Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) của virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HÀ ĐĂNG CHIẾN

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH
PROTEIN TÁI TỔ HỢP GLYCOPROTEIN (GP5)
CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ
HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRSV)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ VĂN SƠN

Thái Nguyên, 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự
hƣớng dẫn của PGS.TS Lê Văn Sơn. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn
là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Hà Đăng Chiến

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




iii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS LÊ VĂN SƠN đã tận
tình chỉ bảo và hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và
hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy, Cô giáo – Các nhà
khoa học đã trực tiếp giảng dạy truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức khoa
học quý báu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô, đồng nghiệp và bạn bè đã tận
tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi luôn
trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị cán bộ nghiên cứu thuộc Viện
Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở đào tạo
thuộc Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên. Cuối cùng, tôi xin
cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu.
Tác giả luận văn

Hà Đăng Chiến

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu
bp

Tên tiếng Anh
Base pairs

Tên tiếng Việt
Cặp bazơ nitơ
Cộng sự

CS
DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

E.coli

Escherichia coli

EtBr

Ethidium bromide

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic
Acid

GP5

Glycoprotein 5

IPTG

IsoPropylThio-β-Galactoside

kb

Kilo base

kDa

Kilodalton

LB

Luria Bertami

Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ
bản nuôi cấy vi khuẩn

MES

2-(N-morpholino)etansulfonic
acid

OD

Optical density

Mật độ quang

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

PRRS

Porcine Reproductive and

Hội chứng rối loại hô hấp và

Respiratory Syndrome

sinh sản ở lợn

Porcine Reproductive and

Virus gây hội chứng rối loại

Respiratory Syndrome virus

hô hấp và sinh sản ở lợn

PRRSV

RNA

Ribonucleic acid

RNase

Ribonuclease

SDS

Sodium dodecyl sulphate

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




v

TAE

Tris-acetate-EDTA

TBS

Tris-buffered saline

TTBS

Tween tris-buffered saline

v/p
X-gal

Vòng/ phút
5-bromo-4-chloro-3-indolylbeta-D-galacto-pyranoside

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




vi

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ ii
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................. iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................ iv
MỤC LỤC ...................................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... ix
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài.......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu: .................................................................................. 2
3.Nội dung nghiên cứu:.................................................................................... 3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1. Tổng quan về PRRS .................................................................................. 4
1.1.1. Khái niệm PRRS ..................................................................................... 4
1.1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn .......................................... 4
1.1.3. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV) ................ 10
1.2. Protein tái tổ hợp ..................................................................................... 15
1.2.1. Giới thiệu ............................................................................................... 15
1.2.2. Glycoprotein (GP5) ............................................................................... 15
1.2.3. Sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF5........................................... 16
1.2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp ........................... 17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




vii

1.2.5. Vector biểu hiện pET 32a(+) và chủng biểu hiện BL21 ...................... 17
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 20
2.1. Vật liệu .................................................................................................... 20
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 20
2.1.2. Hóa chất và môi trƣờng......................................................................... 22

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm............................................................... 23
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 24
2.2.1. Tạo dòng gen GP5 ................................................................................. 24
2.2.2. Tạo vector tái tổ hợp mang gen GP5 .................................................... 25
2.2.3. Phƣơng pháp biểu hiện và tinh sạch protein GP5 ................................ 28
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 34
3.1. Tạo dòng vector mang gen mã hóa protein GP5 .................................... 34
3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5 ...................... 37
3.3. Biểu hiện và tinh sạch protein GP5 trong E.coli .................................... 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 44
1. Kết luận ...................................................................................................... 44
2. Kiến nghị .................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS ................................................... 13
Hình 1.2. Cấu tạo phân tử virion ................................................................... 15
Hình 2.1. Vector tách dòng pBT ................................................................... 20
Hình 2.2. Cấu trúc vector biểu hiện pET 32a(+) ........................................... 21
Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc mang plasmid pBT-GP5 ............................... 35
Hình 3.2. Kết qủa điện di sản phẩm colony- PCR khuẩn lạc mang gen GP5 35
Hình 3.3. Kết quả cắt kiểm tra và tinh sạch pBT-GP5 .................................. 36

Hình 3.4. Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) với enzyme cắt giới hạn ....... 38
Hình 3.5. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn39
Hình 3.6. Kết quả điện di SDS-PAGE .......................................................... 40
Hình 3.7. Kết quả phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag .......... 41
Hình 3.8. Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh sạch sản phẩm ....................... 42
Hình 3.9. Kết quả điện di kiểm tra GP5 tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni-NTA ...... 44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ix

