Kỹ Thuật Nuôi Cấy Tế Bào Động Vật

KỸ THUẬT NUÔI CẤY
TẾ BÀO ĐỘNG VẬT


I. GIỚI THIỆU CHUNG:
• * Harrison (1907),Carrel (1912): nuôi cấy tế bào động vật
• Ếch là nguồn mô đầu tiên để nuôi cấy
• * Sự thúc đẩy của y học buộc người ta quan tâm đến các loài
động vật ổn nhiệt.
• * Dòng Hela được Gey và cộng sự thiết lập năm 1952
• * Năm 1961 Hayflick và Moorhead nghiên cứu về những tế
bào bình thường có đời sống xác đònh
• * Tạo vaccin kháng virus và nghiên cứu về ung thư thúc đẩy kỹ
thuật nuôi cấy TBĐV phát triiển.
• * Sự phát triển chung của kỹ thuật công nghệ làm nuôi cấy mô
có thể được quan tâm rộng rãi.
• * Kỹ thuật nuôi cấy mô được ứng dụng nhiều vào các lónh vực
trong y học và công nghiệp.


1. Những thuận lợi của nuôi cấy mô 
a. Kiểm soát môi trường
b. Tính đồng nhất của mẫu
c. Kinh tế 
2. Những khó khăn của nuôi cấy mô
a. Sự thành thạo của người thao tác
b. Số lượng 
c. Sự không ổn đònh


3. Những khác biệt chính của tế bào trong điều

kiện in vitro
•* Thay đổi không gian kết hợp
•* Không còn tính tương tác tế bào chuyên biệt, tương tác đa
chiều.
• * Không thực sự đại diện cho mô mà từ đó các tế bào này được
tách ra do thiếu các yếu tố điều hòa.


II. ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
1. Tính cơ học yếu
2. Tăng trưởng và phân chia chậm
3. Cơ chế kìm hãm ngược (negative feed-back)
4. Tính chất cần giá đỡ
5. Thay đổi kiểu gen và kiểu hình
6. Có thể được bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu
7. Các đặc tính khác


III.MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
1. Môi trường
• *Môi trường tổng hợp dần thay thế chiết phẩm sinh học (phôi
gà, huyết thanh ...).
• *Đa số các dòng tế bào được nuôi cấy trong môi trường tổng
hợp có bổ sung 5 – 10% huyết thanh (có dòng tế bào cần bổ
sung 20% huyết thanh).
* Một vài loại môi trường thường được sử dụng trong nuôi cấy tế
bào và mô động vật:
• Môi trường BM (Basal Medium): tế bào Hela, tế bào L.
• Môi trường E’MEM (Eagle Minimum Essential Medium)
• Môi trường D'MEM (Dulbecco – Modified Eagle Medium)

• Môi trường F10, F12: do R.G. Ham thiết lập dùng cho nguyên
bào sợi
• Môi trường Iscove: do N.N.Iscove thiết lập trên cơ sở tiếp tục
cải biến môi trường DMEM.
• Môi trường 5A: do T.A. Mc.Coy thiết lập, thường được dùng
cho tế bào bệnh bạch huyết.
• Môi trường RPMI-1640: được G.E. Moore thiết lập, được dùng
để nuôi tế bào và mô bạch huyết.
• Môi trường 199: do R.C. Parker thiết lập dùng để nuôi tế bào
mô cơ phôi gà trong sản xuất vaccin phòng bệnh bại liệt.


Huyết thanh:
• *Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các
amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi
lượng…
• *Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng
trưởng và phân chia.
•* Kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy
chuyền và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin
tránh các enzym gây tổn thương tế bào.
• *Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng.
• *Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các
yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ.
• *Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh và
ức chế độc tính của oxy.

2. Giới thiệu về kỹ thuật pha môi trường
Một số điều cần lưu ý trong khi pha môi trường
• Thành phần môi trường:
+ Acid amin: cung cấp nguồn N cho tế bào
+ Glucose: cung cấp nguồn C cho tế bào
+ Vitamine: là các yếu tố vi lượng quan trọng trong
hoạt động sống của tế bào
+ Muối khoáng: tạo hệ đệm và duy trì áp suất thẩm
thấu phù hợp
+ Protein: quan trọng nhất là các yếu tố tăng trưởng
hiện diện trong huyết thanh có vai trò kích thích phân bào
• Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ CO2
• Sự vô trùng 


IV. KỸ THUẬT TÁCH TẾ BÀO, CHỌN DÒNG
TẾ BÀO VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VÂÏT
1. Kỹ thuật tách tế bào
Một số khái niệm:
• *Dòng tế bào (cell line)
• *Dòng tế bào liên tục (continued cell line; established cell
line) Ví dụ: CHO (chinese hamster ovary: tế bào buồng trứng
chuột Trung Quốc), Schneider-2 (tế bào phôi ruồi giấm),
COS1 (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi), Hela (tế bào ung thư
cổ tử cung người), Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi). . .
• *Dòng tế bào tạm thời (temporary cell line)
• *Tế bào sơ cấp (primary cell)
• *Tế bào thứ cấp (secondary cell)

