có trung tâm hoạt động là RHGXRXP và
quá trình thủy phân phosphomonoester gồm các bước giống nhau.

Nhóm thứ 2 (EC 3.1.3.8) là các β-propeller phytase (BPP), chủ yếu là
các enzyme của Bacillus. Cho đến nay, việc phân lập, xác định các gen
điều khiển hoạt động của phytase thuộc nhóm này chưa đầy đủ. Hiện có 2
loại phytase của Bacillus thuộc nhóm này đã được xác định là phyC [19] và
TS-phy [21].
Nhóm thứ 3 (EC 3.1.3.2) bao gồm các purple axit phosphatase (PAP).
Gmphy được chiết tách từ lá mầm của đậu nành nảy mầm thuộc nhóm
enzyme này. Người ta đã xác định được cấu trúc không gian 3 chiều và cơ chế
xúc tác của Gmphy [8].
Bảng 1.2. Phân loại một số phytase đã được nghiên cứu [47]
Stt Gen

Nguồn cung cấp

Nhóm phân loại

1. appA

Escherichia coli

Histidin acid phosphatase

2. phyA

Aspergillus ficuum

Histidin acid phosphatase

3. phyB

Aspergillus niger

Histidin acid phosphatase

4. Gmphy

Đậu nành (Glycine soja)

Purple acid phosphatase

5. KBPAP

Đậu trắng (Phaseolus vulgaris)

Purple acid phosphatase

6. TRAP

Động vật có vú

Purple acid phosphatase

7. phyC

Bacillus subtilis

Beta-propeller phytase

8. TS-phy

Bacillus amyloliquefaciens

Beta-propeller phytase

9. 168phyA

Bacillus subtilis 168

Beta-propeller phytase

7


1.2.2. Đặc tính sinh lí, sinh hóa của phytase
Phytase từ vi nấm, E. coli, Klebsiella terrigena, Bacillus subtilis đã
được xác định là các enzyme đơn phân tử. Kích thước phân tử của phytase từ
vi khuẩn thường dao động trong khoảng từ 35 đến 50 kDa. Phytase của
Klebsiella aerogenes có hai dạng khác nhau, một dạng có kích thước khoảng
700 kDa, dạng còn lại có kích thước phân tử từ 10 – 13 kDa nhưng vẫn đảm
bảo chức năng của một enzyme, trong đó các gốc glycosyl hóa chiếm phần
lớn khối lượng của enzyme [17].
Phytase của các sinh vật nhân thực có kích thước phân tử lớn hơn vi
khuẩn, kích thước phân tử phytase của nấm men khoảng 500 kDa; ở thực vật
và động vật enzyme được hình thành từ nhiều tiểu đơn vị có kích thước từ 50150 kDa. Hạt ngô trong quá trình nảy mầm sinh ra phytase được xác định
gồm 2 tiểu đơn vị có kích thước 38kDa. Phytase được tinh sạch từ đường ruột
của chuột thể hiện thành 2 loại protein trên bản điện di SDS - PAGE với kích
thước 70 và 90 kDa [17].
Phytase có nguồn gốc từ các đối tượng khác nhau sẽ có khoảng nhiệt
độ tối ưu khác nhau nhưng trung bình dao động từ 45 đến 77°C. Phần lớn các
phytase đều bị bất hoạt ở nhiệt độ 40-65°C [29]. Phytase của A. niger có khả

năng chịu nhiệt rất kém, ở nhiệt độ khoảng 50 - 55°C, enzyme không còn giữ
được cấu trúc và hoạt độ giảm 70 - 80%. Phytase của A. fumigatus cũng
không có khả năng chịu nhiệt, tuy nhiên, sau khi bị biến tính ở 90°C thì
enzyme có khả năng hồi tính khi trở lại nhiệt độ tối ưu, hoạt độ enzyme được
phục hồi không đổi so với ban đầu. Phytase của một số vi sinh vật có nhiệt độ
tối ưu rất cao như: phytase từ Schwanniomyces castelii là 77°C, từ Bacillus
sp. MD2 là 73°C [46], từ Bacillus amyloliquefaciens DS11 là 70°C [21].
pH tối ưu của phytase nằm trong khoảng từ 2,2 đến 8,0. Đối với vi
sinh vật pH tối ưu của phytase trong khoảng 4,5 – 5,6 (ở nấm). Phytase của

