Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau (luận văn thạc sĩ)

IH
TRƢ

QU

GI H N I

Ọ

Ọ T

-----------------------

ÔT Ị

TÁCH DÒNG VÀ B ỂU

À

Ệ CECROPIN TR

VECTOR KHÁC NHAU

U

V

T

S

i - 2012

Ọ

Á

Ệ


MỞ ẦU
Nhân ngày Sức khỏe Thế giới 7/4/2011, tổ chức Y tế Thế giới WHO đã đưa ra
chủ đề “ hống kháng kháng sinh: không hành động hôm nay, không còn thuốc chữa
mai sau” nhằm thức tỉnh cộng đồng về vấn đề vi sinh vật kháng thuốc đang đe dọa toàn
cầu.

hống kháng kháng sinh không phải là vấn đề mới, nhưng đã trở nên cấp bách,

đòi hỏi nỗ lực tổng hợp giúp nhân loại tránh nguy cơ quay trở lại thời kỳ chưa có
kháng sinh.
ho đến nay, các giải pháp đưa ra nhằm hạn chế tình trạng kháng kháng sinh
chưa phát huy tác dụng như mong đợi. Trong khi hướng phát triển các loại kháng sinh
mới đang trong tình trạng bế tắc, các nhà khoa học đã tìm ra một nguồn kháng sinh tự
nhiên đầy tiềm năng, đó là các peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptides,

MPs).

Trong số các peptide này, cecropin chủ yếu được tách chiết từ côn trùng, có phổ kháng
khuẩn rộng và có nhiều tiềm năng ứng dụng nên thu hút được rất nhiều sự quan tâm
của các nhà khoa học.
ể sản xuất AMPs nói chung và cecropin nói riêng, có ba con đường tiếp cận

chính là (1) tách chiết từ tự nhiên (2) tổng hợp trực tiếp từ các axit amin theo con
đường hóa học và (3) biểu hiện protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, với yêu cầu thu được
lượng lớn cecropin tinh khiết, hai phương pháp đầu đều có giá thành cao và khó áp
dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm ở các nước đang phát triển như Việt Nam. Vì
vậy, với mong muốn giảm chi phí và chủ động trong việc sản xuất cecropin được phân
lập từ côn trùng ở Việt Nam cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành đề tài
“Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau”.

ây là một

hướng nghiên cứu còn khá mới ở Việt Nam nhưng hứa hẹn nhiều triển vọng.

ề tài

được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y và Phòng Genomic, Trường ại học Khoa
học Tự nhiên, ại học Quốc gia Hà Nội.


CHƢƠNG 1 - TỔ

QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về tình hình kháng kháng sinh
1.1.1. Thực trạng kháng kháng sinh
Kháng kháng sinh là hiện tượng vi sinh vật (virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng)
có khả năng vô hiệu hóa tác dụng của thuốc kháng sinh mà trước đó chúng vẫn mẫn
cảm [63, 79]. Khi các loại thuốc mất tác dụng điều trị, vi sinh vật gây bệnh vẫn tồn tại
và phát triển khiến bệnh lây lan nhanh ra cộng đồng thành dịch bệnh rất khó kiểm soát.
ặc biệt các nước nghèo và các nước đang phát triển phải đối mặt với hậu quả vô cùng
nghiêm trọng do gánh nặng điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc

cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới đắt tiền. Thực trạng
kháng kháng sinh đã, đang và sẽ là vấn đề mang tính toàn cầu, thách thức toàn nhân
loại.

iều này đã được Tổng giám đốc WHO Margaret han nhận định nhân ngày Sức

khỏe Thế giới 7/4/2011: “Một trong những mối quan ngại hàng đầu trong việc chăm
sóc sức khỏe y tế hiện nay chính là tình trạng bệnh kháng thuốc kháng sinh. ây chính
là nguy cơ hàng đầu gây thách thức trong công tác chăm sóc y tế và kiểm soát các bệnh
truyền nhiễm, đồng thời làm tăng chi phí chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng”.
Năm 1928 được coi là mốc quan trọng đầu tiên đánh dấu cho công cuộc tìm
kiếm thuốc kháng sinh khi Alexander Fleming (1881-1955) phát hiện ra penicillin [72,
75]. Tuy nhiên, hơn 60 năm sau khi phát hiện và gần 50 năm sau khi penicillin được
đưa vào sản xuất ở quy mô công nghiệp, trên thế giới đã xuất hiện hơn 95% chủng
Staphylococcus aureus kháng lại penicillin và 60% kháng lại dạng dẫn xuất của nó là
methicillin [7]. Ngày nay, vi khuẩn không chỉ kháng lại penicillin mà còn kháng nhiều
loại kháng sinh khác và trở thành mối đe dọa thực sự đối với sức khoẻ nhân loại. Theo
thống kê năm 2006 của WHO, 5 vi khuẩn có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất hiện nay
là Klebsiella (15.1%), E. coli (13.3%), P. aeruginosa (13.3%), Acinetobacter spp


(9.9%) và S. aureus (9.3%). Nhóm thuốc cephalosporin thế hệ thứ tư có tỷ lệ kháng cao
đặc biệt từ 66-83%, tiếp theo là nhóm kháng sinh aminosid và fluoroquinolon có tỷ lệ
kháng xấp xỉ trên 60%.

áo cáo của WHO cho biết, số quốc gia có bệnh lao kháng

thuốc tăng từ 58 trong năm 2010 lên 69 trong năm 2011. Mỗi năm, thế giới có khoảng
440,000 ca mới nhiễm lao đa kháng thuốc, ít nhất 150,000 ca tử vong vì loại vi khuẩn
này [79]. Tính riêng ở các nước thuộc liên minh châu Âu EU thì cứ mỗi năm có

khoảng 25,000 người chết vì các loài vi khuẩn đa kháng thuốc [80]. ác kháng sinh thế
hệ mới đắt tiền, thậm chí cả một số kháng sinh thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng” cũng
đang mất dần hiệu lực [1]. ằng chứng mới đây nhất là sự lây lan của chủng vi khuẩn
kháng carbapenem (NDM-1) ở một số nước châu Âu và châu Á. Loại “siêu vi khuẩn
kháng thuốc” này tiết ra enzyme NDM-1 có thể kháng lại hầu hết mọi loại thuốc kháng
sinh, kể cả nhóm kháng sinh mạnh nhất là carbapenem [7, 79].

