Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

HOÀNG ĐĂNG HIẾU

SỬ DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG VÀ ĐỊNH DANH LOÀI Ở TẬP ĐOÀN
CÂY DÓ BẦU (AQUILARIA SP.) TẠI HÀ TĨNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

1


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................5
1.1. Tổng quan về cây dó bầu .....................................................................................5
1.1.1. Đặc điểm phân loại và vị trí phân bố của cây dó bầu .......................................5
1.1.2. Đặc điểm sinh trƣởng và phát triển của cây dó bầu ..........................................6
1.1.3. Giá trị kinh tế và sinh thái của cây dó bầu ........................................................8
1.1.4. Thực trạng trồng và khai thác cây dó bầu trong nƣớc và trên thế giới ...........10
1.1.5. Các nhân tố ảnh hƣởng tới khả năng tạo trầm nhân tạo ..................................12
1.2. Một số phƣơng pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định quan hệ di
truyền .........................................................................................................................13
1.3. DNA barcode - quan điểm mới trong phân loại .................................................15
1.3.1. Giới thiệu DNA barcode .................................................................................15

1.3.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode ......................................................16
1.4. Một số locus đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp DNA barcode ở thực vật ........17
1.4.1. Trình tự gen nhân ............................................................................................17
1.4.2. Vùng gen mã hóa ribosome.............................................................................18
1.4.3. Trình tự gen luc lạp .........................................................................................18
1.4.4. Trình tự gen rbcL ............................................................................................20
1.4.5. Trình tự gen matK ...........................................................................................20
1.4.6. Trình tự gen rpoB và rpoC1 ............................................................................20
1.4.7. Trình tự gen ycf5 .............................................................................................21
1.4.8. Trình tự hai gen trnH - psbA ...........................................................................21
1.4.9. Trình tự hai gen trnL(UAA) - trnF(GAA) ......................................................22
1.5. Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật .................................................22
1.6. Một số kết quả trong nghiên cứu về cây dó bầu tại Việt Nam và trên thế giới .24
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..........................................................25
2.1.Vật liệu ................................................................................................................25
2.1.1. Thực vật...........................................................................................................25
2.1.2. Chủng vi khuẩn ...............................................................................................26

2


2.1.3. Hóa chất ..........................................................................................................26
2.1.4. Máy móc thiết bị .............................................................................................26
2.1.5. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ...........................................................27
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................27
2.2.1. Các bƣớc nghiên cứu.......................................................................................27
2.2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu..........................................................................27
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................36
3.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số ....................................................36
3.2. Tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR ...........................................37

3.3. Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu............................................39
3.3.1. Kết quả nhân bản gen rbcL .............................................................................39
3.3.2. Kết quả nhân bản gen rpoB .............................................................................39
3.3.3 Kết quả nhân bản gen psbA-trnH .....................................................................40
3.3.4. Kết quả nhân bản gen ITS ...............................................................................41
3.4. Kết quả tách dòng gen ........................................................................................41
3.4.1 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel) .....................................................41
3.4.2. Kết quả chuyển gen vào vector tách dòng ......................................................42
3.4.3. Kết quả biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli ...........................42
3.4.4 Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp ..........................................43
3.4.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp ..............................................................44
3.4.6. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp ..........................................................45
3.5. Xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA chỉ thị................46
3.5.1. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen trn-psbA ......................................47
3.5.2. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen rpoB ............................................49
3.5.3. Kết quả xác định và phân tích trình tự vùng gen lục lạp rbcL ........................51
3.5.4. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen ITS ...............................................55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................62

3


MỞ ĐẦU
Cây dó bầu (Aquilaria sp) là một trong những loài thực vật đặc hữu của nƣớc
ta, phân bố rải rác từ Bắc tới Nam, tập trung nhiều ở các tỉnh miền Trung đặc biệt là
Hà Tĩnh và Quảng Nam. Cây dó bầu mang lại giá trị kinh tế rất lớn với mục đích
chủ yếu là khai thác trầm hƣơng, một mặt hàng có giá trị kinh tế cao sử dụng trong
công nghiệp mỹ phẩm, trong dƣợc liệu, trong tôn giáo, chế tác đồ thủ công mỹ
nghệ.

Ở nƣớc ta hiện đã phát hiện ra 6 loài dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm
nhiệt đới thƣờng xanh, ẩm nguyên sinh: A. crassna (Dó bầu, Dó tía, Dó trắng),
A. baillonii (Dó Gạch), A. rugosa (Dó Quả Nhăn), A. malaccensis (Dó Mã Lai),
A. sinensis (Dó Trung Quốc), A. banaensis (Dó Bà Nà). Trong đó A. crassna là loài
đƣợc trồng phổ biến nhất do có khả năng tạo ra loại trầm Kỳ tốt nhất thế giới. Tuy
nhiên, hiện nay các loài dó bầu ở Việt Nam bị lai tạp rất nhiều, công tác lựa chọn
giống đƣa vào trồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm của mỗi
cá nhân, dẫn đến năng suất và chất lƣợng trầm thu đƣợc không ổn định. Do vậy,
việc chọn lọc giống cây ban đầu để đƣa vào triển khai là hết sức quan trọng và là
nhiệm vụ cấp thiết trong công tác bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen quý.
Hiện nay phƣơng pháp DNA barcode là một trong những công cụ phục vụ
định danh loài chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng
DNA chuẩn hay còn gọi là chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode). Việc
xác định loài bằng DNA chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài thực
vật [16] trong đó có dó bầu ở Việt Nam [18] khi những quan sát hình thái, sinh
trƣởng và phát triển chƣa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài.
Xuất phát từ những yêu cầu đặt ra nhƣ vậy chúng tôi quyết định thực hiện đề
tài “Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định
danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh.”

4


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây dó bầu
1.1.1. Đặc điểm phân loại và vị trí phân bố của cây dó bầu
Cây dó bầu (Aquilaria sp.) là một trong những loài thực vật có giá trị kinh tế
cao. Ở Việt Nam, cây dó bầu phân bố rải rác từ Bắc tới Nam, có nhiều ở các tỉnh
miền Trung. Cây dó bầu có rất nhiều tên gọi tùy theo mỗi địa phƣơng nhƣ: cây
Trầm Hƣơng, Dó Trầm, Dó Bầu Hƣơng, cây Tóc [43].

Cây dó bầu thuộc chi trầm Aquilaria, họ Thymeleaceae, bộ Thymelaeales,
lớp cây gỗ lớn Magnoliopsida, ngành Mộc Lan Magnoliophyta [41], [42].

