Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật sinh hương trong công nghệ sản xuất nước mắm (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

NGHIÊM THỊ HƢƠNG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH HƢƠNG
TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT NƢỚC MẮM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

1


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

1

Chƣơng 1- TỔNG QUAN

2

1.1.Giới thiệu chung về nƣớc mắm

2

1.1.1. Giá trị dinh dƣỡng của nƣớc mắm

2

1.1.2. Nguyên liệu.

3

1.2. Quy trình sản xuất nƣớc mắm truyền thống

8

1.2.1. Quá trình thuỷ phân, lên men nƣớc mắm

8

1.2.2. Quy trình sản xuất

14

1.3. Quy trình sản xuất nƣớc mắm có bổ sung enzyme protease

18

thƣơng mại (quy trình sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày)
1.3.1. Quy trình sản xuất

19

1.3.2. Thuyết minh quy trình

19

1.4. Các nghiên cứu về hƣơng nƣớc mắm

20

1.4.1 Mối liên quan giữa nguyên liệu và hƣơng nƣớc mắm.

20

1.4.2.Các thành phần hóa học của nƣớc mắm liên quan đến hƣơng

22

vị của nƣớc mắm cổ truyền.
1.4.3. Liên hệ giữa vi sinh vật và hƣơng nƣớc mắm.

23

Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

25

2.1 Nguyên liệu

25

2.2 Hóa chất và thiết bị.

25

2.2.1. Hóa chất

25

2


2.2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu

25

2.3. Môi trƣờng phân lập và nuôi cấy vi sinh vật

26

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

27

2.4.1. Phƣơng pháp vi sinh

27

2.4.2. Phƣơng pháp sinh hóa

32

2.4.3 Phƣơng pháp tính toán thống kê

33

2.4.4. Phƣơng pháp cảm quan

34

2.4.5 Nghiên cứu tỷ lệ bổ sung các chủng vi khuẩn sinh hƣơng

35

trong sản xuất nƣớc mắm
2.4.6. Phƣơng pháp phân tích

35

Chƣơng 3: KẾT QUẢ, THẢO LUẬN

39

3.1. Xác định thành phần nguyên liệu cá

39

3.2. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật.

40

3.2.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sinh proteaza

40

trong môi trƣờng có nồng độ muối cao.
3.2.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn, sinh proteaza, sinh

41

hƣơng cho sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày.
3.2.3. Định tên các chủng vi khuẩn chịu mặn, sinh tổng hợp

43

proteaza, sinh hƣơng ứng dụng cho sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày.
3.3. Nghiên cứu tỷ lệ bổ sung các chủng vi khuẩn sinh hƣơng trong
sản xuất nƣớc mắm.

50

3.3.1 Nghiên cứu sự kết hợp các chủng vi khuẩn tới khả năng sinh

50

hƣơng
3.3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng tỉ lệ vi khuẩn bổ sung đến khả năng

3

39


sinh hƣơng
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy tới khả năng

sinh khối của các chủng vi khuẩn sinh hƣơng.

52

3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ.

53

3.4.2 Ảnh hƣởng của pH

54

3.4.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ tiếp giống

56

3.3. Khảo sát đặc tính chịu mặn của 4 chủng vi khuẩn

57

3.5. Động học quá trình phát triển của các chủng vi khuẩn sinh
hƣơng trong điều kiện cấy thích hợp.

58

3.6. Kết quả phân tích các cấu tử sinh hƣơng trong mẫu sản phẩm
có bổ sung vi sinh vật và không bổ sung vi sinh vật.

61

3.5. Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng vi khuẩn

51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

65

TÀI LIỆU THAM KHẢO

66

PHỤ LỤC

70

4


MỞ ĐẦU
Nƣớc mắm là một loại nƣớc chấm quen thuộc đƣợc ƣa chuộng nhất ở
nƣớc ta và không thể thiếu trong mỗi bữa ăn hàng ngày. Nƣớc mắm có giá trị
dinh dƣỡng cao, hấp dẫn ngƣời ăn bởi hƣơng vị đậm đà, đặc trƣng mà không loại
sản phẩm nào có thể thay thế đƣợc.
Nƣớc mắm là một mặt hàng chính của ngành thủy sản. Nó tiêu thụ khoảng
40-60% tổng số cá đánh bắt và đƣợc chế biến khắp nơi trên toàn quốc. Nƣớc
mắm đƣợc sản xuất từ cá và muối không chỉ đƣợc sử dụng rộng rãi ở Việt Nam
mà hiện nay còn đƣợc ƣa chuộng ở nhiều nƣớc trên thế giới. Tƣơng tự nhƣ nƣớc
mắm các nƣớc trên thế giới cũng có một số loại nƣớc chấm khác nhƣ: Shottusuru
ở Nhật, nampla ở Thái Lan, …. Nhƣng với phƣơng pháp khác nhau thì sản phẩm

có mùi vị không giống nhau
Nƣớc mắm sản xuất theo phƣơng pháp cổ truyền ở Việt Nam có mùi vị
thơm ngon đặc trƣng. Tuy nhiên nó có nhƣợc điểm là hàm lƣợng nitơ không cao,
chu kì sản xuất quá dài (từ 6 tháng đến 1 năm hoặc có thể lâu hơn), giá thành sản
phẩm cao vì vậy không kinh tế. Vài chục năm gần đây có nhiều nghiên cứu trong
và ngoài nƣớc nhằm rút ngắn thời gian chế biến và nâng cao chất lƣợng, đáp ứng
yêu cầu ngày càng cao của thị trƣờng trong và ngoài nƣớc. Nhƣng sản phẩm chế
biến từ các phƣơng pháp cải tiến này đã gặp trở ngại về hƣơng vị vì sự tạo thành
hƣơng vị của nƣớc mắm chủ yếu là do vi sinh vật trong quá trình phân hủy cơ
chất tạo thành, mà để tạo hƣơng thì cần thời gian dài.
Xuất phát từ yêu cầu đó chúng tôi đã tiến hành đề tài : “ Phân lập, tuyển
chọn vi sinh vật sinh hƣơng trong công nghệ sản xuất nƣớc mắm”

