Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp KCTC 9161 (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Thị Tâm Tiến

NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH
HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC 9161

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐỖ THỊ TUYÊN
PGS.TS. NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội - 2013
i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị
Tuyên, Phó trƣởng phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng
dẫn, sửa luận văn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Quang Huy, Phó trƣởng khoa, Phụ
trách Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên đã hƣớng dẫn, quan tâm
giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tâp.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trƣởng phòng Công
nghệ sinh học enzyme, Phó Viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều
kiện về hóa chất, thiết bị, thời gian cho tôi thực hiện đề tài.

Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh
học, tập thể Bộ môn Sinh lý thực vật và hóa sinh, trƣờng Đại học Khoa học tự
nhiên, đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng nhƣ
chia sẻ những kinh nghiệm chuyên môn.
Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Phòng tổ chức cán
bộ, Khoa Nông Lâm Ngƣ, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng đã luôn quan tâm, tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi đi học và hoàn thiện đề tài luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè và đồng
nghiệp đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập.
Hà Nội, tháng 11 năm 2013
Học viên

Hà Thị Tâm Tiến

ii


MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC BẢNG BIỂU .......................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH VẼ ............................................ Error! Bookmark not defined.
BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT.................. Error! Bookmark not defined.
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. Khái quát về acarbose ..........................................................................................3
1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose ............................................................................3
1.3. Vai trò của acarbose .............................................................................................5
1.3.1. Vai trò của acarbose đối với bệnh đái tháo đƣờng ............................................5
1.3.2. Nghiên cứu về các tác dụng khác của acarbose ................................................8
1.4. Vai trò Actinoplanes trong sinh tổng hợp acarbose .............................................9

1.4.1. Đại cƣơng về Actinoplanes ...............................................................................9
1.4.2. Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 .............................................................. 10
1.4.3. Ứng dụng Actinoplanes trong sản xuất acarbose ............................................11
1.5. Nghiên cứu hoạt chất acarbose trên thế giới ......................................................12
1.5.1. Nghiên cứu về sản xuất acarbose ....................................................................12
1.5.2. Nghiên cứu về ứng dụng đột biến trên vi sinh vật ..........................................16
1.5.3. Các phƣơng pháp tinh sạch và thu nhận acarbose ..........................................17
1.5.4. Nghiên cứu sản xuất acarbose trong nƣớc ......................................................20
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................................23
2.1. Vật liệu và hóa chất ............................................................................................23
2.1.1. Chủng giống ....................................................................................................23
2.1.2. Hóa chất ..........................................................................................................23
2.1.3. Môi trƣờng ......................................................................................................23
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm ..........................................................................................24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................25
2.2.1. Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật .................................................................25

iii


2.2.2. Lựa chọn môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes
sp. KCTC 9161..........................................................................................................25
2.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy ..................................................................26
2.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nitrogen khi nuôi cấy .................................26
2.2.5. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc, nhiệt độ và pH khi nuôi cấy .................................26
2.3. Gây đột biến bằng NTG .....................................................................................26
2.4. Sắc ký lớp mỏng TLC ........................................................................................27
2.5. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose .....................................27
2.6. Tách chiết và tinh sạch acarbose ........................................................................28
2.6.1. Tách chiết và tinh sạch sơ bộ ..........................................................................28

2.6.2. Tinh sạch acarbose bằng sắc ký cột ................................................................ 29
2.7. Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ................................................................................31
2.8. Sắc ký lỏng ghép khối phổ .................................................................................31
2.9. Xác định cấu trúc phân tử acarbose bằng cộng hƣởng từ hạt nhân ...................31
2.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................................32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................33
3.1. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy ...........................................................................33
3.2. Tối ƣu các thành phần môi trƣờng và các điều kiện nuôi cấy ...........................35
3.2.1. Ảnh hƣởng của thời gian .................................................................................35
3.2.2. Ảnh hƣởng của nguồn maltose........................................................................37
3.2.3. Ảnh hƣởng của nguồn glucose ........................................................................38
3.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn bột ngô ........................................................................40
3.2.5. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng .......................................................................41
3.2.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy ...................................................................42
3.2.7. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc ...............................................................................43
3.2.8. Môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy tối ƣu .........................................................44
3.2.9. Xác định hàm lƣợng acarbose bằng HPLC .....................................................45
3.3. Gây đột biến chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ............................................46
3.4. Tinh sạch acarbose có hoạt tính ức chế α-glucosidase ......................................48

iv


3.4.1. Chọn lựa các phƣơng pháp tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 ...................................................................................48
3.4.1.1. Tinh sạch bằng sắc ký hấp thụ silica gel ......................................................48
3.4.1.2. Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel sephadex G100.............................................49
3.4.1.3. Tinh sạch bằng cột than hoạt tính 1 .............................................................50
3.4.2. Chọn lựa các phƣơng pháp tinh sạch acarbose từ dịch qua cột than 1 ...........51
3.4.2.1. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 .............................51

3.4.2.2. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose .............................. 51
3.4.3. Tinh sạch và thu nhận acarbose ......................................................................52
3.4.4. Hoạt tính ức chế α-glucosidase .......................................................................55
3.5. Xác định cấu trúc hóa học acarbose ...................................................................56
3.6. Quy trình tách chiết tinh sạch acarbose .............................................................59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................60
Kết luận .....................................................................................................................60
Kiến nghị ...................................................................................................................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................61
PHỤ LỤC .................................................................. Error! Bookmark not defined.

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật ............................................23
Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng ......................................24
Bảng 2.3. Các môi trƣờng khảo sát nghiên cứu ........................................................25
Bảng 3.1. Khối lƣợng chế phẩm qua các bƣớc tinh sạch acarbose ...........................55

vi


MỞ ĐẦU
Đái tháo đƣờng (ĐTĐ) hiện nay là một vấn đề sức khỏe mang tính chất toàn cầu,
ảnh hƣởng đến nhiều ngƣời, nhất là trong độ tuổi lao động trên toàn thế giới. Theo
thông báo của tổ chức y tế thế giới (WHO) ƣớc tính mỗi năm trên thế giới có 3,4
triệu ngƣời chết do đái tháo đƣờng, trong đó 80% các ca tử vong xảy ra ở những
nƣớc đang phát triển. Hiện nay trên thế giới có 347 triệu ngƣời mắc bệnh đái tháo
đƣờng, có 90% số ca mắc đái tháo đƣờng type 2. Chi phí về y tế dành cho căn bệnh

