Kỹ thuật bào chế thuốc nang và phương pháp kiểm nghiệm - Chương 2

Chuyên đề
Chuyên đề
KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC
KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC


I. MỞ ĐẦU
I. MỞ ĐẦU


Trong ngành Dược có nhiều phương pháp khác nhau để kiểm tra
Trong ngành Dược có nhiều phương pháp khác nhau để kiểm tra
chất lượng của thuốc như phương pháp hoá học, phương pháp vật
chất lượng của thuốc như phương pháp hoá học, phương pháp vật
lý, phương pháp sinh học.
lý, phương pháp sinh học.


Phương pháp hoá, vật lý tiến hành nhanh, chính xác nhưng chỉ
Phương pháp hoá, vật lý tiến hành nhanh, chính xác nhưng chỉ
áp dụng được với các chất thành phần hoá học đã biết. Một số dược
áp dụng được với các chất thành phần hoá học đã biết. Một số dược
phẩm có yêu cầu về hiệu lực tác dụng, hoặc những tính chất riêng
phẩm có yêu cầu về hiệu lực tác dụng, hoặc những tính chất riêng
biệt như độ an toàn của vaccine, độc tính bất thường hay yếu tố gây
biệt như độ an toàn của vaccine, độc tính bất thường hay yếu tố gây
sốt của một số loại thuốc…Những tiêu chuẩn này không thể xác

sốt của một số loại thuốc…Những tiêu chuẩn này không thể xác
định được bằng phương pháp lý, hoá mà phải dùng phương pháp
định được bằng phương pháp lý, hoá mà phải dùng phương pháp
sinh học.
sinh học.


1.1. Nguyên tắc
1.1. Nguyên tắc

•
•
Phương pháp sinh học dựa trên nguyên tắc:
Phương pháp sinh học dựa trên nguyên tắc:

So sánh hiệu lực tác dụng hoặc các đặc tính riêng của
So sánh hiệu lực tác dụng hoặc các đặc tính riêng của
chất thử với chất chuẩn tương ứng trong cùng điều
chất thử với chất chuẩn tương ứng trong cùng điều
kiện và thời gian thí nghiệm.
kiện và thời gian thí nghiệm.

Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, hai loại thử
Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, hai loại thử
nghiệm được áp dụng nhiều nhất là:
nghiệm được áp dụng nhiều nhất là:

- Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động
- Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động
vật

vật

- Kiểm nghiệm thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật.
- Kiểm nghiệm thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật.


1.2. Chất chuẩn
1.2. Chất chuẩn

Chất chuẩn là một yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng
Chất chuẩn là một yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng
chất thử. Chất chuẩn được chia làm hai loại:
chất thử. Chất chuẩn được chia làm hai loại:



- Chất chuẩn gốc
- Chất chuẩn gốc



- Chất chuẩn thứ cấp
- Chất chuẩn thứ cấp

Chất chuẩn phải được bảo quản trong các ống thuỷ tinh ở
Chất chuẩn phải được bảo quản trong các ống thuỷ tinh ở
nhiệt độ thích hợp tuỳ theo mẫu (thường ở nhiệt độ < 5
nhiệt độ thích hợp tuỳ theo mẫu (thường ở nhiệt độ < 5
0
0

C)
C)
trong điều kiện khô, tránh ánh sáng.
trong điều kiện khô, tránh ánh sáng.

1.3. Đánh giá kết quả
1.3. Đánh giá kết quả

Thử nghiệm sinh học thường có thời gian thí nghiệm kéo dài
Thử nghiệm sinh học thường có thời gian thí nghiệm kéo dài
và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tính chất đáp ứng của sinh
và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tính chất đáp ứng của sinh
vật thí nghiệm, người làm thí nghiệm, các điều kiện thử
vật thí nghiệm, người làm thí nghiệm, các điều kiện thử
nghiệm. Các yếu tố này thường không ổn định. Vì vậy kết
nghiệm. Các yếu tố này thường không ổn định. Vì vậy kết
quả thử nghiệm sinh học phải được đánh giá bằng toán thống
quả thử nghiệm sinh học phải được đánh giá bằng toán thống
kê. Độ chính xác của phép thử được thể hiện bằng giới hạn
kê. Độ chính xác của phép thử được thể hiện bằng giới hạn
tin cậy.
tin cậy.


II. KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG
II. KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG
PHÁP THỬ TRÊN ĐỘNG VẬT
PHÁP THỬ TRÊN ĐỘNG VẬT

2.1. Nguyên tắc

2.1. Nguyên tắc

Kiểm nghiệm thuốc bằng các phép thử trên động
Kiểm nghiệm thuốc bằng các phép thử trên động
vật dựa trên sự đáp ứng của động vật thí nghiệm
vật dựa trên sự đáp ứng của động vật thí nghiệm
đối với các chế phẩm được đưa vào cơ thể một liều
đối với các chế phẩm được đưa vào cơ thể một liều
lượng theo qui định của từng thí nghiệm đẻ đánh
lượng theo qui định của từng thí nghiệm đẻ đánh
giá chất lượng của chế phẩm cần thử.
giá chất lượng của chế phẩm cần thử.


2.2. Động vật thí nghiệm
2.2. Động vật thí nghiệm

Yêu cầu: Động vật thí nghiệm phải đồng đều, thuần khiết
Yêu cầu: Động vật thí nghiệm phải đồng đều, thuần khiết
về nòi giống, khoẻ mạnh không nhiễm bệnh, không có
về nòi giống, khoẻ mạnh không nhiễm bệnh, không có
thai và được nuôi dưỡng đầy đủ. Chất lượng của động
thai và được nuôi dưỡng đầy đủ. Chất lượng của động
vật quyết định sự chính xác của phép thử.
vật quyết định sự chính xác của phép thử.

2.3. Thử Invivo và Invitro.
2.3. Thử Invivo và Invitro.

Thử nghiệm được tiến hành trên cơ thể động vật sống

Thử nghiệm được tiến hành trên cơ thể động vật sống
gọi là Invivo.
gọi là Invivo.

Phép thử có thể được tiến hành trên các cơ quan cô lập
Phép thử có thể được tiến hành trên các cơ quan cô lập
của động vật: tim, tử cung, ruột, máu… gọi là thử
của động vật: tim, tử cung, ruột, máu… gọi là thử
Invitro.
Invitro.


2.4. Liều (Dose)
2.4. Liều (Dose)

Liều là lượng chế phẩm thử đưa vào cơ thể động vật một lần cho
Liều là lượng chế phẩm thử đưa vào cơ thể động vật một lần cho
từng mục đích thí nghiệm. Ví dụ: Liều LD
từng mục đích thí nghiệm. Ví dụ: Liều LD
0
0
, LD
, LD
50
50
, LD
, LD
100
100
, MLD,

, MLD,
liều thử chất hạ áp, liều thử chất gây sốt.
liều thử chất hạ áp, liều thử chất gây sốt.

2.5. Một số thử nghiệm trên động vật áp dụng trong kiểm
2.5. Một số thử nghiệm trên động vật áp dụng trong kiểm
nghiệm thuốc
nghiệm thuốc

2.5.1. Thử độc tính bất thường
2.5.1. Thử độc tính bất thường

•
•
Nguyên tắc:
Nguyên tắc:

Độc tính bất thường của mẫu thử được đánh giá bằng số chuột
Độc tính bất thường của mẫu thử được đánh giá bằng số chuột
nhắt sống và chết trong thời gian 48 giờ sau khi chuột nhận được
nhắt sống và chết trong thời gian 48 giờ sau khi chuột nhận được
một lượng thuốc thử thích hợp bằng đường tiêm hoặc đường
một lượng thuốc thử thích hợp bằng đường tiêm hoặc đường
uống.
uống.

Thí nghiệm này thường được áp dụng cho các thuốc đông dược
Thí nghiệm này thường được áp dụng cho các thuốc đông dược
có dược liệu độc như ô đầu, phụ tử hay các chế phẩm đông dược
có dược liệu độc như ô đầu, phụ tử hay các chế phẩm đông dược

mới.
mới.


•
•
Động vật thí nghiệm :
Động vật thí nghiệm :



Dùng chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, nếu chuột cái không
Dùng chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, nếu chuột cái không
được có thai, cân nặng từ 18g đến 22g.
được có thai, cân nặng từ 18g đến 22g.
•
•
Nguyên tắc tiến hành:
Nguyên tắc tiến hành:

Chất thử được hoà tan trong NaCl 0,9% hoặc nước cất pha
Chất thử được hoà tan trong NaCl 0,9% hoặc nước cất pha
tiêm để tạo dung dịch có nồng độ quy định cho từng chuyên
tiêm để tạo dung dịch có nồng độ quy định cho từng chuyên
luận.
luận.

