Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

NGUYỄN THỊ HẠNH

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CÁC
CHỦNG VI KHUẨN LAO Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011

1


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 9
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 12
1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO ..................................................................... 12
1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế gới ....................................................... 12
1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam ....................................................... 13
1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ VI KHUẨN LAO .................................................... 14
1.2.1. Đặc điểm phân loại ......................................................................... 14
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc ........................................................................... 14
1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy .......................................................................... 18
1.2.4. Hệ gen vi khuẩn lao ........................................................................ 20
1.3. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO ................................. 28
1.3.1. Phƣơng pháp soi trực tiếp ............................................................... 28
1.3.2. Phƣơng pháp nuôi cấy .................................................................... 28
1.3.3. Sinh học phân tử trong chẩn đoán lao ............................................ 29

1.3.4. Một số nghiên cứu về tỷ lệ khuyết gen của M.tuberculosis trên thế giới ...31
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 32
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 32
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................... 24
2.1.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ......................................................................... 32
2.2. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ........................................... 25
2.2.1. Các hóa chất và thiết bị .................................................................. 33
2.2.2. Các cặp mồi đƣợc sử dụng trong phát hiện gen đích ..................... 35
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 29
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu ........................................................................ 29
2.3.2. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................ 38

2


2.3.3. Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu ........................................... 39
2.4. PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU ..................................................... 45
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................... 46
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ KHUYẾT CÁC TRÌNH TỰ IS6110,
IS1081 VÀ 23S rDNA TRÊN CÁC CHỦNG LAO Ở VIỆT NAM ... 46
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA ................................................................. 46
3.1.2. Kết quả phát hiện các gen đích đặc trƣng của vi khuẩn lao ........... 48
3.1.3. Tỷ lệ khuyết các trình tự gen đích ở Việt Nam .............................. 57
3.2. SO SÁNH TỶ LỆ KHUYẾT CÁC TRÌNH TỰ IS6110, IS1081 VÀ 23S
rDNA TRÊN BA MIỀN BẮC TRUNG NAM TẠI VIỆT NAM .......... 58
3.2.1. So sánh tỷ lệ khuyết các trình tự IS6110 trên ba miền Bắc Trung Nam 58
3.2.2. So sánh tỷ lệ khuyết trình tự IS1081 trên các chủng lao ở ba miền
Bắc Trung Nam Việt Nam ............................................................. 59
3.2.3. So sánh tỷ lệ khuyết gen 23S rDNA trên ba miền Bắc Trung Nam
Việt Nam ........................................................................................ 59

KẾT LUẬN .................................................................................................... 61
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 61
TÀI TIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 62

3


DANH MỤC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

2.1. Các sinh phẩm hóa chất chất chính ......................................................... 34
2.2. Các máy và thiết bị chính ........................................................................ 35
2.3. Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu .......................................... 36
2.4. Chu kì nhiệt cho phản ứng multiplex PCR ............................................. 41
2.5. Thành phần phản ứng .............................................................................. 41
2.6. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 .................................... 42
2.7. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 .................................... 43
2.8. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi 23S rDNA ............................... 43
3.1. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao của Bệnh viện Lao và Bệnh
phổi Trung Ƣơng .................................................................................... 47
3.2. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao của Bệnh viện Đa khoa Trung
Ƣơng Huế ................................................................................................ 47
3.3. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao của Bệnh viện Phạm Ngọc
Thạch ....................................................................................................... 47
3.4. Kết quả phát hiện gen đích đặc trƣng ở các chủng lao miền Bắc ........... 49

3.5. Kết quả phát hiện gen đích ở miền Trung ............................................... 54
3.6. Kết quả phát hiện gen đích trên một số chủng lao miền Nam ................ 56
3.7. Kết quả kiểm tra hiện tƣợng khuyết gen ở Việt Nam ............................. 57
3.8. Tỷ lệ khuyết gen IS6110 ở ba miền Bắc Trung Nam ............................. 58
3.9. Tỷ lệ khuyết gen IS1081 ở ba miền Bắc Trung Nam ............................. 59
3.10. Tỷ lệ khuyết gen 23S rDNA ở ba miền Bắc Trung Nam ...................... 60

4


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1. Trực khuẩn M. tuberculosis .................................................................... 15
1.2. Trực khuẩn M. tuberculosis sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen ................ 15
1.3. Thành tế bào Mycobacteria ..................................................................... 18
1.4. Khuẩn lạc M. tuberculosis trên môi trƣờng Lowenstein - Jensen .......... 19
1.5. Hệ gen vi khuẩn lao ................................................................................. 20
1.6. Cấu trúc của IS ........................................................................................ 23
1.7. 6 bản copy của IS6110 trong hệ gen M. tuberculosis ............................. 25
3.1. Kết quả phát hiện 3 gen đích đặc trƣng trên một số chủng lao Miền Bắc .. 48
3.2. Kết quả phát hiện các gen đích trên các chủng lao ở miền Trung .......... 50
3.3. Kết quả phát hiện khuyết gen IS6110 trên các chủng lao ở miền Nam .. 50
3.4. Kết quả kiểm tra bằng PCR đơn với 9 mẫu nghi khuyết IS6110 tại miền
Trung ....................................................................................................... 51
3.5. Kết quả phát hiện mẫu khuyết IS1081 ở miền Trung ............................. 52

