công nghệ tạo động vật chuyển gen

CHUYÊN ĐỀ
CHUYÊN ĐỀ
CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT
CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT
CHUYỂN GEN
CHUYỂN GEN


THẦY HƯỚNG DẪN: ĐÀO XUÂN TÂN
THẦY HƯỚNG DẪN: ĐÀO XUÂN TÂN
HỌC VIÊN THỰC HIỆN: NGÔ THỊ HỒNG THUÝ
HỌC VIÊN THỰC HIỆN: NGÔ THỊ HỒNG THUÝ

I. Khái niệm chung
I. Khái niệm chung
1. Ðộng vật chuyển gen
1. Ðộng vật chuyển gen


Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển)
Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển)
xen vào trong DNA genome của nó. Gen ngoại lai này phải được
xen vào trong DNA genome của nó. Gen ngoại lai này phải được
truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm. Việc
truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm. Việc
chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen

chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen
này di truyền lại cho thế hệ sau.
này di truyền lại cho thế hệ sau.
2. Sự phát triển của khoa học chuyển gen ở động vật
2. Sự phát triển của khoa học chuyển gen ở động vật
•
Vào thập kỷ 1970, các thí nghiệm nghiên cứu đã được thực hiện
Vào thập kỷ 1970, các thí nghiệm nghiên cứu đã được thực hiện
với các tế bào ung thư biểu bì phôi và các tế bào ung thư quái
với các tế bào ung thư biểu bì phôi và các tế bào ung thư quái
thai để tạo nên chuột thể khảm (Brinster,1974; Mintz và
thai để tạo nên chuột thể khảm (Brinster,1974; Mintz và
Illmensee, 1975; Bradley, 1984). Trong các động vật thể khảm
Illmensee, 1975; Bradley, 1984). Trong các động vật thể khảm
này, các tế bào nuôi cấy lấy từ một dòng chuột được đưa vào
này, các tế bào nuôi cấy lấy từ một dòng chuột được đưa vào
phôi của một dòng chuột khác bằng quần tụ phôi trực tiếp
phôi của một dòng chuột khác bằng quần tụ phôi trực tiếp
(direct embryo aggregation) hoặc bằng cách tiêm vào phôi ở giai
(direct embryo aggregation) hoặc bằng cách tiêm vào phôi ở giai
đoạn phôi nang (blastocyst).
đoạn phôi nang (blastocyst).

•
Bước phát triển tiếp theo của kỹ thuật chuyển gen được thực
Bước phát triển tiếp theo của kỹ thuật chuyển gen được thực
hiện bằng cách tiêm retrovirus vào các phôi chuột đã được nuôi
hiện bằng cách tiêm retrovirus vào các phôi chuột đã được nuôi
cấy trước (Jeanish và Mintz, 1974; Jeanish, 1976). Thông tin di
cấy trước (Jeanish và Mintz, 1974; Jeanish, 1976). Thông tin di

truyền của virus được chuyển một cách hiệu quả vào genome
truyền của virus được chuyển một cách hiệu quả vào genome
của động vật nhận và sau đó ít lâu kỹ thuật sử dụng retrovirus
của động vật nhận và sau đó ít lâu kỹ thuật sử dụng retrovirus
làm vector cho các đoạn DNA ngoại lai đặc biệt đã được phát
làm vector cho các đoạn DNA ngoại lai đặc biệt đã được phát
triển (Stuhmann, 1984). Sử dụng retrovirus như là vật truyền
triển (Stuhmann, 1984). Sử dụng retrovirus như là vật truyền
trung gian đối với việc chuyển gen đã tạo nên hiện tượng khảm
trung gian đối với việc chuyển gen đã tạo nên hiện tượng khảm
ở mức độ cao.
ở mức độ cao.


•
Trong những năm gần đây, một số kỹ thuật tạo động vật
Trong những năm gần đây, một số kỹ thuật tạo động vật
chuyển gen khác đã được công bố: phương pháp chuyển gen
chuyển gen khác đã được công bố: phương pháp chuyển gen
bằng cách sử dụng tế bào gốc phôi (Grossler,1986), phương
bằng cách sử dụng tế bào gốc phôi (Grossler,1986), phương
pháp chuyển các đoạn nhiễm sắc thể nguyên (ví dụ như chuột
pháp chuyển các đoạn nhiễm sắc thể nguyên (ví dụ như chuột
“transomic“, Richa và Lo, 1988), chuyển gen trực tiếp vào tinh
“transomic“, Richa và Lo, 1988), chuyển gen trực tiếp vào tinh
trùng kết hợp với thụ tinh
trùng kết hợp với thụ tinh
in vitro
in vitro
(Lavitrano, 1989). Tuy nhiên,