ác nhà khoa học lo

ngại “siêu vi khuẩn” có thể lan ra khắp thế giới, đồng thời khẳng định trong tương lai
gần chưa có loại thuốc nào có khả năng tiêu diệt được. Kháng kháng sinh không chỉ
ảnh hưởng tới lĩnh vực y tế mà nó còn tác động sâu sắc đến nền kinh tế. Theo ước tính
của WHO, ở Mỹ mỗi năm chi phí y tế cho thuốc điều trị nhiễm khuẩn xấp xỉ 20 tỉ $;
còn với khối EU là 1.5 tỉ € [80]. Vì vậy, kháng kháng sinh giờ đã trở thành vấn đề
mang tính toàn cầu.
Hiện nay, tình hình kháng kháng sinh ở Việt Nam cũng diễn biến hết sức phức
tạp. Theo báo cáo của

ộ Y tế trong năm 2008 thì nhiễm khuẩn chiếm tỷ lệ tử vong

cao thứ hai (16.7%) chỉ sau bệnh về tim mạch (18.4%). Báo cáo kết quả nghiên cứu ở
19 bệnh viện ở Hà Nội, thành phố Hồ

hí Minh và Hải Phòng trong hai năm (2009-

2010) về tình trạng kháng kháng sinh cho thấy, có 4 chủng vi khuẩn kháng kháng sinh
thường gặp là Acinetobacter spp, Pseudomonas spp, E. coli và Klebsiella. Hầu hết các
kháng sinh thông thường như: penicillin, tetracycline, streptomycine, … đã bị kháng.
Theo báo cáo “Phân tích thực trạng: sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh ở Việt

Nam” do nhóm nghiên cứu Quốc gia của Việt Nam thuộc tổ chức hiệp hội kháng
kháng sinh toàn cầu (GARP, Global Antibiotic Resistance Partnership) vào tháng 10
năm 2010 thì tình trạng kháng kháng sinh ở nước ta đáng báo động [1]. Bằng chứng là
tỷ lệ chủng Streptococcus pneumoniae, một trong những nguyên nhân chính gây nhiễm
khuẩn hô hấp, kháng penicillin là 71.4%, kháng erythromycin là 92.1%.

ây là tỉ lệ

kháng cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc
hâu Á ( NSORP) năm 2000-2001. Năm 2009 tỷ lệ các chủng vi khuẩn Gram âm
kháng với ceftazidime là 42%, kháng với gentamicin là 63% và kháng với axit
nalidixic là 74% ở cả bệnh viện và trong cộng đồng. Xu hướng gia tăng của tình trạng
kháng kháng sinh cũng thể hiện rõ rệt. Những năm 1990, tại thành phố Hồ hí Minh,
chỉ có 8% các chủng pneumococcus kháng với penicillin.

ến năm 1999-2000, tỉ lệ

này đã tăng lên 56% [1]. hính vì tình trạng kháng kháng sinh ngày càng có xu hướng
tăng lên như vậy mà Việt Nam đã bị WHO xếp vào nhóm nước có tỷ lệ kháng kháng
sinh cao nhất thế giới (WHO, 2008). Thực trạng phức tạp này không chỉ đặt ra cho
ngành y tế Việt Nam nhiều thách thức mà còn đòi hỏi cả xã hội phải cùng nhau hành
động để có thể làm giảm bớt tình trạng kháng kháng sinh.
1.1.2. Nguyên nhân v giải pháp cho tình trạng kháng kháng sinh
ể hiểu rõ căn nguyên của tình trạng kháng kháng sinh, báo cáo của WHO
trong ngày sức khỏe thế giới 7/4/2011 đã tổng kết 6 nguyên nhân chính dẫn đến tình
trạng kháng kháng sinh cao như sau [79]:
Thứ nhất, kháng thuốc là một hiện tượng tiến hóa tự nhiên. Khi vi sinh vật tiếp
xúc với các chất có khả năng tiêu diệt chúng, những vi sinh vật “may mắn” sống sót sẽ
tự tạo ra những cơ chế tự vệ tránh được tác dụng của các chất này. Từ đó các thế hệ vi

sinh vật kháng thuốc được hình thành. Không những thế, gen kháng thuốc có thể được


truyền ngang từ cá thể này sang cá thể khác nên vi sinh vật kháng thuốc ngày càng
nhiều. Nguyên nhân này là quy luật tự nhiên nên khó có giải pháp ngăn chặn.
Tuy nhiên, 4 nguyên nhân tiếp theo lại xuất phát chủ yếu từ phía con người.

ó

chính là: sử dụng thuốc không hợp lý; chất lượng thuốc kém; công tác phòng ngừa,
kiểm soát bệnh lây truyền yếu và thiếu hệ thống giám sát. Chính những nguyên nhân
này thúc đẩy nguyên nhân đầu tiên diễn ra nhanh hơn và góp phần không nhỏ dẫn đến
tình trạng kháng kháng sinh hiện nay. Vì vậy, muốn tình trạng kháng kháng sinh giảm
xuống thì chính chúng ta phải có những hành động tích cực ngay ngày hôm nay.
Nguyên nhân cuối cùng dẫn tới tình trạng kháng kháng sinh ngày càng trầm
trọng chính là các công cụ mới chống lại sự kháng thuốc ngày càng cạn kiệt. ác loại
thuốc kháng sinh đang mất dần tác dụng. Trong khi đó, sự phát triển các loại kháng
sinh thế hệ mới ngày càng thu hẹp.

Hình 1. Lịch sử phát hiện thuốc kháng sinh.

Nhìn vào Hình 1 chúng ta thấy hàng loạt các thuốc kháng sinh được tìm ra chủ
yếu trong khoảng từ năm 1940 đến năm 1970. ó thể nói đây là thời đại hoàng kim của


thuốc kháng sinh. Tuy nhiên, từ những năm 1980 trở lại đây số lượng thuốc kháng sinh
mới rất hiếm.

iều này đặt ra mối lo ngại có phải nguồn kháng sinh đã cạn kiệt? Thêm

vào đó nếu tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng như hiện nay thì liệu rằng
những thế hệ tương lai sẽ còn được hưởng những lợi ích mà kháng sinh mang lại?