3.6. Kết quả kiểm tra bằng PCR với 1mẫu khuyết IS1081 tại miền Trung ... 52
3.7. Kết quả phát hiện mẫu khuyết 23S rDNA ở miền Trung ....................... 53
3.8. Kết quả kiểm tra bằng PCR với 1mẫu khuyết 23S rDNA tại miền Trung . 54
3.9. Kết quả phát hiện mẫu khuyết IS6110 ở các chủng lao miền Nam ........ 55
3.10. Kết quả kiểm tra bằng PCR với 3 mẫu khuyết IS6110 tại miền Nam .. 56

5


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1.AFB:

Acid Fast Bacilli

2. BCG:

Bacille Calmette-Guérin (Trực khuẩn Calmette-Guérin)

3. bp :

Base pairs (cặp base)

4. DNA:

Deoxyribonucleic acid

5. dNTPs:

Deoxynucleotide triphophates

6. DR:

Direct Repeat (Đoạn lặp lại trực tiếp)

7. EDTA:

Ethylene Diamine Tetra Acid

8. GuSCN:

Guanidinium thiocyanate

9. IR:

Inverted Repeat (Đoạn lặp lại ngƣợc chiều)

10. kDa:

Kilo – Dalton

11. IS:

Insertion Sequence (Trình tự chèn)

12. LAM:

Lipoarabinomannan

13. MGIT:

Mycobacteria Growth Indicator Tube

14. MTBC:

Mycobacteria tuberculosis complex

15.MOTT:

Mycobacteria other than tuberculosis

16. OD:

Optical Density (Mật độ quang học)

17. ORF:

Open Reading Frame (Khung đọc mở)

18. PCR:

Polymerase Chain Reaction

19. PCR-RFLP: Polymerase Chain Reacion – Restriction fragment length
polymorphism (Phân tích đa hình độ dài các đoạn giới hạn dựa trên PCR)
20. PE:

Proline – Glutamine

21. PGL:

Phenolic glycolipids

22. PGRS:

Polymophic GC – rich Repetive Sequences (Trình tự lặp lại

giàu G-C)
23. RNA:

Ribonucleic acid

6


24. TB:

Tuberculosis (Bệnh lao)

25. TBE:

Tris – Boric Acid – EDTA

26. UV:

Ultraviolet (tia tử ngoại)

27. WHO:

World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

7


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin được bày lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
thầy: PGS. TS Nguyễn Thái Sơn, người đã truyền dạy trang bị kiến thức quý
báu, cung cấp nhiều tài liệu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để cho tôi
hoàn thành tốt đề tài luận văn này. Trong suốt thời gian học cũng như thực
hiện đề tài luận văn tại Phòng Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học – Trung
tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học – Học viện Quân Y tôi luôn được
sự quan tâm giúp đỡ ân cần và hướng dẫn tận tình của thầy. Nhân dịp này
một lần nữa tôi xin được gửi lời cảm ơn, lời chúc chân thành tới thầy cùng
gia đình.
Bên cạnh đó tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các
thầy, cô trong Bộ môn Vi sinh vật, Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên. Các thầy cô đã nhiệt thành trang bị những kiến thức khoa học và
cuộc sống trong suốt thời gian tôi học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể ban lãnh đạo Trung tâm nghiên
cứu ứng dụng Sinh Y Dược học – Học viện Quân Y, đặc biệt là các thành viên
tại Phòng Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học đã luôn giúp đỡ và tạo điều
kiện tốt nhất để tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn này.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã
luôn động viên, khích lệ giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi học tập
và hoàn thành luận văn này.
Mặc dù đã cố gắng hết mình để hoàn thành luận văn này, nhưng chắc
chắn không tránh khỏỉ những sai xót, rất mong được sự tận tình chỉ dẫn và
góp ý quý thầy cô.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày 22 tháng 12 năm 2010

Học viên

Nguyễn Thị Hạnh

8


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội loài ngƣời ngày càng phát triển, cùng với nó là sự bùng nổ của
các đại dịch mà nổi bật nhất là lao, HIV và sốt rét. Theo thống kê của tổ chức
Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới. Mỗi
năm theo ƣớc tính có khoảng 9 triệu ngƣời mắc lao mới và có khoảng 3 triệu
ngƣời chết vì lao, tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện bệnh chỉ đạt 37%. Nhƣ vậy còn
rất nhiều bệnh nhân mắc lao không đƣợc phát hiện và chữa trị kịp thời, đây sẽ
là nguồn lây nhiễm rất khó kiểm soát. Việt Nam hiện đứng thứ 12 trong tổng
số 22 nƣớc có tỉ lệ nhiễm lao lớn nhất trên Thế giới, trong khu vực Tây Thái
Bình Dƣơng đứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philippin [2, 10, 54].
Ngày nay bệnh lao càng trở nên nguy hiểm hơn do tính kháng thuốc,
đặc biệt là lao kháng đa thuốc gây tử vong rất lớn, do vậy, việc phát hiện để
điều trị sớm càng trở nên cần thiết. Tuy nhiên việc chẩn đoán còn gặp rất
nhiều khó khăn. Ở Việt Nam, phƣơng pháp nhuộm Ziehl - Neelsen hiện nay
vẫn đƣợc coi là phổ biến nhất. Hạn chế của phƣơng pháp này là chỉ có khả
năng phát hiện trong trƣờng hợp số lƣợng vi khuẩn lao ≥ 104 AFB/1ml bệnh
phẩm, do vậy nếu chỉ áp dụng phƣơng pháp này sẽ để sót nhiều bệnh nhân.
Phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trƣờng Lowenstein-Jensen đƣợc
coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán, tuy nhiên phải mất 4 đến 8 tuần nuôi cấy
mới cho kết quả. Ngay cả trên môi trƣờng nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC
cũng mất đến 2 tuần, điều này khó đáp ứng đƣợc mục tiêu phát hiện nhanh để
kiểm soát bệnh lao [4, 18].
Trƣớc yêu cầu bức thiết đó đòi hỏi phải có một phƣơng pháp chẩn đoán