này đã tăng lên 465 tỷ USD (Dehghan, Gagari, 2013).
Ở Việt Nam, theo tổng hội Y học Việt Nam, năm 2012 có 5,7% dân số mắc
ĐTĐ và 12,8% số ngƣời mắc rối loạn dung nạp đƣờng. Với tỷ lệ bệnh nhân tăng 810% mỗi năm, Việt Nam trở thành nƣớc có tỷ lệ gia tăng bệnh ĐTĐ nhanh nhất thế
giới. Chi phí điều trị ĐTĐ chiếm 6% ngân sách của ngành Y tế và hầu hết đều tập
trung cho biến chứng của ĐTĐ nhƣ: bệnh tim mạch, tai biến mạch máu não, mù lòa,
hoại tử chi, suy thận gây ra (Công Sơn, Thế Ân, 2013).
Các thuốc điều trị ĐTĐ type 2 chủ yếu tập trung vào nhóm chất có hoạt tính ức
chế α-glucosidase nhƣ: acarbose, miglitol, voglibose, 1-deoxynojimycine.
Acarbose là hợp chất hữu cơ giả đƣờng pseudo-oligosaccharide có tác dụng kìm
hãm hoạt động của α-glucosidase, là enzyme chuyển hóa các oligosaccharide thành
glucose và monosaccharide trong ruột non, với ƣu điểm làm giảm đƣờng huyết sau
ăn, không làm tăng insulin huyết, không gây đề kháng insulin, bảo tồn tế bào beta,
giảm nồng độ HbA1c, triglyceride và giảm các biến chứng do tiểu đƣờng. Do đó,
acarbose đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh đái tháo đƣờng type 2, tạo cho
bệnh nhân khả năng kiểm soát hàm lƣợng đƣờng trong máu tốt hơn sau khi ăn thức
ăn chứa tinh bột. Acarbose đƣợc sinh tổng hợp từ các chủng vi sinh vật khác nhau
nhƣ Streptomyces, đặc biệt là chủng Actinoplanes.
Hiện nay, ở Việt Nam nhu cầu sử dụng dƣợc phẩm để sản xuất thuốc chữa bệnh
ĐTĐ chủ yếu đƣợc nhập từ nƣớc ngoài với giá thành cao, hoặc sử dụng thuốc có
nguồn gốc từ thảo dƣợc nhƣ quả mƣớp đắng xanh có chứa hoạt chất charantin,

1


glycosid steroid có tác dụng hạ đƣờng máu, làm tăng khả năng dung nạp glucose
của ngƣời bệnh; dây thìa canh chứa gymnemic acid làm tăng tiết insulin của tuyến
tụy; bạch truật có hoạt chất achactan A, B và C có tác dụng hạ đƣờng máu; cam
thảo đất có hoạt chất amellin có thể làm giảm đƣờng máu và các triệu chứng của
bệnh ĐTĐ type 2... Tuy nhiên sử dụng nguồn nguyên liệu từ thảo dƣợc phụ thuộc
nhiều vào thời vụ, với hàm lƣợng hoạt chất thấp, số nguyên liệu sử dụng phải rất

nhiều, một số thảo dƣợc quý hiếm ngày càng khan hiếm. Do đó, việc sản xuất các
hoạt chất bằng sử dụng nguồn vi sinh vật đang là một hƣớng nghiên cứu mới và cấp
thiết. Việc sản xuất acarbose từ xạ khuẩn Actinoplanes sẽ mang lại hiệu quả kinh tế,
sản xuất nhanh, chủ động, giá thành thấp do sử dụng nguồn nguyên liệu dễ kiếm.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nâng cao khả năng sinh
tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC
9161” trong khuân khổ đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ điều chế acarbose
làm nguyên liệu thuốc chữa bệnh đái tháo đƣờng” do TS. Đỗ Thị Tuyên làm chủ
nhiệm với các mục tiêu: (1) Tối ƣu đƣợc môi trƣờng lên men thu nhận hoạt chất
acarbose từ Actinoplanes sp. KCTC 9161 đạt năng xuất cao; (2) Nâng cao khả năng
sản xuất hoạt chất acarbose bằng phƣơng pháp gây đột biến; (3) Xây dựng đƣợc quy
trình tách chiết, tinh sạch acarbose.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về acarbose
Acarbose là một pseudo-oligosacharide có tên hóa học O{4,6-dideoxy-4[1S(1,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethyl-2-cyclohexen-1-yl]-amino-α-D-glucopyranosyl}-(1→4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-D-glucopyranose. Acarbose có
cấu trúc lõi acarviosyl gồm một nửa valienamine liên kết với 4-amino-4,6dideoxyglucose qua liên kết N-glycosidic (Hình 1.1). Acarviosyl liên kết với phân
tử maltose qua liên kết α-1,4 tạo nên phân tử acarbose hoàn chỉnh (Truscheit, et al.,
1981, Wehmeier, 2003). Acarbose thành phẩm có dạng bột màu trắng, trọng lƣợng
phân tử 645,6, có thể hòa tan trong nƣớc, trong ethanol, methanol, có pKa 5,1 và
công thức phân tử C25H43NO18.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của acarbose

1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose
Acarbose là một chất ức chế cạnh tranh. Khả năng ức chế cạnh tranh của
acarbose có đƣợc là nhờ vào cấu tạo phân tử của nó. Acarbose có cấu trúc và kích

thƣớc gần giống với một tetrasachacride: gồm có bốn tiểu phần nhỏ cấu tạo nên.
Bốn tiểu phần này nối với nhau bằng liên kết α-1,4 giống nhƣ trong phân tử đƣờng.
Do đó, acarbose có thể liên kết dễ dàng với α-glucosidase, cạnh tranh vị trí liên kết
với các oligosaccharide (Hình 1.2).

3


Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose trong ruột non
(Bischoff, 1994)

Khi ăn, tinh bột bị α-amylase thủy phân thành các oligosaccharide; ở màng ruột
non, α-glucosidase tiếp tục thủy phân oligosaccharide, trisaccharide và disaccharide
thành glucose và các monosaccharide khác. Acarbose liên kết trực tiếp với αglucosidase ở bề mặt niêm mạc ruột non, những liên kết trên có thể kéo dài từ 4-6
giờ, khi đó α-glucosidase không thể liên kết để thủy phân oligosaccharide thành
glucose. Do đó bệnh nhân tiểu đƣờng tránh đƣợc hiện tƣợng tăng đƣờng huyết sau
khi ăn. Acarbose không có hoạt tính ức chế lactase và do đó không gây ra hiện
tƣợng không dung nạp lactose trong cơ thể (Công báo số 119, Bộ Y tế, 2012).
Hấp thu acarbose: sau khi uống phần lớn acarbose lƣu lại trong ống tiêu hóa để
đƣợc các enzyme tiêu hóa và chủ yếu là vi khuẩn đƣờng ruột chuyển hóa để
acarbose phát huy tác dụng dƣợc lý. Dƣới 2% liều uống đƣợc hấp thụ dƣới dạng
thuốc có hoạt tính, trong khi đó khoảng 35% liều uống đƣợc hấp thu chậm dƣới
dạng chất chuyển hóa đƣợc tạo thành trong đƣờng tiêu hóa. Nồng độ đỉnh acarbose
trong huyết tƣơng khoảng 1 giờ sau khi uống. Nồng độ đỉnh các chất chuyển hóa
trong huyết tƣơng từ 14-24 giờ sau khi uống.
Chuyển hóa acarbose: acarbose đƣợc chuyển hóa hoàn toàn ở đƣờng tiêu hóa,
chủ yếu do vi khuẩn chí đƣờng ruột và một lƣợng ít hơn do enzyme tiêu hóa.