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tên thiết bị thí nghiệm ................................................................... 23
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ........................................................... 24
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ............................................... 25
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pBT mang gen GP5 ............................. 26
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt pET 32a(+) .......................................... 26
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ghép nối gen .............................................. 27
Bảng 2.7. Thành phần gel điện di protein (SDS-PAGE)............................... 31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine
Reproductive and Respiratory Syndrome), tại Việt Nam còn gọi là bệnh “lợn
tai xanh” (Blue Ear), đƣợc xem là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên lợn
từng đƣợc ghi nhận trên thế giới và đƣợc ghi nhận lần đầu tiên tại Bắc Mỹ
năm 1987 [23], do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm
sau đó tím xanh. Đặc trƣng của bệnh, với lợn nái, PRRS gây hậu quả nghiêm
trọng nhƣ sảy thai, đẻ non, lợn con sinh ra yếu ớt, chết non, tình trạng bệnh
âm ỉ gây rối loạn sinh sản nhƣ động dục kéo dài, chậm động dục trở lại. Đối
với lợn đực giống, PRRS làm giảm số lƣợng tinh dịch, chất lƣợng tinh dịch
kém, ảnh hƣởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lƣợng đàn con [3]. “Lợn tai xanh”
là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, do virus PRRS (PRRSV), thuộc họ
Arteriviridae, bộ Nidovirales gây ra. Bệnh lây lan nhanh và làm chết nhiều
lợn nhiễm bệnh [1].
Hiện nay, PRRS đã và đang trở thành dịch ở nhiều nƣớc trên thế giới,
gây tổn thất nặng nề cho nền kinh tế. PRRS lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Hoa
Kỳ vào năm 1987 [31], ở châu Âu (tại Đức năm 1990, tại Hà Lan năm 1991)
và tại châu Á vào đầu những năm 1990. Tại Việt Nam, PRRSV đƣợc phát
hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ năm 1997 bằng phản ứng huyết thanh học. Gần
đây, từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiều
địa phƣơng trong cả nƣớc, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chăn
nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm [8].
Virus PRRS có tính thích ứng rất cao đối với các đại thực bào ở phổi.
Hệ gen của PRRSV là phân tử RNA sợi đơn dƣơng, cấu trúc tƣơng tự các
khung đọc mở (open reading frame, ORF) của Coronavirus, gồm 7 khung đọc
mở gối lên nhau, mã hóa cho 7 protein của virus gồm: GP1, GP2, GP3, GP4,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

2

GP5, M và N. Trong số đó, protein GP5 (glycoprotein 5) đƣợc mã hoá bởi
ORF5, là một protein đƣợc glycosyl hoá, gắn với màng bọc ngoài của
PRRSV, có tính kháng nguyên mạnh và chịu trách nhiệm gây bệnh của virus.
Protein GP5 là đích chủ yếu của các kháng thể trung hoà, tham gia vào
cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV, do ngăn cản
hiện tƣợng trình diện kháng nguyên virus của các đại thực bào với các tế bào
có thẩm quyền miễn dịch trong cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và qua trung
gian tế bào (CMI-cell mediated immunity). Ngoài ra, GP5 còn tham gia hiện
tƣợng “chết theo chƣơng trình” (apoptosis) của các tế bào trong cơ thể bị
nhiễm PRRSV. Sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân làm gia
tăng khả năng lây nhiễm và gây bệnh của PRRSV, làm cho bệnh dịch PRRS
ngày càng phức tạp, do làm giảm hiệu quả phòng bệnh của các vaccine phòng
bệnh đang lƣu hành.
Chính vì vậy, nghiên cứu protein tái tổ hợp GP5 của PRRSV là thực sự
cần thiết, giúp cho chẩn đoán xác định bệnh và sản xuất vaccine tái tổ hợp thế
hệ mới nhằm khống chế, giảm bớt thiệt hại do virus PRRSV gây ra.
Từ những cơ sở lý luận khoa học và những nghiên cứu của các nhà
khoa học trong và ngoài nƣớc chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5)
của vius gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)”.
2. Mục đích nghiên cứu:
- Thiết kế đƣợc vector biểu hiện protein tái tổ hợp GP5.
- Biểu hiện và tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp GP5 của Porcine
Reproductive and Respiratory Syndrome virus.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




3

3.Nội dung nghiên cứu:
- Nghiên cứu tạo dòng vector mang GP5. Dựa trên thông tin về trình tự
nucleotide của gen GP5 đã công bố, thiết kế các cặp mồi phù hợp để phân lập
kiểm tra và nhân gen bằng PCR.
- Nghiên cứu thiết kế vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa
cho protein GP5.
- Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp (GP5 ) bằng sắc ký ái lực Ni-NTA.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