Hình 1.1. Lá cây dó bầu

Chi Trầm Aquilaria gồm 24 loài khác nhau, tuy nhiên chỉ có 15 loài có khả
năng cho trầm hƣơng gồm: Aquilaria crassna; A. baillonii; A. sinensis hoặc
A. chinesis; A. borneensis; A. Malaccensi; A. gollocha; A. hirta; A. rostrata;
A. beccariana; A. cummingiana; A. filaria; A. khasiana; A. microcarpa;
A. grandiflora; A. bancana; A. Rugosa. Trong đó loài A. rugosa mới đây đƣợc
TS. Lê Công Kiệt và TS. Paul Kessler ngƣời Hà Lan phát hiện năm 2005 [18].
Trên thế giới, chi trầm phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến
Đông Nam Á và miền Nam Trung Quốc. Ở nƣớc ta, dó bầu phân bố rải rác trong
rừng rậm nhiệt đới thƣờng xanh, rừng ẩm nguyên sinh thuộc các tỉnh Tuyên Quang,

5


Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt là từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên
Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình Thuận đến
Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang và đảo Phú Quốc [42].
Trong số các loài có khả năng tạo trầm thì Aquilaria crassna là loài cây nổi
tiếng có khả năng tạo ra loại trầm kỳ tốt nhất thế giới [5].
1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng của cây dó bầu
Dó bầu là một loại cây gỗ thƣờng xanh, cao 20 - 30 m, đƣờng kính thân đạt
60 - 80 cm, thân thƣờng thẳng, đôi khi có rãnh dạng lòng máng, vỏ ngoài nhẵn, màu
nâu xám, thịt vỏ màu trắng có nhiều chất xơ (cellulose), nứt dọc lăn tăn, dễ bóc và
tƣớc ngƣợc từ gốc lên, cành mảnh, cong queo, màu nâu nhạt, có lông hoặc nhẵn, tán
thƣa. Lá đơn, mọc cách (so le), cuống lá dài 4 - 6 mm, phiến lá hình trứng, bầu dục
thuôn đến mác thuôn, kích thƣớc 8 - 15 x 2,5 - 9 cm, mặt trên màu lục bóng, mặt

dƣới nhạt hơn và có lông mịn, gốc lá thon nhọn dần hay tù; chóp lá nhọn, thuôn
nhọn, tận cùng có mũi, gân bên 15 - 18 đôi, thay đổi thất thƣờng, khá rõ ở mặt dƣới.
Cụm hoa hình tán hoặc chùm tán, mọc ở nách lá hoặc ở đầu cành, cuống cụm hoa
mảnh, dài 2 - 3 cm. Hoa nhỏ, mẫu 5, đài hợp ở phần dƣới, hình chuông, màu vàng
lục, trắng nhạt hoặc vàng xám, phía ngoài có lông thƣa; mặt trong gần nhƣ nhẵn, có
10 đƣờng gân rõ, tồn tại ở quả, 5 thùy dài hình trứng thuôn, dài 12 - 15 mm. Phần
phụ dạng cánh hoa, gốc bầu có tuyến mật. Quả nang gần hình trứng ngƣợc hoặc
hình quả lê, dài 4 cm, đƣờng kính 2,5 - 3 cm, có lông mềm, ngắn, có mang dài tồn
tại, khi khô nứt làm 2 mảnh, thƣờng mỗi quả chỉ có một hạt. Mùa hoa vào tháng 7 8, quả chín vào tháng 9 - 10 [3], [43].
Dó bầu sinh trƣởng rải rác trong rừng thƣờng xanh ẩm nhiệt đới, nguyên sinh
hoặc thứ sinh, trên sƣờn núi hoặc trên đất bằng ở độ cao 50 - 1.000 m có khi lên tới
1.200 m so với mặt biển. Ở nƣớc ta, dó bầu thƣờng phân bố rải rác trên sƣờn núi có
độ dốc nhỏ, thoát nƣớc. Trong quần xã của dó bầu thƣờng gặp các cây gỗ lớn: Táu,
Huỳnh , Gụ mật … Đôi khi cũng gặp cây dó bầu mọc trong rừng thứ sinh cùng các
loài Thánh thất, Mò lƣng bạc, Bƣởi bung, Mít nài và Ràng ràng.

6


Dó bầu (A. crassna) ƣa đất feralit điển hình, feralit trên núi phong hóa từ đá
kết, đá phiến hay đá granit. Lớp đất mặt trung bình hay mỏng, hơi ẩm, chua hoặc
gần trung tính (pH vào khoảng từ 4 - 6).
Tại Malaysia và vùng Đông Bắc Ấn Độ, dó bầu (A. malaccensis) phân bố
khá rải rác, độ gặp khoảng 2,5 cá thể trên một hecta. Ở Đông Bắc Ấn Độ, loài dó
bầu này thƣờng mọc rải rác ở độ cao từ 200 - 700 m, đôi khi lên tới 1.000 m. Dó
bầu sinh trƣởng trong các khu vực có lƣợng mƣa hàng năm thay đổi từ 1.500 6.500 mm, nhiệt độ trung bình tối đa năm 22 - 28oC. Những kết quả quan sát ở vùng
Đông Bắc Ấn Độ còn cho biết, loài này phân bố chủ yếu trong rừng ẩm thƣờng
xanh hoặc rừng thƣờng xanh, rất ít gặp trong rừng nửa rụng lá. Tuy nhiên, trong
thực tế, cây dó bầu trƣớc và sau khi tái tạo trầm vẫn sinh trƣởng tốt ở những nơi có
độ cao trên dƣới 40 m so với mực nƣớc biển. A. malaccensis thích ứng với các loại

đất phong hóa trên nham thạch, trên các loại đá biến tính, nhƣng cũng sinh trƣởng
tốt trên đất phong hóa từ sa thạch [42].
Tại Malaysia, từ lâu đã đƣa cây dó bầu vào trồng trọt, những quần thể rừng
trầm A. malaccensis 67 năm tuổi đã có chiều cao trung bình 27 m, và đƣờng kính
thân trung bình 38 cm. Những cây dó bầu có độ trƣởng thành 80 năm tuổi tại miền
Đông Bắc Ấn Độ, có chiều cao cây 25 - 30 m, thân to nhất có đƣờng kính 55 - 70
cm. Ở miền Tây Bắc Ấn Độ (Arunachal Pradesh), các quần thể trầm 8 năm tuổi đã
có chiều cao gần 5 m, và đƣờng kính thân gần 30 cm. Cũng ở Tây Bắc Ấn Độ,
chúng thƣờng bắt đầu ra hoa, kết quả ở thời kỳ đạt 7 - 9 năm tuổi. Những cá thể có
kích thƣớc trung bình cho năng suất hạt tốt, mỗi cây có thể cho tới 1,5 kg hạt [42].
Các khối trầm thƣờng đƣợc tạo thành trong thân cây hoặc trong những cành
lớn, chúng là kết quả của cả một quá trình chuyển hoá các hoạt động bệnh lý ở
những nơi bị bệnh, bị thƣơng… Nấm là một thành phần có tác dụng trong các hoạt
động đó, ngoài ra các côn trùng đục thân cây cũng có thể có mối liên hệ nào đó. Có
giả thuyết cho rằng, trƣớc tiên cây bị nấm gây bệnh tại những chỗ bị thƣơng làm
cho cây bị suy yếu, tiếp đó nấm thâm nhập vào cây và tạo thành các khối trầm.
Nhựa trầm là sản phẩm từ cây hay do nấm tạo ra? Lý giải diễn biến của quá trình

7


chuyển hóa để tạo thành các hợp chất hóa học trong nhựa trầm thế nào vẫn còn là
vấn đề nan giải và vẫn chƣa hiểu biết tƣờng tận [1].
Đến nay đã xác định đƣợc nấm Cytosphaera mangiferae có ở trầm của loài
A. Malaccensis và nấm Melanotus flavolives chứa trong khối trầm từ loài
A. sinensis [42].