4

Đào thải: acarbose hoạt tính đƣợc sử dụng trong huyết tƣơng khoảng 2 giờ,
không có hiện tƣợng tích lũy khi uống 3 lần mỗi ngày. 51% liều uống đƣợc đào thải
qua phân dƣới dạng acarbose không hấp thu trong vòng 96 giờ. Khoảng 34% liều
uống đào thải qua thận dƣới dạng chất chuyển hóa hấp thu. Dƣới 2% liều uống đào
thải qua nƣớc tiểu dƣới dạng acarbose và chất chuyển hóa hoạt động (Công báo số
119, Bộ Y tế, 2012).
1.3. Vai trò của acarbose
1.3.1. Vai trò của acarbose đối với bệnh đái tháo đường
Bệnh đái tháo đƣờng (ĐTĐ) là một nhóm các bệnh chuyển hóa đƣợc đặc trƣng
bởi tăng đƣờng máu mãn tính do hậu quả của sự thiếu hụt hoặc giảm hoạt động của
insulin hoặc cả hai trong cơ thể ngƣời bệnh. Trên thế giới, hàng năm căn bệnh ĐTĐ
tiêu tốn hơn 132 tỷ USD. Ƣớc tính năm 2010, có trên 221 triệu ngƣời mắc bệnh
ĐTĐ, năm 2025 sẽ lên tới trên 400 triệu ngƣời bệnh.
Trong đái tháo đƣờng, ĐTĐ type 2 là dạng ĐTĐ thƣờng gặp nhất. Thông
thƣờng, với bệnh ĐTĐ type 2, trong cơ thể vẫn còn sản xuất insulin, nhƣng các tế
bào không thể sử dụng nó. Điều này đƣợc gọi là đề kháng insulin. Theo thời gian,
đƣờng huyết sẽ tăng cao trong máu. Béo phì và ít vận động sẽ làm tăng nguy cơ
phát triển bệnh ĐTĐ type 2 (Công Sơn, Thế Ân, 2013).
Các loại thuốc dùng trong điều trị bệnh ĐTĐ type 2: Các dẫn xuất của
sulfonylurea (glibenclamid, glipizid, gliclazid), có tác dụng hạ đƣờng huyết do ngăn
cản tế bào tuyến tụy tạo ra glucagon, kích thích tế bào beta ở tụy tiết ra insulin. Các
loại thuốc hạ đƣờng máu đang đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ĐTĐ gồm: Nhóm
thuốc cải thiện sự nhạy cảm của insulin (glitazon, benfluorex) làm hạ đƣờng huyết,
nhờ làm giảm đề kháng insulin, có tác dụng điều hòa chuyển hóa lipid. Thuốc chữa
bệnh ĐTĐ có nguồn từ thực vật chuyển gene, insulin “thực vật”. Gene tổng hợp
insulin đƣợc cấy vào cây hoa rum để tổng hợp insulin; thuốc chữa bệnh ĐTĐ có
nguồn gốc từ thảo mộc, chế phẩm dikamo đƣợc phối chế từ cao quả mƣớp đắng và
cao quả nhàu dùng trong điều trị bệnh ĐTĐ type 2. Quả mƣớp đắng (Monordica

5


charantia) chứa charantin có hoạt tính ức chế α-glucosidase, hợp chất monordicosid
làm giảm đƣờng huyết, có hoạt tính nhƣ insulin (Phạm Hữu Điển, 2003). Quả nhàu
(Morinda citrifolia) làm tăng cƣờng miễn dịch, hỗ trợ việc trị bệnh ĐTĐ type 2 (Vũ
Ngọc Lộ, 2005). Cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre) có hoạt chất chính là
gymnemic acid làm tăng tiết, tăng cƣờng hoạt lực của insulin tuyến tụy, ức chế hấp
thu glucose ở ruột, giảm cholesterol và lipid máu, làm dƣợc liệu quý cho ngƣời
bệnh ĐTĐ ở Ấn Độ, Trung Quốc, Mỹ, Nhật, Singapore từ lâu (Trần Văn Ơn, et al.,
2008). Ngoài ra cây é tía (Ocimum tenuiflorum), dừa cạn (Catharanthus roseus),
hoài sơn (Dioscorea persimilis) dùng để điều chế hoạt chất metformin chữa bệnh
ĐTĐ (Vũ Ngọc Lộ, 2005); nhóm thuốc ức chế men α-glucosidase dùng điều trị
ĐTĐ type 2: acarbose, miglitol, voglibose, có thể dùng một mình hoặc kết hợp với
insulin hoặc các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ khác.
Acarbose là một oligosaccharide phức tạp có tác dụng ức chế việc tiêu hóa
carbohydrate, kìm hãm sự gia tăng nồng độ đƣờng trong máu sau bữa ăn. Acarbose
làm giảm mức độ glycosyl hóa hemoglobin ở bệnh nhân ĐTĐ type 2. Hệ thống phi
enzyme protein-đƣờng nhƣ đƣợc phản ánh theo mức độ đƣờng huyết, làm chức
năng duy trì nồng độ đƣờng huyết trung bình trong cơ thể. Vì vậy, acarbose có thể
kiểm soát hàm lƣợng đƣờng trong máu của bệnh nhân sau khi ăn.
Acarbose là chất ức chế enzyme α-glucosidase trong ruột, làm chậm tiêu hóa
và hấp thu carbohydrate. Kết quả là glucose máu tăng chậm hơn sau ăn, giảm
nguy cơ tăng glucose máu và nồng độ glucose máu ban ngày ít dao động hơn . Do
đó, acarbose đã đƣợc sử dụng là thuốc điều trị ĐTĐ type 2 với ƣu điểm không làm

tăng insulin huyết, không gây đề kháng insulin, bảo tồn tế bào beta, giảm nồng độ
HbA1c, triglyceride và giảm các biến chứng do tiểu đƣờng. Acarbose không có hoạt
tính ức chế chống lại lactase và do đó sẽ không gây ra hiện tƣợng không dung nạp
lactose trong cơ thể. Ngoài ra, acarbose có thời gian bán hủy tƣơng đối lâu, khoảng

từ 6-8 giờ và đƣợc chuyển hóa hoàn toàn trong ruột ngƣời. Các sản phẩm chuyển
hóa chủ yếu là dẫn xuất của 4-methylpyrogallol không độc. Một phần nhỏ đƣợc hấp
thụ vào máu sẽ đƣợc bài tiết qua đƣờng nƣớc tiểu (Lê Văn Chi, 2004).

6


Hiện nay, acarbose đƣợc nhiều công ty dƣợc phẩm sản xuất và bán ở 110 nƣớc
trên thế giới với nhiều tên thƣơng mại khác nhau nhƣ: glucobay® (Châu Âu và
Trung Quốc), precose® (Mỹ), glucor® (Pháp) và prandase® (Canada). Ở nƣớc ta
Công ty Cổ phần Dƣợc Hậu Giang sản xuất viên nén có tên thƣơng mại glumeca,
glucobay với hàm lƣợng 100 mg acarbose.
Thuốc acarbose đƣợc dùng đơn hoặc có thể kết hợp với các thuốc trị liệu khác
nhƣ sulfonylurea, metformin hoặc insulin để điều trị bệnh ĐTĐ type 2. Khi dùng
liệu pháp một thuốc, acarbose làm giảm nồng độ trung bình của hemoglobin
glycosylate (0,6 đến 1%), giảm hemoglobin glycosylate tƣơng quan với giảm nguy
cơ biến chứng vi mạch ở ngƣời đái tháo đƣờng. Trái với thuốc đái tháo đƣờng
sulfonylurea, acarbose không làm tăng tiết insulin. Acarbose cũng không gây giảm
glucose máu lúc đói khi dùng đơn trị liệu ở ngƣời. Khi dùng điều trị phối hợp với
thuốc sulfonylurea chúng sẽ có tác dụng cộng hợp do cơ chế tác dụng của hai loại
thuốc này khác nhau. Do đó, acarbose không gây tăng cân và cũng không làm giảm
tác dụng hƣớng đến insulin của sulfonylurea.
Hiệu quả điều trị ĐTĐ type 2 bằng acarbose đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu:
Mori và cs (2011) đã đánh giá ảnh hƣởng của acarbose đến sự biến động glucose ở
bệnh nhân ĐTĐ type 2 bằng cách giám sát glucose liên tục (continuous glucose
monitoring, CGM). CGM đƣợc thực hiện trong 4 ngày, với hàm lƣợng 300 mg
acarbose/ngày. Tổng cộng 10 bệnh nhân (5 nam và 5 nữ), với độ tuổi trung bình
63,1±12,1 tuổi, chỉ số khối cơ thể 22,6±5,4 kg/m và glycohemoglobin là 9,9±1,9%.
Trong thời gian điều trị với acarbose, ba giá trị trung bình (hàm lƣợng glucose trong
máu, SD của glucose máu, biên độ đƣờng huyết giao động bất thƣờng) đều giảm