đáp ứng đƣợc hai yêu cầu nhanh và chính xác. Ngày nay sự phát triển mạnh

9


mẽ của sinh học phân tử đã tạo ra một bƣớc đột phá trong việc chẩn đoán lao.
Nhờ ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán lao đã rút ngắn
thời gian chẩn đoán từ vài tuần xuống còn hai ngày với độ nhạy và độ đặc
hiệu cao, ngoài ra phƣơng pháp này còn cho phép phân biệt chính xác các loài
có khả năng gây bệnh lao cũng nhƣ phát hiện khả năng kháng thuốc thông
qua các gen đặc trƣng. Hiện nay, trên thế giới và một số cơ sở trong nƣớc
đang ứng dụng phản ứng PCR nhằm khuếch đại các đoạn gen IS6110, đây là
trình tự đặc trƣng ở vi khuẩn lao.
Tuy nhiên một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có những chủng
lao ở Đông Nam Á trong đó có Việt Nam có một tỉ lệ nhất định khuyết các
gen đích này, cụ thể là IS6110 có tỷ lệ khuyết từ 5% đến 8% [25, 30, 32. 40].
Một số nghiên cứu đề xuất chọn các gen đích khác là IS1081 và 23S rDNA
thay cho gen đích IS6110 nhƣng chúng ta chƣa có một nghiên cứu rộng khắp
các chủng lao ở Việt Nam để khẳng định rằng có hay không hiện tƣợng
khuyết gen đích, và nếu có thì tỷ lệ đó là bao nhiêu. Điều này rất quan trọng
vì khi khuyết gen đích thì phản ứng PCR nhằm vào gen đó không có giá trị
chẩn đoán. Nghiên cứu về các gen đích này đồng thời cũng góp phần xây
dựng nên sự hoàn thiện trong việc xác định đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao
ở Việt Nam [13, 30].
Nhận thấy vấn đề này có vai trò quan trọng trong hƣớng phát triển sinh
học phân tử trong việc chẩn đoán lao để có thể thiết kế các bộ kit PCR phù
hợp với đặc điểm riêng của các chủng lao trong cả nƣớc để tránh trƣờng hợp
bỏ sót bệnh nhân.
Từ những vấn đề trên chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác
định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam”. Đề

tài tiến hành khảo sát trên số lƣợng lớn các chủng vi khuẩn lao đƣợc thu thập
ở ba miền Bắc – Trung – Nam Việt Nam với hai mục tiêu sau:

10


1. Xác định tỷ lệ xuất hiện các trình tự đặc trƣng IS6110, IS1081 và 23S
rDNA trên các chủng vi khuẩn lao.
2. So sánh tỷ lệ xuất hiện các trình tự IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên
các chủng lao ở ba miền Bắc – Trung – Nam tại Việt Nam.

11


Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO
1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế gới
Lao là một bệnh truyền nhiễm và đã từng đƣợc Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) khuyến cáo về tình trạng khẩn cấp toàn cầu của căn bệnh này. Hiện
nay, bệnh lao đang đƣợc khuyến cáo là một trong ba bệnh truyền nhiễm nguy
hiểm nhất trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch AIDS và sốt
rét. Hiện có tới hơn 2 tỷ ngƣời nhiễm lao chiếm gần 1/3 dân số thế giới, mỗi
năm có khoảng 9 triệu bệnh nhân mới đƣợc phát hiện và trên 3 triệu ngƣời
chết vì lao [2]. Tình hình cũng diễn biến xấu hơn ở những nƣớc đang phát
triển, nơi chiếm 95% số ngƣời mắc lao. Bệnh lao chiếm 25% nguyên nhân tử
vong ở những nƣớc này. Khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22
quốc gia có gánh nặng bênh tật cao. Đặc biệt trong những năm gần đây tình
hình lao đồng nhiễm với HIV – AIDS và lao kháng thuốc đang nổi lên nhƣ
một vấn đề nhức nhối, đặc biệt là ở các nƣớc kém và đang phát triển, điều này