5


Chƣơng 1- TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu chung về nƣớc mắm.
Nƣớc mắm là sản phẩm đƣợc lên men từ các loại cá, là sản phẩm truyền

thống của dân tộc Việt Nam. Nƣớc mắm đã gắn liền với đời sống hằng ngày và
là một bản sắc rất riêng của dân tộc Việt Nam.
Đây là sản phẩm của nhiều quá trình phức tạp gồm quá trình đạm hóa, quá
trình phân giải đƣờng trong cá thành acid, quá trình phân hủy một phần amino
acid dƣới tác dụng của vi khuẩn có hại, tiếp tục bị phân hủy thành những hợp
chất đơn giản nhƣ amin, amoniac, cacbonic hydrosunfua…
Nƣớc mắm đƣợc sản xuất từ cá và muối không chỉ đƣợc sử dụng rộng rãi
ở Việt Nam mà còn đƣợc ƣa chuộng tại nhiều nƣớc trên thế giới. Đặc biệt, nƣớc

mắm đƣợc sản xuất ở hầu hết các nƣớc Châu Á. Mỗi nƣớc có điều kiện sản xuất
khác nhau tạo ra sản phẩm có giá trịnh dinh dƣỡng và giá trị cảm quan khác
nhau.[4]
1.1.1. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm
Hàm lƣợng nitơ: Chiếm chủ yếu và quyết định giá trị dinh dƣỡng của
nƣớc mắm..
- Hàm lƣợng nitơ toàn phần: là tổng lƣợng nitơ có trong nƣớc mắm (g/l), quyết
định phân hạng của nƣớc mắm.
- Hàm lƣợng nitơ amin: là tổng lƣợng đạm nằm dƣới dạng acid amin (g/l), quyết
định giá trị dinh dƣỡng của nƣớc mắm
- Hàm lƣợng nitơ amon: Lƣợng đạm amon càng nhiều nƣớc mắm càng kém chất
lƣợng

6


Ngoài ra trong nƣớc mắm còn chứa đầy đủ các acid amin, đặc biệt là các
acid amin không thay thế: valin, leucin, methionin, isoleucin, phenylalanin,
alanin.v.v .. Các thành phần khác có kích thƣớc lớn nhƣ tripeptid, peptol,
dipeptid. Chính những thành phần trung gian này làm cho nƣớc mắm dễ bị hƣ
hỏng do hoạt động của vi sinh vật.[11]
Các chất bay hơi: Rất phức tạp và quyết định hƣơng vị của nƣớc mắm.
Hàm lƣợng các chất bay hơi trong nƣớc mắm mg/100g nƣớc mắm
- Các chất cacbonyl bay hơi: 407-512 (formaldehyde)
- Các acid bay hơi: 404-533 (propionic)
- Các amin bay hơi: 9,5-11,3 (izopropylamin)
- Các chất trung tính bay hơi: 5,1-13,2 (acetaldehyde)
Các chất khác: Các chất vô cơ: NaCl chiếm 250-280g/l và một số các chất
khoáng nhƣ: S, Ca, Mg, P, I, Br. Vitamin: B1, B12, B2, PP.
1.1.2. Nguyên liệu.

a, Cá
Nguyên liệu chính dùng để sản xuất nƣớc mắm là các loại cá. Tuy nhiên
chất lƣợng nƣớc mắm lại phụ thuộc rất nhiều vào từng loại cá. Vì thế việc chọn
cá để sản xuất nƣớc mắm là điều mà các nhà sản xuất quan tâm.
Thành phần hóa học của cá gồm: nƣớc, protide, lipid, glucid, muối vô cơ,
vitamine,...trong đó nƣớc chiếm tỉ lệ rất lớn, protide và lipid chiếm một phần
đáng kể, glucid trong cá thƣờng rất ít và tồn tại dƣới dạng glycogen. Các thành
phần này khác nhau và thay đổi phụ thuộc vào giống, loài, giới tính, điều kiện
sinh sống. Ngoài ra, các yếu tố nhƣ thành phần thức ăn, môi trƣờng sống, kích cỡ

7


cá và các đặc tính di truyền cũng ảnh hƣởng đến thành phần hóa học, đặc biệt ở
cá nuôi. Thành phần hóa học của cá ở từng cơ quan, bộ phận có sự khác nhau.
Bảng 1: Thành phần hóa học của cá [11]
Thành phần

Nƣớc

Protein

Lipid

Muối vô cơ

Thịt cá

48 – 85,1

10,3 – 24,4

0,1 – 5,4

0,5 – 5,6

Trứng cá

60 – 70

20 – 30

1 – 11

1–2

Gan cá

40 – 75

8 – 18

3–5

0,5 – 1,5

Da cá

60 – 70

7 – 15

5 – 10

1–3

Chỉ tiêu

Sự khác nhau về thành phần hóa học của cá và sự biến đổi của chúng có
ảnh hƣởng đến mùi vị và giá trị dinh dƣỡng của sản phẩm, việc bảo quản tƣơi
nguyên liệu và qui trình chế biến.
Bảng 2. Thành phần hóa học cá biển [2]
TT