đáng kể sau 24 giờ ở nhóm bệnh nhân điều trị so với nhóm không điều trị. Nhƣ vậy
acarbose đã làm giảm đƣờng huyết dao động quá mức ở ngƣời (Mori, et al., 2011).
Tsujino và cs (2011) đã so sánh sự biến đổi glucose ở 10 bệnh nhân ĐTĐ type 2
đƣợc điều trị với miglitol và acarbose qua giám sát glucose liên tục (CGM) trong 4
ngày nhập viện. Bệnh nhân đƣợc uống 50 mg miglitol hoặc 100 mg acarbose trƣớc

7


mỗi bữa ăn trong ngày thứ 2 và ngƣợc lại vào ngày thứ 3, theo một thử nghiệm
ngẫu nhiên. Các bệnh nhân đã có ba bữa ăn thử nghiệm giống hệt nhau vào ngày
thứ 2 và thứ 3. Các số liệu CGM đã đƣợc so sánh cho từng thông số biến đổi đƣờng
huyết sau mỗi bữa ăn. Điều trị miglitol hoặc acarbose không có sự khác biệt nào
đáng kể liên quan đến việc tăng nồng độ đƣờng từ mức cơ bản đến mức cao, thời
điểm lƣợng đƣờng tăng cao nhất là 3 giờ sau ăn (Tsujino, et al., 2011).
1.3.2. Nghiên cứu về các tác dụng khác của acarbose
Bên cạnh việc ứng dụng trong điều trị bệnh ĐTĐ type 2 acarbose còn đƣợc thử
nghiệm để sản xuất nhiều loại thuốc phòng và chữa bệnh khác nhƣ: bệnh béo phì,
tăng mỡ máu, viêm dạ dày, loét tá tràng, bệnh mục xƣơng ở ngƣời hoặc dùng trong
chăn nuôi để tăng tỷ lệ thịt và mỡ trong động vật nuôi (Frommer, et al., 1975)
Acarbose có tác dụng làm giảm nguy cơ tim mạch. Một số nghiên cứu dịch tễ
học đã chỉ ra rằng tăng đƣờng huyết sau ăn có liên quan đến tăng nguy cơ mắc bệnh
tim mạch. Các nghiên cứu này đã so sánh hiệu quả điều trị bằng acarbose và
glimepiride đối với hàm lƣợng lipoprotein trong huyết thanh ở 37 bệnh nhân ĐTĐ
type 2 mới đƣợc chẩn đoán. Các bệnh nhân đƣợc chỉ định ngẫu nhiên để điều trị
trong 12 tuần chia thành 3 nhóm: với acarbose, glimepiride, đối chứng ăn uống bình
thƣờng. Kết quả cho thấy việc điều trị bằng acarbose đã làm giảm nguy cơ tim mạch
(Hayashim, 2008).
Blanch và cs (2010) đã đánh giá khả năng ức chế của acarbose đến hoạt tính của
-amylase và -glucosidase trong hỗn hợp lên men ở dạ cỏ đến sự trao đổi chất

trong máu và đến hệ vi khuẩn trong dạ cỏ bò sữa Holstein (với chế độ ăn 0,75 g
acarbose mỗi ngày). Kết quả cho thấy, việc bổ sung chế độ ăn uống chứa acarbose
trong nuôi bò sữa cao sản xuất khẩu có hiệu quả hơn nhƣ: giảm thời gian mà pH dạ
cỏ đạt tối ƣu, không có tác động tiêu cực đến quá trình lên men ở dạ cỏ và chuyển
hóa máu (Blanch, et al., 2010).

8


1.4. Vai trò Actinoplanes trong sinh tổng hợp acarbose
1.4.1. Đại cương về Actinoplanes
Chi Actinoplanes đƣợc công bố đầu tiên bởi Couch năm 1950 với loài chuẩn là
Actinoplanes philippinensis (Couch, 1950). Chúng sống chủ yếu trong đất và trong
nƣớc, phát triển dƣới dạng sợi, phân nhánh, không đứt đoạn, gram dƣơng, rất ít sợi
khí sinh hoặc không có, tạo nhiều loại sắc tố có khả năng khuếch tán. Bào tử chứa
trong túi bào tử, sinh trên cuống bào tử hoặc không có, rất ít khi trong thạch. Bào tử
hình cầu hoặc que ngắn, sắp xếp theo nhiều cách khác nhau bên trong túi bào tử,
bào tử có thể di động khi túi bào tử nứt ra (Nguyễn Lân Dũng, 2006). Thành tế bào
có

chứa

meso-2,6-diaminopimelic

acid,

LL-2,6-diaminopimelic

acid,

hydroxydiaminopimelic acid và glycine (Lechevalier H, Lechevalier M, 1970).
Thành phần đƣờng có chứa D-xylose và L-arabinose. Thành phần phospholipid
chính là phosphatidylethanolamin. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 72-73%
(Schwientek, et al., 2012). Actinoplanes là những sinh vật hiếu khí, hóa dị dƣỡng,
ƣa ẩm, ƣa nhiệt vừa phải, phát triển trong điều kiện 15 đến 37oC, thích hợp từ 2528oC. Chúng ăn các sinh vật hoại sinh, hạt phấn và các vật liệu sinh học chứa chitin,
sử dụng tốt các thành phần trong tế bào thực vật nhƣ xylose và arabinose. Chúng
sống thành các tập đoàn và có hình dạng xác định, ở giữa phồng lên phát triển bào
tử nang. Tập đoàn có màu cam hoặc vàng tùy thuộc vào thành phần chất màu trong
nguyên sinh chất của tế bào (Parenti, Coronelli, 1979).
Actinoplanes có vai trò quan trọng trong công nghiệp và dƣợc phẩm nhƣ sản
xuất kháng sinh, amino acid, bổ sung vào thực phẩm và làm thuốc chữa bệnh...
(Ventura, et al., 2007). Tính đến tháng 10 năm 2011 có tới 11% các dự án về
genome liên quan đến Actinomycetes mà chủ yếu liên quan đến chi Actinoplanes.
Đã phân lập đƣợc hơn 200 loài xạ khuẩn hiếm trong đó có hơn 45 loài có vai trò
quan trọng, có hơn 120 loại kháng sinh đã đƣợc công bố sản xuất từ các loài này với
thành phần là peptide và depsipeptide, đặc biệt là glycopeptide teicoplanin đƣợc sản
xuất bởi A. teichomyceticus điều trị bệnh nhiễm trùng gây ra bởi các vi khuẩn gram