4

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về PRRS
1.1.1. Khái niệm PRRS
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndome, viết tắt PRRS), là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho lợn.
Biểu hiện đặc trƣng là các rối loạn sinh sản ở lợn nái nhƣ sảy thai, thai chết lƣu,
lợn sinh ra chết yểu [20], cũng nhƣ lợn con theo mẹ và lợn nái hậu bị còn thể
hiện viêm đƣờng hô hấp rất nặng nhƣ: sốt, ho, khó thở, chết với tỷ lệ cao…

Bệnh còn đƣợc gọi bằng một số tên khác nhƣ:
“Mystery Disease Syndome” (Bệnh bí hiểm ở lợn).
“Swine Infertility and Respiratory Syndromde. Viết tắt là SIS (Hội
chứng vô sinh và hô hấp ở lợn).
“Porcine Endemic and Respiratory Syndrome, viết tắt là PEARS” (Hội
chứng hô hấp và sảy thai ở lợn).
“Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome” (Hội chứng rối loạn
hô hấp và sinh sản ở lợn).
“Blue-ear disease” (Bệnh lợn tai xanh).
Năm 1992, Hội nghị quốc tế về bệnh này đƣợc tổ chức tại St. Paul,
Minnesota (Mỹ) đã nhất trí dùng tên hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở
lợn (PRRS) và đƣợc tổ chức Thú Y thế giới công nhận. Bệnh đƣợc gây ra bởi
virus PRRS, tồn tại dƣới dạng hạt virion gây nhiễm.
1.1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
* Cơ chế gây bệnh và các phƣơng pháp lan truyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




5

Virus gây PRRS có trong dịch mũi, nƣớc bọt, phân và nƣớc tiểu của
lợn ốm hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trƣờng; tinh dịch của lợn đực
giống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh. Ở lợn nái mang thai, virus có
thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh.
Virus gây PRRS có thể xâm nhập vào cơ thể lợn theo đƣờng hô hấp,
tiêu hóa và đƣờng âm đạo. Sau khi xâm nhập, đích tấn công chủ yếu của virus
là các đại thực bào ở phế nang. Đây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp

với cấu trúc hạt của virus, vì thế chúng hấp thụ và thực hiện quá trình nhân
lên chỉ trong loại tế bào này và phá hủy nó. Ở lợn mắc bệnh, một tỷ lệ lớn các
tế bào đại thực bào trong nang phổi bị virus xâm nhập rất sớm và phá hủy làm
giảm khả năng phòng vệ của phổi. Lúc đầu, PRRSV có thể kính thích sự tăng
sinh của đại thực bào nhƣng sau 2-3 ngày, virus này sẽ giết chết chúng, các
virion đƣợc giải phòng ồ ạt xâm nhiễm sang các tế bào khác, tiếp tục quá trình
nhân lên và phá hủy đại thực bào. Trong cơ thể lợn ốm do mắc PRRS có tới
40% tế bào đại thực bào bị virus giết chết [17]. Trong hệ thống miễn dịch của
cơ thể, đại thực bào đóng vai trò vô cùng quan trọng, cả trong đáp ứng miễn
dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện kháng nguyên
thiết yếu. Khi đại thực bào bị phá hủy bởi PRRSV mở đầu cho quá trình miễn
dịch không xảy ra đƣợc, cơ thể lợn rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và
dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát, điều này có thể thấy rõ ở những đàn
lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ
viêm phổi kế phát do những vi khuẩn vốn sẵn có trong đƣờng hô hấp nhƣ
Mycoplasma hyopneumoniae, P. multocida, S. suis, A. pleuropneumoniae...
Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011) [1] khi xác định một số vi khuẩn
kế phát gây chết lợn trong vùng dịch PRRS ở huyện Văn Lâm, tỉnh Hƣng Yên
năm 2010 đã cho thấy lợn mắc PRRS thƣờng kế phát bệnh do các nhóm vi
khuẩn đƣờng hô hấp và đƣờng ruột nhƣ A. pleuropneumoniae, P. multocida,
S.suis, Escherichia coli, Salmonella sp, Clostridium perfringens. Kết quả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




