Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm AH5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

Trần Thị Tình

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH
VIRUS CÚM GIA CẦM A/H5N1 TRONG MẪU BỆNH PHẨM BẰNG
KỸ THUẬT MULTIPLEX REVERSE TRANSCRIPTION
POLYMERASE CHAIN REACTION

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011

1


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN .......................................................................................10
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1.......................................................10
1.1.1. Phân loại học và danh pháp .......................................................................10
1.1.2. Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1 ..................................................12
1.1.3. Hệ gen và các protein của virus A/H5N1 ..................................................13
1.1.4. Chu trình tái bản của virus cúm A/H5N1 ..................................................16
1.1.5. Hiện tượng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A.................................18
1.1.6. Khả năng thích ứng vật chủ của virus cúm A ...........................................19
1.1.7. Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1 ............................21
1.1.8. Sức đề kháng của virus cúm A ..................................................................22

1.2. CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM
A/H5N1 .....................................................................................................................23
1.2.1. Triệu chứng nhiễm cúm A/H5N1 ..............................................................23
1.2.2. Các phương pháp xét nghiệm và chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1 ............24
1.2.3. Điều trị nhiễm cúm A/H5N1 ở người........................................................30
1.2.4. Kiểm soát lây nhiễm và dự phòng .............................................................31
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A/H5N1 Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN
THẾ GIỚI ................................................................................................................32
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................34
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .........................................................................34
2.1.1. Mẫu vật ......................................................................................................34
2.1.2. Hóa chất .....................................................................................................34
2.1.3. Thiết bị .......................................................................................................35
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................35
2.2.1. . Chọn mẫu..................................................................................................35
2.2.2. K thuật ấy mẫu bảo quản v vận chuyển mẫu .......................................35
2.2.3. Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm ..............................................................36
2.2.4. Thiết kế m i ...............................................................................................37
2.2.5. Tối ưu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA ...................39
2.2.6. Tối ưu phản ứng Multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1.................45

2


2.2.7. Thử nghiệm phản ứng Multiplex RT-PCR trên mẫu bệnh phẩm ..............47
2.2.8. Điện di v phân tích kết quả ......................................................................48
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................50
3.1. Thiết kế mồi ......................................................................................................50
3.1.1. Thiết kế m i đặc hiệu cho gen M của virus cúm A ....................................50
3.1.2. Thiết kế m i đặc hiệu cho gen HA của virus cúm A/H5N1 ......................51

3.1.3. Thiết kế m i đặc hiệu cho gen NA của virus cúm A/H5N1 .......................52
3.2. Tối ƣu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA .....................54
3.2.1 Tối ưu nhiệt độ gắn m i .............................................................................54
3.2.2. Tối ưu n ng độ m i ...................................................................................56
3.2.3. Tối ưu thời gian kéo dài chuỗi ...................................................................57
3.2.4. Đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR ..................................................58
3.2.5. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR............................................53
3.3. Tối ƣu phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1 ....................63
3.3.1. Tối ưu nhiệt độ gắn m i ............................................................................56
3.3.2. Tối ưu n ng độ m i ...................................................................................63
3.3.3. Tối ưu thời gian kéo d i chuỗi ...................................................................64
3.3.4. Tối ưu số chu kỳ phản ứng ........................................................................65
3.3.5. Đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR .................................66
3.3.6. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng mu tip ex RT-PCR ...........................66
3.4. Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1 trên mẫu
bệnh phẩm................................................................................................................61
Kết luận...............................................................................................................67
Kiến nghị ............................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................75

3


DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ

Hình 1.1. Cấu trúc của virus cúm A............................................................................5
Hình 1.2. Các phân đoạn gen và các protein của virus cúm A/H5N1........................6
Hình 1.3. Chu trình tái bản của virus cúm A…........................................................10
Hình 1.4. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của
virus cúm A................................................................................................................13

Bảng 2.1: Các thành phần của phản ứng RT-PCR...................................................33
Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR....................................................33
Bảng 2.3: Thành phần của phản ứng multiplex RT-PCR.........................................37
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR....................................38
Bảng 3.1: Cặp mồi phát hiện gen M của virus cúm A..............................................43
Hình 3.1: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen M của virus cúm A...............................43
Bảng 3.2: Cặp mồi phát hiện gen HA của virus cúm A/H5N1..................................44
Hình 3.2: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen HA của virus cúm A/H5.......................45
Bảng 3.3: Cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/H5N1..................................46
Hình 3.3: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/N1........................46
Bảng 3.4: Trình tự các mồi được lựa chọn để thực hiện phản ứng RT-PCR…........47
Hình 3.4. Ảnh điện di kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng RT-PCR phát
hiện từng gen riêng biệt............................................................................................49
Hình 3.5. Ảnh kết quả điện di tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng RT-PCR...............50
Hình 3.6. Ảnh điện di kết quả tối ưu thời gian kéo dài chuỗi...................................51
Bảng 3.5: Giá trị đo độ hấp thụ OD của RNA 3 gen M, HA và NA..........................51
Hình 3.7. Ảnh điện di đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR..............................52
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen M.....................................53
Bảng 3.7: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR phát hiện gen M.........................54
Bảng 3.8: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen H5...................................54
Bảng 3.9: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát hiện gen H5..............................54
Bảng 3.10: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1..................................55

4


Bảng 3.11: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1............................55
Hình 3. : Ảnh điện di tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiple RT-PCR....56
Hình 3.9. Ảnh điện di tối ưu nồng độ mồi phản ứng multiplex RT-PCR..................57
Hình 3.10: Ảnh điện di tối ưu thời gian kéo dài chuỗi phản ứng multiple RT-PCR ...58

Hình 3.11: Ảnh điện di tối ưu số chu kỳ phản ứng multiple RT-PCR.....................59
Hình 3.12: Th nghiệm đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR….......59
Hình 3.13: Ảnh điện di đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng multiple RT-PCR.......60
Bảng 3.12: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR .............................................60
Bảng 3.13: Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR ……………………….61
Hình 3.14:

ết quả th nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR trên m u bệnh ph m

dương tính…………………………………………………………………………………...62
Hình 3.15:

ết quả th nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm

gia cầm A/H5N1 trên một số m u bệnh ph m………………………………………….63
Hình 3.16:

ết quả th nghiệm phản ứng RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm

A/H5N1 trên một số m u bệnh ph m………………………………………………….…64
Bảng 3.14: So sánh kết quả xét nghiệm phản ứng RT-PCR và multiplex RT-PCR
trên m u bệnh ph m………………………………………………………………………..64
Bảng 3.15: So sánh thời gian và chi phí hoá chất làm xét nghiệm giữa phản ứng
multiplex RT-PCR và RT-PCR………………………………………………………………65

5


CHỮ VIẾT TẮT

bp:

Base pair

DEPC-treated water: Diethylpyrocarbonate treated water
DNA:

Deroxi ribonucleic acid

dNTP:

Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA:

Etilendiamin tetraaxetic acid

HA (H):

Haemagglutinin

LB:

Luria-Bertani media

M:

Matrix protein

NA (N):

Neuraminidase

NP:

Nucleoprotein

NS:

Non-structural protein

PA:

Polymerase A protein

PB:

Polymerase B protein

RT-PCR:

Reverse Transcription - Polymerase Chain

Reaction
RNA:

Ribonucleic acid

TBE:

Tris Base, Acid Boric, EDTA

vRNP:

Viral ribonucleoprotein

6


LỜI CẢM ƠN!
Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn sự
hướng d n tận tình, chu đáo của GS.TS Lương Xuân Hiến - Trường Đại học Y
Thái .
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Nam Thắng và các thầy cô trong
Trung tâm dịch vụ Khoa học kỹ thuật Y dược - Trường Đại học Y Thái Bình đã giúp
đỡ tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng in chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học Trường Đại học khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội đã giảng dạy, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, các thầy cô trong Bộ môn Sinh
học- Trường Đại học Y Thái Bình, gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện cho tôi đi học
và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này.
Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2011
Học viên
Trần Thị Tình

7


MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây dịch cúm gia cầm do virus A/H5N1 là vấn đề quan
tâm đối với cả thế giới, đặc biệt là đối với các nước châu Á như Việt Nam,
Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc... Kể từ cuối năm 2003 đến nay dịch cúm
A/H5N1 đã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm và gây tử vong cho
hàng trăm người. Cả thế giới đang lo sợ trước nguy cơ có thể xảy ra một đại dịch
cúm trên người do virus A/H5N1 giống như các vụ đại dịch cúm đã xảy ra trong thế
kỷ 20. Các nước trên thế giới đã tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lại
một đại dịch cúm H5N1 có thể xảy ra trong tương lai như mua thuốc v các thiết bị
y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành các phương án phòng chống dịch, thực
hiện các chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới...
Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay dịch cúm gia cầm liên tục xảy ra ở hầu
hết các tỉnh thành trên toàn quốc. Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu
hủy. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đang đứng thứ 2 trên thế
giới (sau Indonesia) về số người nhiễm và tử vong do virus A/H5N1.
Virus cúm A/H5N1 là virus có khả năng biến đổi gen nhanh chóng và hình
thành nên các chủng virus mới nên việc sử dụng vaccine để dự phòng thường không
đạt được hiệu quả cao. Ở Việt Nam hiện nay, dịch cúm A/H5N1 vẫn liên tục xảy ra
trên gia cầm và người, mặc dù mức độ không trầm trọng như giai đoạn trước đây
nhưng nếu không được phát hiện và có các biện pháp dập dịch kịp thời thì dịch có
thể trở nên bùng phát.
Khi có dịch cúm gia cầm một phương pháp chẩn đoán nhanh nhạy v chính
xác

cần thiết cho việc điều trị kiểm soát v ngăn chặn kịp thời tránh ây an rộng

ra cộng đ ng. Để phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu bệnh phẩm ở người
và gia cầm, hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm đều áp dụng k thuật RT-PCR
(Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction). Đây là k thuật sinh học
phân tử, cho phép phát hiện virus với độ chính xác cao, thời gian làm xét nghiệm
khoảng 4-6 giờ nếu thực hiện Realtime RT-PCR và 12-24 giờ nếu thực hiện RTPCR và điện di trên gel agarose. Với RT-PCR thông thường, người ta phải thực

8


hiện ba phản ứng để chẩn đoán xác định virus cúm A/H5N1, bao g m: một phản
ứng để xác định virus cúm A một phản ứng xác định subtype H5 v một phản ứng
xác định subtype N1. Để đơn giản hóa quá trình xét nghiệm, rút ngắn thời gian xét
nghiệm v tiết kiệm chi phí người ta có thể ứng dụng k thuật multiplex RT-PCR,
cho phép chẩn đoán xác định cúm A/H5N1 chỉ với một phản ứng RT-PCR thay vì
phải làm ba phản ứng RT-PCR. Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế và xây dựng
quy trình thực hiện k thuật multiplex RT-PCR khá phức tạp nên hiện nay hầu hết
các phòng xét nghiệm trong nước chưa áp dụng k thuật này trong chẩn đoán cúm
A/H5N1. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát
hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật
Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” tại Labo Trường
Đại học Y Thái Bình với mục tiêu:
1. Thiết kế và lựa chọn được các m i phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex
RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1.
2. Nghiên cứu tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT-PCR:
nhiệt độ và thời gian gắn m i, n ng độ m i ...
3. Thử nghiệm được phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện A/H5N1 trên một
số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người v gia cầm.