9


dƣơng đặc biệt là Staphylococcus aureus (Jung, et al., 2009). Sản xuất nhiều loại
kháng sinh đƣợc quan tâm khác nhƣ lipiarmicyn từ A. deccanensis (Parenti, et al.,
1975), ramoplanin từ Actinoplanes sp. ATCC 33076 (Cavalleri, et al., 1884).
1.4.2. Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 còn gọi là chủng Actinoplanes sp.
SE50/110 (ATCC 31043, CBS 67473) đƣợc phân lập năm 1969 trên vùng đất trồng
cà phê ở Kenya, châu Phi (Schwientek, 2012).
Vị trí phân loại theo khóa phân loại của Bergey, xạ khuẩn Actinoplanes sp.
KCTC 9161 thuộc :

Giới: Bacteria
Ngành: Actinobacteria
Lớp: Actinobacteria
Bộ: Actinomycetales
Họ: Micromonosporaceae
Chi: Actinoplanes
Loài: Actinoplanes sp.
Đặc điểm hình thái: Actinoplanes sp. KCTC 9161 gram dƣơng có cấu tạo dạng
sợi, các sợi liên kết chặt chẽ với nhau tạo thành các khuẩn lạc riêng rẽ, màu vàng
cam, ở giữa khuẩn lạc phồng lên phát triển các túi bào tử chứa nhiều bào tử. Bào tử
có thể di động. Toàn bộ hệ sợi của xạ khuẩn chỉ là một tế bào có nhiều nhân, không
có vách ngăn ngang, nhân đơn giản, không có màng nhân (Nguyễn Lân Dũng,
2006). Thành tế bào có chứa meso-2,6-diaminopimelic acid,

LL-2,6-diaminopimelic

acid, hydroxydiaminopimelic acid và glycine, tỷ lệ GC trong ADN là 71,32%.
Xạ khuẩn sinh sản sinh dƣỡng bằng bào tử, phát triển mạnh trong điều kiện 2528oC, phát triển dƣới dạng sợi, phân nhánh, ƣa ẩm.
Đặc điểm nuôi cấy: Điều kiện phát triển nuôi cấy là môi trƣờng hiếu khí, nhiệt
độ nuôi cấy tối ƣu là 25oC, pH thích hợp trong nuôi cấy với pH 6-8. Trên môi
trƣờng thạch đĩa, khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 có dạng hình tròn,

10


bề mặt nhẵn, có tâm phồng lên, phát triển chậm. Khuẩn lạc có màu cam đƣờng kính
1-2 mm. Sau 7-10 ngày bề mặt nhăn lan rộng (Hình 1.3). Trên môi trƣờng thạch
nghiêng, chủng mọc dày tạo thành vệt, màu cam đậm, rìa gợn sóng. Trên môi
trƣờng lỏng, chủng phát triển tốt, hình thành các hạt pellet hình tròn, không tan khi
lắc lên, màu vàng cam, một số sắc tố màu cam tiết ra môi trƣờng tạo môi trƣờng có

màu cam.

Hình 1.3. Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161

1.4.3. Ứng dụng Actinoplanes trong sản xuất acarbose
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các chủng Actinoplanes có vai trò quan trọng trong
việc sản xuất hoạt chất acarbose với hoạt tính ức chế α-glucosidase. Dịch nuôi cấy
chủng Actinoplanes sp. SE50 đã đƣợc công ty Bayer AG thử nghiệm với hoạt tính ức
chế amylase, maltase và saccharase trong ruột chuột (Frommer, et al., 1975). Năm
1977 Schmidet và cs đã tìm thấy hỗn hợp oligosaccharide trong dịch lên men trong
đó có acarbose có hiệu lực ức chế α-glucosidase (Schmidet, et al., 1997). Sau này một
chủng tự nhiên Actinoplanes sp. SE50 khác đƣợc phân lập gọi là Actinoplanes sp.
SE50/110 (Actinoplanes sp. KCTC 9161) đã sản xuất acarbose lên tới 1 g/l và từ đó
chủng này đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu về gene sinh tổng hợp
acarbose, chức năng mã hóa enzyme của nó (Klein, et al., 2013, Schwientek, 2012).

11


Cụm gene (acb) sinh tổng hợp acarbose trong Actinoplanes sp. SE50/110 đã
đƣợc xác định trình tự gồm 41323 bp có mã số Y18523.4 trên GenBank (Hemker, et
al., 2001, Schwientek, et al., 2012).
Các nghiên cứu khác cũng đã phân lập đƣợc nhiều chủng Actinoplanes có khả
năng sản xuất acarbose đạt năng xuất cao nhƣ Actinoplanes sp. CKD485-16 đạt 2,3
g/l (Choi, Shin, 2003); Actinoplanes sp. A56 đạt 1,043 g/l (Wei, et al., 2010); A.
utahensis ZJB-08196 đạt 4,210 g/l (Wang, et al., 2011) ; Actinoplanes sp. A56 đạt
5,0 g/l (Li, et al., 2012); A. utahensis ZJB-08196 đạt 6,113 g/l (Sun, et al.,2012) ; A.
utahensis ZJB-08196 đạt 6,606 g/l (Xue, et al., 2013).
1.5. Nghiên cứu hoạt chất acarbose trên thế giới
1.5.1. Nghiên cứu về sản xuất acarbose

Acarbose đƣợc phát hiện đầu tiên trong hỗn hợp các oligosaccharide từ dịch lên
men chủng Actinoplanes sp. SE50 với hoạt tính ức chế α-glucosidase (Schmidet, et
al., 1997). Năm 1979, Frommer và cs lên men chủng Actinoplanes sp. SE50/110 đạt
năng suất lên tới 1 g/l (Frommer, et al., 1979). Nhiều nghiên cứu về nâng cao năng
suất sinh tổng hợp acarbose từ Actinoplanes đã đƣợc công bố chủ yếu về tối ƣu các
điều kiện lên men, tối ƣu các thành phần môi trƣờng, lên men bổ sung thêm một số
chất kích thích và sử dụng các chủng đột biến.
Choi và Shin (2003) đã nuôi lên men chủng Actinoplanes sp. CKD485-16 (một
dòng đột biến của chủng Actinoplanes sp. SE50/110) với năng suất đạt 2,3 g/l
acarbose và 0,6 g/l thành phần C sau khi kết thúc lên men. Thành phần môi trƣờng
lên men gồm (%): 3 glucose; 14 maltose; 4 bột đậu tƣơng; 0,7 cao nấm men; 0,3
NZ-amin; 0,3 CaCO3; 0,06 K2HPO4; nuôi lên men 192 giờ, 200 vòng/phút, 28oC.
Theo tác giả, maltose, bán phân tử của acarbose cần đƣợc duy trì ở nồng độ cao
trong môi trƣờng trong suốt quá trình lên men để sinh tổng hợp acarbose có hiệu
quả. Trong quá trình lên men, thành phần C cũng đƣợc sinh ra do sự chuyển hóa của
acarbose trong pha nghỉ của tế bào. Việc ức chế sự chuyển hóa từ acarbose cũng đã
đƣợc nghiên cứu để giảm bớt thành phần C, tăng hàm lƣợng acarbose.