6

phân lập đƣợc vi khuẩn A. pleuropneumoniae với tỷ lệ cao nhất 63.33% và
thấp nhất là P. multocida 10%. Các tác giả nhận định các nhóm vi khuẩn kế

phát trên đã làm cho dịch PRRS trầm trọng và phức tạp hơn.
* Triệu chứng
Lợn mắc PRRS thƣờng có các triệu chứng đầu tiên là sốt cao, bỏ ăn,
mẩn đỏ da, khó thở, táo bón hoặc ỉa chảy, tốc độ lây lan nhanh. Đặc biệt, một
số con lợn mắc bệnh ở chóp tai bị ứ huyết có màu xanh tím và một số triệu
chứng khác tuỳ thuộc vào bệnh kế phát và từng loại lợn.
Ở lợn nái: Các triệu chứng chủ yếu là tím âm hộ, sảy thai, thai chết lƣu,
thai gỗ hàng loạt, đẻ non, lợn con đẻ ra yếu ớt, tỷ lệ tử vong cao. Tỷ lệ thai
chết tăng lên theo độ tuổi của thai nhƣ thai dƣới 2,5 tháng tuổi tỷ lệ chết 20%,
thai trên 2,5 tháng tỷ lệ chết là 93,75% [11]. Lợn nái trong giai đoạn nuôi con
thƣờng ít uống nƣớc, viêm vú, mất sữa, viêm tử cung âm đạo, mí mắt sƣng,
có thể táo bón hoặc ỉa chảy, viêm phổi.
Ở lợn đực giống: Sốt cao, bỏ ăn, đờ đẫn hoặc hôn mê, một số con có hiện
tƣợng tai xanh. Đặc biệt xuất hiện hiện tƣợng viêm dịch hoàn, bìu dái nóng đỏ
(chiếm 95%), dịch hoàn sƣng đau, lệch vị trí (85%), giảm hƣng phấn. Lƣợng
tinh ít, chất lƣợng kém biểu hiện qua các chỉ số nhƣ nồng độ tinh trùng C<
80.106, hoạt lực của tinh trùng A< 0,6, sức kháng của tinh trùng R< 3000, tỷ lệ
kỳ hình K >10%, tỷ lệ sống của tinh trùng < 70%, độ nhiễm khuẩn cao 20.103.
Lợn đực giống rất lâu mới hồi phục đƣợc khả năng sinh sản của mình [11].
Ở lợn choai, lợn thịt: Lợn mắc bệnh sốt cao 400C đến 420C, bỏ ăn, ủ rũ,
khó thở, ho; những phần da mỏng gần tai, phần da bụng lúc đầu có màu hồng
nhạt, dần dần chuyển sang màu hồng thẫm và xanh nhạt. Lợn con mới sinh
hầu nhƣ sẽ chết sau vài giờ; số còn sống sót tiếp tục chết vào tuần thứ nhất.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




7

Lợn con có triệu chứng gầy yếu, bỏ bú, da xuất huyết phồng rộp, khó thở và
tiêu chảy [2].
* Bệnh lý
Lợn mắc PRRS bệnh tích thƣờng thấy nhƣ thận xuất huyết lấm tấm nhƣ
đầu đinh ghim; não xung huyết; hạch hầu, amidan sƣng hoặc sung huyết; gan
sƣng, tụ huyết; lách sƣng, nhồi huyết; hạch màng treo ruột xuất huyết; loét
van hồi manh tràng; phổi tụ huyết, xuất huyết, cuống phổi chứa đầy dịch nhớt,
sầu bọt [2].
Theo Nguyễn Tiến Dũng (2011) [6], bệnh tính đặc trƣng nhất là viêm
phổi kẽ và viêm hạch lâm ba ở cả 2 dạng (PRRS dạng cổ điển và PRRS dạng
sốt cao). Viêm phổi hoại tử và thâm nhiễm đặc trƣng bởi những đám đặc chắc
(nhục hóa) trên các thùy phổi. Thùy phổi bị viêm có màu đỏ xám, có mủ và
đặc chắc. Trên mặt cắt ngang của thùy bị viêm lồi ra, khô. Nhiều trƣờng hợp
lợn mắc bệnh bị viêm phế quản phổi hóa mủ ở mặt dƣới thùy đỉnh. Các triệu
chứng thƣờng gặp của lợn mắc bệnh bao gồm rối loạn sinh sản, gây chết (đối
với lợn con) và các biểu hiện rối loạn hô hấp đối với lợn ở mọi lứa tuổi.
* Các biện pháp phòng bệnh
Hiện nay chƣa có thuốc điều trị đặc hiệu lợn mắc PRRS, do vậy việc
phòng bệnh bằng vaccine và vệ sinh phòng bệnh, tiêu độc khử trùng hiện
đang là hai biện pháp hữu hiệu ở nhiều cơ sở chăn nuôi lợn. Để chủ động
phòng chống dịch, cần thực hiện đồng bộ, kiên quyết các giải pháp phòng,
chống dịch nhƣ: Phát hiện sớm, bao vây xử lý kịp thời các ổ dịch; công tác
tuyên truyền thực hiện sâu rộng tới các ngành, các cấp và ngƣời dân tham gia
chăn nuôi; đặc biệt có sự chỉ đạo quyết liệt của chính quyền các cấp từ Trung
ƣơng tới các địa phƣơng. Thực hiện nghiêm việc tiêm vaccine phòng các bệnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