Thí nghiệm được thử trên 5 chuột, cho mỗi chuột 0,5 ml
Thí nghiệm được thử trên 5 chuột, cho mỗi chuột 0,5 ml
dung dịch chất thử bằng một trong các đường dùng sau:

dung dịch chất thử bằng một trong các đường dùng sau:



+ Tiêm tĩnh mạch
+ Tiêm tĩnh mạch



+ Tiêm màng bụng
+ Tiêm màng bụng



+ Tiêm dưới da
+ Tiêm dưới da



+ Uống
+ Uống


•
•
Đánh giá kết quả:
Đánh giá kết quả:

Sau 48
Sau 48

h
h
dùng thuốc ở lần thứ nhất, nếu không có chuột
dùng thuốc ở lần thứ nhất, nếu không có chuột
nào chết, mẫu thử đạt yêu cầu. Nếu có một hay nhiều
nào chết, mẫu thử đạt yêu cầu. Nếu có một hay nhiều
chuột chết trong thời gian trên phải làm lại thí nghiệm
chuột chết trong thời gian trên phải làm lại thí nghiệm
lần thứ hai.
lần thứ hai.

Thí nghiệm lần thứ hai được tiến hành với 10 chuột
Thí nghiệm lần thứ hai được tiến hành với 10 chuột
cân nặng từ 20g. Sau 48
cân nặng từ 20g. Sau 48
h
h
nếu không có chuột nào chết
nếu không có chuột nào chết
thì mẫu thử đạt yêu cầu. Nếu có một hay nhiều chuột
thì mẫu thử đạt yêu cầu. Nếu có một hay nhiều chuột
chết, mẫu thử không đạt yêu cầu.
chết, mẫu thử không đạt yêu cầu.


2.2.2. Thử chất gây sốt
2.2.2. Thử chất gây sốt

•
•

Nguyên tắc:
Nguyên tắc:

Là một phương pháp sinh học để kiểm tra chất
Là một phương pháp sinh học để kiểm tra chất
lượng mẫu thử, dựa trên sự tăng thân nhiệt của thỏ
lượng mẫu thử, dựa trên sự tăng thân nhiệt của thỏ
sau khi được tiêm thuốc thử cần thử vào tĩnh mạch
sau khi được tiêm thuốc thử cần thử vào tĩnh mạch
tai.
tai.

Các dịch tiêm truyền yêu cầu bắt buộc phải thử
Các dịch tiêm truyền yêu cầu bắt buộc phải thử
chất gây sốt. Các thuốc tiêm nếu ghi trên nhãn
chất gây sốt. Các thuốc tiêm nếu ghi trên nhãn
“không có chất gây sốt” hoặc có thể tích từ 15ml
“không có chất gây sốt” hoặc có thể tích từ 15ml
trở lên cũng phải thử chất gây sốt.
trở lên cũng phải thử chất gây sốt.


•
•
Động vật thí nghiệm:
Động vật thí nghiệm:

Thực hiện trên thỏ trưởng thành, khoẻ mạnh, đực hoặc
Thực hiện trên thỏ trưởng thành, khoẻ mạnh, đực hoặc
cái (không có thai) nặng từ 1,5kg trở lên.

cái (không có thai) nặng từ 1,5kg trở lên.

Thỏ được nuôi đầy đủ với các chất kháng sinh. Nhiệt độ
Thỏ được nuôi đầy đủ với các chất kháng sinh. Nhiệt độ
nhà chăn nuôi và phòng thí nghiệm không chênh lệch
nhà chăn nuôi và phòng thí nghiệm không chênh lệch
nhau quá 3
nhau quá 3
0
0
C. Trong 3 ngày trước ngày thí nghiệm , thỏ
C. Trong 3 ngày trước ngày thí nghiệm , thỏ
được lấy nhiệt độ 3 lần/ngày vào buổi sáng, mỗi lần cách
được lấy nhiệt độ 3 lần/ngày vào buổi sáng, mỗi lần cách
nhau 1
nhau 1
h
h
.
.