đòi hỏi sự vào cuộc của toàn xã hội. Theo thống kê năm 2005 toàn thế giới có
gần 8,8 triệu ngƣời mắc bệnh lao và đã dẫn tới 1,6 triệu ngƣời bị chết.
Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số ngƣời chết do lao ở các nƣớc có thu
nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động.
Trong đó có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nƣớc có gánh
nặng bệnh lao [54, 69]. Vào năm 2007, WHO ƣớc tính khu vực Đông Nam Á
có số ngƣời nhiễm lao chiếm 34% trên toàn thế giới.
Thông báo gần đây nhất năm 2007 của WHO cho biết bệnh lao bƣớc đầu
đã ổn định và giảm đi ở cả 6 vùng trên thế giới. Tuy nhiên số lƣợng các ca
mới nhiễm trên toàn cầu vẫn tăng lên và tập trung ở các khu vực châu Phi,

12


Đông Địa Trung Hải và Đông Nam Á. Tình hình trên cho thấy là bệnh lao vẫn
là mối nguy hại hàng đầu đối với loài ngƣời [54].
1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Theo đánh giá của WHO, Việt Nam đứng hàng thứ 12 trong 22 nƣớc có
số bệnh nhân lao cao nhất thế giới. Tại khu vực Tây Thái Bình Dƣơng,
Việt Nam đứng hàng thứ 3 sau Trung Quốc và Phillipin. Tỷ lệ mắc bệnh
lao tại Việt Nam cao hơn 1,6 lần so với ƣớc tính của WHO, nghĩa là có
khoảng 150.000 bệnh nhân lao các thể. Theo WHO thì Việt Nam là nƣớc có
gánh nặng bệnh lao cao với khoảng 44% dân số nhiễm lao. Trong đó tỷ lệ lao
mới mắc các thể là 173/100.000 dân, tỷ lệ hiện mắc các thể là 225/100.000
dân, tỷ lệ tử vong là 26/100.000 dân, tỷ lệ đồng nhiễm lao/HIV trong các bệnh
nhân lao mới là 5% [2].
Theo báo cáo của Chƣơng trình Phòng chống lao quốc gia, hàng năm Việt
Nam phát hiện và điều trị khoảng 100.000 bệnh nhân lao, trong đó 65% là lao
phổi và tập trung ở các vùng đông dân cƣ và thành phố lớn. Bệnh lao ở Việt
Nam đang có xu hƣớng trẻ hóa, rất nhiều thanh niên và ngƣời trong độ tuổi

lao động mắc lao. Trong giai đoạn 1997 đến 2000, chƣơng trình chống lao
Quốc Gia đã phát hiện hơn 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện ƣớc
tính đạt 82% số bệnh nhân. Đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ
khỏi 92% [2, 9, 42]. Đáng ngại là tỷ lệ lao kháng thuốc ở Việt Nam, tỷ lệ lao
kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới là 2,7% và tỷ lệ lao kháng đa thuốc
trong số bệnh nhân điều trị lại là 19%. Nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nƣớc
ta ƣớc tính là 1,5% [2].
Những năm gần đây việc áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR vào
chẩn đoán lao đã mang lại nhiều kết quả khả quan, với các kĩ thuật trên đã rút
ngắn thời gian chẩn đoán và cho độ chính xác cao. Tuy vậy cần có các nghiên

13


cứu nhằm hiểu rõ hơn về đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao nhằm hoàn thiện
hơn kĩ thuật chẩn đoán lao bằng phƣơng pháp phân tử.
1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ VI KHUẨN LAO
1.2.1. Đặc điểm phân loại
Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ
Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, giống
Mycobacterium. Vi khuẩn lao có tên khoa học là: Mycobacterium
tuberculosis [15].
Các chủng vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium đƣợc chia làm 2 nhóm
 Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm:
M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti. Trong đó M.
tuberculosis và M. bovis gây bệnh lao điển hình.
 Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm:
M. avium, M. ortuitum, M. govdovac, M. kansasii... Nhóm này không
gây bệnh lao.
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc

1.2.2.1. Cấu trúc hình thái
Vi khuẩn lao đƣợc phát hiện bởi Robert Koch khoảng 100 năm trƣớc
đây. Trực khuẩn lao có hình que, kích thƣớc 2-3 µm, dày 0,3 µm. Khi nhuộm
Ziel-Nellsen trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, không bị cồn và axit làm mất
màu fucsin, do vậy chúng đƣợc gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid
fast bacilli-AFB). Đây là đặc điểm nổi bật của Mycobacteria có thể giúp phát
hiện vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm. Trực khuẩn lao trong dịch huyền
phù duy trì tính kháng axit trong khoảng thời gian rất dài kể cả khi chịu tác
dụng của nhiệt. Trực khuẩn lao có khả năng thực hiện tất cả các cơ chế cần
14


thiết để tổng hợp các vitamin, axit amin và các enzyme co-factor thiết yếu cho
tế bào [3, 4, 5, 10]

Hình 1.1. Trực khuẩn M. tuberculosis

Hình 1.2. Trực khuẩn M. tuberculosis

[55]

sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen [55]

1.2.2.2. Cấu trúc thành tế bào
Cấu trúc thành tế bào của M. tuberculosis chia thành 4 lớp, nhờ đó giúp
bảo vệ tế bào khỏi áp suất thẩm thấu, kiểm soát con đƣờng hoà tan giữa tế bào
chất và môi trƣờng.
Lớp trong cùng là cấu trúc màng sinh chất có thành phần chủ yếu là các
phospholipid. Các phân tử phospholipid bao gồm hai nhóm, nhóm ƣa nƣớc
hƣớng về bên trong và nhóm kị nƣớc hƣớng về bên ngoài, quay ra phía vỏ

[1]. Màng sinh chất của mycobacteria điều hoà sự thẩm thấu giữa nguyên sinh
chất và môi trƣờng, màng chứa các protein có chức năng khác nhau nhƣ phân
tử nhạy với nồng độ của các phân tử trong môi trƣờng, các protein truyền tín
hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất, các
enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lƣợng, các chất
mang làm trung gian cho vận chuyển các chất dinh dƣỡng và các ion. Các
enzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia
tế bào, tập hợp và tiết một số protein ngoại bào, sao chép DNA [3, 4, 11].