Thành phần hóa học (% khối lƣợng)
Tên loại cá

Nƣớc

Protein

Lipit

1

Nục sổ

76.80

21.75

0.85

2

Mối thƣờng

77.50

19.26

1.80

3

Trích

75.90

21.76

3.15

4

Phèn hai sọc

76.20

20.35

2.20

5

Lƣơn ngắn

79.30

19.03

1.21

6

Cơm

75.14

11.25

2.10

7

Mòi

76.60

9.37

14.40

8

Lẹp

81.84

10.00

1.40

9

Chuồn

76.17

9.75

7.50

8


Nƣớc: [2] Đóng vai trò và chức năng quan trọng trong đời sống, chất
lƣợng của cá. Nƣớc tham gia vào phản ứng sinh hoá, vào các quá trình khuếch
tán trong cá, tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển.
Lipid: [2] Cá sử dụng chất béo nhƣ là nguồn năng lƣợng dự trữ để duy trì

sự sống trong những tháng mùa đông, khi nguồn thức ăn khan hiếm. Hàm lƣợng
lipid trong cá dao động nhiều (0,1-30%).
Lipid trong các loài cá xƣơng đƣợc chia thành 2 nhóm chính: phospholipid
và triglycerit. Phospholipid tạo nên cấu trúc của màng tế bào, vì vậy chúng đƣợc
gọi là lipid cấu trúc. Triglycerit là lipid dự trữ năng lƣợng có trong các nơi dự trữ
chất béo, thuờng ở trong các tế bào mỡ đặc biệt đƣợc bao quanh bằng một màng
phospholipid và mạng lƣới collagen mỏng hơn.
Lipid của cá khác với lipid của động vật có vú, chủ yếu do lipid của cá có
tới 40% acid béo mạch dài (14 - 22 nguyên tử cacbon) và mức độ không no cao.
Trong lipid của động vật có vú, ít khi có acid béo với 2 nối kép trở lên trong khi
lipid của cá có nhiều acid béo với 5 hoặc 6 nối kép. [2]
- Protein: [2] Có thể chia protein của mô cơ cá ra thành 3 nhóm sau:
* Protein cấu trúc: Gồm các sợi myosin, actin, actomyosin và
tropomyosin, chiếm khoảng 70 - 80% tổng lƣợng protein (so với 40% trong các
loài động vật có vú). Các protein này hòa tan trong dung dịch muối trung tính có
nồng độ ion khá cao (> 0,5 M). Các protein cấu trúc có chức năng co rút đảm
nhận các hoạt động của cơ.
* Protein tƣơng cơ: Gồm myoalbumin, globulin và các enzyme, chiếm
khoảng 25-30% tổng luợng protein. Các protein này hòa tan trong nuớc,
trong dung dịch muối trung tính có nồng dộ ion thấp (<15M). Đa số

9


protein tƣơng cơ là các enzyme tham gia vào sự trao đổi chất của tế bào, nhƣ sự
chuyển hoá năng lƣợng trong điều kiện yếm khí từ glycogen thành ATP.
* Protein mô liên kết: Bao gồm các sợi collagen. Chiếm khoảng 3% tổng
lƣợng protein trong cá xƣơng và khoảng 10% trong cá sụn. Có trong mạng luới
ngoại bào, không tan trong nuớc, dung dịch kiềm hoặc dung dịch muối có nồng
độ ion cao.

Protein của cá có thành phần acid amin gần giống protein trong cơ thịt của
động vật có vú, mặc dù đặc tính vật lý có thể khác nhau đôi chút. Điểm đẳng
điện (pI) của protein cá vào khoảng pH 4,5 - 5,5. Tại giá trị pH này, protein có
độ hòa tan thấp nhất. Giống nhƣ protein trong sữa, trứng và thịt của động vật có
vú, protein trong cá có tất cả các acid amin chủ yếu và có giá trị sinh học rất cao.
Bảng 3: Các acid amin chủ yếu (%) trong các protein khác nhau [2]
Acid amin

Cá

Sữa

Thịt bò

Trứng

Lysine

8.8

8.1

9.3

6.8

Trytophan

1.0

1.6

1.1

1.9

Histidine

2.0

2.6

3.8

2.2

Phenylalanine

3.9

5.3

4.5

5.4

Leucine

8.4

10.2

8.2

8.4

Isoleucine

6.0

7.2

5.2

7.1

Threonine

4.6

4.4

4.2

5.5

Methionine-cystine

4.0

4.3

2.9

3.3

Valine

6.0

7.6

5.0

8.1

10


- Hệ vi sinh vật cá: [10] Thịt cá là môi trƣờng thuận lợi cho sự phát triển
của hầu hết các vi sinh vật, trong đó có cả các loài sinh bào tử cũng nhƣ gây
bệnh. Hệ vi sinh vật của cá rất đa dạng. Trên bề mặt cá thƣờng có một lớp nhầy
chƣa một lƣợng lớn chất protein. Lớp nhầy này là môi trƣờng dinh dƣỡng tốt đối
với vi sinh vật. Những vi sinh vật này thƣờng là trực khuẩn sinh bào tử hoặc
không sinh bào tử, cầu khuẩn nhỏ, Sarcina và một số nấm men, nấm mốc có ở
trong nƣớc. Các vi khuẩn thƣờng thấy ở đây là Pseudomonas fluorescens
liquefaciens, Proteus vulgaris, Micrococcus roseus và E.coli.
Ở mang cá đặc biệt nhiều vi khuẩn hiếu khí. Sau khi cá chết các vi sinh vật
này phát triển rất mạnh. Trong số này dễ tìm thấy Pseudomonas fluorescens
liquefaciens.