8


A. fumigatus có phổ pH tối ưu khá rộng pH từ 4,0 – 7,3. Đối với các hạt
thực vật pH tối ưu dao động từ 4,0 - 7,5; ngoại trừ ở hạt đậu và phấn hoa
Lily, phytase có pH là 8,0. Đối với đa số động vật thì phytase hoạt động ở
pH kiềm từ 7,4 - 8,7. Bảng 1.3 nêu một số ví dụ về khoảng nhiệt độ và pH
tối ưu của một số phytase.
Bảng 1.3. Nhiệt độ và pH tối ưu của một số phytase [21,46,42]
TT Nguồn cung cấp phytase
1. Aspergillus oryzae

pH tối ưu
5,5

Nhiệt độ tối ưu (oC)
50
ưưuưu(°C)

2.

3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.

Aspergillus niger 92
Candida intermedia
Citrobacter freundii
Escherichia coli
Bacillus sp. DS11
Bacillus subtilis (natto)
Pseudomonas sp.
Enterobacter sp. 4
Salenomonas ruminatium
Typha latifola (hạt phấn)
Lúa mì

5,0
4,5
2,7; 5,0
4,5
7,5
6,0 - 6,5
5,5

7,0 - 7,5
4,0 - 5,5
8,0
6,0

55
53
52
55
70
60
40
50
50 – 55
45

13.
14.
15.
16.

Hạt cây họ đậu
Ngô (đang nảy mầm)
Người
Dịch nhờn trong ruột chuột

8,0
4,8
7,4
7,5

55
-

Các ion kim loại được xem là các tác nhân ảnh hưởng trực tiếp đến
hoạt độ phytase. Tuy nhiên, rất khó để xác định rõ ảnh hưởng của các kim
loại khác nhau vì sự liên kết trực tiếp của chúng với enzyme hoặc các ion kim
loại ở dạng hợp chất liên kết với axit phytic và do đó làm giảm mức độ hoạt
động của cơ chất. Phytase của Enterobacter sp. 4 bị ức chế bởi các ion Zn2+,
Ba2+, Cu2+ và Al3+ [48].
Theo nghiên cứu của Wyss và cs (1999), ion Cu2+ được xác định có khả
9


năng làm giảm hoạt độ của phytase có nguồn gốc từ E. nidulans và A. terms.
Phytase của A. fumigatus bị ức chế bởi một số ion kim loại thông thường.
Hoạt độ phytase của A. fumigatus bị giảm 50% dưới tác dụng của EDTA,
ngược lại, EDTA không phải là yếu tố chính tác động lên hoạt độ phytase có
nguồn gốc từ nấm như E. nidulans, A. niger, A. Terrus [51]. Những chất hóa
học khác có khả năng kìm hãm hoạt độ phytase là flor và molypdate.
1.3. Phytase kiềm (β-propller phytase-BPP) từ Bacillus sp.
1.3.1. Vài nét về chi Bacillus
Bacillus là nhóm vi khuẩn được nghiên cứu rất kĩ cứu về đặc điểm, sinh
lý cũng như khả năng cảm ứng, sinh tổng hợp các loại enzyme. Chúng bao
gồm các vi khuẩn gram dương, hình que, sống hiếu khí, có khả năng sinh bào
tử và hình thái tế bào không bị biến dạng khi sinh bào tử [1, 2]. Bào tử hình
elip hoặc hình viên trụ, tròn đầu. Bào tử có màng mỏng và không dễ bắt màu
thuốc nhuộm [6].
Hầu hết các chủng Bacillus đều có khả năng sử dụng các hợp chất hữu
cơ như đường, amino axit, các axit hữu cơ. Bacillus có nhiệt độ sinh trưởng

tối ưu từ 30 - 45°C và thời gian sinh trưởng khá ngắn khoảng 24 giờ nuôi cấy
trong môi trường tối ưu cho sự phát triển [17].
Các chủng Bacillus sinh các enzyme như amylase, protease, phytase...
được đặc biệt quan tâm và nghiên cứu [1]. Một số chủng Bacillus như B.
subtilis, B. amyloliquefaciens trong đất có khả năng phân hủy phytate tạo dinh
dưỡng vì vậy mà thúc đẩy quá trình phát triển của thực vật. Phytase có nguồn
gốc từ thực vật với một lượng nhỏ không đủ để phân giải lượng phytate khá
lớn trong đất vì thế, sự có mặt của nhóm vi khuẩn này có ý nghĩa vô cùng qua
trong đối với quá trình phân giải phytate [44].
1.3.2. Phytase từ Bacillus
PhyC [19] và TS-phy [21] là hai loại phytase được sinh tổng hợp từ
Bacillus, chúng đều thuộc nhóm β-propeller phytase (BPP) [47]. Hoạt độ xúc
10