15


Lớp tiếp theo là peptidoglican liên kết với đƣờng arabinose và các phân
tử axit mycolic tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vỏ
vi khuẩn có độ cứng nhất định [1]. Thành tế bào của Mycobacteria là cấu trúc
phức tạp nhất đƣợc biết ở prokaryote, có một số thành phần hoá học và nhiều
liên kết chéo bất thƣờng, mức độ liên kết giữa peptidoglycan ở thành tế bào
M. tuberculosis là 70-80% trong khi ở E. coli là 20-30% [45].
Lớp ngoài là lớp đƣợc tạo nên bởi sự liên kết giữa các axit mycolic và
các lipid phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc
làm tăng khả năng chống thấm nƣớc của thành vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn
tại lâu với môi trƣờng bên ngoài, chống khả năng bị huỷ diệt bởi đại thực bào
và các tế bào miễn dịch [1]. Bám với peptidoglycan là một polysaccharide
phân nhánh, arabinogalactan, đầu ngoài của các phân tử này đƣợc ester hoá
với axit béo có khối lƣợng phân tử cao là axit mycolic. Sự sắp xếp của các
axit mycolic có tính đặc hiệu loài cho phép xác định loài mycobacteria bằng
sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký khí-lỏng. Các axit
mycolic đặc hiệu M. tuberculosis là alpha-keto và mythoxymycolate chứa 76
đến 82, 84 đến 89 và 83 đến 90 carbon. Lớp ngoài của thành tế bào có các
phân tử lipid tự do nhƣ phthiocerol dimycoserosates (PDIM), phenolic

glycolipids (PGL), trehalose-containing glycolipids và sulfolipids (SL). Nằm
ngang qua toàn bộ lớp màng là một số glycolipid nhƣ phosphatidylmyoinositol mannosides, lipomannan (LM) và lipoarabinomannan (LAM),
đƣợc đính vào màng sinh chất và mở rộng ra bên ngoài thành tế bào trong đó
LAM có tính đặc hiệu loài. Thành tế bào mycobacteria chứa các protein nằm
rải rác, một vài protein này có tác dụng cấu trúc thành tế bào, một số protein
porin hình thành các kênh ƣa nƣớc cho phép vận chuyển tích cực các chất tan
trong nƣớc thông qua lớp axit mycolic. Porin ở mycobacteria khác so với các
vi khuẩn Gram âm [44, 51].

16


Lớp ngoài cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vi
khuẩn lao phát triển bên trong tế bào, nó có tác dụng tăng cƣờng nhƣ một lớp áo
giáp cho các vi khuẩn nằm trong tế bào chống đƣợc các enzyme phân giải từ các
lysozyme của tế bào [1]. Khi phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy lỏng hoặc
trong đại thực bào, M. tuberculosis tích luỹ một capsule giả không bám. Thành
phần của capsule chứa protein, polysaccharide và lƣợng nhỏ lipid. Cấu thành của
capsule có thể bung ra trong in vivo bên trong các đại thực bào. Màng tế bào của
vi khuẩn lao gây bệnh đa phần giống với màng của các mycobacteria trong cùng
một giống bao gồm cả mycobacteria không gây bệnh.
Màng tế bào của vi khuẩn lao là một cấu trúc linh động có thể thay đổi
khi phát triển hoặc tồn tại trong các môi trƣờng khác nhau. Trong điều kiện
thiếu oxy thành tế bào sẽ dày lên, sự biểu hiện của các gen mã hoá cho các
porin dƣờng nhƣ đƣợc điều hoà ngƣợc trong các điều kiện môi trƣờng nhất
định nhƣ trong môi trƣờng nuôi cấy axit nhẹ cũng nhƣ trong khoang đại thực
bào. Ngoài ra sự hình thành cấu trúc cord liên quan đến Trehalose 6, 6’dimycolate là một glycolipid chứa hai phân tử axit mycolic bám lỏng lẻo ở
lớp ngoài của thành tế bào. Rất nhiều các hoạt tính sinh học liên quan đến khả
năng gây bệnh, tính sinh độc tố và bảo vệ chống lại đáp ứng của tế bào chủ [3,
4, 11].

Ở điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao có thể tồn tại trong 3 đến 4 tháng.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm vi khuẩn lao có thể đƣợc bảo quản trong
nhiều năm. Tuy nhiên dƣới ánh sáng mặt trời trực tiếp thì sau 5 phút vi khuẩn
lao sẽ bị tiêu diệt. Dƣới ánh sáng của tia cực tím, vi khuẩn lao chỉ tồn tại đƣợc
2 đến 3 phút. Ở nhiệt độ 42o C vi khuẩn lao ngừng phát triển, ở nhiệt độ 80o C
vi khuẩn lao chết sau 10 phút [1, 8].