ây

chính là mối băn khoăn chính được đưa ra trong Ngày sức khỏe thế giới năm nay.
Một trong những giải pháp nhằm đáp ứng nguồn kháng sinh mới là khai thác
các peptide kháng khuẩn

MPs (antimicrobial peptides) [7, 79]. Hàng loạt nghiên cứu

đã chỉ ra rằng cơ thể của các sinh vật đều mang trong mình một hệ thống các peptide
có khả năng kháng khuẩn [22, 30].

húng có đầy đủ tiềm năng để trở thành nguồn

nguyên liệu quý giá mà con người có thể khai thác trong “thời đại kháng kháng sinh”
hiện nay [28, 49].
1.2. Peptide kháng khuẩn (AMPs)
1.2.1.

iới thiệu chung về MPs

Tất cả các cơ thể đa bào đều tiến hóa qua hàng triệu năm trong môi trường có
nhiều loại vi sinh vật. Mặc dù thường xuyên tiếp xúc với các mầm bệnh qua những con
đường khác nhau nhưng nhiều loài sinh vật vẫn không có sự bảo vệ của kháng thể hoặc
các tế bào miễn dịch [30, 57]. Lý do mà chúng có thể tồn tại được là nhờ hệ miễn dịch
bẩm sinh tạo ra bởi hàng loạt

MPs tham gia đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu [20,

28]. Một thực tế quan trọng là các mầm bệnh vi sinh vật dường như không hình thành
tính kháng với các peptide này.

ây cũng chính là một trong những lý do để các nhà

nghiên cứu và các hãng dược phẩm tin tưởng rằng AMPs sẽ trở thành liệu pháp chữa
bệnh mới thay thế cho các loại thuốc kháng sinh dễ bị vi sinh vật gây bệnh kháng lại
[22, 45, 70].


1.2.1.1. Hoạt tính sinh học của AMPs
AMPs có hoạt tính kháng lại vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, vi rút, nấm, kí sinh
trùng [20, 28, 37, 48]. Tùy thuộc vào loại

MPs mà có hoạt tính kháng mạnh hay yếu,

phổ tác dụng rộng hay hẹp. Ngoài ra, một số loại

MPs còn có hoạt tính kháng viêm,

diệt tế bào ung thư và đảm nhiệm các chức năng nhất định trong hệ thống miễn dịch
bẩm sinh cũng như hệ thống miễn dịch tiếp thu [28, 30].
1.2.1.2. Sự đa dạng của AMPs
AMPs được tìm thấy trong nhiều mô và cơ quan khác nhau ở tất cả các giới,
các ngành sinh vật, từ prokaryote cho đến con người [28, 60]. Tuy nhiên, hiện nay các
nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung phân tích AMPs có nguồn gốc từ sinh vật nhân
chuẩn.

ến nay đã có khoảng 800 loại

MPs khác nhau được tìm thấy ở các sinh vật

nhân chuẩn [37]. Dựa vào mức độ tương đồng về độ tích điện, trình tự, chức năng và
cấu trúc không gian, AMPs được chia thành các nhóm như sau [4, 9]:
 Nhóm peptide là phân đoạn của các protein lớn hơn:

ác peptide này

được tạo ra do protein lớn hơn bị phân cắt bởi enzyme. Trong số các peptide thuộc
nhóm này, peptide được quan tâm nhiều nhất là lactoferricin được tạo ra khi lactoferrin
(một protein có hoạt tính kháng khuẩn, được tiết chủ yếu ở các mô nhầy) bị phân cắt
bởi enzyme pepsin. ác nghiên cứu cho thấy lactoferricin là peptide có hoạt tính kháng
khuẩn phổ rộng [62].
 Nhóm peptide tích điện âm: Lần đầu tiên vào năm 1992, các nhà khoa
học đã phân lập được 3 peptide kích thước nhỏ (721.6 đến 823.8 Da) tích điện âm từ
cừu có hoạt tính kháng lại Mannheimia haemolytica, Escherichia coli và Klebsiella
pneumoniae [8].

ến nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra được rất nhiều loại peptide

kháng khuẩn tích điện âm từ lưỡng cư (maximin H5), từ người (dermcidin) [9].


 Nhóm peptide tích điện dương:

ây là nhóm peptide đầu tiên được

nghiên cứu và cũng là nhóm lớn nhất, có mặt ở cả động vật lẫn thực vật trong đó phần
lớn được phân lập từ các loài côn trùng [5]. Một số loại peptide kháng khuẩn tích điện

dương điển hình như cecropin, andropin, moricin, ceratotoxin, melittin từ côn trùng
hay magainin, dermaseptin, brevinin-1, esculentins, buforin II từ lưỡng cư [9].
1.2.1.3. Tiềm năng ứng dụng của AMPs
ho đến nay, bên cạnh việc phát triển để thay thế dần các loại kháng sinh đã bị
kháng, AMPs còn hứa hẹn trở thành liệu pháp chữa trị ung thư mới đầy hiệu quả [42,
58, 64]. Hơn nữa, các gen mã cho AMPs là một nguồn gen quan trọng để tạo nên các
sinh vật chuyển gen có khả năng kháng lại mầm bệnh. Thực tế cho thấy hàng loạt các
loại thực vật và động vật chuyển gen mã cho AMPs đã được tạo ra [27, 47]. Riêng
trong lĩnh vực phát triển thuốc kháng sinh thế hệ mới từ

MPs đã thu được những kết

quả khả quan. Rất nhiều loại MPs đã được các hãng dược phẩm đưa vào sản xuất, thử
nghiệm và một số loại đã được thương mại hóa ( ảng 1) [22].


Bảng 1. ác loại MPs và tương tự AMPs được sản xuất thương mại [22].
Tên hãng
sản xuất

Tên thuốc

iai đoạn
phát triển

Sử dụng trong y học

AM-Pharma
(Phần Lan)

hLF-1-11 (petide nhỏ có
nguồn gốc từ lactoferrin
người)

Phase II

Các nhiễm trùng liên
quan đến cấy ghép tủy
xương cùng loài

Ceragenix
(Denver)

CSA-13 (steroid tích điện
dương bắt chước các
peptide thuộc hệ thống
bảo vệ cơ thể)

Tiền thử nghiệm
lâm sàng

Chống nhiễm khuẩn

Helix
Biomedix
(USA)

HB-50 (peptide tổng hợp
tự nhiên bắt chước
cecropin)

HB-107 (đoạn dài 19 axit
amin của cecropin B)

