Kỹ Thuật Nuôi Cấy Sơ Cấp Tế Bào Động Vật

Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

Kỹ thuật nuôi cấy sơ cấp
tế bào động vật


Khái niệm
Nuôi cấy sơ cấp (primary culture) là quá trình nuôi tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy
chuyền đầu tiên (subculture). Sau đó, việc nuôi cấy được gọi là thứ cấp (secondary culture)


Hai kiểu nuôi cấy sơ cấp
KIỂU 1: NUÔI CẤY MẢNH
MÔ SƠ CẤP
Là việc nuôi cấy các mảnh
mô in vitro. Trong quá trình
nuôi cấy, các tế bào từ mảnh
mô sẽ phát triển lan ra từ
vùng mô trung tâm.

KIỂU 2: NUÔI CẤY SƠ
CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
ĐƠN
Là việc nuôi cấy các tế bào
đơn được tách ra từ mảnh mô.
Trong quá trình nuôi, từng mỗi
tế bào sẽ phát triển tăng sinh
thành nhiều tế bào mới.


NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP

(mảnh mô ung thư vú)



Thu nhận tế bào đơn nhân tủy xương chuột


NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ
TẾ BÀO ĐƠN
(thu từ máu cuống rốn)


Quy trình nuôi cấy sơ cấp
Thu nhận mẫu

Xử lí mẫu

Nuôi cấy tế bào đơn:
Tách mô thành tế bào đơn

Nuôi cấy

Nuôi cấy mảnh mô:
Cố định mảnh mô


Thu nhận mẫu
• Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kì mô
sống nào của cơ thể.
• Trước hết phải làm sạch mô tại vị trí lấy mẫu

bằng cồn, cho mô vào dung dịch PBS, nhanh
chóng chuyển về phòng thí nghiệm.
• Tùy loại mẫu mô cũng như thời gian cần thiết
vận chuyển về phòng thí nghiệm: có kế hoạch
vận chuyển chúng trong điều kiện thích hợp.



Xử lí mẫu đối với nuôi cấy huyền phù
tế bào đơn

Các tế bào động vật trong khối mô liên kết chặt chẽ với nhau
nhờ các cầu nối hình thành giữa các tế bào với nhau.

Biện pháp:
–

(1) tác dụng một lực cơ học để bẻ gãy những cầu nối.

– (2) dùng enzym để phân hủy các cầu nối nói trên.


Cắt
nhuyễn

Biện pháp
cơ học

Ép
nhuyễn

Tách
bằng
màng lọc


Phương pháp cắt nhuyễn
Sử dụng lục sơ học bẻ gãy các cầu nối liên bào: dùng kéo,
dao cắt nhuyễn các mảnh mô.
Huyền phù vào dịch PBS, để lắng, thu dịch trong


Phương pháp ép nhuyễn

Ép nhuyễn mô: dùng 2 phiến lame
ép chặt mảnh mô để thu tế bào
đơn đối với những mô có liên kết
yếu.


Phương pháp tách bằng màng lọc

Tách bằng màng lọc tế bào (Cell
strainer): kích thước lỗ trên màng
từ 70–100 µm, chỉ cho những tế
bào đơn có kích thước tương ứng
qua màng.


Tách mô thành tế bào đơn bằng enzym

• Quy trình trypsin ấm
• Quy trình trypsin lạnh


Quy trình trypsin ấm


Quy trình trypsin lạnh
Cắt mẫu mô [2 –
3mm], rửa nhiều lần
với PBS vô trùng

Thêm môi trường,
sục nhẹ nhành cho
đến khi mô rời ra

Nếu các mảnh mô chưa
rời ra có thể thêm môi
trường để dễ huyền phù
hoặc dùng màng lọc

Thay PBS bằng
trypsin 0.25%

ủ ống chứa mẫu mô
trong 36,50C,
20 – 30 phút

Thu dịch huyền phù
tế bào, xác định

mật độ, tiến hành
nuôi

Ủ trong 40C, 6- 18
giờ

Loại bỏ trypsin


Tách tế bào bằng phương pháp khác
• Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng
• Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề
mặt


Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng


• “Tế bào quan tâm là tế bào a. Tế bào này nằm
trong 1 khối mô rắn cùng với 3 loại tế bào
khác là b, c và d. Các tế bào có tỉ trọng như
sau: a = 1,070 g/cm3, b = 1,077 g/cm3; c =
1,067 g/cm3, d = 1,080 g/cm3”.


• c = 1,067 g/cm3 > a = 1,070 g/cm3 > b =
1,077 g/cm3 > d = 1,080 g/cm3


Phương pháp tách tế bào dựa vào

marker bề mặt tế bào


Xử lí mẫu đối với nuôi cấy mảnh mô

Đặt mảnh mô vào dụng cụ nuôi
Mảnh mô nổi
Cố định mảnh mô
Mảnh mô sống
Thành công


Phương pháp cố định mảnh mô
• Lammel
• Huyết thanh
• Tăng kết dính và lật ngược bình nuôi