Chỉ dùng thỏ có nhiệt độ từ 38 - 39,8
Chỉ dùng thỏ có nhiệt độ từ 38 - 39,8
0
0
C. Trong thời gian
C. Trong thời gian
lấy nhiệt độ không cho thỏ ăn, nhưng có
lấy nhiệt độ không cho thỏ ăn, nhưng có

thể cho uống
thể cho uống
nước. Những con thỏ có sự chênh lệch nhiệt độ giữa các
nước. Những con thỏ có sự chênh lệch nhiệt độ giữa các
lần đo trong ngày ≥0,6
lần đo trong ngày ≥0,6
0
0
C không được dùng để thí
C không được dùng để thí
nghiệm.
nghiệm.


•
•
Dụng cụ thí nghiệm:
Dụng cụ thí nghiệm:

Các dụng cụ thuỷ tinh: bơm tiêm, kim tiêm phải được
Các dụng cụ thuỷ tinh: bơm tiêm, kim tiêm phải được
rửa sạch và khử trùng 250
rửa sạch và khử trùng 250
0
0
C/ 30 phút hoặc 200
C/ 30 phút hoặc 200
0
0

C/ 1
C/ 1
h
h
.
.

•
•
Phương pháp tiến hành:
Phương pháp tiến hành:

Thí nghiệm được thực hiện trên 3 thỏ có nhiệt độ khác
Thí nghiệm được thực hiện trên 3 thỏ có nhiệt độ khác
nhau không quá 1
nhau không quá 1
0
0
C
C

Lấy nhiệt độ ban đầu: Trước khi tiêm chất thử, lấy nhiệt
Lấy nhiệt độ ban đầu: Trước khi tiêm chất thử, lấy nhiệt
độ thỏ 2 lần, mỗi lần cách nhau 30 phút. Hai nhiệt độ này
độ thỏ 2 lần, mỗi lần cách nhau 30 phút. Hai nhiệt độ này
không được chênh nhau quá 0,2
không được chênh nhau quá 0,2
0
0
C. Nhiệt độ ban đầu là

C. Nhiệt độ ban đầu là
trung bình cộng của 2 lần đo.
trung bình cộng của 2 lần đo.

Tiêm thuốc: Thể tích tiêm từ 0,5 – 10ml/ 1kg thỏ.
Tiêm thuốc: Thể tích tiêm từ 0,5 – 10ml/ 1kg thỏ.

Theo dõi nhiệt độ thỏ ở những khoảng thời gian ít nhất
Theo dõi nhiệt độ thỏ ở những khoảng thời gian ít nhất
30 phút trong 3 giờ sau khi tiêm.
30 phút trong 3 giờ sau khi tiêm.


•
•
Đánh giá kết quả:
Đánh giá kết quả:

Nếu không có thỏ nào tăng nhiệt độ ≥ 0,6
Nếu không có thỏ nào tăng nhiệt độ ≥ 0,6
0
0
C hoặc tổng
C hoặc tổng
nhiệt độ của 3 thỏ ≤ 1,4
nhiệt độ của 3 thỏ ≤ 1,4
0
0
C thì chế phẩm thử đạt yêu c
C thì chế phẩm thử đạt yêu c

ầu
ầu
.
.

Nếu một thỏ trở lên tăng nhiệt độ ≥0,6
Nếu một thỏ trở lên tăng nhiệt độ ≥0,6
0
0
C hoặc tổng tăng
C hoặc tổng tăng
nhiệt độ của 3 thỏ > 1,4
nhiệt độ của 3 thỏ > 1,4
0
0
C thì phải thử lại trên 5 thỏ khác.
C thì phải thử lại trên 5 thỏ khác.

Nếu 4 thỏ trở lên trong 8 con của hai lần thí nghiệm tăng
Nếu 4 thỏ trở lên trong 8 con của hai lần thí nghiệm tăng
nhiệt độ ≥ 0,6
nhiệt độ ≥ 0,6
0
0
C, hoặc nếu tổng số tăng nhiệt độ của 8
C, hoặc nếu tổng số tăng nhiệt độ của 8
con > 3,7
con > 3,7
0
0

C thì chế phẩm coi như không đạt yêu cầu thử
C thì chế phẩm coi như không đạt yêu cầu thử
chất gây sốt.
chất gây sốt.