Tiền thử nghiệm
lâm sàng

Chống nhiễm khuẩn

Tiền thử nghiệm
lâm sàng

Chữa lành vết thương

IMX942 (peptide dài 5
axit amin)

Trong quá trình
tối ưu hóa

iều chỉnh hệ miễn dịch;
điều trị sốt và giảm bạch
cầu trung tính ở bệnh
nhân hoá trị liệu

Phát minh

Chống nhiễm khuẩn và
ung thư

Inimex

(Canada)

Lytix
Biopharma
(Na Uy)

hưa công bố

Novacta
Biosystems
Ltd.
(Anh)

Mersaxitin (bacteriocin)

Tiền thử nghiệm
lâm sàng

Kháng vi khuẩn Gram
dương

Novozymes
A/S
( an Mạch)

Plectasin
(defensin của nấm)

Tiền thử nghiệm
lâm sàng

Kháng các loại vi khuẩn
Gram dương, đặc biệt
trong trường hợp nhiễm
phế cầu khuẩn và khuẩn
liên cầu

Pacgen
(Canada)

PAC113 (dựa trên đoạn
hoạt động của histatin 5protein được tìm thấy
trong nước bọt của người)

ược phê chuẩn
là loại thuốc mới
nghiên cứu

Thuốc uống điều trị
chứng sưng tấy do nấm
lan trong âm đạo, ruột,
miệng hoặc da


1.2.2. Peptide kháng khu n tích điện dƣơng (

MPs) v cecropin

1.2.2.1. Giới thiệu chung về CAMPs
MPs được định nghĩa là các peptide có từ 12-50 axit amin với điện tích +2

đến +9 do có đuôi lysine hoặc arginine và có tới 50% là các axit amin kỵ nước [11, 38].
Trong số 3 nhóm peptide kháng khuẩn đã trình bày ở trên thì đây là nhóm được quan
tâm rất nhiều do các đặc điểm: (1) có mặt ở hầu hết các loài sinh vật; (2) có phổ kháng
khuẩn rộng; (3) vi sinh vật khó hình thành tính kháng và (4) có mức độ đa dạng cao
giữa các sinh vật.

ặc điểm này giúp

thuốc khác nhau [14, 28, 63].

MPs có tiềm năng phát triển thành các loại

ến nay, đã có khoảng hơn 600

MPs được phát hiện

từ vi sinh vật cho đến con người [38]. Từ những năm 1990, các hãng dược phẩm lớn
trên thế giới như Magainin Pharmaceuticals (Plymouth Meeting, PA), XOMA (Santa
Monica, CA), Demegen (Durham, NC), IntraBiotics Pharmaceuticals (Mountain View,
), … đã nhận thấy nhóm

MPs mang nhiều triển vọng và tập trung phát triển để

sản xuất thành thuốc thương mại ( ảng 2) [7].
Bảng 2. Một số sản phẩm từ
trị bệnh [7].
Công ty sản xuất

MPs được các công ty sản xuất phát triển phục vụ điều
Sản ph m

iai đoạn
phát triển

Magainin Pharmaceuticals
(Plymouth Meeting, PA)

Pexiganan, 1 loại CAMPs có nguồn gốc Hoàn thành
từ da ếch
phase III

Micrologix Biotech
(Vancouver, BC, Canada)

oạn 12 axit amin 1 loại CAMPs của
loài động vật có vú có khả năng chống
nhiễm khuẩn máu

Phase II

XOMA Corporation
(Santa Monica, CA)

MPs PI dùng để kháng Neisseria
meningitidis

Phase III

Dựa vào đặc điểm về cấu trúc cuộn gấp,

MPs có thể được phân thành 4 lớp:

lớp peptide dạng phiến gấp nếp  được làm bền bởi 2 đến 4 cầu disulfit (ví dụ như ,


-defensin, plectasin, protegrins); lớp peptide dạng xoắn  (ví dụ như LL-37, cecropin,
magainin); lớp peptide có cấu trúc giàu glycine, proline, tryptophan, arginine và hoặc
histidine (ví dụ như indolicidin); lớp peptide dạng loop với 1 cầu disulfide (ví dụ như
bactenecin) [22].
1.2.2.2. Peptide kháng khuẩn cecropin
Cecropin là peptide kháng khuẩn đầu tiên được phân lập và nghiên cứu một
cách đầy đủ nhất [31, 45]. Cecropin được phân lập lần đầu tiên (năm 1981) từ loài
bướm đêm Hyalophora cecropia sau khi bị nhiễm với vi khuẩn [55]. Kể từ đó, người ta
nhận thấy cecropin hay các peptide tương tự cecropin cũng tồn tại ở các loài côn trùng
khác, chủ yếu thuộc

ộ

ánh phấn và

ộ Hai cánh [14, 55]. Hàng loạt các loại

cecropin đã được phân lập từ nhiều loài côn trùng ở các vùng địa lý khác nhau và được
nghiên cứu chi tiết để có những hiểu biết đầy đủ trước khi đưa vào ứng dụng thực tế.
1.2.2.2.1. ác đặc trưng về cấu trúc của cecropin
Kết quả so sánh trình tự axit amin cho thấy cecropin của các loài thuộc ộ Hai
cánh có độ tương đồng hơn 70%.

ặc biệt cecropin I

(sarcotoxin I ) của loài nhặng

xanh Sarcophaga peregrina có độ tương đồng đến 100% với cecropin

của loài ruồi

giấm Drosophila melanogaster. Trong khi đó, cecropin của các loài thuộc

ộ

ánh

phấn lại có trình tự ít tương đồng với nhau hơn [13]. Trình tự axit amin của một số
cecropin được trình bày trong ảng 3.