(Lavitrano, 1989). Tuy nhiên,
phương pháp vi tiêm DNA vào tiền nhân của hợp tử là phương
phương pháp vi tiêm DNA vào tiền nhân của hợp tử là phương
pháp có hiệu quả nhất, được sử dụng rộng rãi nhất để tạo động
pháp có hiệu quả nhất, được sử dụng rộng rãi nhất để tạo động
vật chuyển gen.
vật chuyển gen.

Sử dụng phương pháp này, các gen chuyển có chiều dài trên 50 kb
Sử dụng phương pháp này, các gen chuyển có chiều dài trên 50 kb
của virus, sinh vật tiền nhân , thực vật, động vật không xương
của virus, sinh vật tiền nhân , thực vật, động vật không xương
sống hoặc động vật có xương sống có thể được chuyển vào
sống hoặc động vật có xương sống có thể được chuyển vào
genome của động vật có vú và chúng có thể được biểu hiện ở cả
genome của động vật có vú và chúng có thể được biểu hiện ở cả
tế bào sinh dưỡng và tế bào sinh sản.
tế bào sinh dưỡng và tế bào sinh sản.
II. Công nghệ tạo động vật chuyển gen
II. Công nghệ tạo động vật chuyển gen


Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp
Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp
và ở những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội
và ở những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội
dung cơ bản gồm các bước chính sau: tách chiết, phân lập gen
dung cơ bản gồm các bước chính sau: tách chiết, phân lập gen
mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật;
mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật;

tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen; biến nạp gen vào phôi động vật;
tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen; biến nạp gen vào phôi động vật;
nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao);
nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao);
phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ và
phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ và
tạo ra dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản
tạo ra dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản
xuất động vật chuyển gen.
xuất động vật chuyển gen.

Hình 4.1: Sơ đồ tạo động vật chuyển gen

1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp
1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp
gen biểu hiện trong tế bào động vật
gen biểu hiện trong tế bào động vật
1.1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn
1.1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn
•
Một gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào
Một gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào
vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập và
vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập và
tinh chế hay nói cách khác là nó phải được tạo dòng. Các công
tinh chế hay nói cách khác là nó phải được tạo dòng. Các công
cụ sử dụng để tạo dòng bao gồm các enzyme đặc biệt có hoạt
cụ sử dụng để tạo dòng bao gồm các enzyme đặc biệt có hoạt
tính cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase), các mẫu dò
tính cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase), các mẫu dò

(probe), vector và tế bào vật chủ. Tế bào vật chủ thường được
(probe), vector và tế bào vật chủ. Tế bào vật chủ thường được
sử dụng là tế bào vi khuẩn
sử dụng là tế bào vi khuẩn
E.coli
E.coli
và vector thường được sử dụng
và vector thường được sử dụng
là plasmid.
là plasmid.
•
Việc tách chiết một gen riêng lẻ là rất phức tạp bởi vì DNA mẫu
Việc tách chiết một gen riêng lẻ là rất phức tạp bởi vì DNA mẫu
chứa hàng triệu gen. Do đó để thực hiện điều này, DNA mẫu
chứa hàng triệu gen. Do đó để thực hiện điều này, DNA mẫu
chứa gen mong muốn và vector plasmid phải được cắt bởi cùng
chứa gen mong muốn và vector plasmid phải được cắt bởi cùng
một loại enzyme hạn chế. Các đoạn DNA mẫu sau khi được cắt
một loại enzyme hạn chế. Các đoạn DNA mẫu sau khi được cắt
có mang gen mong muốn sẽ được xen vào vector plasmid và các
có mang gen mong muốn sẽ được xen vào vector plasmid và các
đầu của các đoạn DNA mẫu này và các đầu của vector plasmid
đầu của các đoạn DNA mẫu này và các đầu của vector plasmid
sẽ được nối với nhau nhờ ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp.
sẽ được nối với nhau nhờ ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp.
Sau đó các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào các tế bào vi
Sau đó các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào các tế bào vi
khuẩn
khuẩn
E.coli

E.coli
và các tế bào vi khuẩn tiến hành sinh trưởng.
và các tế bào vi khuẩn tiến hành sinh trưởng.