tác và tính ổn định về nhiệt của phyC phụ thuộc vào khả năng liên kết với ion
Ca2+ và đây cũng chính là điểm khác so với các nhóm phytase khác. Ở môi
trường tĩnh điện thích hợp thì ion Ca2+ dễ dàng tạo được liên kết với cơ chất.
BPP có hai vị trí gắn với phosphate, vị trí “bẻ gãy” và vị trí “ái lực”. Sự thủy
phân cơ chất xảy ra tại vị trí “bẻ gãy”, còn vị trí “ái lực” thì có thể làm tăng
ái lực liên kết với cơ chất [48].
Cấu trúc của β-propellerphytase gồm có 6 dải băng được xếp lại với
nhau như hình cánh quạt, trong đó mỗi dải băng thường bao gồm 4-5 nếp
gấp β chạy song song nhưng ngược chiều nhau, riêng nếp gấp thứ tư của mỗi
dải được nối với nếp gấp β đầu tiên của dải băng tiếp theo trên phía đầu của
phân tử enzyme. Dải băng thứ 6 được sắp xếp dọc theo trục trung tâm
của cánh quạt, tạo thành một mạch trung tâm, liên kết với nhiều phân tử
nước [14]. Dải băng này bao gồm 1 nếp gấp β từ đầu N và 3 nếp gấp β khác
từ đầu C của phân tử protein enzyme. Để duy trì sự ổn định cấu trúc của
enzyme thì dải băng thứ 6 này tham gia vào 2 đầu C và N của phân tử

enzyme; một nếp gấp β phụ được thêm vào cuối đầu N của enzyme, kết nối
dải băng thứ 6 và thứ 5 [14] ( Hình 1.3.)

Hình 1.3. Cấu trúc của BPP phytase (Ha và cs [14])

11


Tính đặc hiệu của phytase ở Bacillus rất cao, tuy nhiên chúng thường
nhạy cảm với một số enzyme tiêu hóa như pepsin. Hoạt độ riêng thấp và sự
nhạy cảm cao với pepsin đã làm cản trở việc sản xuất và sử dụng phytase của
Bacillus ở quy mô công nghiệp [23, 24].
Phytase từ Bacillus là enzyme đơn phân tử, kích thước phân tử khoảng
36,5 - 44 kDa trên bản gel SDS-PAGE. Kích thước phân tử của phytase từ B.
subtilis là 44 kDa [22].
Canxi là yếu tố quan trọng, có ảnh hưởng trực tiếp đến độ bền phân tử
và hoạt tính của các phytase từ Bacillus. Trong môi trường có CaCl2 sau 10
phút ủ ở 70°C, hoạt độ của phytase từ Bacillus sp. DS11 không thay đổi (giữ
nguyên 100% hoạt tính). Hoạt tính của enzyme này giảm ở 50°C nếu trong
môi trường thiếu CaCl2. Sau khi ủ ở 90°C trong 10 phút, hoạt độ còn lại đạt
khoảng 50% hoạt độ lúc ban đầu khi có mặt canxi. Điều đó cho thấy ion Ca2+
ảnh hưởng mạnh mẽ đến duy trì sự ổn định của enzyme trước tác động biến
tính của nhiệt độ [20].
Đa số phytase của Bacillus có pH tối ưu khoảng 6,5 - 7,0; phytase của
B. subtilis có pH tối ưu 6,0 - 6,5; B. subtilis VTC68013 có pH ở 7,0 nhiệt độ
tối ưu là 55°C [23].
1.4. Ứng dụng của phytase
Ở động vật nhai lại, phytate được phân hủy thông qua hoạt động của
các phytase có nguồn gốc từ các vi sinh vật trong dạ cỏ (vi khuẩn, nấm).
Tuy nhiên, cơ chế này thường không có ở các động vật dạ dày đơn như

heo, gia cầm và cá. Do vậy, chúng không có khả năng hấp thụ axit phytic;
và thức ăn của chúng thường được bổ sung các loại phốt phát vô cơ. Theo
nghiên cứu của Scheldeler SE, khi bổ sung vào khẩu phần ăn của gà mái
nuôi lấy thịt một lượng phốt phát hợp lí sẽ nâng cao tăng trọng trong
khoảng 7 tuần tuổi, cải thiện năng suất xương chân, không gây thiệt hại