Phương pháp thử trên động vật còn được áp dụng để
Phương pháp thử trên động vật còn được áp dụng để
kiểm nghiệm nhiều loại dược phẩm có tính chất đặc biệt:
kiểm nghiệm nhiều loại dược phẩm có tính chất đặc biệt:
Định lượng các hormon, corticotropin (ACTH), insulin,
Định lượng các hormon, corticotropin (ACTH), insulin,
adrenalin, định lượng heparin, vitamin D, Oxytocin,
adrenalin, định lượng heparin, vitamin D, Oxytocin,
digitalin và các chế phẩm chứa glucosid trợ tim, kiểm tra
digitalin và các chế phẩm chứa glucosid trợ tim, kiểm tra
độ an toàn và hiệu lực của vacxin…
độ an toàn và hiệu lực của vacxin…


III. KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG CÁC PHÉP
III. KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG CÁC PHÉP
THỬ VI SINH VẬT
THỬ VI SINH VẬT

3.1. Đại cương về vi sinh vật
3.1. Đại cương về vi sinh vật

Vi sinh vật là những cơ thể sống có kích thước rất nhỏ
Vi sinh vật là những cơ thể sống có kích thước rất nhỏ
mà mắt thường không nhìn thấy được. Trong tự nhiên, vi

mà mắt thường không nhìn thấy được. Trong tự nhiên, vi
sinh vật tồn tại rất phong phú và đa dạng, chúng đóng vai
sinh vật tồn tại rất phong phú và đa dạng, chúng đóng vai
trò tích cực vào vòng tuần hoàn vật chất. Nhiều loại vsv
trò tích cực vào vòng tuần hoàn vật chất. Nhiều loại vsv
được ứng dụng trong các lĩnh vực y tế, công nghiệp,
được ứng dụng trong các lĩnh vực y tế, công nghiệp,
nông nghiệp như các vsv có khả năng lên men rượu, sinh
nông nghiệp như các vsv có khả năng lên men rượu, sinh
tổng hợp kháng sinh, vitamin, acid amin, vi sinh vật cố
tổng hợp kháng sinh, vitamin, acid amin, vi sinh vật cố
định đạm ở thực vật…
định đạm ở thực vật…

Để phục vụ cho việc kiểm nghiệm thuốc bằng các thử
Để phục vụ cho việc kiểm nghiệm thuốc bằng các thử
nghiệm vi sinh vật, ta cần tìm hiểu một số đặc điểm
nghiệm vi sinh vật, ta cần tìm hiểu một số đặc điểm
chính của hai nhóm vi sinh vật là vi khuẩn và vi nấm.
chính của hai nhóm vi sinh vật là vi khuẩn và vi nấm.


3.1.1. Vi khuẩn (Bacteria)
3.1.1. Vi khuẩn (Bacteria)

•
•
Đặc điểm:
Đặc điểm:


Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào có cấu tạo tế bào
Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào có cấu tạo tế bào
tiền nhân (Procaryote), có kích thước rất nhỏ, khoảng
tiền nhân (Procaryote), có kích thước rất nhỏ, khoảng
0,2- 2,0 x 2- 8 μm. Vi khuẩn có nhiều hình dáng khác
0,2- 2,0 x 2- 8 μm. Vi khuẩn có nhiều hình dáng khác
nhau: hình cầu, hình que, xoắn, dấu phẩy. Vi khuẩn sinh
nhau: hình cầu, hình que, xoắn, dấu phẩy. Vi khuẩn sinh
sản vô tính, một số tạo bào tử. Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ
sản vô tính, một số tạo bào tử. Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ
có một bào tử. Một số vi khuẩn có khả năng di động nhờ
có một bào tử. Một số vi khuẩn có khả năng di động nhờ
lông (flagella)
lông (flagella)

•
•
Phân loại:
Phân loại:

Với mục đích phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc,
Với mục đích phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc,
ta cần tìm hiểu vi khuẩn theo các nhóm dựa trên hình thể,
ta cần tìm hiểu vi khuẩn theo các nhóm dựa trên hình thể,
tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram và khẳ năng hô hấp
tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram và khẳ năng hô hấp
của chúng.
của chúng.