9


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1
1.1.1. Phân loại học và danh pháp
1.1.1.1. Phân loại virus cúm

Theo ủy ban Quốc tế về phân loại virus (ICTV - International Committee on
Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae g m 3
type là A, B và C. Chúng là các virus có vật liệu di truyền là RNA sợi đơn âm [32].
Sự phân biệt virus cúm A, B và C dựa trên sự khác nhau về đặc tính kháng
nguyên của nucleoprotein (NP) v protein nền M1 (matrix protein). Ngoài ra, hệ
gen của virus cúm A và B đều có 8 đoạn RNA còn virus cúm C chỉ có 7 đoạn RNA
[36].
Trong 3 type thì type A là virus có giới hạn vật chủ rất rộng ưu h nh phổ
biến trên gia cầm và một số động vật có vú như ợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,… và
cả con người [32]. Virus cúm A là loại có độc lực mạnh nhất, có khả năng biến đổi
gen rất lớn và nguyên nhân chủ yếu gây ra các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ qua.
Dựa vào sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên của hai glycoprotein là
haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), virus cúm A còn được chia thành 16
subtype HA (H1-H16) và 9 subtype NA (N1-N9). Sự tái tổ hợp giữa các subtype
HA v NA về mặt ý thuyết sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau về độc tính v khả
năng gây bệnh [2]. Tất cả các subtype HA và NA đều hiện diện trên các chủng virus
lưu hành ở các loài thủy cầm hoang dã. Tuy nhiên, chỉ có một số subtype nhất định
thường xuyên lưu hành trên người như H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11]. Cúm
A/H5N1

một subtype có khả năng gây nhiễm cao của virus cúm. Các chủng của

virus cúm gia cầm có thể xâm nhiễm v o nhiều oại động vật khác nhau như chim
ợn ngựa hải cẩu cá voi v con người.
Virus cúm B và virus cúm C lưu hành chủ yếu trên người và chỉ gây ra các vụ
dịch ở mức độ vừa v nhỏ.

10

1.1.1.2. Phân loại virus cúm A/H5N1
Virus cúm A/H5N1 được phân biệt với các subtype virus cúm A khác dựa trên
sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên HA và NA. Do có khả năng biến đổi di
truyền nhanh chóng nên các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành còn được
phân chia th nh nhiều clade/subclade (nhóm/phân nhóm), mỗi clade/subclade có
các đặc điểm di truyền đặc trưng [2].
Các genotype của virus cúm A/H5N1
Trong những năm gần đây virus cúm A/H5N1 đã có những biến đổi di truyền
và được phân chia thành nhiều nhóm dựa vào sự khác biệt về kiểu gen (genotype).
Kiểu gen của virus cúm A/H5N1 thể hiện đặc điểm di truyền của virus được hình
thành do sự kết hợp của 8 phân đoạn gen. Trên cơ sở gen H5 và N1 của chủng gốc
Goose/Guangdong/1/96, virus A/H5N1 được phân chia thành các kiểu gen khác
nhau với các đặc điểm di truyền được hình thành do sự tái tổ hợp 6 gen còn lại từ
các ngu n khác nhau. Các kiểu gen khác nhau của virus cúm A/H5N1 đã được xác
định bao g m A, B, C, D, E, G, V, W, X0, X1, X2, X3, Y, Z và Z+ [26]. Trong số các
kiểu gen này, chỉ có một số kiểu gen (B, Z, Z+, V, G, W, và X0) lưu hành được trên
2 năm, chứng tỏ chúng đã thích nghi để có thể t n tại [22]. Kiểu gen Z là kiểu gen
lưu hành phổ biến ở Indonesia, Thái Lan, Việt Nam và phía nam Trung Quốc từ
năm 2003 đến nay [14].
Các clade của virus cúm A/H5N1
Các tổ chức WHO (World Health Organization), OIE (Organisation for
Animal Health) và FAO (Food and Agriculture Organization) đã cùng nhau xây
dựng một hệ thống danh pháp thống nhất để có thể xác định các clade A/H5N1 [50].
Hiện nay hệ thống danh pháp này chia virus A/H5N1 thành 10 clade khác nhau,
mỗi clade còn có thể phân thành các subclade (phân dòng) [5, 46]. Hiện tại chỉ có
các virus thuộc clade 0, 1, 2 và 7 là lây nhiễm cho người. Clade 2 g m một số
subclade khác nhau vẫn đang lưu h nh v tiếp tục hình thành các subclade mới [5].
Kể từ 2008, các clade A/H5N1 hiện đang lưu hành và gây bệnh ở người g m có

11

clade 2.3.2 (Trung Quốc), 2.3.4 (Trung Quốc và Việt Nam) 2.2 (Ai Cập), 2.1
(Indonesia), 1 (Campuchia) và 7 (Trung Quốc) [51].
1.1.1.3. Danh pháp virus cúm
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã quy định thống nhất danh pháp của virus cúm
theo thứ tự kí hiệu: type virus (A, B hoặc C), vật chủ (có thể bỏ qua nếu vật chủ là
người), địa điểm phân lập virus, mã số chủng virus và năm phân lập. Nếu là virus
cúm A thì phải thêm kí hiệu của kháng nguyên HA và kháng nguyên NA đặt trong
dấu ngoặc đơn.
Ví dụ: A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) là chủng virus cúm A ở người, phân
lập ở Hong Kong, mã số chủng là 156, phân lập năm 1997, có kháng nguyên HA là
H5 và kháng nguyên NA là N1.
A/Chicken/Vietnam/G62/2005 (H5N1) là chủng virus cúm A phân lập ở gà tại
Việt Nam năm 2005, mã số chủng là G62, kháng nguyên HA là H5 và kháng
nguyên NA là N1.
1.1.2. Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1
Virus cúm H5N1

một subtype của virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridea.

Virus cúm A/H5N1 mang các đặc điểm của virus cúm A (hình 1.1).