Hình 1.2. Hoa và quả cây dó bầu

1.1.3. Giá trị kinh tế và sinh thái của cây dó bầu

Giá trị kinh tế quan trọng nhất của cây dó bầu là để khai thác trầm hƣơng. Từ
thời xa xƣa trầm hƣơng đã đƣợc coi là sản vật hết sức quí hiếm, ngày nay trầm
hƣơng vẫn là lâm sản ngoài gỗ có giá trị thƣơng mại quốc tế lớn. Trên thế giới trầm
hƣơng đƣợc sử dụng để chƣng cất tinh dầu trầm, một chất định hƣớng quan trọng
trong ngành công nghiệp để sản xuất các loại mỹ phẩm cao cấp. Tinh dầu trầm có
giá trị đặc biệt, đƣợc dùng trong công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loại
nƣớc hoa cao cấp, giá trị. Trầm hƣơng là sản phẩm văn hóa vật chất tín ngƣỡng tâm
linh của dân tộc Việt Nam đã tồn tại từ xa xƣa đến thời nay [9].
Theo CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of
Wild Fauna and Flora - Công ƣớc về buôn bán quốc tế những loài động thực vật
hoang dã nguy cấp) khối lƣợng mua bán trầm hƣơng trên thị trƣờng thế giới thời kỳ
1995 - 1997 khoảng 1.350 tấn. Giá mua bán trầm hƣơng đƣợc tính theo kg tùy
thuộc vào chất lƣợng. Giá bán trầm tại thị trƣờng Dubai (Arabia Saudi) vào năm
1993 giao động từ 27 đô la Mỹ/kg (loại thấp nhất) đến 10.000 đô la Mỹ/kg (loại tốt

8


nhất) [11]. Theo ƣớc tính của Liên hiệp Khoa học sản xuất tinh dầu - hƣơng liệu mỹ phẩm Việt Nam thì trong những năm từ 1980 đến 1990, khối lƣợng trầm hƣơng
các loại đã bị khai thác và xuất khẩu từ nƣớc ta khoảng 300 tấn. Trong đó có 2.000
kg trầm từ loại 1 - 4 trị giá khoảng 1,5 triệu USD và 300.000 kg Trầm loại 5 - 9 trị
giá khoảng 4,5 triệu USD; đặc biệt là 200 g kỳ nam loại 1 - 3 trị giá 0,5 triệu USD
và tới 2.800 kg kỳ nam loại 4 - 8 trị giá 2,52 triệu USD. Với giá trị kinh tế cao, trầm
hƣơng đã đem đến những hứa hẹn triển vọng cho ngành sản xuất lâm nghiệp khi 1
ha trồng cây dó bầu, tạo trầm hƣơng có thể làm ra giá trị 1,5 - 1,8 tỷ đồng/ 10 năm,
bình quân giá trị tạo ra 150 - 180 triệu/ ha/năm, trong đó lợi nhuận từ 50 - 60 %
[11].
Ngoài ra trong y học, trầm hƣơng còn đƣợc sử dụng để chữa một số bệnh
hiểm nghèo. Theo Đông y, trầm hƣơng là vị thuốc quý hiếm, có vị cay, tính ôn, vào
3 kinh: tì, vị, thận; có tác dụng dáng khí, nạp thận, bình can, tráng nguyên dƣơng,

chữa các bệnh đau bụng, đau ngực, nôn mửa, hen suyễn, lợi tiểu, giảm đau, trấn
tĩnh, hạ sốt, cấm khẩu, thổ huyết, khó thở, kích dục… Theo tây y, trầm hƣơng có tác
dụng kháng khuẩn, đặc biệt là với các loại khuẩn Mycobacterium tuberculosis và
Shigella flexneri, có tính khánh sinh, tạo kháng thể mạnh (diệt khuẩn, làm lành vết
thƣơng), có tác dụng chữa một số bệnh nhƣ bệnh về tim mạch (suy tim, đau ngực),
bệnh về hô hấp (hen suyễn), bệnh về thần kinh (an thần, mất ngủ, giảm đau, trấn
tĩnh….), bệnh về tiêu hoá (đau bụng, buồn nôn, tiêu chảy), bệnh về tiết niệu (bí tiểu
tiện). Đặc biệt, có thể dùng trầm hƣơng để chữa ung thƣ tuyến giáp [42].
Cũng giống nhƣ một số cây lâm nghiệp khác, dó bầu là một trong những cây
lâm nghiệp cung cấp nguyên liệu làm giấy có chất lƣợng cao. Theo các kết quả
nghiên cứu thực nghiệm nhiều năm của Trung tâm nghiên cứu lâm đặc sản thuộc
Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam, dó bầu là loài cây thích nghi tốt với khí hậu
nhiệt đới nóng ẩm mƣa nhiều và cho năng suất khai thác khá cao, đƣợc ngành công
nghiệp giấy xác định là một trong những nguồn nguyên liệu chính trong các dự án
đầu tƣ phát triển sản xuất của ngành từ nay đến năm 2010 [6].
Bên cạnh đó đối với môi trƣờng sinh thái và phát triển bền vững thì việc đƣa

9


dó bầu vào cơ cấu cây rừng với mục tiêu 5 triệu hecta rừng tại tỉnh Hà Tĩnh nói
riêng và trong cả nƣớc nói chung đã góp phần thúc đẩy tăng độ che phủ của rừng,
chống xói mòn đất và bảo vệ môi trƣờng. Đồng thời góp phần bảo tồn và phát triển
loài cây đặc hữu, qúy hiếm, có giá trị về khoa học và kinh tế của nƣớc ta. Đây còn
là giải pháp phù hợp với quy luật sản xuất đi đôi với bảo vệ môi trƣờng, kết hợp lợi
ích trƣớc mắt với lợi ích lâu dài, làm giàu trên cơ sở khai thác và tái tạo lợi thế đặc
hữu, ƣu việt của tài nguyên quốc gia. Hơn nữa, cây dó bầu còn có ý nghĩa tạo công
ăn việc làm cho ngƣời lao động, mở ra hƣớng phát triển kinh tế bền vững cho nông
thôn, vùng sâu vùng xa [5].
1.1.4. Thực trạng trồng và khai thác cây dó bầu trong nước và trên thế giới