Bảng 3. Trình tự axit amin của một số cecropin [13].
Loài

Trình tự axit amin

Drosophila melanogaster

Cecropin A
GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR

Sarcophaga peregrina

Sarcotoxin IA
GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR

Aedes aegypti

Cecropin A
GGLKKLGKKLEGAGKRVFNAAEKALPVVAGAKALRK

Aedes albopictus

Cecropin A1
GGLKKLGKKLEGVGKRVFKASEKALPVAVGIKALGK

Hyalophora cecropia

Cecropin A
KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK

Bombyx mori

Cecropin D
GNFFKDLEKMGQRVRDAVISAAPAVDTLAKAKALGQ

ác phân tích cho thấy cecropin ngay sau khi tổng hợp thường có từ 62-64 axit
amin. Trong đó, 20-26 axit amin ở đầu tận cùng amino không xuất hiện trong phân tử
cecropin trưởng thành.

húng có thể đóng vai trò như trình tự peptide dẫn. Phân tử

cecropin trưởng thành thường gồm khoảng 29-42 axit amin, không chứa cystein [5]. ấu
trúc bậc hai điển hình của cecropin là xoắn α-helix (Hình 2). ặc biệt, hầu hết các phân tử
cecropin đều mang tính lưỡng cực cho phép cecropin tương tác dễ dàng với màng tế bào

[28]. Phân tích cấu trúc của cecropin A bằng phương pháp khối phổ cộng hưởng từ cho
thấy peptide này có một đầu N-terminal dài, dạng xoắn  lưỡng cực (từ vị trí 5 đến 21)
và một đuôi ngắn hơn nhưng kị nước ở đầu xoắn -terminal (từ vị trí 24 đến 37); hai
vùng này nối với nhau thông qua khớp nối Gly-Pro [23]. Hình ảnh về cấu trúc không
gian của cecropin A được minh họa trên Hình 2.


Khớp nối Gly-Pro

Hình 2. ấu trúc cecropin
hưởng từ [23].

của Hyalophora cecropia phân tích bằng khối phổ cộng

1.2.2.2.2. ặc điểm nổi bật của cecropin
Là một peptide kháng khuẩn tích điện dương điển hình, cecropin mang nhiều
đặc điểm nổi bật hứa hẹn nhiều tiềm năng ứng dụng.
ecropin có phổ hoạt tính kháng khu n r ng: Nhìn chung các nhà nghiên
cứu đều thống nhất rằng cecropin có phổ hoạt tính rộng bao gồm vi khuẩn Gram âm, vi
khuẩn Gram dương, nấm, một số virus và kí sinh trùng [14, 26, 32, 36, 60, 61, 66].
Trong khi đó, một số loại AMPs khác có phổ hoạt tính hẹp ví dụ như attacin và
diptericin chỉ có hoạt tính kháng lại vi khuẩn Gram âm hay drosomycin chỉ có hoạt tính
kháng lại nấm [57].

ây là đặc điểm mà bất cứ nhà nghiên cứu hoặc các hãng dược

phẩm nào cũng mong muốn thu được từ sản phẩm của mình. Nhìn chung, hoạt tính
kháng khuẩn của cecropin đối với vi khuẩn Gram âm thường hiệu quả hơn so với vi
khuẩn Gram dương [13].
ấu trúc phù hợp với hoạt tính kháng khu n: ác nghiên cứu đã chỉ ra rằng

những đặc điểm như thành phần axit amin, cấu trúc không gian, độ tích điện và tính
lưỡng cực của cecropin có đặc điểm hoàn hảo cho hoạt tính kháng khuẩn. ụ thể là:
ecropin có cấu trúc lưỡng cực, dạng xoắn α-helix mà những peptide có cấu
trúc dạng này thường có hoạt tính mạnh hơn các peptide có cấu trúc bậc 2 không rõ
ràng khác. Mặt khác, cấu trúc dạng xoắn α-helix giúp peptide bền, ít bị các tác động


làm ảnh hưởng đến hoạt tính [35]. Thực nghiệm cho thấy nhờ cấu trúc này mà cecropin
vẫn giữ được hoạt tính sau khi ủ ở 1000

tới 10 phút hoặc lâu hơn nữa [41]. Không

những thế, do có cấu trúc lưỡng cực nên cecropin có khả năng tan trong nước hoặc
trong lớp màng lipit kép rất tốt. Nhờ vậy, cecropin có thể dễ dàng tương tác với các
thành phần ưa nước và kị nước của vi sinh vật hơn [35].
Cecropin là peptide tích điện dương nên thường có hoạt tính kháng khuẩn cao
hơn hẳn so với các peptide trung hòa khác [9, 39]. Hơn nữa, trong khi các peptide tích
điện âm cần cofactor kẽm để hoạt động thì các peptide tích điện dương như cecropin
không cần đến.

ặc biệt, cecropin còn đảm nhiệm nhiều chức năng khác của hệ miễn

dịch bẩm sinh [4, 10]. Do tích điện dương nên cecropin có khả năng cô lập cấu tử
Lipopolysacharite (LPS) của vi khuẩn Gram âm.

hính những cấu tử này hoạt động

như nội độc tố gây ra hiện tượng nhiễm trùng. Ngoài ra nhờ tích điện dương, cecropin
còn có tính hóa ứng động cao giúp thu hút và tập trung các tế bào trình diện kháng
nguyên, nhờ đó làm thúc đẩy các phản ứng của hệ miễn dịch tiếp thu [19, 30, 70]. Như

vậy, ngoài hoạt tính kháng khuẩn, cecropin còn đóng vai trò quan trọng trong hệ thống
miễn dịch bẩm sinh và hệ thống miễn dịch tiếp thu.
ích tác đ ng của cecropin l m vi sinh vật khó hình th nh tính kháng:
Khác với các thuốc kháng sinh truyền thống, các

MPs nói chung và cecropin nói

riêng có đích tác động chủ yếu là cấu trúc màng tế bào vi sinh vật. húng sẽ tuơng tác,
phá vỡ cấu trúc màng, qua đó làm dung giải tế bào [12]. Với những đặc điểm về thành
phần axit amin, tính lưỡng cực, độ tích điện và kích thước, cecropin có thể tương tác
với màng tế bào của vi sinh vật theo bốn mô hình như mô tả ở Hình 3 [28].


Hình 3. Một số mô hình tương tác của cecropin với màng tế bào vi sinh vật. Trong
hình, lớp kép lipit của màng tế bào: màu vàng; peptide cecropin: hình trụ; vùng ưa
nước của cecropin: màu đỏ; vùng kị nước: màu xanh; A: mô hình “tập hợp”; B: mô
hình “lỗ hình xuyến”; C: mô hình “thùng thủng lỗ”; D: mô hình “tấm thảm” [28].

Trong mô hình “tập hợp” (A), các phân tử cecropin tạo thành cầu qua màng như
một tập hợp giống phức mixen của các peptide và lipit.