17


1- Lipid ngoài
2- Axit mycolic
3- polysaccharides
(arabinogalactan)
4- peptidoglycan
5- màng sinh chất
6- lipoarabinomannan (LAM)
7- phosphatidylinositol
mannoside
8- Khung thành tế bào
Hình 1.3. Thành tế bào Mycobacteria
[ />
1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy
Trực khuẩn lao là vi khuẩn ƣa khí bắt buộc, không mọc đƣợc ở điều
kiện kị khí. Nhiệt độ thích hợp để mọc là 37oC. Hầu nhƣ không mọc ở nhiệt
độ dƣới 37oC hoặc trên 42oC.
Vi khuẩn lao phát triển trong môi trƣờng đặc biệt giàu chất dinh dƣỡng,
chứa trứng, khoai tây, xitrat, glixerol, asparagin, xanh malachit. Môi trƣờng
thƣờng dùng là môi trƣờng đặc Loewenstein đƣợc cải tiến bởi Jensen; (hoặc
môi trƣờng lỏng Sauton).

Trực khuẩn lao là vi khuẩn mọc chậm, phải 4-6 tuần sau mới hình
thành khuẩn lạc điển hình, dạng R.

18


Hình 1.4. Khuẩn lạc M. tuberculosis trên môi trƣờng Lowenstein - Jensen
[www.stanford.edu/.../tb%20culture.jpg]

Trực khuẩn M. tuberculosis gây bệnh phát triển thành các khuẩn lạc xù xì bề
mặt ngoài dính và uốn khúc. Trong khi đó các Mycobacteria không gây bệnh và
các trực khuẩn lao bị làm yếu đi trong nuôi cấy kéo dài thƣờng mọc khuẩn lạc
nhẵn, tạo thành đám trong môi trƣờng nuôi cấy [3, 4, 11, 45].
Thời gian phân chia: Ở điều kiện phòng thí nghiệm, M. tuberculosis cứ
12 đến 24 giờ phân chia một lần. Tốc độ phân chia chậm này có thể do tính
thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ các chất dinh dƣỡng và
liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome. Harshey và Ramakrishnan đã xác
định rằng sự tổng hợp RNA là một tác nhân chính liên quan đến thời gian
sống dài của trực khuẩn. Tỷ lệ RNA/DNA, tốc độ kéo dài chuỗi RNA chậm
hơn 10 lần so với E. coli. Hơn nữa, khi trực khuẩn chuyển từ trạng thái ổn
định sang pha phân chia thì RNA tổng số chỉ tăng lên hai lần. Kết quả là tổng
hợp protein bị chậm lại [45].

19


1.2.4. Hệ gen vi khuẩn lao
1.2.4.1. Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis

Hình 1.5. Hệ gen vi khuẩn lao

M. tuberculosis H37Rv (Cole 1998a) chứa một trình tự gồm 4.411.529
bp, có đặc tính chứa nhiều Guanine và Cytosine (G+C 65,61%) không thay
đổi ở các vị trí khác nhau trong toàn bộ hệ gen, kiểm chứng cho giả thuyết là
không có các nhân tố chuyển gen theo phƣơng ngang trong hệ gen M.
tuberculosis [22, 29, 45].
Ở Mycobacteria có một nhóm gen với tỷ lệ G+C cao (>80%) mã hoá
cho họ protein PE (Pro-Glu) hoặc PPE (Pro-Pro-Glu). Trình tự PE và PPE có
ở vùng đầu N và bảo thủ trong từng họ protein, chiều dài lần lƣợt xấp xỉ 110
và 180 amino axit. Trong 172 gen thì có 104 gen mã hoá PE và 68 mã hoá
PPE chiếm hơn 4% các gen của M. tuberculosis. Các protein PE và PPE đóng
một vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên và sống sót của mycobacteria
trong các môi trƣờng khác nhau. Họ PE đƣợc chia thành 3 phân họ, họ quan
trọng nhất chứa các trình tự đa hình giàu G-C (PGRS) và có 61 thành viên.
Các protein đƣợc mã hoá bởi các gen 104 PE đƣợc chia nhỏ hơn thành 3 lớp,
lớp thứ nhất chứa 29 protein chỉ với vùng PE, lớp thứ hai gồm 8 protein trong
đó vùng PE đi kèm với các trình tự đầu C độc lập, và lớp thứ ba gồm 67
20


protein tạo thành dƣới họ PE-PGRS. PGRS (polymorphic GC-rich repetitive
sequences) là nhóm các protein có vùng PE bảo thủ và đầu C mở rộng với sự
lặp lại nhiều lần Gly-Gly-Ala hoặc Gly-Gly-Asn. Chức năng của các họ này
vẫn chƣa biết rõ nhƣng có một số giả thuyết cho rằng một số protein này có
liên quan đến tính đa dạng kháng nguyên của M. tuberculosis trong quá trình
lây nhiễm [29, 45, 49]. Các protein PE-PGRS đặc trƣng cho M. tuberculosis
có chức năng ức chế trình diện kháng nguyên thông qua phức hệ hoà hợp tổ
chức (MHC) lớp I [45]. Một số gen PE mã hoá cho các protein chỉ chứa vùng
110 axit amin đƣợc đi kèm gần với một gen mã hoá một protein PPE. Trong
một số trƣờng hợp, cặp PE-PPE (Rv2431c-Rv2430c) biểu hiện cùng nhau và