Với giá trị kinh tế cao và nhu cầu ngày càng tăng nên trên thế giới nói chung
và Việt Nam nói riêng, trầm hƣơng tự nhiên bị khai thác đến cạn kiệt [13]. Năm
1994, cây dó bầu đƣợc ghi trong công ƣớc quốc tế CITES quy định về việc buôn
bán các sinh vật có nguy cơ tuyệt chủng [31].
- Trong nước
Theo thống kê của ngành thƣơng mại, nƣớc ta từ năm 1986 - 1990 đã khai
thác và xuất khẩu khoảng 1.163,9 tấn trầm hƣơng. Nhƣng cũng giống nhƣ các nƣớc
trên thế giới, số lƣợng này ngày càng giảm sút, năm 1985 khai thác và xuất khẩu
216,1 tấn đến năm 1990 chỉ còn 73,4 tấn.
Do có giá trị kinh tế cao và những thành công ban đầu trong các nghiên cứu
tạo trầm trên cây dó bầu mà hiện nay, các dự án trồng cây dó bầu đã và đang thu hút
sự quan tâm của các địa phƣơng trên cả nƣớc. Việc nhân giống cây dó bầu và sản
xuất trầm bền vững là một vấn đề cần thiết về mặt kinh tế và xã hội nhằm đem lại
nguồn lợi lớn từ trầm hƣơng đồng thời góp phần bảo vệ môi trƣờng và ngăn ngừa
tình trạng khai thác cây dó bầu trong tự nhiên. Quyết định 16/2005/QĐ-BNN ngày
15/03/2005 của Bộ NN-PTNT đã cho phép 6 trên 9 vùng sinh thái cả nƣớc đƣợc
trồng rừng sản xuất bằng cây dó bầu. Kết quả trong vòng 3 - 4 năm gần đây diện
tích cây dó bầu tăng nhanh góp phần đa dạng hóa loại cây trồng rừng và cây đặc
sản, hứa hẹn nhiều triển vọng lớn cho nền lâm nghiệp nói riêng và nền kinh tế nói

10


chung [44].
Theo thống kê của Hiệp hội trầm hƣơng, năm 2002, diện tích trồng cây dó
bầu ở các tỉnh phía Nam là 2.340 ha đến năm 2004 đã lên đến 5.527 ha, số liệu này
chủ yếu do tƣ nhân trồng cung cấp [7]. Số liệu thống kê của hiệp hội trầm hƣơng
cho thấy chỉ qua 2 năm diện tích trồng cây dó bầu ở các tỉnh phía Nam đã tăng thêm
70%, đến năm 2007 đã có trên 22 tỉnh, thành trồng cây dó bầu với diện tích khoảng
15.000 - 18.000 ha, phân bố trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam [4].

Tuy nhiên, do diện tích trồng cây dó bầu ngày càng tăng, trong khi đó nguồn
cung cấp hạt giống chủ yếu là những cây dó bố mẹ còn lại trong rừng tự nhiên và từ
một số cây trồng vào thập niên 80, 90 của thế kỷ XX dễ dẫn đến thoái hóa giống.
Ngoài ra, phần lớn các cơ sở sản xuất giống cây là của tƣ nhân, hạt giống thu hái từ
những cây chƣa tuyển chọn đầu dòng hoặc cây chƣa thành thục sinh dục, kỹ thuật
gieo ƣơm hạn chế, làm cho chất lƣợng giống cây còn những điều đáng lo ngại. Hơn
nữa, hiện nay, các loài dó bầu ở Việt Nam bị lai tạp rất nhiều, công tác lựa chọn
giống đƣa vào trồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm của mỗi
cá nhân dẫn đến năng suất và chất lƣợng trầm thu đƣợc không ổn định.
- Trên thế giới
Tại Malaysia và vùng Đông Bắc Ấn Độ, dó bầu (Aquilaria crassna) phân bố
khá rải rác, độ gặp khoảng 2,5 cá thể trên một hecta. Thái Lan đƣợc biết đến là quốc
gia trồng và khai thác trầm hƣơng nổi tiếng. Ở miền đông Thái Lan phát hiện thấy
loài A. subintegra, theo số liệu cho biết loài này rất phổ biến ở tỉnh Trad. Trƣớc đây,
do ngƣời nông dân không biết khai thác trầm từ loài này nên đã đem một số loài từ
nơi khác về trồng nhƣ loài A. crassna . Vì vậy, hiện nay loài A. subintegra đã bị lai
tạp rất nhiều. Tính đến năm 2003, loài cây này đƣợc trồng rất nhiều ở tỉnh Trad và
đã trở thành nơi cung cấp tinh dầu trầm có chất lƣợng tốt nhất thế giới. Đồng thời
các nhà khoa học đã tìm thấy nhiều loài có khả năng tạo trầm thuộc chi Aquilaria
đều có nguồn gốc từ các miền Đông-Bắc-Nam của Thái Lan [15].
Có thể thấy, nhu cầu trầm hƣơng trên thế giới ngày càng cao và trầm hƣơng
mua bán trên thị trƣờng hầu hết là khai thác từ thiên nhiên. Nhƣng một thực tế cho

11


thấy việc khác thác trầm hƣơng vào những thập niên cuối thế kỷ XX có tính chất
huỷ diệt cây dó bầu, làm cho nguồn cung cấp trầm hƣơng trên thị trƣờng ngày càng
cạn kiệt. Năm 1993, Indonesia khai thác và xuất khẩu hơn 661 tấn đến năm 1997
con số ấy chỉ còn 302 tấn; tƣơng tự nhƣ Indonesia, Malaysia từ 43,6 tấn còn 21,6

tấn; Campuchia năm 1995 khai thác và xuất khẩu 133,8 tấn sau 3 năm chỉ còn 13,2
tấn; Ấn Độ năm 1995 xuất khẩu 15,1 tấn đến năm 1997 còn 1,4 tấn. Những số liệu
này cho thấy một thực tế khối lƣợng trầm hƣơng mua bán trên thị trƣờng đang giảm
sút nghiêm trọng do cây dó bầu từ thiên nhiên bị khai thác nặng nề. Yêu cầu cấp
thiết đặt ra cho các quốc gia phải có biện pháp cũng nhƣ kế hoạch trồng và nghiên
cứu tạo trầm trên cây dó bầu đảm bảo nhu cầu lớn của thị trƣờng thế giới [5].
1.1.5. Các nhân tố ảnh hưởng tới khả năng tạo trầm nhân tạo
Sự tạo trầm trong tự nhiên của cây dó bầu là sự biến đổi của các phần tử gỗ
do tác động bệnh lý bởi vết nứt gãy, sự xâm nhập của các loài nấm…xảy ra một
cách tự nhiên năm này sang năm khác. Khi bị nhiễm bệnh ở một vùng nào đó, cây
sẽ tích tụ nhựa đến đây để tự băng bó vết thƣơng, xem nhƣ một khả năng tự đề
kháng để chống lại bệnh nên tạo ra trầm kỳ. Căn cứ vào sự hóa nhựa nhiều hay ít
mà có những sản phẩm nhƣ: Tóc, Trầm hƣơng và Kỳ nam. Để sản xuất trầm hƣơng
nhân tạo thách thức lớn nhất là công nghệ tạo trầm, chất lƣợng cây giống, các chỉ
tiêu về lâm sinh đối với cây dó trồng, sự tƣơng thích giữa các cây trồng xen, bệnh
của cây [43].
Trong đó, dựa trên cơ chế hình thành trầm trong tự nhiên, hiện nay về cơ bản
có 3 kỹ thuật cấy tạo trầm nhân tạo đƣợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu:
Phƣơng pháp vật lý (gây vết thƣơng cơ giới); Phƣơng pháp hóa học (xúc tác hóa
chất); Phƣơng pháp sinh học (xử lý với men vi sinh). Một số cách tạo trầm khác nhƣ
kết hợp một số phƣơng pháp trên với nhau.
Nhìn chung mỗi phƣơng pháp tạo trầm hƣơng cho kết quả không giống nhau
về số lƣợng, chất lƣợng, thời gian và chi phí, nhƣng có thể khẳng định con ngƣời đã
tạo đƣợc trầm hƣơng trên cây dó bầu là rõ ràng. Ngoài ra, các nghiên cứu tạo các
chromone invitro (thành phần chính trong tinh dầu trầm) từ nuôi cấy huyền phù tế

12


bào của dó bầu đã bƣớc đầu có kết quả [23], [20].