ối với mô hình “lỗ hình

xuyến” (B), cecropin dạng xoắn chèn vào màng, lớp đơn lipit bị uốn cong liên tục làm
cho vùng trung tâm chứa nước bị đầy bởi các peptide chèn vào và các đầu lipit. Trong
mô hình “thùng thủng lỗ” (C), cecropin xoắn hình thành một bó trong màng với lỗ
hổng ở giữa giống như một cái thùng. Với mô hình “tấm thảm” (D), cecropin tập hợp ở
bề mặt lớp kép và có xu hướng song song với bề mặt màng. Do tích điện dương nên
cecropin hấp dẫn các nhóm phospholipit tích điện âm ở nhiều vị trí rồi bao lấy màng tế
bào theo kiểu trải thảm.

Trong nhiều thập kỷ, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu hoạt tính phá vỡ
thành và màng tế bào vi khuẩn của cecropin . Năm 2003, nghiên cứu của Hong và cs.
thuộc trường đại học Y Pennsylvania chỉ ra rằng, ở liều lượng thấp cecropin

không

đủ để giết tế bào vi khuẩn thông qua cơ chế tác động màng, nhưng đủ để tác động đến
phiên mã của các gen. Trong số 26 gen chịu tác động có 11 gen mã cho các protein
mang chức năng quan trọng của vi khuẩn [24]. Vi khuẩn không có khả năng thay đổi
bộ máy di truyền của chúng; điều này giải thích tại sao vi khuẩn rất khó hình thành tính
kháng lại với cecropin A. Không những thế, nghiên cứu của Wachinger và cs. đã chỉ ra
rằng một số loại cecropin tác động tới chu kì nhiễm bệnh của virus HIV bằng cách ức
chế biểu hiện gen HIV-1, qua đó làm ảnh hưởng tới quá trình nhân lên của virus HIV
[61]. Vì vậy, đến nay các nhà khoa học đã khẳng định rằng màng tế bào không phải là
đích tác động duy nhất để cecropin giết vi sinh vật. Cecropin có thể tác động tới vi sinh
vật bằng cách thay đổi hình dạng vách ngăn màng tế bào chất, ức chế tổng hợp thành tế
bào, ức chế tổng hợp axit nucleic, ức chế tổng hợp protein và ức chế hoạt động enzyme
như minh họa ở Hình 4 [28].

Tái bản
ADN

Tổng hợp
mARN

Tổng hợp
thành tế bào

Tổng hợp
protein

Gấp nếp
protein
Các enzyme biến đổi
aminoglycoside

Hình 4. ác đích tác động khác của cecropin ngoài màng tế bào [28].

hông gây hại đến tế b o thực vật, đ ng vật v con ngƣời: Với nhiều tiềm
năng phát triển thành một liệu pháp chữa trị lí tưởng thì một câu hỏi quan trọng được


đặt ra là liệu cecropin có gây độc đối với tế bào nhân chuẩn không và cách thức mà
chúng chọn lọc đích tác động như thế nào?
Kết quả các nghiên cứu kiểm tra tính an toàn của cecropin đã đưa ra câu trả lời
đầy khả quan là phần lớn các cecropin không gây độc đối với tế bào nhân chuẩn [43,
70]. Ví dụ như năm 1996, Moore và cs. đã kiểm tra khả năng làm tan hồng cầu người
của cecropin

có nguồn gốc từ bướm đêm Hyalophora cecropia (một trong số các loại

cecropin có hoạt tính mạnh nhất). Kết quả thu được cho thấy ở nồng độ cecropin

rất

cao là 500 M (cao hơn hàng triệu lần so với nồng độ diệt các vi sinh vật khác) vẫn
không quan sát thấy hiện tượng hồng cầu người bị tan [43]. Ngoài ra, cecropin không
gây ảnh hưởng đến hình thái, tốc độ tăng sinh và đặc tính biệt hóa của các dòng tế bào

nuôi cấy [42, 58, 64]. Một trong những giả thuyết giải thích cơ chế chọn lọc đích tác
động của

MPs nói chung và của cecropin nói riêng là dựa vào sự khác biệt về cấu

trúc màng tế bào [21]. Không giống như màng tế bào nhân sơ, màng tế bào nhân chuẩn
có thành phần cholesterol giúp cho các phân tử phospholipit kép co đặc hơn, do đó
màng tế bào trở nên bền vững khiến cecropin rất khó tạo ra lỗ hổng trên bề mặt màng.
Ngoài ra, chính sự phân bố một cách bất đối xứng các phân tử phospholipit tích điện
âm và trung hòa tại hai lớp màng đơn cũng là nguyên nhân giúp màng tế bào nhân
chuẩn không nhạy cảm với cecropin.
hả năng giết tế b o ung thƣ m t cách chọn lọc: Hoạt tính kháng ung thư của
cecropin đã được quan tâm rất sớm với những nghiên cứu của Moore và cs. (1994).
Trong điều kiện in vivo, cecropin

giúp kéo dài thời gian sống sót của những con

chuột bị ung thư cổ trướng ác tính. Trong thử nghiệm in vitro, cecropin

có hoạt tính

làm tan bào đối với các dòng tế bào ung thư vú và ung thư buồng trứng ở người [42].
Tiếp đó, năm 2008 nghiên cứu của Suttmann và cs. cho thấy cecropin

có khả năng

ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư bàng quang, phá hủy cấu trúc màng tế bào
và gây chết đối với các tế bào ung thư (Hình 5) [58].

Hình 5. Hoạt tính của cecropin

lên tế bào ung thư bàng quang.

: tế bào ung thư

bàng quang 486P không bị xử lý với cecropin ; : tế bào ung thư bàng quang 486P bị
xử lý với cecropin ở nồng độ 65 µM [58].

Kết quả nghiên cứu mới nhất được công bố năm 2010 của Xiaobao và cs. cho
thấy cecropin của Musca domestica có khả năng ức chế sự phát triển của dòng tế bào
gan ung thư biểu mô BEL-7402.

ặc biệt, cecropin không làm ảnh hưởng tới sự phát

triển của các tế bào gan lành xung quanh [64]. Kết quả ở Hình 6 cho thấy khi xử lý tế
bào ung thư với cecropin ở nồng độ càng cao (từ 25 µM đến 100 µM) thì số lượng tế
bào ung thư bị tiêu diệt càng nhiều.

Hình 6. Hình thái học của các tế bào EL-7402 khi xử lý với cecropin ở các nồng độ
khác nhau được phân tích bằng kính hiển vi điện tử ( ) và bằng phương pháp TUNEL
(B) [64].