có thể tạo thành một phức hệ [45, 46, 50].
Trong hệ gen của H37Rv có ít gene với tỷ lệ G+C thấp (<50%) mã hoá
cho các protein xuyên màng hoặc enzyme polyketide synthase. Hơn 6% các
gen đã đƣợc nghiên cứu mã hóa cho các enzyme của quá trình trao đổi axit
béo. Trong số này có khoảng 3% gen đƣợc dự đoán về chức năng trong oxy
hoá β của các axit béo, trong khi E. coli chỉ có 50 enzyme liên quan đến
chuyển hoá axit béo. Phần lớn các enzyme ở M. tuberculosis đƣợc cho là sử
dụng axit béo có thể liên quan đến khả năng gây bệnh phát triển trong mô của
vật chủ nơi mà axit béo có thể là nguồn carbon chính [29, 45, 49].
Trong số 50 gen mã hoá cho các RNA chức năng thì chỉ có một operon
RNA ribosome, operon này nằm ở vị trí cách 1,5 Mbp so với vị trí khởi đầu
sao mã (losus oriC). Đa số vi khuẩn có nhiều hơn một operon rrn định vị gần
locus oriC để tăng quá trình sao mã. Vi khuẩn lao chỉ có một operon rrn đơn
ở một vị trí tƣơng đối xa so với oriC do đó gây ra kiểu hình phát triển chậm.
Phát hiện hai thể tiền thực khuẩn trong genome, cả hai giống nhau về độ dài
và cách tổ chức. Một là prophage PhiRv1 có trong hệ gen của M. tuberculosis
H37Rv phá vỡ trình tự lặp lại của họ 13E12. Hệ gen của M. tuberculosis chứa

21


7 vị trí cho PhiRv1 chèn vào do đó các chủng có những vị trí biến đổi cao
trong hệ gen. Prophage thứ hai PhiRv2 ổn định hơn, ít biến đổi hơn giữa các
chủng. Các gen mã hoá protein ở M. tuberculosis H37Rv mã hoá cho 3.924
ORF (Open Reading Frame), sự khởi đầu khác ở codon GTG đƣợc sử dụng
trong 35% trƣờng hợp so với 14% hoặc 9% trong Bacillus subtilis hoặc
Escherichia coli. Từ trình tự hệ gen cho thấy M. tuberculosis có khả năng
chuyển từ một con đƣờng trao đổi chất này thành con đƣờng trao đổi chất
khác bao gồm cả hiếu khí và hô hấp kỵ khí . Tính mềm dẻo này rất có lợi cho
sự sống sót trong các môi trƣờng khác nhau bên trong cơ thể ngƣời cả trong

trạng thái áp lực oxy cao trong phế nang và các điều kiện kỵ khí, vi kỵ khí
trong các nang lao. Một đặc tính nữa của hệ gen M. tuberculosis là có các gen
tổng hợp và phân huỷ hầu nhƣ tất cả các loại lipid nhƣ các axit béo và các
phân tử phức nhƣ axit mycolic. M. tuberculosis có các gen mã hoá cho 250
enzyme khác nhau liên quan đến trao đổi axit béo, so với 50 loại trong hệ gen
của E. coli [35]. Trong số các protein điều khiển, M. tuberculosis có 13 yếu tố
sigma (protein liên quan đến tính đặc hiệu sao mã trên RNA polymerase)
tƣơng ứng 0,3% tổng số gen và 22 protein điều khiển khác bao gồm 13 nhân
tố điều khiển đáp ứng hai thành phần, tƣơng ứng 0,6% tổng số. Số lƣợng
tƣơng ứng trong M. tuberculosis là 125 gen đƣợc nghiên cứu cho các chức
năng vận chuyển, tƣơng ứng 3% tổng số [50].
Trong hệ thống trao đổi chất DNA của M. tuberculosis có một hệ thống
sửa chữa DNA rất hiệu quả, bộ máy sao chép có độ chính xác cao. Hệ gen của
M. tuberculosis không có hệ thống sửa chữa bắt cặp sai dựa trên mutS nhƣng
đƣợc khắc phục bởi sự có mặt của gần 45 gene liên quan đến các cơ chế sửa
chữa DNA, bao gồm 3 bản copy của gen mutT. Gen này mã hoá cho enzyme
chịu trách nhiệm loại bỏ các Guanine đã bị oxy hoá gây ra sự bắt cặp sai giữa
các cặp base trong quá trình sao chép [22, 29, 45].