Bên cạnh các nghiên cứu về các kỹ thuật cấy tạo trầm nhân tạo, một hƣớng
nghiên cứu cũng rất quan trọng nhƣng còn bị bỏ ngỏ đó là các nghiên cứu ở mức độ
sinh học phân tử quần thể dó bầu để xác định nhóm các cá thể hay giống dó bầu có
khả năng tạo trầm hiệu quả, vì ngay trong tự nhiên không phải bất kỳ thân cây dó
bầu nào cũng có trầm và khả năng tạo trầm, chất lƣợng trầm ở các loài khác nhau
cũng là rất khác nhau. Hơn nữa, việc đầu tƣ trồng cây dó bầu đến khi thu hoạch là
khá lâu, đòi hỏi thời gian khoảng 7-10 năm (sau 5-7 năm mới có thể cấy tạo trầm
nhân tạo, và sau 2-3 năm mới có thể hạ cây để thu trầm). Trong hội nghị về cây
trầm hƣơng ngày 24/9/2004 tại thành phố Hồ Chí Minh, các chủ trại trầm cũng đƣa
ra những băn khoăn về công tác lựa chọn giống để có đƣợc trầm chất lƣợng cao, do
chất lƣợng trầm tạo đƣợc thật sự chỉ tạo trầm loại 4, loại 5 ảnh hƣởng rất lớn đến
hiệu quả kinh tế [5].
1.2. Một số phƣơng pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định quan
hệ di truyền
Có nhiều phƣơng pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định
loài ở động, thực vật và hầu hết các phƣơng pháp này đều dựa trên nguyên tắc nhƣ
những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau, càng gần nhau thì
tính chất giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải
phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học. Đối với thực vật, đặc điểm hình thái học của
các loài thực vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ƣu
điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trực quan nhƣng chỉ dựa vào thống kê phân tích một
hoặc nhiều tính trạng đƣợc thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả thấp. Điều này thật sự
gặp nhiều khó khăn khi các mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình
thái bên ngoài. Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm
dân gian sẽ đƣợc hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử
hiện đại.
Các phƣơng pháp phân loại học phân tử và xác định loài là hƣớng nghiên
cứu đƣợc phát triển mạnh trên thế giới hiện nay, đƣợc xây dựng dựa trên việc nhận

13

biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu của các taxon sinh vật. Hiện nay,
các kỹ thuật dựa trên phân tích DNA là phƣơng pháp có hiệu quả cao trong việc
định loại và giám định loài.
Phân loại học phân tử có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen
nhân, hệ gen của các bào quan nhƣ ti thể, lục lạp hoặc các sản phẩm của gen nhƣ
protein, enzyme. Mỗi loại gen, sản phẩm của gen lại phù hợp với từng đối tƣợng và
mục đích nghiên cứu khác nhau. Do đó, việc lựa chọn gen nào, loại protein nào có ý
nghĩa lớn đối với sự thành công của mỗi hƣớng nghiên cứu. Các kỹ thuật thƣờng
đƣợc sử dụng bao gồm: kỹ thuật isozym (đồng enzyme), các kỹ thuật phân tích so
sánh trình tự nucleotide các đoạn DNA nhƣ phƣơng pháp đa hình chiều dài các
đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), các kỹ
thuật trên cơ sở phản ứng PCR nhƣ SSR (Simple Sequence Repeats), đa hình các
đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên - RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA)
[17], [24], đa hình chiều dài các đoạn DNA nhân bản - AFLP (Amplified Fragment
Length Polymorphism), phân tích trình tự DNA … [7], [8] đã giúp giải quyết các
mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ
chủng loại và tiến hoá của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật. Thêm vào đó các
kỹ thuật này cũng đƣợc sử dụng nhƣ những chỉ thị phân tử để xác định những gen
kiểm soát hoặc có liên quan đến tính trạng nào đó của các cá thể, loài hay các nhóm
loài.
Gần đây, việc sử dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để định danh loài
đang đƣợc các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng
góp đáng kể trong việc phân loại loài. Để nhận dạng gen hay đánh giá mức độ tiến
hoá loài thì các nhóm gen chính thƣờng đƣợc sử dụng là gen ribosome rRNA, gen
ty thể, và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen rRNA 18S, 5S và 16S hay đƣợc dùng
để đánh giá mối quan hệ tiến hoá giữa các sinh vật. So với chỉ thị hình thái và chỉ
thị hoá học, chỉ thị DNA cho độ chính xác cao hơn mà không lệ thuộc vào bất cứ
yếu tố khách quan nào.

14


1.3. DNA barcode - quan điểm mới trong phân loại
1.3.1. Giới thiệu DNA barcode
Kỹ thuật DNA barcode (DNA mã vạch) là một tên mới cho một khái niệm
cũ. Thuật ngữ “ DNA mã vạch ” lần đầu tiên đƣợc sử dụng vào năm 1993 (Arnon,
1993), trong một bài báo mà không nhận đƣợc sự chú ý nhiều từ cộng đồng khoa
học, và gần đây thuật ngữ này đƣợc sử dụng lại trong nhiều nghiên cứu. Về cơ bản,
kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng một khu vực DNA (400-800 bp) nhƣ là một tiêu
chuẩn để nhận dạng các loài một cách nhanh chóng và chính xác. Kỹ thuật DNA mã
vạch giúp các nhà phân loại học trong công tác phân loại và xác định loài, Nâng cao
năng lực kiểm soát, hiểu biết và tận dụng sự đa dạng sinh học. Ngoài ra, kỹ thuật
này có triển vọng nghiên cứu và ứng dụng trong khoa học cuộc sống, trong khoa
học pháp y, y tế, nghiên cứu y dƣợc, sản xuất và kiểm soát chất lƣợng thực phẩm.
Phƣơng pháp này vô cùng có ý nghĩa trong các trƣờng hợp các mẫu vật sinh học
cần giám định loài đã đƣợc qua xử lý, chế biến nhƣ các dạng chế phẩm thuốc hay
thực phẩm đã qua chế biến…
Trên thực tế, DNA barcode bắt đầu có tầm ảnh hƣởng từ nghiên cứu của
Hebert và cs (2002), kết quả của nhóm nghiên cứu chỉ ra rằng các cá thể từ bộ sƣu
tập của 200 loài có quan hệ gần gũi với nhau thuộc bộ cánh vảy có thể xác định với
độ chính xác 100% bằng cách sử dụng gen ty thể cytochrome c oxidase tiểu đơn vị
I (COI) [36]. Sau đó nhiều nghiên cứu về định danh loài bằng chỉ thị DNA đã thành
công trên động vật nhƣ chim, cá, ốc tiền, nhện và một số loài côn trùng thuộc bộ
Cánh cứng. Gần đây, hệ thống chỉ thị DNA đang đƣợc thiết lập cho các nhóm sinh
vật khác nhƣ thực vật, tảo, nấm, sinh vật nguyên sinh và vi khuẩn đã thu đƣợc hiệu
quả đáng kể.
Để thúc đẩy việc sử dụng DNA barcode cho tất cả sinh vật nhân chuẩn sống
trên hành tinh này, CBOL (Consortium for the Barcode of Life ) đã đƣợc thành lập