Cecropin có khả năng giết các tế bào ung thư một cách chọn lọc do màng tế bào
ung thư có hàm lượng phosphatidylserin cao hơn so với tế bào bình thường.
Phosphatidylserin tích điện âm nên có ái lực cao với cecropin tích điện dương [26, 30].
ồng thời, tế bào ung thư có độ nhớt cao giúp cho các phân tử cecropin dễ dàng tấn
công vào bên trong tế bào. Các vi nhung mao trên bề mặt của các tế bào ung thư có số
lượng lớn, đa dạng về kích cỡ và hình dạng, giữ vai trò quan trọng giúp cecropin chọn

lọc đích tác động [58].
1.2.2.2.3. Tiềm năng ứng dụng và tình hình nghiên cứu cecropin
Với những đặc điểm nổi bật như trên, cecropin đã trở thành đối tượng quan tâm
nghiên cứu hàng đầu trong số

MPs hiện nay [36].

ã có nhiều loại cecropin được

phân lập từ nhiều nguồn côn trùng khác nhau, thậm chí cecropin còn được cải biến
hoặc lai với MPs khác để làm tăng hoạt tính [25, 54]. Tuy nhiên, con đường để có thể
biến cecropin trở thành thuốc kháng sinh thế hệ mới thay thế cho các loại kháng sinh
hiện nay vẫn còn đòi hỏi nhiều nghiên cứu về cách thức thu nhận cecropin và tinh sạch
chúng.
ầu tiên, các nhà khoa học mong muốn chủ động tổng hợp cecropin in vivo và
in vitro.

hính vì vậy, hướng nghiên cứu phân lập gen mã cho cecropin để tạo nên

động vật, thực vật chuyển gen có khả năng kháng lại mầm bệnh đã được quan tâm [27,
47]. Những sinh vật mang gen cecropin có khả năng đề kháng tốt với các mầm bệnh
trong điều kiện in vivo. Kết quả nghiên cứu của Sarmasik và cs. cho thấy chỉ 10% cá
Medaka có gen cecropin chết khi lây nhiễm với Pseudomonas fluorescens và 10-30%
chết khi lây nhiễm với Vibrio anguillarum so với tỉ lệ chết lên tới trên 40% của cá
Medaka không mang gen cecropin [47]. Việc chuyển gen cecropin B vào cây cà chua
Solanum lycopersicum làm tăng khả năng kháng Ralstonia solanasearum,
Xanthomonas campestris [27]. iều này đã mở ra một hướng đi đầy hứa hẹn ứng dụng


cecropin vào công nghệ sinh học trong chăn nuôi và trồng trọt [27]. Hướng sản xuất

cecropin tái tổ hợp cũng được tiến hành trong các hệ thống biểu hiện khác nhau như vi
khuẩn [16, 31, 34, 66], nấm men [29, 32] và côn trùng [67].

ặc biệt hệ thống biểu

hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli được rất nhiều nhà nghiên cứu lựa chọn. Năm 2006,
Liang và cs. đã tách dòng gen cecropin phân lập từ ruồi nhà Musca domestica trong
vector pGEX-4T-1; biểu hiện và tinh sạch thành công cecropin có hoạt tính từ hệ thống
biểu hiện E. coli [34]. Tương tự, hinnavinII-38- sn (một loại

MP thuộc họ cecropin)

được sản xuất tái tổ hợp trong chủng E. coli L21 (DE3) pLysS có hoạt tính kháng lại
Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Bacillus megaterium và Staphyloccus aureus
[31]. ó thể nói, nghiên cứu cecropin để có thể biến tiềm năng của nó trở thành nguồn
kháng sinh thế hệ mới cần cho cuộc chiến chống kháng kháng sinh đã và đang được
công nghệ sinh học quan tâm đặc biệt.
1.2.2.2.4. ác phương pháp thu nhận cecropin
ể thu nhận được lượng lớn cecropin, có ba con đường tiếp cận chính như sau:
(1) tách chiết từ tự nhiên; (2) tổng hợp trực tiếp theo con đường hóa học và (3) biểu
hiện cecropin tái tổ hợp trong vi khuẩn hay các hệ thống biểu hiện khác. Tách chiết
cecropin từ tự nhiên phải qua nhiều công đoạn phức tạp, khó đảm bảo về mặt sinh
khối, mức độ tinh khiết và không chủ động được nguồn nguyên liệu. Việc tổng hợp
cecropin nhân tạo bằng con đường hóa học thì lại có giá thành sản xuất cao [33].

iều

này càng trở nên khó khăn hơn trong điều kiện của các nước đang phát triển như Việt
Nam. Vì vậy, sử dụng “nhà máy vi khuẩn toàn năng” để sản xuất cecropin tái tổ hợp là
lựa chọn phù hợp nhất. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sản xuất cecropin tái tổ hợp

vừa đảm bảo có sinh khối cao, mức độ tinh khiết, hoạt tính của sản phẩm tốt, cũng như
giảm chi phí và chủ động nguồn peptide để sử dụng cho các nghiên cứu khác nhau [33,
34, 66].

ây cũng chính là con đường sản xuất ở quy mô công nghiệp của hầu hết các

kháng sinh đang dùng hiện nay.


1.3. Sản xuất cecropin theo con đường tái tổ hợp
1.3.1. ựa chọn hệ thống tế b o biểu hiện

www.promega.com/resources/produc...ression/

www.invitrogen.com/site/us/en/ho...ems.html

Dòng tế b o

Vi khu n

www.globeimmune.com/technology/

www.blueskybiotech.com/BioServic...ion.aspx

ấm men

Côn trùng

www.invitrogen.com/site/us/en/ho...ems.html

www.invitrogen.com/site/us/en/ho...ems.html

Virus
Hình 7. ác hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp.

ng vật có vú


Muốn biểu hiện được bất kỳ một protein nào thì trước hết phải lựa chọn được hệ
thống biểu hiện tức là nơi sản xuất protein tái tổ hợp. Việc này phụ thuộc rất nhiều vào
loại protein, mục đích sử dụng protein cũng như điều kiện của từng phòng thí nghiệm.
Hình 7 minh họa các hệ thống biểu hiện đang được dùng trong biểu hiện protein tái tổ
hợp hiện nay. Trong đó, hệ thống vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất để biểu hiện
protein cũng như

MPs trong đó có cecropin.