8

nguy hiểm ở lợn theo Quyết định số 63/2005/QĐ-BNN ngày 13/10/2005 của
Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn [16].
* Tình hình dịch bệnh trên thế giới và ở Việt Nam [14]
+ Trên thế giới
Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nƣớc và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các
châu lục (từ châu Đại Dƣơng) trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế
giới khẳng định phát hiện có bệnh Tai xanh lƣu hành.
Hiện nay, hội chứng này đã trở thành dịch địa phƣơng ở nhiều nƣớc
trên thế giới, kể cả các nƣớc có ngành chăn nuôi lợn phát triển nhƣ Mỹ, Hà
Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức... và đã gây ra những tổn thất rất lớn về kinh
tế cho ngƣời chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đô la [22]. Ví dụ: hàng năm
Mỹ phải chịu tổn thất cho bệnh Tai xanh gây ra khoảng 560 triệu USD. Các
nƣớc trong khu vực có tỷ lệ bệnh Tai xanh lƣu hành rất cao, ví dụ: Ở Trung
Quốc là 80%. Đài Loan là 94,7% - 96,4%, Philippine là 90%, Thái Lan là
97%, Malaysia là 94%, Hàn Quốc là 67,4% - 73,1%.
Tại Trung Quốc: Theo báo cáo của đoàn chuyên gia quốc tế và chuyên
gia của Trung Quốc đã đƣợc phát hành vào tháng 12/2007, kể từ năm 2006,
đàn lợn của Trung Quốc đã bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi "Hội chứng sốt
cao ở lợn" do nhiều nguyên nhân, trong đó chủ yểu là virusPRRS và các loại
mầm bệnh này đã làm hàng triệu lợn bị ốm, chết và phải tiêu hủy. Kết quả
nghiên cứu toàn diện của Trung Quốc đã khẳng định chủng virusPRRS gây
bệnh tại nƣớc này là chủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của
virus(thiếu hụt 30 acid amin trong gen). Năm 2007, các tỉnh Anhui, Hunan,
Guangdong, Shandong, Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh hƣởng nặng
buộc Trung Quốc phải tiêu hủy tới 20 triệu lợn để ngăn chặn dịch lây lan.
Trƣớc diễn biến phức tạp của dịch Tai xanh, Bộ Nông Nghiệp Trung Quốc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




9

đang thực hiện chƣơng trình phòng chống bệnh rất quy mô, riêng chƣơng
trình nghiên cứu, sản xuất vác xin đã đƣợc cam kết chi khoảng 280 triệu Nhân
dân tệ tƣơng đƣơng với 36,5 triệu USD [26].
Tại Hồng Kông và Đài Loan đã xác định có cả hai chủng Châu Âu và
Bắc Mỹ cùng lƣu hành, đặc biệt trong cùng một con lơn ở Hồng Kông đã xác
định nhiễm cả hai chủng nêu trên; dịch Tai xanh cũng đƣợc thông báo ở Thái
Lan từ các năm 2000 - 2007. Thông báo cho biết các virus gây bệnh Tai xanh
đƣợc phân lập từ nhiều địa phƣơng thuộc nƣớc này gồm cả chủng dòng châu
Âu và chủng dòng Bắc Mỹ. Trong đó, số virus thuộc chủng dòng châu Âu
chiếm 66,42%, còn các virusthuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm 33,58%. Phần
lớn ở những quốc gia này hiện còn đang lƣu hành virusgây bệnh Tai xanh
chủng châu Âu hoặc Bắc Mỹ, là những chủng viruscổ điển độc lực thấp.
Tháng 9/2007, Nga là nƣớc thứ 3 đã báo cáo chính thức có dịch bệnh
Tai xanh do chủng virusPRRS thể độc lực cao gây ra.
+ Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn
lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanh
dƣơng tính với PRRS và cả đàn đƣợc tiêu hủy ngay [7]. Tuy nhiên, theo điều
tra ở một số địa bàn thuộc thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận cho
thấy 25% mẫu huyết thanh lợn có kháng thể virut PRRS (596/2308 mẫu) và
5/15 trại (chiếm 33%) có lƣu hành huyết thanh bệnh lợn Tai xanh. Năm
2003, tỷ lệ huyết thanh dƣơng tính với bệnh tai xanh trên lợn nuôi tập trung ở
Cần Thơ là 66,86%. Nhƣ vậy, PRRS đã đƣợc phát hiện ở Việt Nam từ năm