Trong ruột cá hệ sinh vật tƣơng đối đa dạng và là nguồn gây thối rữa sau
khi cá chết. Vi sinh vật xâm nhập vào đây từ trƣớc, từ bùn cùng với các loại thức
ăn. Ở đây tìm thấy tất cả các loại vi sinh vật cƣ trú trong nƣớc và bùn, kể cả các
dạng sinh bào tử. Trong ruột cá có Clostridium putrificus và nhóm E.coli, cũng
thấy các loại gây ngộ độc thực phẩm Salmonella và Clostridium botulinum. Số
lƣợng vi khuẩn thƣờng dao động rất lớn rừ vài nghìn tới vài chục triệu tế bào
trên 1g chất chứa trong ruột.
Nhiều kết quả nghiên cứu đã xác định thành phần hệ vi sinh vật của cá
không khác biệt với hệ vi sinh vật của môi trƣờng nƣớc chung quanh cá sống.
Trong các mô và cơ quan của cá tƣơi thƣờng gặp Sarcina lutea, Sarcina flava,
Sarcina alba, Micrococcus flavus, Micrococcus cereus, proteus vulgaris,
Chromobacterium

prodigiosum,

Pseudomonas

fluorescens

liquefacien,

Bacterium pudium, Bacillus megatherium, B. mycoides, B. subtilis, B.
mesentericus, Clostridium putrificus, Aspergiluss niger, Mucor.

11


Trong này có thể tới khoảng 20 loài có hoạt tính proteaza. Chúng có thể
phân hủy protein và là nguồn gây thối rữa sau khi cá chết. Trong cá tƣơi sống rất
ít vi khuẩn tạp nhiễm. Thành phần hệ vi sinh vật tự nhiên của cá không thay đổi,

nếu nhƣ loại trừ đƣợc những nguồn tạp nhiễm từ môi trƣờng chung quanh.
b. Muối
Muối là nguyên liệu không thể thiếu đƣợc trong quá trình sản xuất nƣớc
chấm. Trong tự nhiên muối hiện diện trong các nguồn nƣớc biển. Nhờ khả năng
hút nƣớc nên muối đƣợc dùng tồn trữ thực phẩm, ức chế đƣợc vi sinh vật phát
triển trong thực phẩm trừ các loại vi sinh vật chịu mặn
Thành phần chính của muối là NaCl, H2O, các hoạt chất hòa tan và không
tan. Muối đƣợc dự trữ trên 5 tháng.
Các chất hoà tan gồm có: calciphosphat (CaSO4), Magiesunfat (MgSO4),
Magieclorua (MgCl), Calcioxit (CaO), Manganoxit (MnO)…. Các loại này có vị
đắng và chát, các tạp chất này làm giảm độ thẩm thấu của muối vào cá. Các tạp
chất không tan gồm có: bùn, đá, sỏi, cát…[4]
1.2. Quy trình sản xuất nƣớc mắm truyền thống
1.2.1. Quá trình thuỷ phân, lên men nƣớc mắm.
a, Cơ chế quá trình hình thành nước mắm
Bản chất của quá trình sản xuất nƣớc mắm

Sự tham gia của enzyme trong quá trình thủy phân thƣờng trải qua ba giai
đoạn

12


Trong đó E là enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là hợp chất trung gian
giữa enzyme và cơ chất, P là sản phẩm.
Giai đoạn thứ nhất: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức chất
enzyme protein, bƣớc này xảy ra khá nhanh, liên kết không bền.
Giai đoạn thứ hai: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến
làm phá vỡ các mối liên kết đồng hóa trị tham gia vào phản ứng. Khi đó phức
chất ES đồng thời xảy ra hai quá trình là sự dịch chuyển thay đổi electron, dẫn

đến sự cực hóa của mối liên kết tham gia vào phản ứng và sự biến dạng hình học
của nối liên kết đồng hóa trị trong phân tử protein cũng nhƣ trong trung tâm hoạt
động của enzyme, làm cho protein hoạt động, quá trình thủy phân dễ dàng hơn.
Giai đoạn thứ ba: Giai đoạn tạo thành các acid amin và peptid cấp thấp,
giải phóng enzyme [11].
b, Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm
Gồm 3 hệ enzyme lớn
Hệ enzyme Metalo-protease (Aminodipeptidase): Hệ enzyme này tồn tại
trong nội tạng của cá và chịu đƣợc nồng độ muối cao nên ngay từ đầu nó đã hoạt
động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau. Loại enzyme này có hoạt tính
khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid. Đây là nhóm
thủy phân enzyme trung tính, pH tối thích từ 5-7, nó ổn định với ion Mg2+, Ca2+
và mất hoạt tính với Zn2+, Ni2+, Pb2+, Hg2+..
Hệ enzyme serin-protease: Điển hình là enzyme tripsin, tồn tại nhiều trong
nội tạng của cá. Ở giai đoạn đầu của quá trình sản xuất nƣớc mắm hoạt động của
nó yếu đến tháng thứ 2 và phát triển dần đạt giá trị cực đại ở tháng thứ 3 rồi giảm
dần đến khi chƣợp chín (protein phân giải gần nhƣ hoàn toàn không còn ở dạng

