Phân tích vi sinh (1)

Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM
Khoa Công nghệ Thực phẩm

ĐỀ TÀI

THỬ NGHIỆM SINH HÓA

GVHD: Phan Thị Kim Liên


•
•
•
•

Thử nghiệm khả năng sinh H2S
Thử nghiệm indol
Thử nghiệm KIA/TSI
Thử nghiệm Nitratase

• Nội dung chính:
 Mục đích
 Nguyên tắc – cơ chế
 Môi trường
 Cách đọc kết quả


Thử nghiệm khả năng sinh H2S

• Mục đích:
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng phân giải các acid amin

chứa lưu huỳnh (cysteine, cystin, methionine,…) sinh H2S nhờ
enzyme desulfohydrase.



Nguyên tắc - cơ chế :
Dựa trên khả năng của vi sinh vật chuyển hóa các acid amin
chứa lưu huỳnh trong điều kiện kị khí và sinh H2S, tạo chất kết
tủa màu đen.


•

Ngoài nguồn đạm hữu cơ, H2S còn có thể được tạo ra do phản ứng khử
thiosulfate Na2S2O3 bởi enzyme thiosulfate reductase của vi sinh vật để tạo ra
sulfite và H2S


Môi trường

•
•
•

KIA,TSI (thạch nghiêng).
SIM (thạch sâu).
BSA (thạch đĩa).

Tất cả các môi trường đều thanh trùng ở 1210C trong 15 phút

BSA
Beef Extract

5.000 g/l

Tryptone

5.000 g/l

Peptone

5.000 g/l

D-glucose

5.000 g/l

Disodium Hydrogen Phosphate 4.000 g/l
Bi-Sulphite Indicator

8.000 g/l

Ferrous Sulphate

0.300 g/l

Agar

20.000 g/l

Chất chỉ thị

- Chỉ thị sulfide :FeSO4, Amonium sulfate sắt II.
- Acetate chì.

 Có nhiều cách phát hiện khả năng sinh H2S nhưng phương pháp sử dụng acetate
chì là nhạy nhất để nhận ra 1 lượng H2S ở các vi khuẩn.


Thao tác

•

Dùng que cấy thẳng cấy đâm sâu vào phần đáy của ống thạch nghiêng hoặc ống
0
thạch đứng , ủ ở 37 C, 24giờ.

•

Có thể dùng giấy tẩm Pb(CH3COO)2 5% gắn lên thành ống môi trường lỏng.
Phương pháp này cho kết quả từ 30 phút đến 1-2 giờ.


Đọc kết quả

•

Dương tính (+);

+ xuất hiện màu đen trong môi trường KIA, TSI.
SIM, PIA, BSA
+ màu nâu đen trên giấy tẩm Pb(CH3COO)5

•
•

Âm tính (-):
không xuất hiện màu đen trong môi trường


THỬ NGHIỆM INDOL

MỤC ĐÍCH:
Phát hiện các vi sinh vật có khả năng sinh indol, từ đó phát hiện các vi sinh
vật hiếu khí có hệ emzyme tryptophanase.


CƠ CHẾ
Tryptophan có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme
tryptophanse tạo nên các sản phẩm trung gian chứa gốc indol (indol
pyruvic acid).
Tryptophanase có trong vi sinh vật sẽ xúc tác phản ứng loại nhóm
amin để tạo indol.


CƠ CHẾ
Nhân pyrrol của indol chứa nhóm CH 2 kết hợp với nhóm (CHO) của
p-dimetthylaminobenzaldehyd có trong thuốc thử Kovac’s (có thể dùng

thuốc thử Ehrlich) hình thành nên một phức chất dạng quinone có màu đỏ.


CƠ CHẾ
HCl,alcohol,
warmed condensation

DMABA+Indole

Red color



MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ

_Môi trường Trypton water
_Thuốc thử Kowac’s (có thể dùng thuốc thử Ehrlich).
0
_ Cấy vi khuẩn vào môi trường, ủ 37 C trong 24 giờ, lấy 3-5 giọt
Kowac’s, sau đó đọc kết quả.


CÁCH ĐỌC KẾT QUẢ

•

Bề mặt môi trường xuất hiện
vòng đỏ cánh sen (+).

•

Môi trường có màu vàng chanh
(-).



Thử nghiệm KIA/TSI

• Mục đích:
+ Xác định khả năng sử dụng nguồn Cacbon cụ thể, kết hợp
với môi trường tăng trưởng căn bản.
+ Có hoặc không có sinh hơi Hydrogen sufide (H2S).


Môi trường:

•
•
•
•
•

KIA
1% Lactose.

TSI

0.1% Glucose.
Pepton (nguồn Cacbon/nitrat).
Muối sắt.

Thiosulfate natri.

•
•
•
•
•
•

1% Lactose.
0.1% Glucose.
1% Saccharose.
Pepton (nguồn Cacbon/nitrat).
Muối sắt.
Thiosulfate natri.

Chỉ thị Phenol RED


Nguyên tắc – cơ chế:
Có sử dụng đường:


Nguyên tắc – cơ chế:
Không sử dụng đường:


Nguyên tắc – cơ chế:
Sinh hydrogen sulfide (H2S):

•

Vi khuẩn + Sodiumthiosulfate

•

H2S + ion sắt

H2S

Sắt sulfide
(không tan tạo tủa đen)


Thử nghiệm KIA/TSI

Thao tác tiến hành:

•

Dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn vào phần nghiêng của ống thạch nghiêng và cấy
0
đâm sâu vào phần đứng của ống, ủ 37 C trong 24 giờ.