12


năng suất thịt; đối với gà trống giúp tăng trọng nhanh, nâng cao khả năng
chuyển hóa thức ăn và sức sống [5].
Việc bổ sung một hàm lượng phytase thích hợp vào thức ăn của động
vật nuôi sẽ làm tăng hàm lượng phốt phát dễ hấp thu trong thức ăn và làm
giảm bớt lượng phốt phát dư thừa thải ra phân, qua đó, góp phần giảm
thiểu ô nhiễm cho môi trường. Ở Mỹ, nếu tất cả các động vật đều được sử
dụng thức ăn có bổ sung lượng phytase phù hợp thì lượng phốt phát mà
chúng thủy phân có giá trị khoảng 168 triệu USD, tương ứng với 8,23x 104
tấn phốt phát thải ra môi trường mỗi năm [41]. Hiện nay, phytase là phụ
gia chăn nuôi được áp dụng ở 22 nước trên thế giới, đặc biệt tổ chức FDA
(The Food and Drus Administration) đã chấp thuận phytase là enzyme đạt
tiêu chuẩn an toàn sinh học [50].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ảnh hưởng của phytase đến sự sinh
trưởng đã được thí nghiệm trên gà và lợn. Năm 2008, Mai Thị Hằng và cs đã
thử nghiệm bổ sung phytase tái tổ hợp từ Aspergillus niger XP phối hợp với
xylanase và amylase trong thức ăn cho gà Lương Phượng kết quả là gà tăng
trọng thêm 5,6 - 25,7% và giảm 4,6 - 12,7% lượng thức ăn tiêu tốn so với lô
đối chứng dương (gà ăn khẩu phần có bổ sung P vc nhưng không bổ sung
phytase tái tổ hợp) [26]. Năm 2005, Trần Quốc Việt và Ninh Thị Len nghiên
cứu ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm phytase thương mại (NatuphosBASF) đến tăng trưởng của lợn con cai sữa và lợn nuôi thịt đã công bố sự
tăng trọng 16,4% và giảm 8% chi phí thức ăn so với lô đối chứng (lợn có

khẩu phần ăn không bổ sung phytase) [3]. Thử nghiệm này cho thấy việc bổ
sung 1000 IU phytase tái tổ hợp/kg thức ăn đã thay thế được hoàn toàn
lượng Pvc mà động vật nuôi cần, đặc biệt làm giảm 21,9 - 41,9% lượng phốt
phát thải ra phân [26].
Ngoài ra, phytase còn được nghiên cứu sử dụng dể loại bỏ phytate

13


trong thực phẩm, sản xuất các dẫn xuất myo-inositol phốt phát cho công
nghiệp dược, loại bỏ phytate trong công nghiệp sản xuất giấy [17].
1.5. Một số thành tựu nghiên cứu gây đột biến điểm trên phytase
Các sản phẩm phytase thương mại trên thị trường hiện nay đều là các
phytase axit (HAP – Histidine acid phosphatase), chúng có nguồn gốc từ E.
coli hoặc nấm mốc. Các enzyme này hoạt động rất tốt trong môi trường axit
song lại kém bền ở nhiệt độ cao do đó gây cản trở trong việc chế biến thức ăn
công nghiệp [28, 36, 43]. Để nâng cao tính bền nhiệt của phytase axit, hàng
loạt các nghiên cứu đã được tiến hành, trong đó có nghiên cứu đột biến điểm
trên phytase có nguồn gốc từ nấm mốc Aspergillus fumigatus của Lehmann và
cs [22, 23]. Nghiên cứu này đã thành công trong việc làm tăng tính chịu nhiệt
của enzyme lên 15 – 26oC so với phytase trước đột biến mà vẫn bảo toàn
được hoạt tính của phytase. Đột biến điểm thay thế Gly - 277 và Tyr - 282
trên phytase từ A. fumigatus bằng các gốc tương ứng Lys và His của phytase
A. niger đã làm thay đổi pH hoạt động của enzyme này [42, 43]. Năm 2000,
để nâng cao được hiệu quả xúc tác và tính chịu nhiệt của axit phosphatase
(appA) có nguồn gốc từ Escherichia coli, Rodriguez và cs đã tiến hành gây
đột biến điểm ở 3 vị trí và các cấu trúc này được biểu hiện trong Pichia
pastori. Kết quả bước đầu cho thấy enzyme này đã hoạt động được ở pH 3,5 5,5; phytase của các cấu trúc đột biến sau khi hoạt động ở 80°C trong 10 phút
giữ lại hơn 20% (P < 0.05), và tăng 7°C so với phytase chưa đột biến [36].
Kỹ thuật gây đột biến điểm có định hướng cũng được Mullaney và cs sử dụng