1997, tuy nhiên, từ năm 1997 đến trƣớc tháng 3 năm 2007 chƣa phát hiện các
ổ dịch lâm sàng trên đàn lợn. Việc xảy ra các ổ dịch lần đầu ở các tỉnh phía
Bắc có liên quan đến tình hình dịch ở các nƣớc láng giềng. Theo thông báo
của các tổ chức quốc tế, trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ở một số
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




10

nƣớc trong khu vực. Từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra các đợt
dịch bệnh ở nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng
cho ngành chăn nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus
lây nhiễm. Mặc dù chƣa có những nghiên cứu cụ thể về tốc độ lây lan của
virus, nhƣng quan sát dịch tễ học đợt dịch lần thứ nhất (tháng 3, 4 năm 2007)
cho thấy chỉ một thời gian ngắn sau khi Hải Dƣơng có dịch thì sáu tỉnh lân
cận của vùng đồng bằng Bắc Bộ là Hƣng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình,
Bắc Ninh, Bắc Giang, Hải Phòng. Số lợn mắc bệnh 31.750 con, số lợn chết và
xử lý 7.296 con.
1.1.3. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV)
Qua nghiên cứu giải mã gen của virus tại Mỹ và Trung Quốc cho thấy
các chủng PRRSV tại Việt Nam có mức tƣơng đồng về amino acid từ 99%
đến 99,7% so với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao ở Trung Quốc và đều
bị mất 30 axít amin. Điều này cho thấy các chủng PRRSV ở nƣớc ta hiện nay
thuộc dòng Bắc Mỹ, có độc lực cao giống chủng ở Trung Quốc [5].
Nhiều nghiên cứu của các tác giả trong nƣớc từ năm 2009 đến nay đã
nhận định PRRSV tại Việt Nam hiện nay đƣợc xác định thuộc chủng Bắc Mỹ
dòng Trung Quốc (Lê Thanh Hòa và cs, 2009 [9]; Nguyễn Văn Cảm và cs,
2011 [4]; Cao Văn Thật và cs, 2012 [15]; Lý Thị Liên Khai và Võ Thị Cẩm

Giàng, 2012 [10]).
 Đặc tính sinh học của virus
Virus gây PRRS rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào
hoạt động ở vùng phổi. Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau đó
phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%). Đại thực bào bị giết chết nên sức
đề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng. Do vậy lợn mắc PRRS
thƣờng dễ bị nhiễm khuẩn thứ phát. Virus không gây ngƣng kết với các loại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




11

hồng cầu gà, dê, thỏ, chuột, hồng cầu type O của ngƣời. Virus phát triển tốt
trên môi trƣờng tế bào đại thực bào phế nang lợn, trên tế bào dòng CL 2621,
tế bào MA 140 với bệnh tích phá huỷ tế bào, sau 2- 6 ngày tế bào co tròn, tập
trung thành cụm dày lên, nhân co lại cuối cùng bong ra [17]. Tuy có một số
khác biệt về di truyền và kiểu hình nhƣng các chủng virus Bắc Mỹ và các
chủng virus Châu Âu lại cùng gây ra các triệu chứng lâm sàng về hô hấp và
sinh sản ở lợn rất giống nhau. Dựa vào những kết quả nghiên cứu tổn thƣơng
đại thể và vi thể của tổ chức phổi lợn mắc bệnh, ngƣời ta chia ra hai nhóm
virus là nhóm virus có độc lực cao và nhóm virus có độc lực thấp. Nhóm virus
có độc lực cao thƣờng gây ra các tổn thƣơng ở tổ chức phổi lợn bệnh nặng
hơn nhóm virus có độc lực thấp. Năm 2007, Kegong Tian và Yu khi nghiên
cứu về sự biến đổi về độc lực của PRRSV tại Trung Quốc cho rằng virus đã
có sự biến đổi về độc lực và hậu quả lợn nhiễm virus này có tỷ lệ chết cao,
trên 20% trong tổng số nhiễm bệnh [26].
 Sức đề kháng và khả năng gây bệnh của virus
+ Sức đề kháng của virus.