Hình 1.1. Cấu trúc của virus cúm A. />human-antibodies-neutralize-avian-flu.html

12


Virus cúm A là virus có vỏ bọc, cấu trúc dạng hình cầu với đường kính từ 80120 nm (nanomet) hoặc hình sợi dài 200-300 nm, đường kính 20 nm. Vỏ bọc của
virus là lớp màng lipid kép có ngu n gốc từ tế bào vật chủ, trên màng có khoảng 500

cấu trúc hình gai nhô ra. Các cấu trúc này chính là các kháng nguyên bề mặt của
virus, dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm, bản chất là các glycoprotein HA,
NA và M2 nằm xen kẽ với nhau. Sự phân bố của các kháng nguyên trên bề mặt của
hạt virus không đ ng đều, tỉ lệ HA/NA khoảng 4-5/1. Bên trong màng lipid được lót
bởi một lớp protein nền M1 (khoảng 3000 phân tử M1) [36].
Vật chất di truyền (hệ gen) của virus cúm A

RNA sợi đơn âm (-)ssRNA,

g m 8 phân đoạn riêng biệt mã hóa cho 10 hoặc 11 protein virus (t y theo từng
chủng virus m có thể có hoặc không có protein P 1-F2). Bên trong hạt virus, mỗi
phân đoạn đều iên kết với nucleoprotein (NP) và 3 tiểu đơn vị của enzyme
polymerase (bao g m PB1, PB2, và PA) hình thành nên các phức hợp
ribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein - vRNP) [37].
1.1.3. Hệ gen và các protein của virus A/H5N1
H5N1 có hệ gen

RNA sợi đơn âm bao g m 8 phân đoạn gen mang tên từ

1-8 với kích thước phân tử giảm dần hoặc gọi theo tên protein m chúng mã hóa
tổng hợp là PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2) và NS (NS1 và
NEP) (hình 1.2).

Hình 1.2. Các phân đoạn gen và các protein của virus cúm A/H5N1

13


Đặc điểm các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 như sau:
Các phân đoạn mã hóa cho các kháng nguyên bề mặt của virus (đặc trưng

theo từng chủng virus):
- Phân đoạn 4 (gen HA): Có kích thước khoảng 1704-1707 bases, mang gen
mã hóa tổng hợp protein HA, là một kháng nguyên bề mặt của virus cúm có bản
chất là glycoprotein. Kháng nguyên này có vai trò trong việc giúp cho virus gắn với
tế bào vật chủ và vận chuyển vật liệu di truyền của nó v o bên trong tế bào vật chủ.
Quá trình này có thể bị chặn lại nếu có các kháng thể đặc hiệu gắn kết với các
kháng nguyên trên bề mặt của virus. Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan
trọng của virus cúm A kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc
hiệu với từng subtype HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus. HA là protein
vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus

đích của bảo

vệ miễn dịch nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, là cơ sở điều
chế các vaccine phòng cúm hiện nay. Một đặc điểm di truyền để phân biệt giữa
virus cúm gia cầm và virus cúm người là: virus cúm gia cầm chỉ gắn với thụ thể
alpha 2-3 sialic acid còn virus cúm người chỉ gắn với thụ thể alpha 2-6 sialic acid
trên tế bào chủ. Ở một số động vật ( ợn g ...) có cả 2 oại thụ thể nên có thể bị
nhiễm cả virus cúm gia cầm v cúm người [24]. Người ta đã phát hiện ra sự đột
biến ở một số vị trí trên gen HA làm cho virus cúm gia cầm có thể gắn với tế bào
người và gây bệnh cho người [11]. Một số nghiên cứu trong thời gian gần đây đã
cho thấy ở người cũng có các thụ thể alpha 2-3 sialic acid với mật độ rất thấp và ở
gia cầm cũng có các thụ thể alpha 2-6 sialic acid với mật độ rất thấp [28]. Người ta
cũng nhận thấy nếu đột biến xảy ra ở 2 vị trí trên gen HA tương ứng với axit amin
182 và 192 thì virus có thể gắn với cả thụ thể của người và gia cầm [10, 27].
- Phân đoạn 6 (gen NA): Có kích thước khoảng từ 1350-1410 bases, mang gen
mã hóa cho neuraminidase một kháng nguyên bề mặt của virus, có vai trò

một

enzyme cắt đứt iên kết giữa gốc sia ic acid của m ng tế b o nhiễm với phân tử
carbonhydrate của protein HA, giải phóng các hạt virus con ra khỏi tế bào vật chủ.
Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan

14


loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng
tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu. Giống kháng
nguyên HA NA cũng

đích chủ yếu của cơ chế bảo vệ miễn dịch của cơ thể chủ,

sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đang nhễm.
Như vậy, hai kháng nguyên bề mặt HA và NA của virus

cơ sở điều chế các vaccine

phòng cúm hiện n y cho người và gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [2].
Các phân đoạn mã hóa cho các protein thành phần của enzyme polymerase
của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, gồm:
- Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa
tổng hợp protein PB2, là tiểu đơn vị th nh phần trong phức hợp enzyme po ymerase
của virus chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus [2]. Nghiên cứu thấy
rằng trên P 2 tất cả các virus cúm gia cầm đều có axit amin ở vị trí 627
glutamine, còn P 2 ở các chủng A/H5N1 phân ập từ người mang đột biến chứa
axit amin ysine ở vị trí 627. Sự có mặt của ysine ở vị trí 627 của P 2 sẽ tạo thuận
lợi cho virus phát triển ở cả đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới của động vật
có vú, là nguyên nhân làm cho A/H5N1 có độc lực cao [29].
- Phân đoạn 2 (gen PB1) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa

tổng hợp protein P 1 v P 1-F2. P 1

tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enyzme

polymerase chịu trách nhiệm gắn mũ RNA [5]. PB1-F2 liên quan đến độc lực của
virus và có thể có vai trò quan trọng trong việc xác định mức độ nguy hiểm của dịch
cúm [43]. Khi so sánh các chủng virus trong vụ dịch ở Hong Kong năm 1997, người
ta nhận thấy sự biến đổi axit amin asparagine ở vị trí 66 thành serine (N66S) trên
PB1-F2 liên quan đến độc lực của virus. Sự thay đổi axit amin N66S cũng được
phát hiện trên PB1-F2 của virus cúm gây ra đại dịch cúm năm 1918 [17].
- Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước khoảng 2233 bases
bảo t n cao mã hóa tổng hợp protein PA

phân đoạn gen

một tiểu đơn vị của enzyme

po ymerase chịu trách nhiệm kéo d i RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus
[40].