vào tháng 5 năm 2004, gồm hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia. Với mục tiêu ban đầu
là xây dựng một thƣ viện trực tuyến trình tự barcode cho tất cả các loài chƣa đƣợc
biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ mẫu DNA nào. Với sự hỗ trợ

15


của CBOL, DNA barcode ngày càng phát triển và trở thành một phƣơng pháp phân
loại và định danh loài mới.
Trong bối cảnh của nền kinh tế phát triển nhanh và hậu quả tác động đến
động vật, thực vật của các quốc gia khác nhau, sự xác định loài sử dụng phƣơng
pháp nhanh là cần thiết để đánh giá đa dạng sinh học của các khu vực này nhằm bảo
vệ các loài đặc hữu quý hiếm và nguy cấp. Tuy nhiên cần lƣu ý rằng DNA barcode
không thể thay thế phân loại nhƣng nó là công cụ hữu ích để tạo ra thông tin về đơn
vị phân loại chƣa biết. Hiện nay, trên thế giới, kỹ thuật này đang đƣợc sử dụng chủ
yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực khác nhƣ khảo
cổ học, công nghiệp sinh học và chế biến thực phẩm….
1.3.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode
Đặc điểm quan trọng nhất của DNA barcode là phải phổ biến và đặc hiệu
trong các biến dị và dễ dàng sử dụng. Điều này có nghĩa là các đoạn gen đƣợc sử
dụng nhƣ một barcode nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có sự biến đổi giữa
các loài nhƣng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng kể.
Do đó, DNA barcode lý tƣởng là một đoạn DNA có trình tự nucleotide ngắn, bắt
cặp đƣợc với cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại bằng PCR.
Với động vật, hệ gen ty thể với các đặc tính di truyền theo dòng mẹ, tốc độ
đột biến cao chủ yếu là các đột biến thay thế trong vùng mã hoá, vùng điều khiển và
không tái tổ hợp đƣợc coi là một công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu tìm ra nguồn
gốc các loài. Thêm vào đó, DNA ty thể có số lƣợng bản sao lớn trong tế bào và bền
vững trong thời gian rất dài, hàng nghìn năm trong khi đó DNA nhân chỉ có một
bản sao và nhanh chóng bị phân huỷ ra ngoài môi trƣờng. Do vậy phần lớn các

nghiên cứu sử dụng một vùng DNA ngắn của gen ty thể mã hóa cytochrome c
oxidase subunit I (COI) làm chỉ thị DNA. Mặc dù có vài trƣờng hợp ngoại lệ, COI
đƣợc coi là một chỉ thị DNA điển hình và chung cho các loài động vật [35], [36],
[45].
Quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều
khó khăn. Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với chỉ thị

16


DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal
Transcribed Spacer) thƣờng đƣợc sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên
cứu [12], [26], [32]. Trong vòng 5 năm qua, nhiều vùng gen đã đƣợc nghiên cứu và
đề xuất là chỉ thị DNA cho thực vật [14], [19], [29]. Tuy nhiên chƣa có chỉ thị DNA
nào đƣợc đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [14], [22],
[25]. Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ
cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật
[14], [29], [19].
Theo Taberlet P. và cs (2007), hệ thống mã vạch DNA lý tƣởng phải đáp ứng
các yêu cầu sau đây:
- Thứ nhất, đoạn DNA chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các loài
nhƣng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài.
- Thứ hai, hệ thống định danh bằng DNA phải đƣợc chuẩn hóa, với cùng một
vùng DNA có thể đƣợc sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau.
- Thứ ba, đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ
dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ,…).
- Thứ tƣ, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân
gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA
- Đoạn DNA nghiên cứu nên có kích thƣớc ngắn để quá trình nhân bản DNA
không bị sai lệch. Thông thƣờng, đoạn DNA nghiên cứu có kích thƣớc 150 bp trở

lại, nếu dài hơn sẽ dễ bị sai lầm trong quá trình nhân bản DNA.
1.4. Một số locus đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp DNA barcode ở thực vật
1.4.1. Trình tự gen nhân
Các trình tự barcode đƣợc nhân bản từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến sẽ
cung cấp nhiều hơn thông tin về các loài cần xác định. Tuy nhiên khó khăn trong
việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc có bản sao
gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lƣợng DNA genome và khả năng phân biệt
dƣới loài do bảo toàn gen chức năng có thể chính là lý do tại sao hạn chế số lƣợng

17


các gen nhân đƣợc thử nghiệm trong xác định loài bằng phƣơng pháp DNA barcode
[36], [39].
1.4.2. Vùng gen mã hóa ribosome
Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome. Các gen
DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích
hợp để phân biệt các loài gần gũi. Trong tế bào, rDNA đƣợc sắp xếp nhƣ các đơn vị
đƣợc lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và xen giữa
các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm ở hai bên
sƣờn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba gen rDNA đƣợc bảo tồn cao hơn hai vùng
ITS. Nhìn chung các đơn vị rDNA đƣợc lặp lại hàng nghìn lần và đƣợc sắp xếp tập
trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể. Một trong những tính năng đáng chú ý nhất
của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó
tất cả các đơn vị tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao
hơn trong loài nhƣng khác biệt giữa các loài khác nhau.
Hiện tại, nrITS vùng ITS của gen nhân đƣợc xem là một trong những công cụ
hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó phổ biến
trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng. Một số
nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản vô tính cho thấy một số

mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều nguyên nhân nhƣ
lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của các gen
chức năng dẫn đến những thay đổi đó. Trên cơ sở này nrDNA có thể đƣợc sử dụng
để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử
đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn, dƣới nƣớc) và nguồn gốc tiến hóa
khác nhau [36], [39] [40].
1.4.3. Trình tự gen luc lạp
Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử DNA mạch vòng có kích thƣớc 120
- 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large single-copy region) và
bản sao đơn nhỏ (small single-copy region). Hai bản sao đƣợc phân cách bởi hai
chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20 - 30 kb. Hệ gen lục lạp

18


chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao), các gen tRNA (35 gen) và các
gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết
cho sự tồn tại của chúng.
Bảng 1.1. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp
Mồi