12


Valinenamine ở nồng độ 10 mM ức chế mạnh (giảm hơn 90%) việc chuyển hóa
sang thành phần C (Choi, Shin, 2003). Việc thêm Valienamine vào môi trƣờng để
giảm bớt sự chuyển hóa acarbose sang thành phần C cũng đã đƣợc Xue và cs (2013)
nghiên cứu. Theo kết quả nghiên cứu, việc thêm 20 mg/l valienamine trong quá
trình lên men đã tăng hàm lƣợng acarbose từ 3560 mg/l lên 4950 mg/l và giảm
thành phần C từ 289 mg/l xuống còn 107 mg/l (Xue, et al., 2013).
Để nâng cao năng suất sinh tổng hợp acarbose, Wei và cs (2010) đã tối ƣu môi
trƣờng lên men cho chủng Actinoplanes sp. A56 sinh tổng hợp acarbose. Thực hiện
phƣơng pháp tối ƣu toán học để nghiên cứu ảnh hƣởng của glucose, maltose, dịch

chiết ngô, bột đậu tƣơng và monosodium glutamate đến sinh tổng hợp acarbose. Kết
quả cho thấy maltose và dịch chiết ngô ảnh hƣởng đến năng suất sinh tổng hợp
acarbose. Hàm lƣợng acarbose tăng từ 837 đến 1043 mg/l khi tăng từ 30 g/l lên
61,25 g/l maltose và 10 g/l lên 17,5 g/l dịch chiết ngô (Wei, et al., 2010).
Kết quả tối ƣu cho thấy, maltose có tác động rõ rệt đến sinh tổng hợp acarbose từ
chủng Actinoplanes sp. A56, nồng độ maltose trong dịch nuôi cấy đóng vai trò quan
trọng trong việc sản xuất acarbose. Nồng độ maltose trong môi trƣờng tối ƣu tăng từ
30 lên 61,25 g/l. Điều này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Choi và Shin
(2003) nhận đƣợc, maltose cần duy trì ở nồng độ cao trong suốt quá trình lên men
để tạo ra năng suất acarbose cao (Choi, Shin, 2003).
Kết quả tối ƣu của Wei và cs (2010) cũng cho thấy dịch chiết ngô là một yếu tố
quan trọng để sản xuất acarbose. Dịch chiết ngô là nguồn nitrogen quan trọng và rẻ
tiền để sản xuất acarbose ở quy mô công nghiệp bởi Actinoplanes sp. A56. Nồng độ
dịch chiết ngô khi tối ƣu đã tăng từ 10 lên 17,5 g/l. Dịch chiết ngô là nguồn nitrogen
quan trọng đối với nhiều vi sinh vật (Shah, Cheryan, 1995, Silveira, et al., 2001).
Do đó, dịch chiết ngô đƣợc sử dụng rộng rãi và thành công làm môi trƣờng giá thấp
trong nhiều quá trình lên men nhƣ: sản xuất kháng sinh, dung môi và enzyme.
Môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose cao từ Actinoplanes sp. A56 của
Wei và cs gồm (g/l): 30 glucose; 61,25 maltose; 17,5 dịch chiết ngô; 20 bột đậu

13


tƣơng; 1,0 monosodium glutamate; 2,0 CaCl2; 0,5 FeCl3; 2,5 CaCO3; 1,0 K2HPO4;
nuôi lên men 144 giờ, 180 vòng/phút, 28oC. Năng suất sinh tổng hợp acarbose đạt
1043 mg/l tăng 24,61% so với trƣớc khi tối ƣu (Wei, et al., 2010).
Wang và cs (2011) đã tối ƣu môi trƣờng sinh tổng hợp acarbose của chủng A.
utahensis ZJB-08196 (là một dòng đột biến từ chủng Actinoplanes sp. ZJB005). Kết
quả tối ƣu cho thấy, maltose, glycerol và monosodium glutamate trong môi trƣờng
làm tăng khả năng sinh tổng hợp acarbose. Bột ngô có vai trò cao trong sự sinh

trƣởng của chủng nhƣng cho sản lƣợng acarbose vừa phải, ngƣợc lại bột đậu tƣơng
tăng cƣờng sản xuất acarbose và là nguồn dinh dƣỡng có giá trị. Monosodium
glutamate là nguồn nitrogen đầu tiên trong liên kết N-glycosidic của acarbose (Lee,
Egelkrout, 1998), nồng độ monosodium glutamate tăng lên 5 g/l cho năng suất sinh
tổng hợp acarbose cao nhất đạt 3892 mg/l. Nồng độ 50 g/l maltose và 30 g/l glucose
thích hợp cho sản xuất acarbose từ chủng A. utahensis ZJB-08196. Glucose kích
thích sự tăng trƣởng của chủng. Maltose nâng cao năng suất sinh acarbose, maltose
là phân tử tiền thân kết hợp trực tiếp với acarviose tạo nên phân tử acarbose (Lee, et
al., 1997). Glycerol cũng ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp acarbose, glycerol ảnh
hƣởng trực tiếp đến áp suất thẩm thấu trong môi trƣờng, áp suất thẩm thấu sẽ ảnh
hƣởng trực tiếp đến hoạt động của tế bào do đó sẽ ảnh hƣởng đến quá trình sinh
tổng hợp ra các hợp chất khác nhau trong quá trình lên men. Nồng độ glycerol tại 5
g/l cho áp suất thẩm thấu môi trƣờng là 591 mOsm/kg sinh lƣợng acarbose cao nhất
đạt 4288 mg/l. Tăng áp suất thẩm thấu môi trƣờng sẽ giúp đẩy mạnh sự chuyển dịch
của phân tử maltose dẫn đến tăng năng suất acarbose (Wang, et al., 2011). Điều này
cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Choi và Shin nhận đƣợc, hàm lƣợng
acarbose tỷ lệ thuận với áp suất thẩm thấu của môi trƣờng nuôi cấy và hàm lƣợng
acarbose đạt cao nhất tại 500 mOsm/kg (Choi, Shin, 2003).
Bên cạnh việc tối ƣu nguồn carbon, nguồn nitrogen và áp suất thẩm thấu trong
môi trƣờng Wang và cs còn tối ƣu một số thông số kỹ thuật nhƣ: pH môi trƣờng, tốc
độ lắc, nhiệt độ và nguồn giống, môi trƣờng đạt kết quả tối ƣu nhất cho sinh tổng