13


peptol). Hệ enzyme này luôn bị ức chế bởi chuỗi acid amin trong cấu trúc của
enzyme. Để tháo gỡ chuỗi này phải nhờ đến hoạt động của enzyme cathepsin B
nhƣng enzyme cathepsin B dễ bị ức chế bởi nồng độ muối cao. Vì vậy để
enzyme cathepsin B hoạt động đƣợc ngƣời ta thực hiện phƣơng pháp cho muối
nhiều lần. Enzyme serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5-10, mạnh nhất ở
pH=9.
Hệ enzyme acid-protease: Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là
enzyme cathepsin D. Hệ enzyme này dễ bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15%
nên thƣờng nó chỉ tồn tại một thời gian ngắn ở đầu thời kỳ của quá trình thủy

phân. Loại enzyme này đóng vai trò thứ yếu trong quá trình sản xuất nƣớc mắm.
c, Vai trò của vi sinh vật
Trong ƣớp chƣợp thƣờng chứa một lƣợng lớn các vi sinh vật. Có thể tìm
thấy hàng trăm, hàng nghìn hoặc hàng triệu tế bào trong 1 ml nƣớc chƣợp. Các
vi khuẩn ở đây thƣờng thuộc nhóm vi khuẩn lactic, thuộc chi Micrococus, ngoài
ra còn có Spirilum, Proteus, Leuconostoc, Clostridium và nấm mốc. Những vi
khuẩn sinh bào tử tìm thấy trong nƣớc chƣợp là Bacillus [10].
Nhiều chủng Bacillus có khả năng sinh proteaza đã đƣợc ứng dụng trong
sản xuất thực phẩm. Chi Bacillus là một chi gồm các vi khuẩn hình que, nói
chung Gram dƣơng, hầu hết có khả năng chuyển động, sinh trƣởng hiếu khí hoặc
hiếu khí tùy tiện, hầu hết có phản ứng catalase dƣơng tính, tất cả đều hình thành
nội bào tử [19,20]. Phần lớn Bacillus là các vi khuẩn ƣa ấm với nhiệt độ sinh
trƣởng tối ƣu từ 300 – 450C. Một số loài có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ 65 0C. Một
số loại ƣa lạnh có thể sinh trƣởng và hình thành nội bào tử ở 00C, pH sinh trƣờng
rất khác nhau từ 2 - 11 [30].

14


Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong bảo quản và chế biến đa dạng
các loại thực phẩm lên men [1]. Lên men lactic giúp thực phẩm ngăn chăn sự
phát triển của vi sinh vật gây độc hại cho thực phẩm. Aicd do quá trình lên men
tạo ra cũng làm thay đổi hƣơng của các nguyên liệu ban đầu và cải thiện giá trị
dinh dƣỡng [6, 26].
Vi khuẩn Lactic: Không đồng nhất về mặt hình thái, các giống khác nhau
có hình dạng và kích thƣớc khác nhau. Nhƣng nhìn chung chúng đƣợc chia thành
hai loại hình cầu và hình que [12]. Chúng đều là những vi khuẩn Gram (+),
không có khả năng tạo bào tử, không di động, sinh axit lactic trong quá trình
phát triển, catalase, oxydase và khử nitrat âm tính, không chứa các xitocrom, hô
hấp kỵ khí hoặc vi hiếu khí [5]

Hiroshi [17] khi nghiên cứu về vi sinh vật trong nƣớc mắm Thái Lan và
nƣớc mắm Nhật Bản ông thấy hầu hết chúng là loại vi khuẩn lên men lactic chịu
đƣợc độ muối cao. Một số loại nấm mốc phát triển trong môi trƣờng có hàm
lƣợng đƣờng kính cao, đƣợc phát triển trong nƣớc mắm Thái Lan lại không có
trong nƣớc mắm Nhật Bản. Các loài Bacillus và Micrococcus đƣợc phân lập từ
muối biển, còn Micrococcus đƣợc phân lập trong cả thành phần của muối mỏ.
Các vi sinh vật có mặt ngay trong thành phần nguyên liệu sản xuất là cá và muối,
chúng có khả năng phát triển trên môi trƣờng có độ muối cao. Một số loại lên
men lactic dị hình đƣợc phát hiện nhƣ: Staphylococcus saprophyticus,
Micrococcus varians trong nƣớc mắm Thái Lan, nƣớc mắm Nhật Bản. Vi khuẩn
lên men lactic đồng hình nhƣ Pediococcus halophilus từ các loại nƣớc mắm
Malaixia. Nghiên cứu về vi sinh vật trong nƣớc mắm Thái Lan, Bulan phithakpol
[14] nhận thấy các loài vi khuẩn thuộc nhóm Micrococcus, Pediococcus,
Staphylococcus sarcina, Bacillus liên quan đến quá trình lên men.

15


Vi sinh vật có mặt ngay từ đầu của quá trình chế biến do nguyên liệu,
dụng cụ và từ môi trƣờng nhiễm vào, nhƣng do nồng độ muối cao nên chúng
không hoạt động đƣợc. Song cũng có nhiều loài vi sinh vật ƣa mặn hoặc quen
dần với muối có thể phát triển mạnh trong môi trƣờng muối cao
Ngay trong giai đoạn ngắn đầu tiên khi muối chƣa kịp tác dụng, có một
ít vi sinh vật gây thối hoạt động. Với sự hình thành của nƣớc bổi, độ mặn tăng
dần lên, khi đạt từ 12% trở lên thì vi sinh vật gây thối hầu nhƣ ngừng hoạt động
và các vi khuẩn hầu nhƣ cũng bị ức chế. Nhƣ vậy trong quá trình chế biến nƣớc
mắm sự tham gia của vi sinh vật trong quá trình thủy phân tƣơng đối yếu nhƣng
về sự hình thành mùi vị của nƣớc mắm trong quá trình chế biến thì vi khuẩn gây
hƣơng đã tham gia khá tích cực [4].
d, Các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình chế biến nước mắm.