để làm thay đổi dải pH của phytase có nguồn gốc từ Aspergillus niger NRRL
3135 (phyA) hoạt động tốt ở pH 3,0 – 5.0. K300E là vị trí axit amin duy nhất
được gây đột biến, chính sự thay thế này đã làm tăng hiệu quả phân giải axit
phytic là 56% và 19% ở pH 4,0 và 5,0 ở 37oC [28].
Phytase kiềm là các enzyme có cấu trúc beta-propeler (BPP), được

14


tách chiết từ Bacillus và một số loại phấn hoa. Khác với phytase axit,
enzyme này có khả năng chịu nhiệt và không bị biến tính ở nhiệt độ cao [43]
hoạt động tốt ở pH trung tính và hơi kiềm của ruột non, ít nhạy cảm với
pancreatin; tuy bền với dải pH rộng (từ pH 3 đến 9) nhưng lại nhạy cảm với
pepsin. Khả năng chịu nhiệt và hoạt động trên phạm vi pH rộng giúp
enzyme chịu được nhiệt độ cao trong quá trình ép viên thức ăn. Nghiên cứu
của Salvadó JMV và cs (2010) cho thấy các phytase kiềm sau đột biến hoạt
động ở dải pH rộng, từ pH 2,5 - 9; khi ủ enzyme ở 80°C và pH 5,5 hoặc 7,5
thì enzyme vẫn giữ được hoạt tính khá cao [37]. Tran TT và cs (2011) tiến
hành gây đột biến điểm trên phytase kiềm chịu nhiệt từ vi khuẩn Bacillus sp.
MD2 với mục tiêu tăng cường hoạt động và tính ổn định của enzyme trong
môi trường axit. Các đột biến này được thực hiện trên bề mặt xúc tác của
enzyme (P257R, E180N, E229V và S283R) và một số điểm ở gần trung tâm
hoạt động (K77R, K179R và E227S). Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra
rằng với các điểm đột biến E229V và S283R làm tăng hoạt động của enzyme
lên 19% và 13% ở pH 2,6 - 3. Đột biến E227S đã thay đổi pH hoạt động tối
ưu của enzyme đến pH 5,5 và tăng độ bền của enzyme trong môi trường axit
(Ở pH 2,6, sau 3 giờ ủ thì hoạt tính của phytase đột biến E227S vẫn giữ
được trên 80% trong khi đó enzyme không đột biến thì chỉ giữ được khoảng
40% hoạt tính ban đầu) [45]. Đó là những nghiên cứu bước đầu về đột biến
điểm nhằm thay đổi đặc tính và hoạt động của enzyme phytase kiềm; chưa

có một nghiên cứu nào nhằm nâng cao khả năng kháng pepsin của phytase,
giúp enzyme này bền hơn trong pha dạ dày và thể hiện được đầy đủ hoạt
tính của nó trong pha ruột non của động vật dạ dày đơn.
1.6. Pepsin
Pepsin là enzyme tiêu hóa chủ yếu trong dạ dày của động vật bậc cao.
Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa protein trong
các sản phẩm thịt, trứng, các loại hạt, hoặc sữa.
15