ác "nhà máy" vi khuẩn thường được

lựa chọn do chi phí thấp, sinh khối lớn và tốc độ sản xuất nhanh [16, 32]. Một số vi
khuẩn hay được sử dụng trong biểu hiện protein tái tổ hợp như E. coli, Caulobacter,
Staphylococcus, Streptomyces, Bacillus [76]. Những điểm nổi bật của các vật chủ này
là: hoạt tính protease thấp, các plasmid tương đối bền, khả năng sinh trưởng trên nhiều
loại cơ chất khác nhau và hiệu suất biểu hiện cao. Trong số các hệ thống biểu hiện vi
khuẩn thì E. coli được sử dụng phổ biến nhất để sản xuất các protein tái tổ hợp [16,
36]. Nhiều năm qua, nỗ lực tối ưu hóa E. coli thành bộ máy biểu hiện protein của các
sinh vật bậc cao đã tạo ra nhiều chủng E. coli thương mại phục vụ cho mục đích sản
xuất protein tái tổ hợp khác nhau.

hiến lược này đã tạo ra hàng loạt các “nhà máy”

biểu hiện từ E. coli như: BL21, BL21 (DE3), BL21 (DE3)-pLysS, BL21 Star-pLysS,
BL21-SI, Tuner, Tuner pLysS, Rosetta, Rosetta pLysS, … Trong số này, E. coli BL21
(DE3) là một chủng biểu hiện protein hiệu quả và phổ biến. Chủng này có ưu điểm
thiếu hụt hai protease lon và ompT, tương thích với hệ thống promoter T7 lacO (là một
promoter mạnh được sử dụng ở nhiều hệ thống vector biểu hiện). Rất nhiều nghiên cứu
AMPs nói chung và cecropin nói riêng đều cho thấy khả năng biểu hiện protein tái tổ
hợp của E. coli BL21 (DE3) là rất cao [36, 53, 65].
1.3.2. ựa chọn hệ thống vector biểu hiện
ể biểu hiện được lượng lớn protein tái tổ hợp, việc thiết kế vector biểu hiện
phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm của hệ thống biểu hiện, bản chất của protein nghiên
cứu cũng như mục đích sử dụng protein cho các nghiên cứu tiếp theo. Lựa chọn được


vector biểu hiện phù hợp là điều kiện quyết định số lượng cũng như trạng thái protein
cần tạo ra; hai yếu tố này có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất tinh sạch.
Hiện nay, do nhu cầu sản xuất

MPs tái tổ hợp ngày càng tăng nên nhiều hệ

thống vector biểu hiện đã được nghiên cứu và phát triển. Tuy nhiên, khi lựa chọn đối
tượng nghiên cứu là MPs nói chung và cecropin nói riêng thì các nhà nghiên cứu phải
chấp nhận nhiều thách thức hơn các protein thông thường khác.

ó là do cecropin là

peptide kháng khuẩn nên rất độc đối với hệ thống biểu hiện là vi khuẩn [7, 69]. Không
những thế, khi sự biểu hiện peptide độc ảnh hưởng tới vi khuẩn thì xu hướng peptide
tạo ra thường bị đóng gói ở dạng thể vùi. Việc tinh sạch protein dạng thể vùi đòi hỏi
nhiều khâu xử lý và ảnh hưởng rất nhiều tới hiệu suất tinh sạch để thu được protein có

hoạt tính. Mặt khác, AMPs có kích thước nhỏ (như cecropin thường nhỏ hơn 10 kDa)
nên rất khó biểu hiện hoặc dễ dàng bị các protease của tế bào phân hủy [36]. Giải pháp
đưa ra là phải lựa chọn vector biểu hiện sao cho cecropin được biểu hiện dưới dạng
dung hợp với 1 protein đã biết (các protein này thường được gọi là đuôi dung hợp hay
Tag). Khi được biểu hiện dưới dạng dung hợp với Tag,

MPs có xu hướng ít độc với

tế bào nên biểu hiện nhiều và tan dễ hơn [3, 33, 36]. Không những thế, do kích thước
của các Tag thường lớn nên làm cho kích thước của protein dung hợp cũng tăng lên; vì
vậy protein đích ít bị ảnh hưởng của protease. Mặt khác, các Tag này thường là các
protein có ái lực nhất định với 1 cơ chất hay phân tử nào đó, do đó quá trình tinh sạch
protein dung hợp trở nên dễ dàng và có hiệu quả nhờ phương pháp sắc ký ái lực. Với
nhiều ưu điểm như trên nên hiện nay các vector biểu hiện thường có một hay nhiều Tag
để phù hợp với các loại protein khác nhau. Tuy nhiên, các protein khác nhau khi dung
hợp với các Tag khác nhau lại cho các kết quả rất khác nhau.

iểu đồ ở Hình 8 cho

thấy rõ sự khác biệt về hiệu quả biểu hiện khi sử dụng các Tag khác nhau với AMPs ở
E. coli [33]. Trong đó, 3 loại Tag: GST, His và Trx có ưu thế nổi bật về hiệu suất sử
dụng.


Hình 8. iểu đồ biểu diễn tỉ lệ (%) các đuôi protein dung hợp (Tag) được sử dụng để
biểu hiện AMPs ở E. coli [33].

Hiện nay, các vector biểu hiện hay được sử dụng có mang ba loại Tag này là
pGEX-4T-1 (có GST Tag), pET-28a (có His Tag) và pET-32b (có Trx Tag). Ngoài
những đặc điểm cần thiết của một vector biểu hiện như có promoter mạnh, operator,

mã khởi đầu, mã kết thúc, vùng đa điểm, gen kháng kháng sinh, … thì cả ba vector
biểu hiện này còn mang nhiều đặc điểm có lợi cho quá trình biểu hiện và tinh sạch
CAMPs. Những đặc điểm này được trình bày trong ảng 4. Trong số 3 Tag này, His
Tag có khối lượng phân tử nhỏ (< 1 kDa) nên

MPs có khối lượng nhỏ như cecropin

(4-7 kDa) dù đã được dung hợp với His Tag thì khối lượng protein dung hợp vẫn chưa
được 8 kDa. Với khối lượng thấp như vậy thì dễ bị phân hủy bởi protease của vật chủ,
khó biểu hiện hoặc biểu hiện ở dạng thể vùi và rất khó phát hiện băng biểu hiện trên
điện di SDS-P GE thông thường [16, 29, 32]. Vì vậy, để thuận tiện cho quá trình biểu
hiện có thể thiết kế 2 Tag liên tiếp nhau [44, 56].