15


Các phân đoạn mã hóa các protein chức năng khác của virus, chúng có kích
thước tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, gồm:
- Phân đoạn 5 (gen NP) có kích thước khoảng 1556 bases mã hóa tổng hợp
nucleoprotein (NP), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân v b o tương tế
b o chủ. NP có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus t n tại trong các
hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA.
- Phân đoạn 7 (gen M): có kích thước khoảng 1027 bases, mang gen mã hóa

tổng hợp protein nền M1 và M2 của virus. Các protein n y kết hợp với 2 kháng
nguyên bề mặt tạo nên lớp vỏ capsid của virus. Hai protein này được tạo ra từ cùng
một phân đoạn RNA với các khung đọc mở khác nhau. Protein M1 gắn với RNA
của virus và M2 có tác dụng phá vỡ vỏ bọc của virus để giải phóng các phân đoạn
RNA v o tế bào chất của tế bào chủ. M2 là protein xuyên màng có bản chất là một
kênh ion, cần thiết cho quá trình xâm nhiễm của virus [36]. Sự thay thế axit amin ở
vị trí 31 serin thành asparagine trên protein M2 của một số chủng H5N1 liên quan
đến tình trạng kháng amantadin của virus [25].
- Phân đoạn 8 (gen NS) có kích thước khoảng 890 bases, chứa gen mã hóa cho
2 protein không cấu trúc của virus là NS1 và NEP (nuclear export protein) (thường
được gọi là protein NS2). Độc lực của virus liên quan đến protein NS [39]. NS1 là
protein có vai trò trong việc ghép nối dịch mã và vận chuyển RNA qua m ng tế
bào. NEP có vai trò trung gian trong quá trình vận chuyển các ribonucleoprotein của
virus (vRNPs) v o nhân tế bào chủ.
1.1.4. Chu trình tái bản của virus cúm A/H5N1
Chu trình tái bản của virus cúm xảy ra chủ yếu ở các tế b o biểu mô đường hô hấp
đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm (hình 1.3).

16


Hình 1.3. Chu trình tái bản của virus cúm A
Khởi đầu chu trình là sự gắn kết của virus với các thụ thể có chứa nhóm
sialic acid trên bề mặt tế b o nhiễm nhờ kháng nguyên HA. Khi virus bám gắn được
với tế b o m ng tế b o õm ại hình th nh túi thực b o (endosome). Túi thực b o
giảm dần pH để giúp cho quá trình ho nhập m ng virus với m ng túi thực b o v
giải phóng các phức hợp RNP của virus v o tế b o chất của tế b o chủ. Sau đó các
phức hợp RNP được vận chuyển v o nhân tế b o để tổng hợp sợi dương RNA. Sợi
dương RNA được

m khuôn để sao mã tạo mRNA v tái bản sợi âm RNA của

virus. mRNA được đưa ra tế b o chất để tổng hợp protein của virus. Quá trình tổng
hợp protein v tái bản hệ gen của virus

quá trình phức tạp được điều ho bởi

nhiều yếu tố của virus cũng như của tế b o. Các protein P 1 P 2 PA v NP của
virus sau khi được tổng hợp sẽ được đưa v o nhân tế b o v kết hợp với RNA virus
hình thành các phức hợp RNP v phức hợp được đưa ra tế b o chất. Các protein
khác (HA NA v M2) được g ycosy hoá nhờ mạng ười nội sinh chất v phức hệ
go gi của tế b o. Sau khi ho n thiện các protein n y được đưa đến m ng tế b o gắn
vào ớp ipid kép v khi mật độ đủ ớn thì các phức hợp RNP và protein M1 cũng
tập hợp ại trên m ng để hình th nh hạt virus thế hệ con gắn trên bề mặt tế b o nhờ
iên kết giữa HA với nhóm sia ic acid của g ycoprotein m ng tế b o. Các hạt virus
sau đó giải phóng khỏi m ng nhờ tác dụng cắt nhóm sia ic acid của enzyme
neuraminidase.

17


Thời gian từ khi virus xâm nhiễm tế b o đến khi hình th nh thế hệ virus con trung
bình khoảng 6 giờ. Sự giải phóng các hạt virus mới không phá tan tế b o nhiễm
nhưng các tế b o n y bị rối oạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử v rơi v o quá
trình chết theo chương trình (apoptosis) m tổn thương mô của cơ thể vật chủ [48].
1.1.5. Hiện tƣợng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A
Virus cúm A là loại virus đặc biệt nhất trong các virus đường hô hấp do có hệ
gen phân th nh 8 đoạn và khả năng biến đổi kháng nguyên nhanh chóng. Khả năng
biến đổi kháng nguyên của virus cúm A là hệ quả của các quá trình biến đổi di
truyền của virus. Các cơ chế biến đổi di truyền của virus bao g m:

- Hiện tƣợng trao đổi kháng nguyên (antigenic shift): Antigenic shift là các
biến đổi di truyền lớn của virus cúm, tạo ra chủng virus mới từ các chủng virus ban
đầu bằng cách sắp xếp lại hệ gen. Quá trình này xảy ra khi virus cúm của các loài
khác nhau đ ng nhiễm trên cùng một vật chủ (ví dụ như hai chủng virus cúm người
và virus cúm gia cầm đ ng nhiễm trên lợn) trao đổi hệ gen cho nhau tạo ra các thế
hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp từ các chủng ban đầu. Sự trao đổi kháng
nguyên có thể tạo ra các chủng virus cúm mới có khả năng ây nhiễm các o i vật
chủ mới hoặc gia tăng động ực gây bệnh [2].
- Hiện tƣợng lệch kháng nguyên (antigenic drift): Antigenic drift là quá trình
tích ũy các đột biến gen trên gen mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng của
virus (kháng nguyên HA và NA). Do enzyme polymerase của virus không có cơ chế
đọc sửa nên trong quá trình tái bản tần số đột biến ở virus rất cao, trung bình mỗi
lần tái bản hệ gen của virus sẽ có 1 nuc eotid bị biến đổi [21]. Qua nhiều thế hệ
virus, các đột biến này dần dần được tích ũy lại và đến một lúc nào đó sẽ làm thay
đổi đặc tính kháng nguyên của virus [21]. Chủng virus cúm với các đặc tính kháng
nguyên mới có thể thoát khỏi hệ thống miễn dịch của cơ thể và dễ d ng an truyền
trong quần thể.
- Hiện tƣợng glycosyl hóa: Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của
một chuỗi oligosaccharide với amino acid asparagine ở một số vị trí nhất định trong

18


chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm. Thông
thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N-X-S/T (N = asparagine; X =
amino acid bất kì, trừ proline; S/T = serine hoặc threonine) [7]. Đây là những vị trí
được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng
nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm. Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến
điểm hình thành bộ mã của asparagine, tạo tiền đ cho hiện tượng glycosyl hóa xảy
ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi đặc tính kháng nguyên

của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo vệ của cơ thể chủ
và điều hoà sự nhân lên của virus [7].
Hiện tượng lệch kháng nguyên và glycosyl hóa tạo ra những biến đổi di truyền
nhỏ nhưng diễn ra iên tục trong quá trình ưu h nh của virus trong tự nhiên. Ngược
ại hiện tượng trao đổi kháng nguyên có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus
cúm A khi có hiện tượng đ ng nhiễm tạo ra các biến đổi di truyền ớn v hình
th nh chủng virus mới. Đây cũng chính

vấn đề đáng o ngại của virus cúm

A/H5N1 hiện nay, mặc d virus n y chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở
người nhưng nó có khả năng gây bệnh cho người với tỉ ệ tử vong rất cao. Nếu như
chủng virus A/H5N1 trao đổi gen HA hay NA hoặc cả hai gen với một chủng virus
cúm A đã thích nghi ở người (ví dụ như H1N1 hoặc H3N2) có thể tạo ra chủng
virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người

nguy cơ của một đại dịch cúm

mới [25].
1.1.6. Khả năng thích ứng vật chủ của virus cúm A
Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A
hoang dã (chủ yếu

vịt trời) đây

các o i thủy cầm

nguyên nhân an truyền virus trong tự nhiên

rất khó kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng

trong quá trình ây truyền ở tự nhiên (hình 1.4).

19


Hình 1.4. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của
virus cúm A.
/>Nhờ đặc tính uôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên virus cúm A có
khả năng xâm nhiễm nhiều o i vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm một
số o i động vật có vú (hải cẩu cá voi ngựa ợn…) v cả con người tạo nên
tính thích ứng an truyền “nội loài” như g - g
gà - ợn - người. Đặc điểm thích ứng vật chủ n y

hay “ngoại loài” như g - ợn;
điều kiện thuận ợi cho virus

cúm A trao đổi tái tổ hợp các phân đoạn gen đặc biệt

các phân đoạn gen

kháng nguyên (HA v NA) giữa các chủng tạo ra một chủng virus cúm mới có
khả năng thích ứng xâm nhiễm ở o i vật chủ mới của chúng đặc biệt khi chúng
vượt qua được “rào cản loài” dễ d ng thích ứng ây nhiễm gây bệnh từ gia cầm
sang người v giữa người với người [15].
Các nghiên cứu về virus H5N1 trong thời gian gần đây cho thấy virus đã có
những biến đổi để thích nghi lây nhiễm trên người. Hai chủng virus H5N1 phân lập
trên người năm 2003 (Hong Kong) cho thấy có hiện tượng giảm ái lực với thụ thể
của gia cầm và có ái lực (mặc dù chỉ ở mức thấp) với thụ thể của người và sự thay
đổi axit amin ở vị trí 227 (Ser th nh Asn)

nguyên nhân m thay đổi tính đặc hiệu

với thụ thể của virus [23]. Đột biến ở vị trí 182 hoặc 192 (Asn182Lys hoặc

20


Gln192Arg) làm cho H5N1 thay đổi đặc tính gắn thụ thể từ dạng có ái lực với thụ
thể của gia cầm chuyển thành dạng có ái lực với thụ thể của người [52].
Trong thế kỷ 20, chỉ có các chủng virus H1N1, H2N2, H3N2 và H1N2 lưu
hành trên người. Tuy nhiên trong những năm gần đây có nhiều subtype virus cúm
gia cầm như H5N1, H7N3, H7N7, H9N2 và H10N7 đã lây nhiễm cho người.
Virus cúm A/H5N1 có khả năng lây nhiễm và gây bệnh cho nhiều loài động
vật có vú khác như chó, mèo, hổ, báo…
1.1.7. Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1
Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích ứng
vật chủ của từng chủng virus. Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây
bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm, nhưng một số
chủng thuộc subtype H5, H7, H1, H2 và H3 có thể gây bệnh nặng ở nhiều cơ quan
trong cơ thể gây nên dịch cúm ở gia cầm và người [52]. Dựa vào khả năng gây
bệnh của virus trên gia cầm, virus cúm A được chia thành 2 nhóm là nhóm có độc
lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) và nhóm có độc lực thấp (Low
Pathogenic Avian Influenza - LPAI). Nhóm LPAI thường chỉ gây ra các bệnh nhẹ ở
đường hô hấp, giảm sức đẻ và/hoặc giảm trọng lượng, mặc dù đôi khi có thể gây
bệnh với tỉ lệ cao nhưng tỉ lệ chết thường thấp. Trái lại, virus HPAI thường gây chết
gia cầm với tỷ lệ cao, ít nhất 75% gia cầm nhiễm đều bị chết [45]. Cho đến nay, tất
cả các chủng HPAI đã biết đều thuộc subtype H5 hoặc H7, tuy nhiên không phải tất
cả mà chỉ có một số ít các chủng virus thuộc subtype H5 và H7 là HPAI. Protein
HA của LPAI có đặc điểm là chỉ có một axit amin kiềm là arginine tại vị trí phân
cắt và một axit amin kiềm khác ở trước vị trí phân cắt 3 hoặc 4 axit amin (tùy thuộc