Pepsin chủ yếu có trong dịch vị, thường được tiết ra dưới dạng zymogen
(tiền enzyme) là pepsinogen chưa có hoạt tính. Khi tiếp xúc với môi trường
axit của dạ dày pepsinogen chuyển thành pepsin dạng hoạt động. Pepsin này lại
tiếp tục hoạt hóa pepsinogen thành pepsin (giai đoạn tự xúc tác).
Pepsin hoạt động tốt trong môi trường axit của dạ dày, nồng độ axit
HCl thích hợp là 0,1 % - 0,8%.
Pepsin bền vững ở pH thấp, nhưng dễ mất hoạt tính ở pH > 6,5 - 7.
Nguyên nhân làm bất hoạt pepsin là do có sự biến tính của protein, dẫn đến
cấu trúc của enzyme bị biến đổi. Khả năng tái hoạt hóa của enzyme tùy thuộc
pH, nồng độ enzyme hoặc thời gian làm biến tính [32, 8]. Trong môi trường
axit mạnh, nhiệt độ cao (pH 1,8 và 50°C) thì pepsin mất dần hoạt tính. Tốc độ
sự mất hoạt tính tỷ lệ trực tiếp với nồng độ [Η +] [8].
Ở pH = l,5 - 2, pepsin thủy phân các protein có khối lượng phân tử lớn
do có khả năng cắt vào khoảng 30% các liên kết peptit, sản phẩm chính của
quá trình thủy phân là protease, pepton và một ít axit amin. Các protein tan
trong nước (caseine, albumin, hemoglobin) thì pepsin dễ dàng phân cắt, còn
đối với các nucleoprotein và các protein không tan như keratin (ở tóc, da),
collagen, sợi fibroin… thì hầu như ít bị pepsin phân cắt [32].
Pepsin là enzyme thuộc nhóm protease, có khả năng phân cắt không
đặc hiệu, có thể cắt tại nhiều điểm trên phân tử protein (Hình1.4) [32].

Vị trí thủy phân

Cơ chất
Đầu N

Đầu C

Trung tâm hoạt động

Hình 1.4. Sơ đồ minh họa cơ chế tác dụng của các protease với cơ chất [32]
16


Nghiên cứu của Palashoff (2008) đã thống kê các dữ liệu phân cắt của
pepsin trên 40 protein ở pH 2,5 – 2,7; phát hiện 1344 vị trí axit amin trên
phân tử protein bị phân cắt. Ngoài ra, Palashoff cũng tiến hành thực nghiệm
thủy phân 9 loại protein khác nhau bằng pepsin ở các pH 1,0; 2,5 và 4,0 và
tìm ra 591 vị trí cắt của pepsin trên các protein này. Quy luật cắt và tính đặc
hiệu của pepsin cũng được Palashoff công bố: pepsin ưu tiên cắt ở vị trí các
axit amin kị nước như leucine và phenylalanine, tryptophan và tyrosine;
nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các axit amin như proline, histidine là những vị
trí có tần suất pepsin cắt thấp nhất [30]. Các nghiên cứu trên cho thấy pepsin
là enzyme có khả năng thủy phân rất đặc hiệu đối với các cấu trúc dạng
vòng xoắn trên bề mặt phân tử protein có chứa các axit amin kị nước. Đặc
biệt, hiệu quả thủy phân của pepsin càng cao nếu các vòng xoắn này được
kết nối trực tiếp với các axit amin chứa cacbon hydro mạch vòng như
tyrosine, tryptophan [30].
Nghiên cứu của Vương Thị Thanh Hằng và cs (2015), đã phát hiện
được 80 vị trí cắt trên tổng số 354 axit amin của phân tử phytaza kiềm
ACZ57955.1 bằng công cụ PeptideCutter [4]. Tuy nhiên, công cụ này chỉ cho

phép xác định các vị trí cắt/thủy phân của pepsin trên cấu trúc phân tử
ACZ57955.1 bậc 1 mà chưa cho phép xác định mức độ ưu tiên đối với từng vị
trí cắt. Dựa vào nghiên cứu của Palashoff về tần suất thủy phân đối với từng
vị trí cắt P1-P1’ của pepsin, tác giả Vương Thị Thanh Hằng và cs đã xác định
được tần suất thủy phân của pepsin đối với từng vị trí axit amin trên phân tử
ACZ57955.1. So với công cụ PeptideCutter, bảng xác suất cắt của Palashoff
cho phép các tác giả xác định được 276 vị trí cắt trên toàn phân tử
ACZ57955.1. Mặc dù tổng số các vị trí cắt gấp 3,5 lần so với dự đoán của
công cụ PeptideCutter, hầu hết các vị trí cắt với xác suất cắt cao (≥40%) trên
phân tử ACZ57955.1 đều trùng với các vị trí cắt được dự đoán bằng công cụ

17