Trình tự 5’→3’

rbcL

a-f
ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
a-r
CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC
matK

matK 1F
GAACTCGTCGGATGGAGTG
matK 1R
GAGAAATCTTTTTCATTACTACAGTG
matK 2F
CGTACTTTTATGTTTACAGGCTAA
matK 2R
TAAACGATCCTCTCATTCACGA
rpoB
rpoB 1
AAGTGCATTGTTGGAACTGG
rpoB 2
ATGCAACGTCAAGCAGTTCC
rpoB 3
CCGTATGTGAAAAGAAGTATA
rpoB 4
GATCCCAGCATCACAATTCC
rpoC1
rpoC1 1
GTGGATACACTTCTTGATAATGG
rpoC1 2
GGCAAAGAGGGAAGATTTCG
rpoC1 3
TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC
rpoC1 4
CCATAAGCATATCTTGAGTTGG
ycf5
ycf5 1
GGATTATTAGTCACTCGTTGG
(ccsA)

ycf5 2
ACTTTAGAGCATATATTAACTC
ycf5 3
ACTTACGTGCATCATTAACCA
ycf5 4
CCCAATACCATCATACTTAC
trnH
- trnH2
CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
psbA
psbAF
GTTATGCATGAAAGTAATGCTC
trnH(GUG)
ACTGCCTTGATCCACTTGGC
psb A
CGAAGCTCCATCTACAAATGG
trnL-F
trnL-c
CGAAATCGGTAGACGCTACG
trnL-d
GGGGATAGAGGGACTTGAAC
trnL-e
GGTTCAAGTCCCTCTTATCCC
trnL-f
ATTTGAACTGGTGACACGAG3’
trnL-g
GGGCAATCCTGAGCCAA
trnL-h
CCATTGAGTCTCTGCACCTATC
→: mồi xuôi; ←: mồi ngƣợc

→
←
→
←
→
←
→
→
←
←
→
→
←
←
→
→
←
→
←
→
←
→
←
→
←
→
←

Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài do vậy

việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và
phân loại thực vật đƣợc các nhà khoa học rất quan tâm. Dựa trên những thông tin có
sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gần đây, một số locus là
đoạn gen hay các gen đƣợc chọn để nghiên cứu làm chỉ thị barcode tiềm năng cho

19


các loài thực vật trên trái đất. Có khoảng 20 gen lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng
1 kb) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài. Các gen này chứa đựng nhiều
mức độ tiến hoá và vì vậy phù hợp cho nhiều mức độ phân loại [36], [38], [35].
Các locus khác nhau đã đƣợc đề xuất về điều tra nhóm, mồi thích hợp cho
các gen này đƣợc trình bày trong bảng 1.1.
1.4.4. Trình tự gen rbcL
Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trƣng nhất, mã hóa các tiểu
đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase (RUBISCO).
rbcL là gen đầu tiên đƣợc giải trình từ thực vật. rbcL đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong
nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn 10000 trình tự rbcL có sẵn
trong GenBank. Do sự dễ dàng trong khuếch đại PCR ở một số nhóm thực vật,
CBOL gần đây đã công nhận rbcL là một trong những trình tự gen tiềm năng nhất
cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực vật. Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài
thấp, nên hầu hết các nhóm đều cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các
chỉ thị barcode khác, ví dụ nhƣ matK là hai locus barcode chuẩn cho thực vật [36],
[37], [39].
1.4.5. Trình tự gen matK
Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh nhất,
có kích thƣớc khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan đến quá
trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA. Do matK tiến hoá
nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã đƣợc sử dụng nhƣ một chỉ thị trong
nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật. CBOL đã thử

nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ
dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng
matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [36], [40].
1.4.6. Trình tự gen rpoB và rpoC1
Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase
lục lạp. Khi nghiên cứu họ Dipterocarpaceae, Tsumura và đtg (1996) đã nhận thấy

20


gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài. Hiện nay rpoB là gen đƣợc sử
dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh loài và xác định các loài vi khuẩn, đặc biệt là
khi nghiên cứu các chủng có quan hệ gần gũi. Cùng với gen 16S rRNA, rpoB đƣợc
sử dụng trong nhiều nghiên cứu để xác định loài vi khuẩn mới, do vậy các gen này
đƣợc đề xuất là chỉ thị barcode độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác. Trong các
nghiên cứu gần đây, CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt
loài cuả đoạn gen rpoC1 là thấp nhất (43%). Mặc dù vậy, trong nghiên cứu Liu và
đtg (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị rất hữu ích khi đƣợc sử dụng để phân biệt
các loài bryophytes. Do vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo để chứng minh sự phù
hợp khi sử dụng rpoB và rpoC1 làm chỉ thị barcode trong các nghiên cứu giám định
loài [36], [38].
1.4.7. Trình tự gen ycf5
ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino acids. Gen này đƣợc bảo tồn
trên tất cả các vùng thực vật và đã đƣợc kiểm nghiệm cho phù hợp với DNA
barcode của một vài nhóm. Tuy nhiên, gen này chƣa đƣợc công nhận và sử dụng
nhiều trong vai trò của một DNA barcode [36], [35].
1.4.8. Trình tự hai gen trnH-psbA
Gen trnH-psbA có kích thƣớc trung bình khoảng 450 bp, nhƣng thay đổi từ
296 đến 1120 bp, trnH-psbA đƣợc chứng minh là có khả năng xác định loài cao.
Locus trnH-psbA đã đƣợc khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt

trần. Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có kích thƣớc rất ngắn (~
300 bp), kích thƣớc của gen này thay đổi lớn do sự có mặt của gen rpS19 hoặc các
gen giả nằm giữa cùng gen của hai gen trnH và psbA. Trong nhiều nghiên cứu gần
đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-psbA nhƣ chỉ thị barcode độc lập cho thực vật hay
kết hợp với matK. CBOL thấy rằng khả năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao
nhất (69%) trong số 7 locus đƣợc thử nghiệm và do đó đề nghị nó nhƣ là chỉ thị
barode bổ sung. trnH-psbA có thể sử dụng trong hệ thống barcode ba locus khi hệ
thống barcode hai locus không cung cấp đầy đủ khả năng phân tích [36], [28].