v o từng subtype). Do đó, protein HA của LPAI chỉ bị phân cắt bởi các protease
ngoại bào (extrace u ar proteases) do các tế bào hoặc vi khuẩn tại vị trí xâm nhiễm
(ví dụ như khí quản và ruột) tiết ra. Trái lại, protein HA của HPAI lại có nhiều axit
amin kiềm tại vị trí phân cắt, do đó có thể chịu tác dụng của các protease nội bào
(intracellular protease) phổ biến như furin [44]. Chính vì vậy mà HPAI có thể gây

21


bệnh ở nhiều mô, cơ quan khác nhau trên cơ thể vật chủ và gây nên các triệu chứng
nặng nề và tỉ lệ tử vong cao.
Độc ực v khả năng gây bệnh của virus A/H5N1 được quyết định chủ yếu bởi
các protein của virus

HA P 2 NS1 v P 1-F2: Protein HA là kháng nguyên bề

mặt quan trọng của virus cúm giúp cho virus có thể gắn với các thụ thể sia ic acid
đặc hiệu trên bề mặt tế b o hòa m ng v xâm nhiễm tế b o chủ. Vị trí phân cắt
protein HA của A/H5N1 mang nhiều axit amin kiềm nên dễ d ng bị phân cắt bởi
các protease, giúp virus có thể ây nhiễm v tái bản ở nhiều mô cơ quan khác nhau
trong cơ thể vật chủ v gây nên các triệu chứng nặng nề. Protein P 2

một th nh

phần quan trọng của phức hợp RNP của virus tham gia v o quá trình sao mã v tái
bản của virus. Protein NS1 có thể tham gia điều hòa đáp ứng miễn dịch ở vật chủ
do đó cũng

một yếu tố quyết định độc ực của virus đối với con người. PB1-F2 có

vai trò gây ra hiện tượng apoptosis làm tổn thương mô cơ quan của cơ thể nhiễm.
1.1.8. Sức đề kháng của virus cúm A
Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân vật í hay hóa học. Các hạt virus
t n tại thích hợp trong khoảng pH từ 6.5 đến 7.9. Ở pH quá acid hay quá kiềm khả năng
lây nhiễm của virus bị giảm mạnh. Lớp vỏ ngo i của virus bản chất

ớp ipid kép, có

ngu n gốc từ m ng tế b o nhiễm dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan ipid chất tẩy
rửa v các chất sát tr ng: forma dehyde pheno β-propiolacton, sodium hypochloride, acid
oãng v hydroxy amine. Virus bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ t n tại được
15 ng y ánh sáng thường tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được
kháng nguyên của virus. Tuy nhiên virus cúm A dễ d ng bị tiêu diệt ho n to n ở 100oC và
ở 60oC/30 phút t n tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm) v tới h ng
năm ở nhiệt độ bảo quản (-70oC). Trong phủ tạng gia cầm (40oC) virus t n tại 25-30 ngày
nhưng chỉ t n tại 7 - 8 ng y ở nhiệt độ cơ thể người (37oC); trong nước virus có thể sống
tới 4 ng y ở nhiệt độ 30oC.

22


1.2. CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1
1.2.1. Triệu chứng nhiễm cúm A/H5N1
Ở gia cầm thời gian ủ bệnh từ v i giờ đến trên hai mươi ng y biểu hiện các
triệu chứng sốt cao chảy nước mắt đứng tụm một chỗ ông x

ph đầu và mắt, da

tím tái, chân xuất huyết, chảy nước dãi ở mỏ. Con vật khi sốt cao có biểu hiện
không bình thường ở hệ thống tiêu hóa, hô hấp, sinh sản và thần kinh. Triệu chứng

chung là giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức ăn gầy yếu. Trường hợp nặng có biểu
hiện ho, khó thở, rối loạn thần kinh, ỉa chảy, một số con có biểu hiện co giật hoặc ở
tư thế không bình thường. Những triệu trứng trên có thể xảy ra cùng một lúc hoặc
riêng rẽ [3, 4].
Ở người thời gian ủ bệnh bệnh của virus cúm A/H5N1 có thể kéo d i hơn so
với cúm m a trung bình hầu hết các trường hợp nhiễm A/H5N1

từ 2-4 ngày,

nhưng một số trường hợp có thể kéo dài hơn, 8-17 ngày [16]. Các triệu chứng lâm
sàng nhiễm cúm A/H5N1 có thể không biểu hiện hoặc biểu hiện các triệu chứng ở
các mức độ khác nhau từ nhẹ như bệnh cúm thông thường (khó thở, ho, sốt) cho
đến biểu hiện viêm phổi nặng, hội chứng suy hô hấp cấp (ARDS- Acute Respiratory
Distress Syndrome) hay hội chứng suy đa tạng (MODS- Multiorgan Disfunction
Syndrome). Các nghiên cứu cho thấy một số bệnh nhân không biểu hiện triệu chứng
(phát hiện qua xét nghiệm) v cũng có trường hợp biểu hiện các triệu chứng không
điển hình (viêm não hoặc viêm đường tiêu hóa) [6]. Không giống như cúm m a
bệnh nhân nhiễm A/H5N1 thường không có biểu hiện nhiễm tr ng đường hô hấp
trên m thường biểu hiện tình trạng viêm phổi v nhiễm tr ng đường hô hấp dưới.
Đặc điểm âm s ng n y có thể

do các thụ thể đặc hiệu với HA của virus cúm

A/H5N1 có nhiều ở đường hô hấp dưới. Triệu chứng cận âm s ng thường gặp
giảm số ượng bạch cầu đặc biệt