Quá trình chế biến nƣớc mắm có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến. Những yếu
tố công nghệ đó là: Nhiệt độ lên men, pH, lƣợng muối, diện tích tiếp xúc và ảnh
hƣởng bởi bản thân nguyên liêu:
Nhiệt độ: Nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng tăng, đến một nhiệt độ nào đó sẽ
không tăng nữa và có thể giảm xuống do nhiệt độ cao làm cho hệ enzyme serinprotease mất hoạt tính, quá trình thủy phân kém. Nhiệt độ 30 - 47oC thích hợp
cho quá trình chế biến chƣợp. Nhiệt độ 70oC trở lên hầu hết các hệ enzyme trong
cá mất hoạt tính. Nâng nhiệt độ của chƣợp lên bằng cách phơi nắng, nấu hoặc sử
dụng tôn nóng để che phân xƣởng [4]..
pH: Mỗi hệ enzyme có pH tối thích khác nhau, vì vậy phải xem loại
enzyme nào nhiều nhất và đóng vai trò chủ yếu nhất trong quá trình sản xuất
nƣớc mắm để tạo pH thích hợp cho enzyme đó hoạt động.

16


Qua thực nghiệm cho thấy: pH môi trƣờng tự nhiên từ 5,5-6,5 enzyme
tripsin và pepsin hoạt động đƣợc, đồng thời ở pH này có tác dụng ức chế một
phần vi khuẩn gây thối. Vì vậy ở môi trƣờng tự nhiên có pH thích hợp cho quá
trình sản xuất nƣớc mắm hơn.
Lượng muối: Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nƣớc
mắm, thiếu muối nƣớc mắm không hình thành đƣợc. Yêu cầu của muối trong sản
xuất nƣớc mắm phải là loại muối ăn, càng tinh khiết càng tốt, kết tinh hạt nhỏ có
độ rắn cao, màu trắng óng ánh. Nồng độ muối thấp có tác dụng thúc đẩy quá
trình thủy phân protein nhanh hơn, chƣợp mau chín. Nồng độ muối quá cao có
tác dụng ức chế làm mất hoạt tính của enzyme, quá trình thủy phân chậm lại,
thời gian thủy phân kéo dài (protein bị kết tủa bởi muối trung tính bão hòa).
Để chế biến chƣợp nhanh cần xác định lƣợng muối cho vào trong chƣợp là
bao nhiêu và lƣợng muối này phải thõa mãn 2 điều kiện: Không mặn quá để
tránh ức chế hoạt động của enzyme và không nhạt quá để có đủ khả năng ức chế
sự phát triển của vi khuẩn gây thối.

Thƣờng lƣợng muối cho vào khoảng 20-25% so với khối lƣợng cá. Nên
thực hiện phƣơng pháp cho muối nhiều lần và cần phải xác định số lần cho muối,
tỉ lệ muối của mỗi lần và khoảng cách giữa các lần cho muối để không ảnh
hƣởng đến quá trình sản xuất nƣớc mắm.
Diện tích tiếp xúc: Muốn phản ứng xảy ra nhanh phải có sự tiếp xúc tốt
giữa enzyme và cơ chất. Các enzyme trong cá tập trung nhiều ở nội tạng, nên để
tăng tốc độ thủy phân ngƣời ta tìm cách tăng diện tích tiếp xúc giữa enzyme và
thịt cá.

17


Bản thân nguyên liệu: Những loài cá khác nhau, thành phần hóa học và
cấu trúc cũng khác nhau, nhất là hệ enzyme trong cá vì vậy tạo ra loại nƣớc mắm
có chất lƣợng khác nhau [11]..
1.2.2. Sơ đồ sản xuất.nƣớc mắm truyền thống [4,11]
a, Sơ đồ

18


b, Thuyết minh sơ đồ.

19


Xử lý nguyên liệu: Nguyên liệu phải đƣợc rửa sạch, loại bỏ tạp chất và
chuẩn bị chế biến.
Ƣớp muối: Trƣớc khi chế biến, phải tiến hành vệ sinh thùng chƣợp và
tính toán lƣợng muối cho vào khi chƣợp.

Cho cá và muối vào thùng. Cứ một lớp cá thì một lớp muối và dùng bàn
cào gỗ để dàn đều lớp cá và lớp muối. Nên rãi nhiều lớp muối mỏng thay vì ít
lớp nhƣng dày. Phủ một lớp muối mặt khá dày khoảng 2 – 3 cm trên cùng.
Lấy nhiều lớp lá phủ lên lớp muối mặt. Lớp lá đƣợc cột chặt vào các thanh
nẹp, dùng các đòn hạ gài các thanh nẹp lại rồi dùng hai đòn thƣợng gác ngang
qua thùng chƣợp để nén vỉ không bị trồi lên. Mục đích của khâu gài nén là vừa
giữ đƣợc vệ sinh, vừa tác dụng lực ép để nƣớc từ thịt cá đƣợc tiết nhanh hơn.
Ủ thời gian 2 ngày. Đây là giai đoạn lên men khô, cả khối chƣợp nóng lên
đến gần 400C. Lên men khô yếm khí vừa có tác dụng phân giải tốt, vừa tạo
hƣơng vị thơm ngon.
Giai đoạn lên men - chế biến chƣợp cổ truyền: Đây chính lá quá trình thủy
phân protein trong cá nhờ hệ enzyme protease. Sản phẩm cuối cùng là acide
amin hoặc peptide cấp thấp.
Có 3 phƣơng pháp chế biến chƣợp cổ truyền:
- Phƣơng pháp đánh khuấy (Đây là phƣơng pháp của Cát Hải - Hải
Phòng): Cho muối nhiều lần đã lợi dụng đƣợc khả năng phân giải của enzyme và
vi sinh vật tới mức đô cao, rút ngắn thời gian chế biến chƣợp. Cho muối nhiều
lần là tạo điều kiện để phòng thối, tiêu diệt các vi khuẩn gây thối thông thƣờng
và không kìm hãm nhiều quá khả năng hoạt động của men. Cho thêm nƣớc lã là
cung cấp cho môi trƣờng phân giải một lƣợng vi sinh vật đáng kể, tạo môi
trƣờng lỏng giúp cho men và vi sinh vật hoạt động đƣợc dễ dàng, làm cho tế bào

20


thịt cá chóng đƣợc phân giải. Lƣợng nƣớc cho thêm vào nên vừa phải, nếu ít quá
thì tác dụng phân giải của men kém nhƣng nếu nhiều quá thì không khống chế
đƣợc quá trình thối rữa, đồng thời làm giảm độ đạm trong nƣớc mắm. Vì vậy,
lƣợng nƣớc cho vào còn tùy thuộc đặc điểm của nguyên liệu, thƣờng từ 20 –
30% so với cá.