21


1.4.9. Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA)
Locus trnL (UAA) - trnF (FAA) chứa gen trnL (UAA), vùng intron và vùng
nằm giữa hai gen trnL (UAA) và trnF (GAA). Taberlet và đtg là nhóm nghiên cứu
đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học thực vật. Vùng không mã
hoá trnL(UAA) và trnF (GAA) không phải là vùng có sự biến đổi lớn nhất của
DNA lục lạp nhƣng có ƣu thế nhƣ cấu trúc bậc 2 với vùng biến đổi và vùng bảo thủ
xen kẽ nhau. Điều này tạo thuận lợi cho các nghiên cứu tìm kiếm trình tự nucleotide
ở các vùng bảo thủ để thiết kế mồi và sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các đoạn
gen ở vùng biến đổi. Trong nghiên cứu để xác định trnL (UAA) intron có nên đƣợc
sử dụng làm vùng DNA barcode, Taberlet (2007) đã sử dụng 100 loài thực vật và
kết luận rằng trnL intron có thể sử dụng nhƣ là một barcode của thực vật, trnL-trnF
là một barcode tiềm năng cho phân tích, xác định các loài thực vật [29], [36], [40].
1.5. Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật
Trọng tâm nghiên cứu barcode ở thực vật chủ yếu là về đánh giá hiệu quả
tƣơng đối của của các đoạn gen chỉ thị đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phát sinh
loài. Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực
vật gặp nhiều khó khăn. Hệ gen ty thể ở thực vật thƣờng quá bảo thủ nên không
đƣợc dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều đặc điểm

mong muốn đối với chỉ thị DNA nhƣ ở hệ gen ty thể ở động vật. Ở hệ gen nhân,
vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcribed Spacer) cũng
đƣợc sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu [12], [26], [35].
Mặc dù một vài locus trong hệ gen lục lạp và gen nhân đã đƣợc nghiên cứu
làm chỉ thị trong nghiên cứu DNA barcode song kết quả thu đƣợc vẫn có những hạn
chế. Điều này cho thấy việc cần thiết sử dụng kết hợp các locus để bổ sung cho
nhau đem lại hiệu quả cao hơn trong đánh giá, phân loại các loài thực vật. Trên thực
tế từ lâu rbcL đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài, bên cạnh đó trình tự
gen matK có tỷ lệ tiến hóa cao nhất trong các gen lạp thể cũng có khả năng phân
biệt loài cao. Trên cơ sở đó CBOL đã kết hợp hai locus của rbcL và matK mang lại
hiệu quả cao (70% sự phân biệt loài) và giảm nhiều chi phí cho các điều tra về xây

22


dựng mối quan hệ cũng nhƣ phân loại đánh giá các loài thực vật. Hiệu quả kết hợp
giữa hai gen này thích hợp cho các nghiên cứu nhƣ là điều tra tƣơng tác thực vật động vật, xác định các loài cây đƣợc bảo vệ, các cuộc khảo sát đa dạng sinh học quy
mô lớn và phân biệt cây giống trong các chƣơng trình tái sinh rừng phân biệt và cho
mục đích xác định loài và phân loại [36].
Spooner sau khi xem xét hiệu quả của psbA - trnH, matK, nrITS trên 63 loài
khoai tây dại đã chỉ ra rằng trình tự của psbA - trnH, matK và nrITS không cung cấp
đầy đủ các thông tin về loài cụ thể. Gen lạp thể không cho thấy đầy đủ sự khác biệt,
trong khi các trình tự nrITS cho thấy sự khác biệt trong loài cao. Những khó khăn
đó cũng gặp phải trong chi Magnolioideae, họ Magnoliaceae và trong họ Lauraceae
khi giải thích những mối quan hệ trong loài. Từ những nghiên cứu cụ thể trên ba
nhóm thực vật khác nhau, thực vật hạt kín, hạt trần và rêu các nhà phân loại kết luận
rằng việc kết hợp các locus hệ gen lạp thể nhƣ rbcL + rpoC1 + matK + trnH-psbA
mang lại hiệu quả cao nhƣ một hệ thống barcode duy nhất cho xác định các nhóm
loài rộng. Vì vậy, trong các dự án nhƣ giám định loài sử dụng các chỉ thị barcode,
việc đề xuất barcode hai locus tiêu chuẩn là không đủ do sự phân ly trong loài và

quần thể ở nhiều thực vật hạt kín là rất lớn. Đặc biệt trong cùng khu vực phân bố
trải qua giao phối và giao phối cận huyết, sự thay đổi của một hoặc hai trình tự gen
lạp thể không đủ để đánh dấu ranh giới loài. Các vấn đề sinh học nhƣ đa bôi thể, dị
bội, sinh sản vô tính, chuyển gen, chọn dòng, phân ly và tiến hóa nhanh hình thái
học dẫn đến sự khó khăn trong xác định loài. Do vậy không thể sử dụng cùng một
vùng DNA để xác định cho các loài khác nhau mà cần lựa chọn các vùng DNA
khác nhau cho xác định ở các loài khác nhau [37], [38].
Hiện nay hệ thống DNA barcode cho thực vật chƣa hoàn chỉnh. Tuy nhiên
với các trình tự DNA barcode này, các nhà khoa học đã có những nghiên cứu, ứng
dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài ở thực vật, mở ra một triển vọng mới cho cho
công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh học.

23


1.6. Một số kết quả trong nghiên cứu về cây dó bầu tại Việt Nam và trên thế
giới
Xuất phát từ những giá trị mà cây dó bầu mang lại đã thúc đẩy các nhà khoa
học trên thế giới trong đó có Việt Nam đã tiến hành những thí nghiệm để nghiên
cứu về loài cây này. Một trong những nghiên cứu có đóng góp lớn nhất cho tới nay
là TS. Lê Công Kiệt và TS. Paul Kessler ngƣời Hà Lan đã phát hiện loài Aquilaria
rugosa năm 2005 đồng thời phân biệt đƣợc Aquilaria rugosa với A. sinnesiss, A.
crassna, A. yunasensis [18].
Bằng chỉ thị AFLP nhóm nghiên cứu của Nurita và đống tác giả (2009) đã
phát hiện đƣợc sự tƣơng đồng di truyền giữa các Aquilaria sp là A. malaccensis, A.
beccatianavà A. crassna khoảng 63,9 đến 72% so với các loài Aquilaria khác [21].
Các nhà khoa học ngƣời Malaysia cũng đã tiến hình phân tích trên 5 quần thể cây
dó bầu ở Malaysia bằng chỉ thị RAPD với 23 cặp mồi RADP từ đó đã tìm ra 5 chỉ
thị SCAR để phân biệt A. hita với các Aquilaria khác [27].

24


Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1.Vật liệu
2.1.1. Thực vật
Gồm 18 mẫu lá cây dó bầu đƣợc thu thập tại Hà Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào
đƣợc thống kê qua bảng sau.
Bảng 2.1. Thông tin về các mẫu dó bầu dùng trong nghiên cứu
STT

Tên mẫu

Loài

Xuất xứ

1

AL 02

Aquiaria sp

Lào

2

AL 06

Aquiaria sp

Lào

3

AL 08

Aquiaria sp

Lào

4

G1

Aquiaria sp

Hà Tĩnh

5

T1

Aquiaria sp

Hà Tĩnh

6

T2

Aquiaria sp

Hã Tĩnh

7

T3

Aquiaria sp

Hà Tĩnh

8

T4

Aquiaria sp

Hà Tĩnh

9

T6

Aquiaria sp

Hà Tĩnh

10

T7

Aquiaria sp

Hà Tĩnh

11

T8

Aquiaria sp

Hà Tình

12

T9

Aquiaria sp

Hà Tĩnh

13

T 10

Aquiaria sp

Hà Tĩnh

14

T 11

Aquiaria sp

Hà Tĩnh

15

T 14

Aquiaria sp

Hà Tĩnh

16

PQ64

Aquiaria sp

Phú Quốc

17

Qx

Aquiaria sp

Phú Quốc

18

M1

Aquiaria sp

Phú quốc

25