14


hợp acarbose từ chủng A. utahensis ZJB-08196 là pH 7,0; 180 vòng/phút; 27oC; 168
giờ lên men và giống đƣợc tiếp sau 60 giờ nhân giống (Wang, et al., 2011).
Wang và cs (2012) đã thành công trong nghiên cứu sự cần thiết của áp suất thẩm
thấu của môi trƣờng lên men đối với quá trình sinh tổng hợp acarbose từ chủng A.
utahensis ZJB-08196. Theo đó, môi trƣờng nuôi cấy đƣợc bổ sung cơ chất liên tục

trong quá trình lên men. Cơ chất bổ sung bao gồm (g/l): 14 maltose, 6 glucose và 9
bột đậu tƣơng, đƣợc bổ sung sau mỗi 48, 72, 96 và 120 giờ. Kết quả làm tăng khả
năng sinh tổng hợp acarbose lên 4878 mg/l, tăng 15,9% so với phƣơng pháp nuôi
cấy kiểu cũ (Wang, et al., 2012b).
Li và cs (2012) đã nuôi lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes
sp. A56 theo phƣơng pháp bổ sung cơ chất. Thành phần môi trƣờng ban đầu gồm
(g/l): 30 tinh bột, 50 glucose, 10 bột ngô, 20 bột đậu tƣơng, 1,0 monosodium
glutamate, 0,5 FeCl3, 1,0 K2HPO4, 2,0 CaCO3, pH 7,2-7,4, sau 72 giờ bổ sung 300 g
maltose và 100 g glucose, nuôi ở 28oC, 200 vòng/phút, 168 giờ. Kết quả hàm lƣợng
acarbose đạt 5000 mg/l (Li, et al., 2012).
Bên cạnh việc tối ƣu các thành phần cơ bản và các thông số trong quá trình lên
men sinh tổng hợp acarbose. Nhằm nâng cao năng suất sinh tổng hợp acarbose,
nhiều tác giả cũng đã nghiên cứu bổ sung thêm các chất cảm ứng để tăng khả năng
sinh tổng hợp sinh acarbose trong quá trình lên men.
Sun và cs (2012) công bố mô hình lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng A.
utahensis ZJB-08196 với năng suất 6113 mg/l acarbose thông qua quá trình tối ƣu
nguồn glucose, maltose có bổ sung thêm S-adenosylmethionine (SAM). SAM có
chức năng nhƣ một cofactor cung cấp methyl cho phản ứng methyl hóa và nó nhƣ
một phân tử tín hiệu làm tăng sự dịch chuyển của gen theo một hƣớng nhất định,
đặc biệt việc thêm SAM ngoại sinh có thể làm tăng sản xuất vật chất thứ cấp trong
Actinomycetes (Huh, et al., 2004). Việc thêm SAM vào môi trƣờng sẽ tăng năng
suất acarbose. Glucose cần thiết cho sự phát triển xạ khuẩn nhƣng trong giai đoạn
đầu của quá trình lên men nồng độ glucose thấp sẽ tăng cƣờng sản xuất acarbose.

15


Tuy nhiên việc thiếu hụt glucose sẽ gây ra sự giảm maltose trong giai đoạn sau, do
đó làm giảm năng suất acarbose. Việc bổ sung thêm nguồn glucose trong suốt quá
trình lên men sẽ cho hiệu quả tốt nhất. Maltose ở nồng độ cao thuận lợi cho sản xuất

acarbose nhất là trong giai đoạn cuối của quá trình lên men. Quá trình lên men giai
đoạn đầu có 10 g/l glucose và 60 g/l maltose bổ sung thêm 100 μmol/l SAM sau 12
giờ, 8 g/l glucose sau mỗi 24 giờ và 20 g/l maltose sau 96 giờ cho năng suất 6,113
mg/l acarbose sau 192 giờ (Sun, et al., 2012).
Xue và cs (2013) cũng tăng cƣờng sản xuất acarbose và giảm bớt sự tạo thành
hợp chất C từ chủng đột biến A. utahensis ZJB-08196 bằng việc bổ sung thêm
validamine trong quá trình lên men. Kết quả cho thấy, quá trình lên men có bổ sung
20 mg/l validamine ngay từ đầu và bổ sung thêm 5 ml hỗn hợp gồm (g/l) : 6
glucose, 14 maltose và 9 bột đậu tƣơng, sau 72 và 96 giờ, đạt năng suất 6606 mg/l
acarbose và 212 mg/l thành phần C sau 168 giờ (Xue, et al., 2013). Validamine là
một chất ức chế glucosyltransferase. Nó ngăn cản sự biến đổi liên kết α,α-1,4 trong
nửa maltose của acarbose thành liên kết α,α-1,1 trong nửa trehalose của hợp chất C,
do đó làm giảm sự tạo thành hợp chất C. Theo một cách khác, validamine nhƣ một
chất hoạt hóa theo hƣớng tạo thành acarbose (Mahmud, 2003).
1.5.2. Nghiên cứu về ứng dụng đột biến trên vi sinh vật
Để nâng cao tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật, nhiều
phƣơng pháp gây đột biến đã đƣợc sử dụng nhằm tác động vào vật chất di truyền
làm thay đổi các đặc tính sinh học của vi sinh vật, đặc biệt là gây đột biến trên
Actinoplanes để nâng cao khả năng sinh tổng hợp acarbose.
Lee và cs (2008) đã nghiên cứu 3 cụm gene Tre X-Y-Z, TpS1 và TreS sinh tổng
hợp trehalose từ chủng Actinoplanes sp. SN223/29, đã xác định đƣợc 5 gene sinh
tổng hợp trehalose. Chúng đƣợc nhân dòng và biểu hiện trong E.coli BL21 sử dụng
vector pET19b. Kết quả nghiên cứu cho thấy, gene TreY đã sản xuất thành phần C
từ acarbose bởi enzyme isomerase, nhƣng gene TreS thì không. Từ nghiên cứu này

16


cho thấy rằng khi gây đột biến gene TreY có thể tăng cƣờng sản xuất acarbose bởi
việc ngăn chặn sản xuất thành phần C (Lee, et al., 2008).

Hu và cs (2011) gây đột biến bằng tia UV trên chủng Gluconobacter oxydans
sinh tổng hợp 1,3-dihydroxyacetone (DHA). Kết quả sau khi gây đột biến năng suất
DHA đạt 209,6 g/l tăng gấp 2 lần so với chủng tự nhiên (Hu, Zheng, 2011).
Cordeno và cs (2011) đã gây đột biến bằng NTG trên chủng Chlorella
sorokiniana để lựa chọn các dòng đột biến có tốc độ sinh trƣởng và sinh tổng hợp
lutein cao. Kết quả thu đƣợc dòng đột biến MR-16 sinh tổng hợp lutein đạt 42 mg/l
cao gấp 2 lần so với chủng ban đầu (Cordero, et al., 2011).
Beenken và cs (2012) sử dụng phƣơng pháp gây đột biến bằng sinh học phân tử
để nâng cao khả năng sinh tổng hợp alginate oligosaccharide (AO) từ glucose trong
điều kiện nitrogen hạn chế trên chủng Pseudomonas mendocina theo hƣớng ngăn
chặn con đƣờng sinh tổng hợp polyhydroxyalkanoate (PHA). 57% trình tự operon
của gene PHA bị loại bỏ bởi plasmid tự hủy pEX18TcC1ZC2Amp. Chủng đột biến
đƣợc nuôi lên men cho năng suất AO cao gấp 2,64 lần so với chủng ban đầu
(Beenken, et al., 2012).
1.5.3. Các phương pháp tinh sạch và thu nhận acarbose
Trong dịch lên men sinh tổng hợp acarbose từ Actinoplanes, ngoài acarbose còn
có rất nhiều chất khác, chất nền, chất trung gian, protein, glucose, maltose và dẫn
xuất acarbose trong đó chủ yếu là maltose và glucose. Việc loại hết glucose và
maltose ra khỏi dịch lên men sẽ thu đƣợc acarbose có độ tinh sạch cao.
Whistler và Durso (1949) đã sử dụng than hoạt tính để tách glucose, maltose và
rafinose ra khỏi hỗn hợp. Than hoạt tính sẽ hấp phụ các loại đƣờng và phản hấp phụ
từng loại đƣờng theo gradient ethanol 0-15%. Glucose bị đẩy ra khỏi cột bằng nƣớc
cất, maltose thu đƣợc bằng ethanol 5% và rafinose thu đƣợc bằng ethanol 15%
(Whistler, Durso, 1949). Phƣơng pháp tinh sạch bằng than hoạt tính đơn giản, dễ
làm, chi phí thấp, loại đƣợc các chất màu và tách đƣợc từng loại đƣờng ra khỏi hỗn
hợp. Tuy nhiên, sử dụng phƣơng pháp này cần nhiều thời gian.

17

Lange và cs (1987) nghiên cứu sử dụng các hợp chất polymer để tinh sạch
acarbose. Việc sử dụng chất trao đổi cation dạng acid mạnh nhƣ lewatit TSW 40
hoặc chất trao đổi cation dowex 50 WX4 dùng nƣớc để đẩy các chất không hấp thụ
ra khỏi cột, sau đó thu acarbose bằng HCl 0,025N. Các phân đoạn chứa acarbose
đƣợc đƣa lên cột trao đổi anion lewatit MP62 và rửa bằng nƣớc để trung hòa dịch
acarbose. Kết quả thu đƣợc acarbose với độ tinh sạch đạt 89,5% (Lange,
Rauenbusch, 1987)
Rauenbusch (1990) tiếp tục tinh sạch acarbose từ dịch acarbose có độ tinh sạch
78-88% đƣợc ông và cs nghiên cứu trƣớc đó (Lange, Rauenbusch, 1987). Ông sử
dụng thêm chất trao đổi cation dạng acid yếu hydrophilic nhƣ: CM-sephadex C25,
CM-sepharose Cl 6B, carboxymethylcellulose CM52 trong khoảng pH 4,0-5,5 để
gắn kết các chất màu và các hợp chất giống đƣờng. Kết quả đã thu đƣợc acarbose
với độ tinh sạch đạt 98% hoặc hơn nữa (Rauenbush, 1990).
Keri và cs (2002) đã tinh sạch đƣợc acarbose từ dịch lên men với độ tinh sạch
lên tới 99%. Dịch lên men đƣợc acid hóa tới pH 2,0-2,2 bằng acid sulfuric và lọc
thu dịch trong, dịch trong đƣợc hấp thụ trong nhựa trao đổi anion dạng acetate hoặc
tartrate và đƣợc rửa với nƣớc. Dịch rửa tiếp tục đƣợc hấp thụ trong nhựa trao đổi
cation amberlite 252H dạng acid và rửa bằng HCl 0,02 M. Sau đó dịch rửa đƣợc
loại bỏ ion Cl- bằng nhựa trao đổi anion dạng base, cô đặc dịch thu đƣợc và kết tủa
acarbose bằng ethanol, lọc và làm khô. Các tinh thể acarbose thu đƣợc có độ tinh
sạch đạt 99% (Keri, Deak, 2002).
Hong và cs (2003) đã tinh sạch acarbose từ dịch lên men chỉ sử dụng 3 loại nhựa
trao đổi qua 3 bƣớc tinh sạch đã thu đƣợc acarbose có độ tinh sạch đạt 98%. Bƣớc
1, dịch lọc chứa acarbose (pH 5) đƣợc tinh sạch sơ bộ nhờ một trong các cột hấp thụ
lewatit EP63, amberlite XAD 1600T, diaion SP850, cột đƣợc rửa với nƣớc ở nhiệt
độ phòng và thu acarbose bằng acetone 10%. Phân đoạn chính thu đƣợc acarbose có
độ tinh sạch trên 50%. Bƣớc 2, sử dụng cột trao đổi anion amberlite IRA67, dịch
rửa chứa acarbose bƣớc 1 đƣợc đƣa lên cột và rửa bằng nƣớc cất để loại màu và

18

trung hòa dịch rửa. Bƣớc 3, sử dụng cột trao đổi cation dạng acid mạnh MFG 210,
cột đƣợc rửa với nƣớc cất ở nhiệt độ phòng và tách rửa bằng nƣớc cất pH 2,1 để loại
những hợp chất giống đƣờng, sau đó thu acarbose bằng nƣớc cất pH 2,0. Phân đoạn
chính chứa acarbose có độ tinh sạch 98,1% (Hong, et al.).
Lin và cs (2007) đã tinh sạch acarbose từ dịch lên men nhờ sử dụng sắc ký trao
đổi cation mạnh và sắc ký ái lực với enzyme gắn kết acarbose α-amyloglucosidase,
đã thu đƣợc acarbose với độ tinh sạch đạt 95%. Dịch lên men đƣợc ly tâm loại tủa,
dịch nổi cô đặc 1/10 (v/v), bổ sung thêm 9/10 ethanol sau 30 phút ly tâm loại tủa,
dịch nổi thu đƣợc cô đặc và làm khô thành dạng bột với acarbose tinh sạch khoảng
10%. Bột acarbose chƣa tinh sạch đƣợc hòa với nƣớc, điều chỉnh pH 5-9 để đƣa lên
cột. Sử dụng cột sắc ký trao đổi cation mạnh nhƣ: amberjet 1200H hoặc amberjet
1200Na đã đƣợc rửa bằng nƣớc deion đến pH ≥ 4, đƣa mẫu lên cột, để 30 phút cho
gắn kết acarbose. Sau đó, rửa cột 3 lần bằng nƣớc để loại hết những chất không gắn,
tiếp tục rửa cột bằng NaCl 1,0 N để thu chất giống đƣờng và rửa bằng dung dịch
ammonia 0,75 N để loại các tạp chất khác, cuối cùng thu acarbose bằng dung dịch
ammonia 1,5 N, với độ tinh sạch đạt 60%. Dịch thu tiếp tục đƣợc tủa với ethanol
sau đó làm khô thu đƣợc acarbose có độ tinh sạch đạt 75-80%. Acarbose tiếp tục
đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực với hạt sắc ký amberject 4400 OH có chứa
emzyme gắn kết α-amyloglucosidase. Bột acarbose tinh sạch 75-80% hòa với nƣớc,
pH 6-7 và đƣa lên cột. Rửa cột bằng nƣớc đề ion ở nhiệt độ 55-75oC và tách
acarbose bằng nƣớc cất ở 65oC. Dung dịch acarbose thu đƣợc tiếp tục đƣợc tủa
ethanol và làm khô thu đƣợc bột acarbose có độ tinh sạch đạt 95% (Lin, et al., 2007,
Lin, et al., 2005).
Rodriguez và cs (2008) đã nghiên cứu một số chất trao đổi ion để tinh sạch
acarbose từ dịch lên men đạt hiệu quả tốt nhất. Bốn loại nhựa trao đổi cation mạnh
đƣợc nghiên cứu là finex CS9GC, finex CS10GC, purolite CT151 và purolite SST6.
Dịch lên men đƣa lên cột và rửa cột bằng nƣớc để loại bỏ những chất không gắn
nhƣ maltose. Acarbose và ion Ca2+ đƣợc gắn trong cột, thu acarbose bằng acid HCl

2,25 N sau khi phần lớn ion Ca2+ đã đƣợc đẩy hết ra trƣớc. Kết quả sử dụng nhựa

19