Virus gây PRRS có thể tồn tại một năm ở nhiệt độ lạnh từ -20 đến -70
o

C; trong điều kiện 4oC virus có thể sống một tháng; nhiệt độ cao virus đề

kháng kém ở 37oC chịu đƣợc 48 giờ, 56oC bị chết sau một giờ, virus thích hợp
ở pH 5 -7. Với các chất sát trùng thông thƣờng và môi trƣờng có pH axit,
virus dễ dàng bị tiêu diệt. Dƣới tác động của ánh nắng mặt trời hoặc tia tử
ngoại vô hoạt virus nhanh chóng [13].
+ Khả năng gây bệnh của virus
Ngƣời và các động vật khác không mắc PRRS, tuy nhiên trong các loài
thuỷ cầm chân màng có vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm. Virus có thể nhân
lên ở loài động vật này và chính đây là nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộng
nên rất khó khống chế [18]. Virus gây bệnh cho lợn ở tất cả các lứa tuổi, nhƣng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




12

lợn con và lợn nái mang thai thƣờng mẫn cảm hơn cả. Lợn rừng là động vật
mang trùng và có thể coi là nguồn dịch thiên nhiên [13]. Về độc lực, ngƣời ta
thấy virus gây PRRS tồn tại dƣới 2 dạng đó là dạng cổ điển và dạng biến thể độc
lực cao. Dạng cổ điển có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì có tỷ lệ
chết thấp, chỉ từ 1 - 5% trong tổng đàn. Dạng biến thể độc lực cao gây nhiễm
bệnh cho lợn lây lan nhanh, trầm trọng và chết nhiều [26].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

13

+ Cấu trúc và chức năng của virus
Cấu trúc:

Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS
(Nguồn: />Dƣới kính hiển vi điện tử PRRSV là loại có vỏ bọc, hình cầu, có kích
thƣớc từ 45 - 80 nm, chứa nhân nucleocapsid có kích thƣớc từ 25 - 35 nm,
trên bề mặt có gai nhô ra rõ, có vỏ là lipid [17]. Virus gây PRRS là ARN virus
với bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn dƣơng, có những đặc điểm chung của
nhóm Arterivirus. Sợi ARN này có kích thƣớc khoảng 15 kilobase [34], có
chín ORF (open reading frame) mã hoá cho chín protein cấu trúc. Tuy nhiên,
có sáu phân tử protein chính có khả năng trung hoà kháng thể bao gồm bốn
phân tử glycoprotein, một phân tử protein xuyên màng (M) và một protein
nucleocapsid (N) [13]. Qua các nghiên cứu cho thấy sợi đơn RNA của virus
bao gồm một bộ gen có khoảng 15 kb, mã hóa 9 ORFs [8]. Bộ gen PRRSV
bao gồm hai gen Polymerase là ORF1a và ORF1b và bẩy gen cấu trúc là
ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6 và 7. ORF1a và ORF1b cấu thành khoảng 75% bộ gen
của virus và đƣợc đặc trƣng bởi một quá trình khung ribosome chuyển dịch
thành một polyprotein lớn mà sự phân tách làm phát sinh các protein không
cấu trúc (NSP) bao gồm cả RNA phụ thuộc Polymerase. Các khung đọc mở
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




14

ORF2a, 3, 4 và 5 tất cả mã hóa cho các protein glycosyl hóa là GP2a, GP3,
GP4, GP5 tƣơng ứng. Các ORF2b mới đƣợc định nghĩa mã hóa các protein
nhỏ nhất của các hạt virus đƣợc chỉ định GP2b. ORF7 mã hóa các protein
nuclocapsid không glycosyl hóa (N).
- Chức năng:
ORF1a và 1b nằm ở đầu 5’ của genome, chiếm hơn hai phần ba bộ gen
và mã hóa cho RNA Polymerase của virus đƣợc xem là protein chịu trách
nhiệm trong quá trình nhân lên của virus.
ORF2 đến ORF7 nằm ở phía sau của ORF 1b, ở đầu 3’ của genome, mã
hóa cho các protein cấu trúc liên quan đến việc hình thành virion.
Sản phẩm của các ORF 5, 6, 7 bao gồm các protein chính của virus.
Cho đến nay ngƣời ta đã xác định đƣợc 3 protein cấu trúc chính của PRRS đó
là: Protein nhân (N-nucleocapsid) trọng lƣợng phân tử khoảng 15 kDa
quy định bởi ORF7, protein màng (M-membrane) trọng lƣợng khoảng 19
kDa quy định bởi ORF6 và protein vỏ glycoprotein (E-envelope, GP5) trọng
lƣợng khoảng 24-25 kDa quy định bởi ORF5. Những nghiên cứu gần đây cho
thấy rằng ORF 2, 3 và 4 của Lelystad virus(LV), chủng Châu Âu của PRRS
virus có lẽ mã hóa cho 3 membrane-associated glycoprotein khác là: 29-30
kD GP2, 45-50 kD GP3, 31-35kD GP4.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