- Phƣơng pháp gài nén (Đây là phƣơng pháp của vùng khu 4 cũ hoặc của
các tỉnh phía Nam): Cá đƣợc trộn đều với muối cho đủ muối ngay từ đầu hoặc
cho muối nhiều lần, sau đó ƣớp vào thùng hoặc bể rồi gài nén. Dựa vào men
trong cá để phân giải protide của thịt cá, không cho nƣớc lã và không đánh
khuấy.
- Phƣơng pháp chế biến hỗ hợp (kết hợp hai phƣơng pháp gài nén và đánh
khuấy). Lúc đầu, thực hiện phƣơng pháp gài nén. Sau đó thực hiện phƣơng pháp
đánh khuấy.
Khi đã cho đủ muối thì thân cá đã ngấm đủ muối, nát đều và chìm xuống,
không còn hiện tƣợng trƣơng và nổi lên nữa. Lúc đó, ngƣời ta nói cá đã “đứng
cá”. Nhờ nén chặt, nhiệt nội có trong cá làm cho men hoạt động tăng lên, trung
tâm tích tụ dần khí NH3, CO2, H2S... làm cho cá trƣơng lên, thịt cá bị xé nát
nhƣng xƣơng và da vẫn còn nguyên. Muối thẩm thấu vào cá nƣớc tiết ra gọi là
nƣớc bổi. Khoảng 1 tháng sau thì cá chìm xuống hẳn, nƣớc nổi lên có màu vàng,
trong và xuất hiện mùi nƣớc mắm rõ rệt, lúc đó cá đã “đứng mặt dầu”. Màu sắc
của nƣớc mắm chuyển từ màu vàng nhạt sang hẳn màu vàng đậm, nƣớc mắm
trong.
Sau 6 – 12 tháng, chƣợp đã chín hoàn toàn, có thể chiết rút.
Đặc điểm của phƣơng pháp này là chƣợp chín cá vẫn còn nguyên con,
xƣơng không nát nên thuận lợi cho việc kéo rút.

21


Chiết rút: Quá trình kéo rút nƣớc mắm là quá trình lọc liên hoàn. Quá trình
kéo rút là quá trình rút đạm trong bã không quá nấu bằng cách dùng lƣợng nƣớc
bổi hoặc nƣớc thuộc ít đạm cho chuyển lần lƣợt từ thùng này qua thùng khác để
tăng đạm và tăng hƣơng vị.
Sau khi chƣợp chín, nƣớc mắm chỉ có mùi thơm thuần túy, không còn mùi
hỗn tạp của chƣợp nữa. Tuy vậy, phần bã vẫn còn mùi tanh. Ta rút phần nƣớc có

nàu vàng, trong phía trên (nƣớc mắm cốt). Còn lại phần xƣơng thịt cá chƣa phân
giải hết ta tiếp tục cho lên men. Với mỗi lần chiết rút ta lại bổ sung nƣớc muối
vào để làm nƣớc thuộc. Quá trình lên men tiếp tục phân giải hết lƣợng thịt cá còn
sót lại. Quá trình lên men và chiết rút dừng lại khi tất cả thịt cá đã hoàn toàn
đƣợc phân giải.
Phối trộn: Muốn thu đƣợc nƣớc mắm có hƣơng vị thơm ngon và có hàm
lƣợng nitơ nhƣ mong muốn, ta phải pha đấu các loại nƣớc mắm có có hàm lƣợng
nitơ khác nhau, thƣờng pha nƣớc mắm có có hàm lƣợng nitơ cao với nƣớc mắm
có có hàm lƣợng nitơ thấp thành loại nƣớc mắm có có hàm lƣợng nitơ trung
bình.
Sản phẩm nƣớc mắm thu đƣợc theo phƣơng pháp cổ truyền có hƣơng vị
đặc trƣng nên đƣợc ngƣời tiêu dùng ƣa thích. Phƣơng pháp này, trang thiết bị
đơn giản, chi phí sản xuất thấp. Nhƣng do thời gian chế biến quá dài nên hiệu
quả kinh tế không cao, lƣợng đạm mất đi lớn, vệ sinh an toàn thực phẩm thấp.
1.3. Quy trình sản xuất nƣớc mắm có bổ sung enzyme protease thƣơng mại
(quy trình sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày)
Dựa trên cơ sở muốn rút ngắn thời gian chế biến nƣớc mắm ta cần bổ sung
enzyme proteaza và tạo điều kiện thích hợp cho enzyme hoạt động để thúc đẩy
nhanh quá trình thủy phân. Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về nƣớc mắm đã