Vào thời điểm này, các tế bào vi khuẩn chứa plasmid mang gen
Vào thời điểm này, các tế bào vi khuẩn chứa plasmid mang gen
mong muốn sẽ được phát hiện bằng mẫu dò. Chúng được nuôi cấy
mong muốn sẽ được phát hiện bằng mẫu dò. Chúng được nuôi cấy
trong môi trường thích hợp để sinh trưởng phát triển tạo ra hàng
trong môi trường thích hợp để sinh trưởng phát triển tạo ra hàng
triệu bản sao của vector chứa gen này. Vector chứa gen này sẽ
triệu bản sao của vector chứa gen này. Vector chứa gen này sẽ
được tách ra khỏi tế bào vi khuẩn và gen mong muốn sẽ được tách
được tách ra khỏi tế bào vi khuẩn và gen mong muốn sẽ được tách
chiết. Phương pháp này có thể tạo ra hàng triệu bản sao của gen
chiết. Phương pháp này có thể tạo ra hàng triệu bản sao của gen
mong muốn mà không bị nhiễm bởi các gen khác. Gen chuyển có
mong muốn mà không bị nhiễm bởi các gen khác. Gen chuyển có
nguồn gốc từ genome này chứa các đoạn exon mã hoá và các
nguồn gốc từ genome này chứa các đoạn exon mã hoá và các
đoạn intron không mã hoá (Hình 4.2).
đoạn intron không mã hoá (Hình 4.2).
Hình 4.2: So sánh hai dạng gen chuyển

Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ sản phẩm
Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ sản phẩm
biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein. Từ mRNA dưới tác động
biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein. Từ mRNA dưới tác động
của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch
của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch

đơn (single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ
đơn (single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ
sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA). DNA
sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA). DNA
bổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không
bổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không
chứa các intron mà chỉ bao gồm các exon (Hình 4.2). Hoặc từ sản
chứa các intron mà chỉ bao gồm các exon (Hình 4.2). Hoặc từ sản
phẩm protein, có thể suy ra trình tự nucleotid của gen cấu trúc
phẩm protein, có thể suy ra trình tự nucleotid của gen cấu trúc
trên cơ sở trình tự các axit amin trong phân tử protein. Sau đó có
trên cơ sở trình tự các axit amin trong phân tử protein. Sau đó có
thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn.
thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn.



1.2.Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào
1.2.Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào
động vật
động vật
•
Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật, các
Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật, các
vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài
vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài
khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm
khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm
bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase. Tất cả các thành
bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase. Tất cả các thành

phần của gen có thể được tách chiết và tái tổ hợp để tạo thành
phần của gen có thể được tách chiết và tái tổ hợp để tạo thành
một cấu trúc gen chuyển biểu hiện (Hình 4.3).
một cấu trúc gen chuyển biểu hiện (Hình 4.3).
•
Ở các đầu của cấu trúc đầy đủ này có thể được sửa đổi bằng
Ở các đầu của cấu trúc đầy đủ này có thể được sửa đổi bằng
cách bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết
cách bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết
các enzyme hạn chế khác nhau. Trình tự polylinker cho phép có
các enzyme hạn chế khác nhau. Trình tự polylinker cho phép có
thể xen vào cấu trúc này một vector để kiểm tra và tạo dòng.
thể xen vào cấu trúc này một vector để kiểm tra và tạo dòng.
•
Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai
Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai
trò điều hoà sự biểu hiện của gen. Các yếu tố điều hoà cũng có
trò điều hoà sự biểu hiện của gen. Các yếu tố điều hoà cũng có
thể nằm ở trong đoạn intron. Yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của
thể nằm ở trong đoạn intron. Yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của
gen là promoter, có vai trò quyết định trong việc điều hoà sự
gen là promoter, có vai trò quyết định trong việc điều hoà sự
biểu hiện của gen.
biểu hiện của gen.





Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động vật như

Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động vật như
methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin, amylase, insulin,
methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin, amylase, insulin,
ß-lactoglobulin, adiposite P2 ... hoặc từ virus động vật như Simian
ß-lactoglobulin, adiposite P2 ... hoặc từ virus động vật như Simian
virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV)...
virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV)...
Hình 4.3: Sơ đồ cấu trúc gen chuyển biểu hiện
enhancer: gen tăng cường
ATG: vị trí khởi đầu phiên mã
SIG: trình tự tín hiệu
AAA: đuôi polyA