15

Hình 1.2. Cấu tạo phân tử virion
(Nguồn: />1.2. Protein tái tổ hợp

1.2.1. Giới thiệu
Hiện nay nhu cầu sử dụng kháng nguyên là protein trong chuẩn đoán
bệnh lý cũng nhƣ sản xuất vaccine là rất cao. Tuy nhiên, PRRSV thƣờng khó
nuôi trên môi trƣờng tế bào. Chúng chỉ phát triển tốt trên môi trƣờng đại thực
bào túi phổi heo (PAM) và một số dòng tế bào thận khỉ Châu Phi. Hiện tại
ngƣời ta chƣa thành công trong việc tuyển lựa các dòng tế bào này trong nuôi
cấy nhân tạo. Các dòng tế bào thận khỉ thƣờng không nhạy cảm cho tất cả các
chủng virus PRRS. Chính vì thế phƣơng pháp sản xuất protein tái tổ hợp cho
PRRSV là hƣớng đi đúng và mang lại nhiều ƣu điểm, đặc biệt sản xuất
protein tái tổ hợp mã hóa bởi ORF5 mang tính ứng dụng cao trong các thử
nghiệm nhƣ dùng làm vật liệu trong các kit chẩn đoán, tạo vaccine tái tổ hợp
thế hệ mới… Sản xuất protein tái tổ hợp mở ra khả năng tạo số lƣợng lớn
kháng nguyên dùng làm vật liệu trong chẩn đoán nhất là khi dịch bệnh bùng
phát. Sản xuất protein tái tổ hợp cũng góp phần khắc phục đƣợc nhƣợc điểm
hiện tại là khó nuôi cấy PRRSV trên môi trƣờng tế bào nhƣ đã nêu ở trên.
1.2.2. Glycoprotein (GP5)
ORF5 của PRRSV mã hóa cho protein vỏ GP5 có kích thƣớc khoảng 25
kDa. GP5 nằm trên bề mặt màng virus chính là vị trí tiếp xúc của PRRSV khi
nó nhiễm vào vật chủ. GP5 là một trong những glycoprotein vỏ phong phú và
đa dạng nhất, là một tác nhân gây cảm ứng chính của kháng thể trung hòa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




16

trong cơ thể. Nó bao gồm ba vị trí glycosylation đƣợc cho là N-linked N34,
N44, N51 nơi mà vị trí trung hòa virus đƣợc đặt tại đó [21]. Plagemann và cs
(2002) đã sử dụng bản đồ peptit để chỉ ra rằng các vị trí trung hòa virus chính

của PRRSV đƣợc đặt tại vị trí giữa của GP5 từ acid amin 36 đến 52. GP5
đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại PRRSV. Vì vậy GP5 rất
đƣợc quan tâm nghiên cứu trong việc phân tích dịch tễ học và tiến hóa phân
tử cũng nhƣ biến đổi vật liệu di truyền của chủng virus này. Điển hình là các
peptide tín hiệu, vùng ngoại bào virus, vùng xuyên màng và vùng nội bào
virus, các điểm trung hòa virus và những đột biến quan trọng: 13 (R  Q),
151 (R  G). Đây là những mô hình có vai trò quan trọng làm thay đổi yếu tố
ảnh hƣởng đến độc lực virus. Hai đột biến trên OFR5 đƣợc xem là chỉ thị cho
độc lực của chủng vaccine, đó là đột biến R13 thành Q13 và R151 thành
G151. Đột biến Q13 nằm trên trình tự peptide tín hiệu giả định là trình tự sẽ
bị loại bỏ sau dịch mã. Đột biến này có thể ảnh hƣởng đến sự vận chuyển GP5
đến màng của mạng lƣới nội chất. Sự thay đổi G151 nằm trên phần ƣa nƣớc
của glycoprotein, đây là một trong những dấu hiệu đột biến liên quan đến sự
suy yếu của PRRSV
1.2.3. Sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF5
Protein tái tổ hợp đƣợc sản xuất bằng cách chèn gene ORF5 mã hóa cho
protein GP5 vào sau promoter của pET 32a(+). Kết quả tạo ra plasmid tái tổ
hợp là pET 32a(+)/GP5, biểu hiện protein có kích thƣớc 25kDa trong tế bào
E.coli chủng BL21. Protein này có kích thƣớc tƣơng tự với kích thƣớc protein
GP5 biểu hiện trong tế bào túi phổi heo và vẫn giữ đƣợc cấu trúc kháng
nguyên của Protein GP5 tự nhiên. Hiện nay hƣớng nghiên cứu ứng dụng
protein tái tổ hợp dựa trên ORF5 của virus PRRS trong sản xuất vaccine vì
protein GP5 đƣợc quy định bởi ORF này có chứa những epitope trung hòa
chính quan trọng của PRRSV.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN