Xây dựng phương pháp biến nạp cho bacillus subtilis 1012 và bacillus subtilis WB800N

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHẠM THỊ MỸ TIÊN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN BIẾN NẠP
CHO BACILLUS SUBTILIS 1012 VÀ BACILLUS SUBTILIS WB800N

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

TP. Hồ Chí Minh – Năm 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHẠM THỊ MỸ TIÊN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN BIẾN NẠP
CHO BACILLUS SUBTILIS 1012 VÀ BACILLUS SUBTILIS WB800N

Chuyên ngành: Vi sinh
Mã số chuyên ngành: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG

TP. Hồ Chí Minh – Năm 2015

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô khoa Sinh – Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh và các thầy cô thỉnh giảng đã tận tình
truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt 2 năm học.
Em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn chân thành đến GS. TS Trần Linh
Thước. Thầy luôn là tấm gương sáng cho em trên con đường học tập và nghiên cứu.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Phan Thị Phượng Trang và thầy
Nguyễn Đức Hoàng. Thầy cô đã tận tâm hướng dẫn, định hướng và truyền đạt cho em
những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu vô cùng quý báu, đồng thời luôn hỗ trợ em
hết mình trong quá trình học tập, nghiên cứu cũng như tạo mọi điều kiện cho em có thể
phát huy tốt năng lực của mình. Cảm ơn thầy cô vì tất cả những thành quả em đạt được
ngày hôm nay.
Em xin cảm ơn các anh chị, các em và các bạn đang học tập và làm việc tại
Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học đã luôn hỗ trợ, động viên em trong suốt
quá trình làm thí nghiệm, đồng thời chia sẻ những kinh nghiệm nghiên cứu cũng như
mọi vui buồn trong công việc. Đặc biệt là cảm ơn anh Trí Nam, chị Ngọc Phương, anh
Tuấn Anh, anh Hoài Nam, anh Lương Thắng và các bạn Tinh Tươm, Kiều Thanh, Châu
Duyên, các em Huy, Vương, Toàn, Phương, Trí, Lan, Lệ. Mọi người đã giúp đỡ em rất
nhiều trong thời gian qua. Cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học
phân tử đã luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình nghiên cứu.
Và trên hết, con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến ba mẹ và gia đình,
những người đã luôn ở bên cạnh con, luôn yêu thương và là chỗ dựa vững chắc nhất cho
con khi bước đi trên con đường mà con đã chọn.
TP. Hồ Chí Minh tháng 4 năm 2015
Phạm Thị Mỹ Tiên


Mục lục

MỤC LỤC

MỤC LỤC .........................................................................................................................i
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................vii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ .................................................................................................vii
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ix
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................................................xi
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1
TỔNG QUAN
1.1.

1.2.

Tổng quan về Bacillus subtilis ........................................................................... 3
1.1.1.

Đặc điểm chung ........................................................................................... 3

1.1.2.

Đặc điểm vách tế bào ................................................................................... 4

1.1.3.

Dinh dưỡng và sinh trưởng .......................................................................... 6

1.1.4.

Ưu điểm của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N ................................ 6

1.1.5.

Ứng dụng của B. subtilis trong sản xuất protein tái tổ hợp ......................... 7

Một số phương pháp biến nạp vật chất di truyền vào B. subtilis ....................... 8
1.2.1.

Phương pháp biến nạp tự nhiên ................................................................... 8

1.2.1.1.

Nguyên tắc ............................................................................................ 8

1.2.1.2.

Ưu và nhược điểm ................................................................................. 8

1.2.2.

Phương pháp biến nạp qua protoplast .......................................................... 9

1.2.2.1.

Nguyên tắc ............................................................................................ 9

Trang i


Mục lục
1.2.2.2.
1.2.3.

1.3.

Ưu và nhược điểm ............................................................................... 10

Phương pháp điện biến nạp........................................................................ 10

1.2.3.1.

Nguyên tắc .......................................................................................... 10

1.2.3.2.

Tác động của dòng điện đến màng tế bào ........................................... 11

1.2.3.3.

Ưu và nhược điểm của phương pháp điện biến nạp ........................... 12

Các yếu tố ảnh hưởng tần suất biến nạp của phương pháp điện biến nạp........ 12
1.3.1.

Đặc điểm của tế bào khả nạp ..................................................................... 13

1.3.2.

Môi trường tăng trưởng và ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên

tính khả nạp ............................................................................................................. 14
1.3.2.1.

Áp suất thẩm thấu và các chất thẩm thấu trong môi trường

tăng trưởng ........................................................................................................... 15
1.3.2.2.

Các chất tác động lên vách tế bào trong quá trình nuôi cấy ............... 16

1.3.2.3.

Nhiệt độ ............................................................................................... 17

1.3.3.

Ảnh hưởng của cấu trúc và kích thước DNA lên tính khả nạp.................. 17

1.3.4.

Thông số điện biến nạp .............................................................................. 18

1.4.

Ảnh hưởng của điện trường đến tế bào vi khuẩn ............................................. 18

1.5.

Tình hình nghiên cứu phương pháp điện biến nạp cho Bacillus ...................... 19

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1.

Địa điểm nghiên cứu......................................................................................... 20

2.2.

Vật liệu ............................................................................................................. 20

Trang ii


Mục lục
2.2.1.

2.2.1.1.

Chủng vi khuẩn ................................................................................... 20

2.2.1.2.

Plasmid ................................................................................................ 20

2.2.2.

2.3.

Nguồn nguyên liệu sinh học ...................................................................... 20

Môi trường - hóa chất - thiết bị - dụng cụ sử dụng ................................... 21

2.2.2.1.

Môi trường .......................................................................................... 21

2.2.2.2.

Hóa chất và thuốc thử ......................................................................... 22

2.2.2.3.

Dụng cụ - thiết bị ................................................................................ 23

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 24
2.3.1.

Tách chiết plasmid ..................................................................................... 24

2.3.1.1.

Biến nạp plasmid vào E. coli OmmiMAX .......................................... 25

2.3.1.2.

Tách plasmid bằng midi kit ................................................................. 25

2.3.1.3.

Biến nạp plasmid vào B. subtilis theo phương pháp thông thường .... 25

2.3.2.

Xây dựng quy trình điện biến nạp ............................................................. 26

2.3.2.1.

Dựng đường cong tăng trưởng của B. subtilis 1012 và B. subtilis

WB800N ............................................................................................................. 27
2.3.2.2.

Xây dựng quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm

thấu cao kết hợp với xử lý tế bào bằng lysozyme ................................................ 28
2.3.2.3.

Xây dựng quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm

thấu cao kết hợp xử lý tế bào với nhiệt độ lạnh 4oC ............................................ 31
2.3.3.

Khảo sát hiệu suất biến nạp với các plasmid khác nhau ............................ 32

Trang iii


Mục lục
2.3.4.

Kiểm tra plasmid sau khi được biến nạp vào tế bào B. subtilis ................. 33

2.3.5.

Khảo sát sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào B. subtilis ........ 35

KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1.

Xây dựng quy trình điện biến nạp. ................................................................... 36
3.1.1.

Đường cong tăng trưởng của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N. .... 36

3.1.2.

Xây dựng quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu

cao kết hợp xử lý tế bào bằng lysozyme. ................................................................ 37
3.1.2.1.

Ảnh hưởng của môi trường tăng trưởng và thời điểm thu mẫu lên tính

khả nạp của tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N................................ 37
3.1.2.2.

Ảnh hưởng của nồng độ lysozyme lên tính khả nạp của tế bào B. subtilis

1012 và B. subtilis WB800N ............................................................................... 41
3.1.2.3.

Ảnh hưởng của thời gian xử lý với lysozyme lên tính khả nạp của tế

bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N ........................................................ 43

3.1.2.4.
3.1.3.

Ảnh hưởng của hiệu điện thế đến tần suất biến nạp ........................... 46

Xây dựng quy trình điện biến nạp sử dụng môi trường có áp suất thẩm thấu

cao kết hợp ủ lạnh tế bào ở 4oC ............................................................................... 50
3.1.3.1.

Ảnh hưởng của môi trường tăng trưởng và thời điểm thu mẫu lên tính

khả nạp của tế bào B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N................................ 50
3.1.3.2.

Ảnh hưởng của thời gian ủ lạnh lên tính khả nạp của tế bào B. subtilis

1012 và B. subtilis WB800N ............................................................................... 52

Trang iv


Mục lục
3.1.3.3.

Ảnh hưởng của hiệu điện thế lên tần suất biến nạp của B. subtilis 1012

và B. subtilis WB800N ........................................................................................ 55
3.2.

Khảo sát tần suất biến nạp với các plasmid pHT1068, pHT43 – amyQ .......... 57

3.3.

Kiểm tra plasmid sau khi được điện biến nạp vào tế bào B. subtilis ................ 59

3.4.

Khảo sát sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào B. subtilis 1012 và

B. subtilis WB800N........................................................................................................ 61
KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ
4.1.

Kết luận............................................................................................................. 64

4.2.

Đề nghị ........................................................................................................... 655

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

Trang v


Danh mục bảng
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Các cặp mồi và kích thước sản phẩm PCR tương ứng với plasmid ............ 34
Bảng 3.1: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B.

subtilis WB800N nuôi trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol ở 7 thời điểm tăng trưởng
được xử lý lysozyme ...................................................................................................... 38
Bảng 3.2: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B.
subtilis WB800N xử lý với các nồng độ lysozyme: 0,5; 1; 2; 4 µg/ml .......................... 42
Bảng 3.3: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B.
subtilis WB800N xử lý nồng độ lysozyme 1 µg/ml trong thời gian: 5; 10; 15; 20 phút ...
....................................................................................................................................... 44
Bảng 3.4: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B.
subtilis WB800N xử lý lysozyme biến nạp với dãy hiệu điện thế 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV
....................................................................................................................................... 47
Bảng 3.5: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid vào B. subtilis 1012 và B. subtilis
WB800N nuôi trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol ở 7 thời điểm tăng trưởng được xử
lý ủ lạnh 4oC. ................................................................................................................. 51
Bảng 3.6: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B.
subtilis WB800N bằng phương pháp ủ lạnh 4oC trong 12; 24; 36; 48 giờ .................. 53
Bảng 3.7: Bảng tổng kết kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B.
subtilis WB800N với dãy hiệu điện thế 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV bằng phương pháp ủ lạnh
....................................................................................................................................... 55
Bảng 3.8: Kết quả điện biến nạp của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N với
plasmid pHT1068 và pHT43 – amyQ theo hai quy trình xử lý lysozyme và ủ lạnh...... 58

Trang vi


Danh mục biểu đồ
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Đường cong tăng trưởng của hai chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis
WB800N trong môi trường LB – sorbitol (0; 0,25; 0,5; 0,75 M) ................................. 36
Biểu đồ 3.2: Bảy thời điểm tăng trưởng từ pha log đến pha cân bằng của B. subtilis
1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – sorbitol (0; 0,25; 0,5; 0,75 M) .. 37

Biểu đồ 3.3: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis
WB800N theo 7 thời điểm tăng trưởng khác nhau dựa trên giá trị OD600nm trong môi
trường LB – 0,5 M sorbitol và xử lý lysozyme .............................................................. 40
Biểu đồ 3.4: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào tế bào B. subtilis 1012 và B.
subtilis WB800N được xử lý lysozyme nồng độ từ: 0,5; 1; 2; 4 µg/ml trong 10 phút .. 43
Biểu đồ 3.5: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào tế bào B. subtilis 1012 và B.
subtilis WB800N được xử lý lysozyme nồng độ từ 1 µg/ml trong 5, 10, 15, 20 phút .... 46
Biểu đồ 3.6: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào tế bào B. subtilis 1012 và B.
subtilis WB800N xử lý lysozyme điện biến nạp với hiệu điện thế: 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV ..
....................................................................................................................................... 48
Biểu đồ 3.7: Bảy thời điểm tăng trường từ pha log đến pha cân bằng của B. subtilis
1012 và B. subtilis WB800N trong môi trường LB – sorbitol (0; 0,25; 0,5; 0,75 M). . 50
Biểu đồ 3.8: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis
WB800N theo 7 thời điểm tăng trưởng khác nhau dựa trên giá trị OD600nm trong môi
trường LB – 0,5 M sorbitol và ủ lạnh 4oC 24 giờ ......................................................... 51
Biểu đồ 3.9: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis
WB800N theo trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol ủ lạnh 4oC 12; 24; 36; 48 giờ ... 54

Trang vii


Danh mục biểu đồ
Biểu đồ 3.10: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis
WB800N trong môi trường LB – 0,5 M sorbitol được ủ lạnh 12; 24; 36; 48 giờ ....... 56
Biểu đồ 3.11: Tần suất biến nạp plasmid pHT1068 và pHT43 – amyQ vào B. subtilis
1012 và B. subtilis WB800N điện biến nạp theo hai phương pháp xử lý tế bào với
lysozyme và ủ lạnh 4oC ................................................................................................. 58

Trang viii

Danh mục hình
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Đặc điểm hình thái của Bacillus spp. ............................................................ 3
Hình 1.2: Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram dương, Gram âm ............................... 5
Hình 1.3: Mô hình đơn phân murein .............................................................................. 5
Hình 1.3: Cơ chế biến nạp qua protoplast ..................................................................... 9
Hình 1.4: DNA đi vào trong tế bào trong quá trình điện biến nạp .............................. 10
Hình 2.1: Sơ đồ plasmid pHT1068 và pHT43 – amyQ ................................................ 21
Hình 2.2: Thang DNA (ZipRulerTM Express DNA Ladder Set – Fermentas) ............ 23
Hình 2.3: Vị trí bắt cặp của mồi trên plasmid pHT1068 ............................................. 34
Hình 2.4: Vị trí bắt cặp của mồi trên plasmid pHT43 – amyQ .................................... 34
Hình 2.5: Chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR...................................................... 35
Hình 3.1: Kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis
WB800N thu nhận ở 7 giai đoạn tăng trưởng khác nhau trong môi trường
LB – 0,5 M sorbitol và được xử lý lysozyme. ................................................................ 39
Hình 3.2: Kết quả biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis
WB800N được xử lý với lysozyme nồng độ: 0,5; 1; 2; 4 µg/ml trong 10 phút ............. 41
Hình 3.3: Kết quả điện biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis
WB800N được xử lý với lysozyme nồng độ 1 µg/ml trong 5, 10, 15, 20 phút .............. 44
Hình 3.4: Kết quả điện biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis
WB800N được biến nạp với dãy hiệu điện thế 1,9; 2,1; 2,3; 2,5 kV) .......................... 47
Hình 3.6: Kết quả PCR khuẩn lạc của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được
biến nạp plasmid pHT1068, pHT43 – amyQ ................................................................ 75

Trang ix


Danh mục hình
Hình 3.5: Kết quả điện biến nạp plasmid pHT1068 vào B. subtilis 1012 và B. subtilis

WB800N được ủ lạnh 4oC 12, 24, 36, 48 giờ ................................................................ 53
Hình 3.6: Kết quả PCR khuẩn lạc của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N được biến
nạp plasmid pHT1068, pHT43 – amyQ, pKTH10 ........................................................ 60
Hình 3.7: Sự biểu hiện GFP trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B. subtilis 1012
và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT1068 được điện biến nạp ........................... 61
Hình 3.8: Sự biểu hiện GFP trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B. subtilis 1012
và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT1068 được biến nạp theo phương pháp thông
thường ........................................................................................................................... 61
Hình 3.9: Sự biểu hiện α-amylase trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B. subtilis
1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT43 – amyQ được điện biến nạp ........ 62
Hình 3.10: Sự biểu hiện α-amylase trên môi trường thạch LB – Agar – Cm của B. subtilis
1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid pHT43 – amyQ được biến nạp theo phương
pháp thông thường ........................................................................................................ 63

Trang x


Danh mục chữ viết tắt
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Amp

Ampicillin

bp

base pair

Cm

Chloramphenicol

DNA

Deoxyribose Nucleic Acide

dNTP

deoxy Nucleotide Triphosphate

EB

Electroporation Buffer

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

FDA

Food and Drug Administration

GRAS

Generally Recognized As Safe

IPTG

Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside

kbp

kilo base pair

LB

Luria-Bertani

M

Marker

PCR

Polymerase Chain Reaction

PG

Peptidoglycan

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

TAE

Tris base acetic acid EDTA

Trang xi

Lời mở đầu
LỜI MỞ ĐẦU
Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương có lợi, chúng được ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, y học, thực phẩm. Ngày nay, với sự
tiến bộ của khoa học kỹ thuật, B. subtilis được sử dụng như một chủng chủ phổ biến
trong nghiên cứu biến đổi di truyền và ứng dụng công nghệ sinh học trong các viện
nghiên cứu, phòng thí nghiệm vì những ưu điểm như: (i) vi sinh vật an toàn được xếp
vào nhóm GRAS; (ii) mật độ tăng trưởng nhanh, nuôi cấy dễ dàng; (iii) thông tin di
truyền được biết rõ. Chính vì những ưu điểm trên, B. subtilis đã trở thành tế bào chủ hấp
dẫn cho biểu hiện protein tái tổ hợp.
Một chiến lược cần thiết và quan trọng cho các thao tác di truyền cũng như sử dụng
làm tế bào chủ biểu hiện protein tái tổ hợp trên chủng B. subtilis là biến nạp DNA vào tế
bào. Có nhiều phương pháp chuyển DNA vào tế bào B. subtilis như sử dụng
deoxiribonucleate, biến nạp qua protolast, xử lý với alkali hay biến nạp tự nhiên. Hạn
chế của các phương pháp này là tần suất biến nạp thấp và đòi hỏi một lượng DNA lớn
cho một lần biến nạp, do đó muốn dòng hóa tạo plasmid tái tổ hợp trên B. subtilis phải
biến nạp qua trung gian E. coli để thu được một lượng lớn DNA. Phương pháp điện biến
nạp là kỹ thuật đơn giản cho tần suất biến nạp cao và được sử dụng phổ biến cho nhiều
loài vi khuẩn khác nhau.
Mặc dù điện biến nạp được sử dụng rộng rãi cho nhiều chủng vi khuẩn khác nhau
nhưng việc sử dụng phương pháp biến nạp này cho B. subtilis vẫn còn nhiều hạn chế và
đặc biệt là vẫn chưa có nghiên cứu xây dựng quy trình điện biến nạp cho hai chủng B.
subtilis 1012 và B. subtilis WB800N. Đây là hai chủng được sử dụng rộng rãi trong
phòng thí nghiệm cho các nghiên cứu và sản xuất protein tái tổ hợp. Nguyên nhân chính
cho vấn đề này là quy trình điện biến nạp vào các chủng B. subtilis không ổn định giữa
các chủng khác nhau, phụ thuộc vào đặc điểm tăng trưởng của từng chủng. Do đó, luận
văn tập trung vào “Xây dựng các phương pháp điện biến nạp cho hai chủng B. subtilis
1012 và B. subtilis WB800N” nhằm tìm ra điều kiện biến nạp cho tần suất cao ổn định,

Trang 1

Lời mở đầu
đơn giản cho hai chủng B. subtilis điển hình. Luận văn được thực hiện tại Phòng thí
nghiệm Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học và phòng thí nghiệm Công nghệ
Sinh học phân tử – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Thành phố
Hồ Chí Minh. Nội dung thực hiện:
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tần suất điện biến nạp: sử dụng môi trường có áp
suất thẩm thấu cao kết hợp với xử lý tế bào bằng lysozyme hoặc sử dụng môi trường
có áp suất thẩm thấu cao kết hợp xử lý tế bào bằng ủ ở 4oC.
- Kiểm tra xác nhận các plasmid tái tổ hợp đã được điện biến nạp vào tế bào B. subtilis
bằng phương pháp PCR khuẩn lạc.
- Khảo sát tần suất biến nạp với các plasmid tái tổ hợp pHT1068, pHT43 – amyQ cho
phép biểu hiện protein tái tổ hợp nội bào và ngoại bào.
- Kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp từ những plasmid đã được biến nạp.

Trang 2


Phần 1
TỔNG QUAN


Tổng quan
1.1.

Tổng quan về Bacillus subtilis

1.1.1. Đặc điểm chung
Theo khóa phân loại của Bergey, chi Bacillus được phân loại như sau [4]:

Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
B. subtilis thuộc chi Bacillus là một chi lớn (51 loài đã được xác định chính xác
và nhiều loài chưa được phân loại rõ ràng), thuộc họ Bacillaecea. Họ này chia làm 5 chi
gồm: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfotomaculum đặc
trưng của họ này là sự hình thành nội bào tử.

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái của Bacillus spp. [64].

Trang 3


Tổng quan
Đặc điểm của chi Bacilllus (Hình 1.1) được mô tả như sau: tế bào hình que, kích
thước 0,5 – 2,5 x 1,2 – 10 μm, các tế bào thường xếp thành cặp hoặc chuỗi, đầu tròn hoặc
hơi vuông. Là vi khuẩn Gram dương, di động nhờ roi. Một tế bào chỉ có duy nhất một
nội bào tử, nội bào tử có hình oval hoặc hình trụ, chịu được điều kiện bất lợi như nhiệt
độ, acid, sự hình thành bào tử không bị ngăn cản bởi sự tiếp xúc không khí. Vị trí của
bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo một nguyên tắc chặt chẽ nào có thể lệch tâm
hoặc gần tâm nhưng không chính tâm.
Bacillus là vi khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ,
nồng độ muối rộng, tồn tại được trong điều kiện bất lợi một thời gian dài. Vì vậy đa số
chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn khác nhau như: đất, nước,
trong hệ tiêu hóa của một số loại thủy hải sản.
Các chủng B. subtilis phân lập từ tự nhiên sẽ khó sử dụng làm tế bào khả nạp hơn

các chủng đã được đột biến. Những chủng đột biến này được cải thiện khả năng tiếp
nhận DNA, tăng trưởng và mất đi một số đặc tính hoang dại. Hầu hết các chủng B.
subtilis sử dụng cho nghiên cứu và trong công nghiệp đều có nguồn gốc từ chủng B.
subtilis 168 là chủng dị dưỡng phụ thuộc tryptophan [62]. Hai chủng B. subtilis 1012 và
B. subtilis WB800N cũng có nguồn gốc từ B. subtilis 168 và là chủng vi khuẩn được sử
dụng phổ biến hiện nay do có nhiều ưu điểm nổi bật.
1.1.2. Đặc điểm vách tế bào
Vách tế bào còn gọi là thành tế bào, chiếm 10 – 40% trọng lượng khô của tế bào,
độ dày vách tế bào vi khuẩn Gram âm là 10 nm, Gram dương là 14 – 18 nm. Vách tế bào
là lớp cấu trúc ngoài cùng, có độ rắn chắc nhất định để duy trì hình dạng tế bào, có khả
năng bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bất lợi. Nồng độ đường, muối bên trong tế
bào thường cao hơn bên ngoài tế bào (áp suất thẩm thấu tương đương với dung dịch
glucose 10 – 20%) do đó tế bào hấp thu khá nhiều nước từ bên ngoài vào. Nếu không có
vách tế bào vững chắc thì tế bào sẽ bị phá vỡ [63]. Khi thực hiện co nguyên sinh rồi quan

Trang 4


Tổng quan
sát dưới kính hiển vi, thấy rõ lớp vách tế bào của vi khuẩn Gram dương và Gram âm
được minh họa như Hình 1.2.

A

B

Hình 1.2: Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram dương (A), Gram âm (B) [65].
B. subtilis là vi khuẩn Gram dương vách tế bào có thành phần cấu tạo cơ bản là
peptidoglycan (PG) hoặc còn gọi là đơn phân murein chiếm 95% trọng lượng khô của
thành, tạo ra một màng polymer xốp, không hòa tan và rất bền vững, bao quanh tế bào

thành mạng lưới. Cấu trúc của PG gồm thành phần: N – acetylglucozamin (G),
N – acetylmuramic acid (M), alanine, D – glutamic, D – aminoacid. Ngoài ra còn thấy
thành phần acid teichoic (là các polymer của glycerol và ribitol photphat), gắn với PG
hay màng tế bào. Mối liên kết giữa các chất trong đơn phân murein như Hình 1.3:

Hình 1.3: Mô hình đơn phân murein [63].

Trang 5


Tổng quan
G và M liên kết với nhau bởi liên kết 1,4 – β glucoside. Các acid amin liên kết
với nhau và liên kết với M bởi liên kết peptide. Các đơn phân liên kết với nhau để tạo
lớp thành vững chắc.
Giữa M của đơn phân này với G của đơn phân kế tiếp cũng liên kết với nhau bởi
liên kết 1,4 – β glucoside tạo thành liên kết chuỗi dọc của vách tế bào. Liên kết 1,4 – β
glucoside có thể bị enzyme lysozyme cắt đứt, do đó vách tế bào sẽ bị thuỷ phân.
Chính vì đặc điểm vách tế bào vi khuẩn B. subtilis dày và liên kết 1,4 – β glucoside
rất chặt chẽ nên làm ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp cho các chủng B. subtilis.
1.1.3. Dinh dưỡng và sinh trưởng
Các loài thuộc chi Bacillus là những vi sinh vật hóa dị dưỡng có khả năng sử dụng
một số hợp chất hữu cơ đơn giản như đường, amino acid, acid hữu cơ. Trong một số
trường hợp, chúng có khả năng lên men hỗn hợp carbon tạo glycerol và butanediol. Đa
số các loài thuộc chi Bacillus (ngoại trừ B. megaterium và một số loài khác) có nhu cầu
amino acid, vitamin B hoặc cả hai hợp chất trên cho sự tăng trưởng. Phần lớn, chúng là
vi khuẩn ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ sinh trưởng từ 30 – 45oC, một số là vi khuẩn
chịu nhiệt với nhiệt độ sinh trưởng lên tới 65oC, còn lại là những vi khuẩn ưa lạnh, có
thể sinh trưởng và tạo bào tử ở 0oC. Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus sinh trưởng
trong khoảng pH rộng từ 2 – 11. Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện sinh trưởng tối
ưu Bacillus có thời gian thế hệ khoảng 25 phút.

Các điều kiện dinh dưỡng và sinh trưởng là cơ sở cần thiết cho các nhà nghiên
cứu nuôi cấy Bacillus trong phòng thí nghiệm hoặc sử dụng nuôi cấy trong sản xuất công
nghiệp.
1.1.4. Ưu điểm của B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N
B. subtilis được coi là vi sinh vật mô hình cho các vi khuẩn Gram dương, được sử
dụng phổ biến cho nghiên cứu, y dược, thực phẩm và trong công nghiệp [62]. Ứng dụng
lớn của vi khuẩn B. subtilis hiện nay là việc sử dụng làm chủng chủ biểu hiện protein tái

Trang 6


Tổng quan
tổ hợp. Bên cạnh các hệ thống tế bào chủ đã được sử dụng từ lâu như nấm men
Saccharomyces cerevisiae, vi khuẩn Escherichia coli, B. subtilis được xem là chủng chủ
hấp dẫn vì mang nhiều ưu điểm:
- Là vi sinh vật an toàn không gây bệnh được tổ chức FDA của Mỹ công nhận.
- B. subtilis dễ mọc ở các môi trường nuôi cấy thông thường, rẻ tiền, đạt mật độ cao
khi lên men.
- Có khả năng tiết hiệu quả protein vào môi trường nuôi cấy lên đến 20 g/l, dễ dàng
cho việc tinh chế protein. Khoảng 60% enzyme công nghiệp được sản xuất từ
Bacillus [37].
- Thông tin di truyền đã được biết rõ như sự phiên mã, dịch mã, gấp cuộn của protein,
hệ thống tiết, kỹ thuật thao tác trên gen, ít sai lệch trong sử dụng codon [42].
- Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp được thiết lập cho phép biểu hiện tốt nhiều
loại protein tái tổ hợp trong B. subtilis.
Ngoài các ưu điểm như trên B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N còn có ưu điểm:
- B. subtilis 1012: tuy là chủng đột biến nhưng có sức sống mạnh nên dễ dàng cho
nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thường được sử dụng trong nghiên cứu. Chủng
này đã được đột biến các gene leuA8 metB5 trpC2 hsdRM1 [36].
- B. subtilis WB800N: là chủng đã loại bỏ các gen mã hóa protease ngoại bào nprE-;

nprB-; aprE-; epr-; mpr-; bpf-; vpr-; wprA- [55]. Đột biến các protease ngoại bào
hạn chế sự phân cắt protein mục tiêu dạng tiết khi sử dụng B. subtilis WB800N làm
tế bào chủ biểu hiện protein tái tổ hợp.
1.1.5. Ứng dụng của B. subtilis trong sản xuất protein tái tổ hợp
Bên cạnh việc sử dụng các chủng B. subtilis tự nhiên có khả năng tiết protein,
hiện nay với sự phát triển của kỹ thuật gen, B. subtilis được sử dụng làm chủng chủ phổ
biến cho biểu hiện protein tái tổ hợp. Cho đến hiện nay ứng dụng lớn nhất của B. subtilis

Trang 7


Tổng quan
trong sản xuất protein tái tổ hợp là việc sản xuất và tiết các protein dùng trong lâm sàng
như interferon, insulin, hay các enzyme trong công nghiệp.
Một số nghiên cứu sử dụng B. subtilis biểu hiện protein tái tổ hợp như
β-galactosidase, cellulase, nattokinase, amylase. Lượng protein tái tổ hợp thu được từ
B. subtilis có thể lên đến 340 mg/lít [48].
Hiện nay các nghiên cứu trong nước cũng đang hướng đến sử dụng B. subtilis,
một số nghiên cứu như biểu hiện cao gen mã hóa cho enzyme pectin lyase trong
B. subtilis 168 [1], biểu hiện gen mã hóa lipase trong B. subtilis FS2.
Ngoài ứng dụng trong sản xuất protein tái tổ hợp, B. subtilis còn được sử dụng để
nghiên cứu phát triển các hệ thống vector biểu hiện cho Bacillus [2], [38].
1.2.

Một số phương pháp biến nạp vật chất di truyền vào B. subtilis
Để sử dụng B. subtilis cho nghiên cứu và sản xuất thì việc biến nạp vật chất di

truyền vào B. subtilis là bước quan trọng. Hiện nay có một số phương pháp khác nhau
đã được sử dụng để biến nạp DNA vào tế bào B. subtilis như biến nạp tự nhiên, biến nạp
qua protoplast hay điện biến nạp.

1.2.1. Phương pháp biến nạp tự nhiên
1.2.1.1.

Nguyên tắc

Nhiều chủng B. subtilis có khả năng hấp thu DNA ngoại lai trong một số điều
kiện tăng trưởng nhất định gọi là có tính khả nạp và đây là tính trạng di truyền [21]. Đối
với B. subtilis có tính khả nạp tự nhiên, các tế bào tổng hợp và tiết ra một loại peptide
nhỏ trong quá trình tăng trưởng và sự tích lũy nồng độ cao của peptide này giúp tế bào
có tính khả nạp và trạng thái này chỉ tồn tại trong vài giờ. Tế bào khả nạp hấp thụ được
cả DNA dạng thẳng và dạng vòng nhưng sẽ ưu tiên hấp thụ DNA dạng vòng trước [24].
1.2.1.2.

Ưu và nhược điểm

Dựa vào đặc tính khả nạp tự nhiên của vi khuẩn B. subtilis, nuôi cấy và thu nhận

Trang 8


Tổng quan
tế bào B. subtilis vào giai đoạn tế bào có tính khả nạp. Tế bào khả nạp có thể được bảo
quản trong glycerol 15% và lưu trữ ở -80oC cho nhiều lần sử dụng. Đây là phương pháp
tương đối đơn giản và ít tốn kém. Tuy nhiên, đối với phương pháp biến nạp dựa vào tính
khả nạp tự nhiên của tế bào B. subtilis có một số nhược điểm là mất nhiều thời gian hơn
so với điện biến nạp, cần một lượng lớn DNA cho biến nạp. Tần suất của phương pháp
biến nạp tự nhiên rất thấp do số tế bào B. subtilis có tính khả nạp tự nhiên chỉ chiếm
khoảng 20% trong tổng số tế bào trong môi trường nuôi cấy và thường đạt được trạng
thái khả nạp ở giai đoạn cuối của pha log [48]. Như vậy, chỉ có một số ít tế bào trong mẻ
nuôi cấy có tính khả nạp tự nhiên và phải thu nhận đúng giai đoạn tăng trưởng tế bào có

tính khả nạp. Thêm nữa là các tế bào khả nạp tự nhiên có hiệu quả biến nạp rất thấp đối
với các plasmid dạng monomeric [12]. Để khắc phục hiện tượng này, một số giải pháp
được đưa ra như sử dụng các vector con thoi sao chép được trong E. coli và B. subtilis
[48]. DNA plasmid được biến nạp vào E. coli để tách chiết thu nhận một lượng lớn nồng
độ DNA plasmid, sau đó biến nạp vào B. subtilis.
1.2.2. Phương pháp biến nạp qua protoplast
1.2.2.1.

Nguyên tắc

Protoplast là dạng tế bào trần có được từ các tế bào sinh dưỡng bị loại bỏ vách
nhờ hoạt động của enzyme phân cắt vách tế bào như lysozyme. Khi bị loại vách tế bào,
các tế bào dễ dàng tiếp nhận DNA ngoại lai (Hình 1.3).

Hình 1.3: Cơ chế biến nạp qua protoplast [67].

Trang 9


Tổng quan
Năm 1979, Chang và Cohen đã biến nạp thành công plasmid vào tế bào trần
B. subtilis với sự hiện diện của polyethylene glycol [16]. Sau khi được biến nạp, DNA
tế bào trần được phục hồi trong một phức hợp môi trường dinh dưỡng [48].
1.2.2.2.

Ưu và nhược điểm

Biến nạp qua tế bào trần cho hiệu quả biến nạp cao hơn biến nạp tự nhiên (tần
suất biến nạp 4x107 CFU/µg DNA plasmid) vì tế bào trần có thể tiếp nhận các monomeric
plasmid [11]. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi cao về kỹ thuật thao tác vì các tế bào

trần mất vách nên rất dễ bị hư tổn. Một nhược điểm khác của phương pháp này là tế bào
trần không thể lưu trữu trong tủ đông lạnh được [48].
1.2.3. Phương pháp điện biến nạp
1.2.3.1.

Nguyên tắc

Điện biến nạp là phương pháp chuyển gen nhờ xung điện, được sử dụng rộng rãi
cho cả eukaryote và prokaryote. Cơ chế của phương pháp này là dưới tác động của một
điện trường màng tế bào bị xáo trộn tạm thời mất ổn định và hình thành các lỗ trên màng
[53]. Trong giai đoạn bất ổn định, màng tế bào trở nên dễ thấm với các phân tử ngoại
lai có mặt trong môi trường xung quanh, do đó DNA được đi vào trong tế bào qua các
lỗ trên màng [14]. Trên Hình 1.3 mô tả quá trình DNA đi vào trong tế bào trong quá
trình điện biến nạp.

Hình 1.4: DNA đi vào trong tế bào trong quá trình điện biến nạp [66].

Trang 10