Taùch teá
baøo baèng
trypsin


2. Kỹ thuật chọn dòng tế bào
Tách tế bào từ đóa nuôi cấy bằng trypsin
Cấy tế bào vào đóa nuôi cấy 1000 tế bào/ml
Nuôi ủ tế bào đến khi chúng phát triển thành những colony
Chọn một colony tế bào cần tạo dòng
Cô lập colony này bằng 1 ống kim loại
Hút bỏ môi trường trong ống và tách các tế bào từ colony này
Cấy sang một đóa môi trường mới



3. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật trong
phòng thí nghiệm
a. Cấy chuyền tế bào
Đổ bỏ môi trường cũ trong bình roux có tế bào
Rửa tế bào bằng PBS(-)
Tách tế bào bằng trypsin
Huyền phù tế bào bằng môi trường
Cấy tế bào sang bình roux mới
Thay môi trường


b. Bảo quản tế bào
Tách tế bào trong bình roux bằng trypsin
Huyền phù tế bào bằng môi trường

Ly tâm thu sinh khối tế bào
Huyền phù tế bào bằng môi trường mới
Hút dòch huyền phù cho vào tube bảo quản tế bào 2ml
Để tube bảo quản vào hộp xốp bên trong có lót bông gòn
Cho vào tủ lạnh -70oC qua đêm
Bảo quản tube tế bào trong Nitơ lỏng


c. Hoạt hóa tế bào
Tube tế bào lấy từ nitơ lỏng
Cho vào becher nước ấm 37– 38oC để giải đông.
Hút dòch huyền phù tế bào cho vào bình roux
Thêm môi trường từng giọt vào bình
Ủ ở 37,5oC trong tủ nuôi.
Sau 24 giờ, thay môi trường cũ bằng môi trường mới


4. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật ở quy mô
pilot và công nghiệp
a. Nuôi cấy trong bình khuấy:
- Thể tích: vài lit đến 20 lit, tốt nhất là dưới 10 lit.
- Hấp vô trùng bằng autoclave.
* Yêu cầu với cánh khuấy:
+ Phải được giữ tốc độ quay ổn đònh từ 10-300rpm
+ Có một máy đo tốc độ gốc chính xác
+ Khởi động lại sau khi mất điện và vẫn giữ nguyên tốc độ đã
cài đặt
+ Không tỏa nhiệt nhiều
+ Hoạt động ổn đònh trong trong môi trường ở 37oC.

Môi trường được giảm nồng độ huyết thanh (0.5-5%), bổ
sung:
+ Pluronic F-68 (polyglycol) : nồng độ 0.1% để bảo vệ tế
bào chống lại sự phá vở do cơ học, đặc biệt ở hàm lượng
huyết thanh thấp.
+ Carboxymethyl cellulose (CMC) : nồng độ 0.1% cũng
dùng để bảo vệ tế bào khỏi sự phá vỡ cơ học.
+ Phá bọt (6ppm) : dùng khi nồng độ huyết thanh trên 2%.


Bình nuoâi caáy khuaáy


b. Nuôi cấy tế bào ở quy mô pilot và sản xuất :
Các hệ thống nuôi cấy
Hollow-fibre (sợi rỗng)
Hệ thống không
đồng nhất
Ceramic matrix modules
(các đơn vò chất nền ceramic)
Bioreactor khuấy
Hệ thống
đồng nhất

Airlift Bioreactor


* Hollow-fibre vaø ceramic matrix module :

Heä thoáng hollow-fiber


Ceramic matrix


Vài đặc điểm của 2 hệ thống này là:
• *Mật độ tế bào cao > 108/ml
• *Nồng độ sản phẩm cao: trong hollow fibre là 400mg/l IgM,
1100mg/l IgG; trong ceremic matrix module: 300mg/l
• *Chất dinh dưỡng, oxy và chất thải tạo thành gradient trong
buồng nuôi
• *Khoảng cách khuếch tán dài của oxy và chất dinh dưỡng
trong hollow-fibre
• *Sản phẩm thu được không lẫn hay rất ít tế bào
• *Đánh giá mật độ tế bào trong phòng nuôi chỉ bằng lượng
oxy tiêu thụ


•* Không có chổ để lấy mẫu tế bào để kiểm tra mức độ sống
và hình thái của tế bào trong quá trình nuôi cấy
•* Không có lực thủy động lực học gây biến dạng trong
hollow-fibre
•* Màng của hệ thống hollow-fibre có thể bò bít lại
•* Sự tăng quy mô bò giới hạn vì chiều dài của ống không thể
vượt quá một độ dài nhất đònh chỉ có thể gia tăng về đường
kính và số lượng module đưa vào.
•* Khó chuyển tế bào phát triển trong hệ thống nhỏ vào hệ
thống lớn

* Bioreactor khuaáy