22


1.2.4.2. Các trình tự chèn
 Cấu tạo:
Một trong những đặc tính đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng nhất của M.
tuberculosis là sự có mặt và phân bố của trình tự chèn (IS), trong đó đặc biệt
là trình tự IS6110 là một trình tự thuộc họ IS3 đƣợc sử dụng rộng rãi trong
nghiên cứu dịch tễ học phân tử vì sự thay đổi ở vị trí chèn và số lƣợng bản
copy trong bộ gen. Các trình tự chèn không có chức năng mã hoá mà chỉ liên
quan đến đặc tính biến đổi và di chuyển. Chúng gồm các yếu tố cis, các trình

tự DNA hoạt động ở hai đầu và enzyme Tpase, enzyme này đƣợc mã hoá
bởi một hoặc hai khung đọc mở và sử dụng hầu nhƣ toàn bộ độ dài của trình
tự chèn.

Hình 1.6. Cấu trúc của IS
- IRL - left inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên trái
- IRR - right inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên phải
- Khung đọc mở mã hoá transposase bao gồm toàn bộ độ dài của IS và trình
tự IRR.
- XYZ chứa các trình tự lặp lại trực tiếp ngắn được sinh ra do quá trình chèn
của IS vào vị trí đích
- p: Promotor định vị trong IRL có hai vùng. Vùng I chứa các cặp base ở tận
đầu của IS cần thiết cho sự nhận biết các trình tự chèn thông qua Tpase.
Vùng II chứa các cặp base cần thiết cho quá trình nhận ra các trình tự đặc
hiệu và gắn của Tpase

23


 Các trình tự lặp lại đảo ngƣợc ở hai đầu:
Trừ một vài trƣờng hợp đáng chú ý (IS91, IS110 và họ IS200/605) đa số
các trình tự chèn có các trình tự lặp lại ngƣợc chiều ở hai đầu (IR-Inverted
Repeat) khoảng 10 đến 40 bp. IR đƣợc phân thành hai vùng chức năng, một
định vị trong IR và liên quan đến chức năng gắn Tpase, vùng chức năng kia
gồm 2 hoặc 3bp ở cuối liên quan đến sự phân cắt và các phản ứng chuyển
chuỗi dẫn đến chuyển vị trí của các trình tự chèn. Các promoter của IS thƣờng
định vị một phần bên trong trình tự IR về phía đầu gen Tpase, sự sắp xếp này
có thể cung cấp một cơ chế tự điều hoà sự tổng hợp Tpase bằng cách gắn
Tpase. Các vị trí gắn các protein đặc hiệu cũng đƣợc tìm thấy bên trong hoặc
ở gần đầu IR, và đóng vai trò kích hoạt tính di chuyển hoặc biểu hiện Tpase.

 Cấu trúc vùng Tpase:
Hoạt tính gắn vào các trình tự DNA đặc hiệu của các protein đƣợc quy
định ở vùng đầu N trong khi vùng xúc tác thƣờng đƣợc quy định ở vùng C.
Cấu trúc này tạo nên sự tƣơng tác của phân tử protein mới sinh với các trình
tự đích trên IS.
 Các đoạn lặp lại trực tiếp:
Đặc điểm khác của IS là có khả năng chèn, đa số tạo nên các trình tự DNA
ngắn lặp lại trực tiếp (DR-Direct Repeat), độ dài của DR vào khoảng từ 2 đến
14bp, chèn vào chuỗi DNA tại các vị trí nhất định.
 Chức năng của IS:
Một số trình tự chèn có tác dụng hoạt hoá sự biểu hiện của các gen lân
cận, trong trƣờng hợp di chuyển tạo nên vị trí thích hợp thì các promoter mới
có khả năng điều khiển sự biểu hiện của các gen bên cạnh.
Thông qua biểu hiện và hoạt động của Tpase nhƣ cô lập các tín hiệu khởi
đầu dịch mã, thay đổi khung dịch mã, kết thúc dịch mã, tác động đến sao mã
và độ bền của Tpase [45].

24


 Trình tự IS6110
Trình tự IS6110 (IS – Insertion Sequence) đƣợc mô tả lần đầu tiên vào
năm 1989. IS6110 có nhiều bản copy (4 đến 25 bản copy), số lƣợng bản
copy IS6110 có trong hệ gen thay đổi và phụ thuộc vào loài và chủng.
Genome của M. tuberculosis gồm 44.411.529 cặp base với 4000 gen, trong
đó trình tự IS6110 tồn tại rải rác nhiều nơi, nó không có chức năng mã hóa
mà chỉ liên quan tới tính biến đổi và di truyền. IS6110 là một trình tự chèn
chứa 1355 bp và thuộc về họ IS3 của các trình tự chèn. IS6110 đã đƣợc xác
định là có mặt trong các chủng M. tuberculosis, và chỉ khác nhau ở một vài
nucleotid giữa các bản copy với nhau. IS6110 có trình tự rất bảo thủ do đó

nó đƣợc chọn làm gen đích trong phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện
M. tuberculosis [13]. Từ lâu IS6110 đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng rộng
rãi mặc dù trong trình tự genome của M. tuberculosis hơn 30 yếu tố lặp lại
có giá trị nhận diện [52]. Tuy nhiên một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ở
một số vùng trên thế giới các chủng lao có rất ít hoặc thậm chí không có
các trình tự IS6110 [24, 32].

Hình 1.7. 6 bản copy của IS6110 trong hệ gen M. tuberculosis

Sự thay đổi về số lƣợng bản copy này là nền tảng của tính đa hình và
thƣờng đƣợc sử dụng trong fingerprinting M. tuberculosis. Những chủng chứa

25