22


có nhiều nha khoa học đã nghiên cứu sử dụng enzyme proteaza nhân tạo để rút
ngắn quá trình thủy phân thịt cá. Nguyễn Thị Dự (Viện công nghệ Thực phẩm)
năm 1995 đã thực hiện đề tài cấp Bộ công nghiệp “Nghiên cứu hoàn thiện quy
trình sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày bằng enzyme proteaza từ B. subtilis”. Kết
quả là rút ngắn quy trình sản xuất nƣớc mắm từ 6 – 8 tháng xuông còn 2 tháng,
độ đạm nƣớc mắm tăng từ 8,3% lên 20,8% hiệu xuất thu hồi đạm tăng gấp 2 lần,
tiêu hao nguyên liệu giảm 13%. Tuy nhiên các nguồn để thu enzyme có nguồn

gốc từ thực vật, động vật, từ vi sinh vật, mặc dù mới nghiên cứu những năm gần
đây, nhƣng những nghiên cứu về enzyme từ vi sinh vật đã đem lại những thành
tựu đáng kể, đóng góp to lớn vào thành công chung của việc nghiên cứu rút ngắn
thời gian chế biến nƣớc mắm. Enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật đƣợc sử dụng
ƣu việt hơn các nguồn enzyme khác. Ba loại enzyme vi sinh vật chính thƣờng
đƣợc sử dụng trong thuỷ phân cá là:
+ Enzyme Flavourzyme: Đƣợc sản xuất từ chủng A. oryzae, chế phẩm này bao
gồm cả hoạt tính endopeptidaza và exopeptidaza. pH thích hợp cho quá trình
thủy phân là 5,0 – 7,0, nhiệt độ thích hợp 45 – 55oC [25].
+ Enzyme Alcalase: Đƣợc sản xuất từ chủng B. licheniformis, Subtilisin A là
thành phần enzyme chính, đó là một endopeptindaza. Nhiệt độ thích hợp cho
enzyme hoạt động tà 55 – 70oC. pH thích hợp 6,5 – 8,5 [23].
+ Enzyme Protamex: là một enzyme proteaza của Bacillus thủy phân protein.
Khác với các endopeptindaza là protamex tạo ra dịch thủy phân protein không có
vị đắng ngay cả khi mức độ thủy phân rất thấp. Protamex hoạt động tối ƣu ở pH
5,5 – 7,5, nhiêt độ 40 – 60oC và bất hoạt ở nhiệt độ 90oC trong 5 phút [24].

23


1.3.1. Sơ đồ quy trình sản xuất [11].
Nguyên liệu

Xử lý

Thủy phân ( Enzyme )

Nƣớc lọc

Lọc

Dịch thủy phân

Sản phẩm
Hình 1. Sơ đồ qui trình chế biến nƣớc mắm bằng phƣơng pháp enzyme
1.3.2. Thuyết minh quy trình
a, Xử lý nguyên liệu
Cá cần phải rửa sạch các tạp chất nhƣ bùn, rác thải, tạp chất còn lẫn trong
cá. Nguyên liệu đƣợc nhập về cần tiến hành phân loại phân hạng dựa trên kích
thƣớc và chất lƣợng của cá, yêu cầu đặt ra với nguyên liệu làm nƣớc mắm là
đồng đều về chất lƣợng và kích cỡ để quá trình thủy phân diễn ra hàng loạt, đều
nhau nhƣ vậy quá trình thủy phân sẽ triệt để tránh hao phí hàm lƣợng nitơ do còn
lại trong bã gây tổn thất hàm lƣợng nitơ, làm giảm hiệu quả kinh tế và giảm chất
lƣợng nƣớc mắm. Đối với những nguyên liệu cá có khối lƣợng và kích thƣớc lớn

24


thì phải xử lý đập dập, nghiền nhỏ hoặc cắt khúc để quá trình thủy phân diễn ra
hoàn thiện hơn.
Muối phải sử dụng muối ăn đã qua bảo quản, ít nhất là muối đã đƣợc bảo
quản hơn một tháng và tỷ lệ muối ban đầu so với cá là 10% sau 3 ngày thì bổ
sung muối một lần, mỗi lần 3% cho đến khi tổng khối lƣợng muối đủ 25%, thời
gian thủy phân tùy theo phƣơng pháp thủy phân.
b, Tiến hành thủy phân
Nguyên liệu cá sau khi đƣợc xử lý đập dập trộn đều với 0,1% chế phẩm
enzyme proteaza đảo trộn đều trong 30 phút, để enzyme khuếch tán trong
nguyên liệu, sau đó trộn với muối tỉ lệ 10% so với nguyên liệu cá và cho vào
thùng có nắp đậy. Hằng ngày mở nắp đánh khuấy 2 lần mỗi lần khoảng 10 – 15
phút. Sau khi đánh đảo xong thì đậy nắp lại tránh ánh nắng chiếu trực tiếp vào

khối chƣợp, sau 2 – 3 ngày thì cá nát nhừ và xảy ra hiện tƣợng cá đòi muối
(khối chƣợp sủi bọt, mùi tanh bốc lên) lúc này ta cho thêm 3% muối nữa, sau 1 –
2 tháng chƣợp đã vào giai đoạn đã ổn định, mùi không còn tanh, có mùi nƣớc
mắm nhẹ. Chƣợp chín khi thấy nƣớc cốt có màu vàng nâu đến màu cánh gián.
Sản xuất nƣớc mắm theo phƣơng pháp ngắn ngày đã đáp ứng đƣợc nhu
cầu ngày cảng tăng của ngƣời dân, giảm tổn thất lƣợng nito trong quá trình chế
biến. Tuy nhiên nƣớc mắm sản xuất theo phƣơng pháp ngắn ngày có nhƣợc điểm
là mùi thơm kém đặc trƣng do đó chƣa hấp dẫn ngƣời tiêu dùng.
1.4. Các nghiên cứu về hƣơng nƣớc mắm
Ngƣời Việt Nam đầu tiên tham gia nghiên cứu nƣớc mắm là Đinh Minh
Kha và Nguyễn Xuân Thọ. Các nghiên cứu xoay quanh về chế độ hoạt động của
proteaza và thành phần của nƣớc mắm. Các nghiên cứu này tập trung rất nhiều
vào khu hệ vi sinh vật cá và tác dụng của chúng trong quá trình tạo ra nƣớc mắm

25