:

bạch cầu ympho giảm số ượng tiểu cầu giảm

a bumin huyết; tăng h m ượng một số protein huyết thanh như aminotransaminase
actate dehydrogenase v creatine phosphokinase; đường huyết tăng rõ có thể iên
quan đến việc sử dụng corticosteroid v có thể tăng creatinine máu [31]. Ở những
bệnh nhân có tải ượng virus cao trong dịch mũi v dịch nội khí quản những bệnh

23


nhân ở giai đoạn cuối của bệnh thì h m ượng cytokin v chemokin trong máu
thường tăng cao đặc biệt

các yếu tố như inter eukin-6 yếu tố hoại tử u v các

interferon chứng tỏ hiện tượng virus đang phát tán trong cơ thể [19]. Ở những bệnh
nhân tử vong người ta đã phát hiện các kháng nguyên v /hoặc RNA của virus ở hầu
hết các mô trong cơ thể bao g m: phổi khí quản gan niêm mạc ruột non ruột gi
tủy xương v não.
Tỉ lệ tử vong đối với bệnh nhân nhiễm cúm A/H5N1 nhập viện tương đối cao,
xấp xỉ 60% [13, 16], mặc dù tỷ lệ tử vong chung có lẽ thấp hơn nhiều. Trái ngược
với năm 1997, khi phần lớn các ca tử vong xảy ra ở bệnh nhân trên 13 tuổi, cúm
A/H5N1 hiện nay gây tỷ lệ tử vong cao ở trẻ nhỏ. Ở trẻ dưới 15 tuổi, tỷ lệ tử vong
là 89% [16]. Thời gian trung bình từ khi có triệu chứng đầu tiên đến khi tử vong là
9-10 ngày (thay đổi từ 6-30 ngày) và hầu hết bệnh nhân tử vong do suy hô hấp tiển
triển [5, 16].
1.2.2. Các phƣơng pháp xét nghiệm và chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1
Chẩn đoán lâm sàng nhiễm cúm A/H5N1 là rất khó vì triệu chứng của bệnh rất
đa dạng và tương tự như một số bệnh khác. Để chẩn đoán xác định người ta thường
phải dựa v o các kết quả xét nghiệm xác định sự có mặt của virus, kháng nguyên,
kháng thể hoặc RNA của virus trong mẫu bệnh phẩm.
1.2.2.1. Các phƣơng pháp xét nghiệm phát hiện cúm A/H5N1

Với đặc điểm cấu tạo v khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1 k thuật
xét nghiệm không chỉ đòi hỏi có độ tin cậy và độ nhạy cao mà thời gian xét nghiệm
phải nhanh [34]. Các k thuật xét nghiệm có thể áp dụng trong chẩn đoán virus cúm
A/H5N1 bao g m: phân lập virus; phát hiện kháng nguyên; phát hiện RNA của
virus bằng k thuật RT-PCR, realtime RT-PCR...và phát hiện sự tăng hiệu giá
kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân. Trong giai đoạn dịch cúm A/H5N1 đang
bùng phát thì việc áp dụng các k thuật chẩn đoán nhanh, có thể thực hiện với nhiều
mẫu bệnh phẩm cùng một úc có vai trò hết sức quan trọng.

24


Phương pháp phân lập virus
Hiện nay phân ập virus

tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán cúm A/H5N1 vì

các chủng virus sau khi phân lập có thể được dùng trong các nghiên cứu về sau như:
giải trình tự, xác định subtype, xác định c ade phân tích các đột biến v hiện tượng
tái tổ hợp để tìm hiểu về khả năng tái bản, khả năng lây nhiễm của virus và hiện
tượng kháng thuốc của virus. Virus A/H5N1 có thể phân lập bằng cách nuôi cấy
trên phôi gà SPF (specific pathogenic free) hoặc nuôi cấy trên tế bào thận chó
(Mardin-Darby canine kidney - MDCK) hoặc các dòng tế bào cảm nhiễm với virus
cúm khác.
Phân lập từ trứng: hầu hết các virus cúm phát triển ổn định trong khoang túi
niệu hoặc túi ối của phôi gà 10-12 ngày tuổi. Sau khi gây nhiễm trứng 48-72 giờ,
thu dịch khoang niệu mô, xác định sự có mặt và xác định subtype virus bằng các
phản ứng miễn dịch (HA, HI) hoặc RT-PCR. Với chủng virus có độc lực cao, phôi
có thể bị chết trong vòng 24 giờ sau khi gây nhiễm.
Phân lập từ tế bào: Khi nuôi cấy các virus cúm m a LPAI trên tế bào MDCK,

người ta phải bổ sung trypsin để virus có thể tái bản. Tuy nhiên, đối với các virus
cúm A/H5N1, vì là HPAI nên virus có thể tái bản mà không cần bổ sung trypsin.
L tiêu chuẩn v ng, nhưng phân lập virus đòi hỏi phải có phòng an toàn sinh
học cấp 3 (BioSafety Level 3 - BSL3) và thời gian nuôi cấy tương đối âu từ 2-6
ngày. Ngoài ra, sau khi phân lập được virus vẫn phải thực hiện các xét nghiệm khác
để chẩn đoán xác định subtype virus.
Phương pháp phát hiện kháng nguyên
L phương pháp dùng kháng thể đặc hiệu để phát hiện kháng nguyên virus.
Người ta có thể phát hiện kháng nguyên của virus trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm bằng
một số k thuật khác nhau, tuy nhiên k thuật được sử dụng phổ biến hơn do thời
gian xét nghiệm nhanh là:
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (direct immunofluorescence assay):
Tế bào niêm mạc đường hô hấp được cố định trên lam kính, kháng nguyên của virus

25