Thiết kế thang chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

HOÀNG THỊ HUYỀN

THIẾT KẾ THANG CHUẨN ADN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014

1


MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học đƣợc định nghĩa là “sự sản xuất hàng hóa và dịch vụ ở
quy mô công nghiệp nhờ việc sử dụng sinh vật, các hệ thống sinh học và các quá
trình sinh học”. Hơn một thế kỷ qua, công nghệ sinh học đƣợc chú trọng phát triển
tại hầu hết các quốc gia trên thế giới với nhiều thành tựu đáng kinh ngạc. Để thúc
đẩy sự phát triển công nghệ sinh học ở Việt Nam, các phòng thí nghiệm sinh học
ngày càng đƣợc trang bị máy móc hiện đại, nguồn nhân lực trình độ chuyên môn
tốt. Do đó, các chế phẩm sinh học phục vụ cho lĩnh vực nghiên cứu này đòi hỏi phải
đảm bảo chất lƣợng và độ chính xác cao. Một chế phẩm sinh học thƣờng dùng trong
nghiên cứu sinh học là thang chuẩn ADN. Đây là công cụ hữu ích đƣợc sử dụng để
đánh giá kích thƣớc và nồng độ các đoạn ADN. Tuy nhiên, thang chuẩn hiện nay
đều phải nhập khẩu với giá thành cao, thiếu tính chủ động trong nguồn cung cấp.
Nhƣợc điểm này đã gây nhiều khó khăn trong quá trình triển khai nghiên cứu tại các
phòng thí nghiệm ở Việt Nam.
Một trong những mặt hàng thang chuẩn có nhu cầu sử dụng cao và thuận tiện
trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử là thang chuẩn ADN 100 bp, thƣờng

gồm dải băng có kích thƣớc từ 100 bp đến 3000 bp. Mặc dù sản phẩm này có nhu
cầu sử dụng lớn, nhƣng lại phải nhập khẩu với giá thành cao, phụ thuộc thời gian
đặt hàng và vận chuyển đã phần nhiều ảnh hƣởng tới tính chủ động trong các thí
nghiệm. Để khắc phục những khó khăn này chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết Kế
Thang Chuẩn ADN”. Mục tiêu của đề tài là: thiết kế đƣợc thang chuẩn ADN 100 bp
đảm bảo chất lƣợng tốt, giá cả hợp lí, đáp ứng nhu cầu sử dụng cũng nhƣ phù hợp với điều
kiện các phòng thí nghiệm trong nƣớc. Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm
Sinh Y - Khoa Sinh học, Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ Enzyme - Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. THANG CHUẨN ADN
1.1.1. Thang chuẩn ADN
o Định nghĩa thang chuẩn ADN
Thang chuẩn ADN đƣợc định nghĩa là một hỗn hợp các phân tử ADN có
kích thƣớc khác nhau, đƣợc sử dụng trong điện di nhằm đánh giá kích thƣớc và
nồng độ đoạn ADN chƣa biết [26].
o Phân loại thang chuẩn ADN
Có nhiều cách gọi tên và phân chia các nhóm thang chuẩn ADN khác nhau nhƣ: dựa
trên bƣớc nhảy của thang chuẩn (thang chuẩn ADN 5 bp, 10 bp, hay 50 bp,…); dựa vào kỹ
thuật sản xuất (thang chuẩn PCR, thang chuẩn tái tổ hợp,…) [1]. Tuy nhiên, phân biệt giữa
ADN ladder và ADN marker cho đến nay vẫn là cách phân chia thang chuẩn thông dụng và
thuận tiện nhất, dựa trên bản chất nguyên liệu ADN đƣợc sử dụng trong quá trình
sản xuất:
- ADN Ladder: Để tạo ra ADN ladder ngƣời ta thƣờng sử dụng các enzyme
giới hạn có vị trí nhận biết đặc hiệu trên một phân tử ADN kích thƣớc lớn, không có
nguồn gốc tự nhiên (ví dụ nhƣ các plasmid đã bị biến đổi bằng kỹ thuật di truyền,

đoạn ADN kích thƣớc lớn). ADN ladder gồm các đoạn ADN có kích thƣớc đặc
trƣng, với bƣớc nhảy mong muốn (Hình 1) [16].

3


Hình 1. Ảnh ADN ladder 500 bp (Takara) [45]; ADN ladder 200 bp (Fermentas) [33] và
ADN ladder 10 bp (Invitrogen) [35].

- ADN Marker: Cũng nhƣ ADN ladder, để sản xuất ADN marker ngƣời ta sử
dụng các enzyme cắt giới hạn có vị trí nhận biết đặc hiệu trên một phân tử ADN kích
thƣớc lớn, nhƣng phân tử ADN này có sẵn trong tự nhiên nhƣ: ADN genome của thực
khuẩn thể lambda, plasmid pBR322, hay ΦX174... (Hình 2) [16]. Thang chuẩn loại này
gồm các đoạn ADN có kích thƣớc khác nhau với bƣớc nhảy ngẫu nhiên.

Hình 2. ADN marker thƣơng mại đƣợc tạo ra từ ΦX174; pBR322 và pUC19 [33].

1.1.2. Vai trò của thang chuẩn ADN trong nghiên cứu sinh học phân tử
Trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử việc tiến hành xác định nồng độ
và kích thƣớc các đoạn ADN luôn rất cần thiết trong các thí nghiệm nhƣ: sử dụng

4


kít tinh sạch, tách chiết ADN hay nhân dòng gen… Thông thƣờng để xác định chính
xác kích thƣớc và nồng độ ADN cần phải sử dụng đến phƣơng pháp giải trình tự và
xác định nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ. Cả hai phƣơng pháp này đều cần
nhiều thời gian, thao tác thí nghiệm tƣơng đối phức tạp, đặc biệt giá thành để giải
trình tự một mẫu ADN khá cao, lại không phải lúc nào cũng cần thiết. Cách đơn
giản, nhanh chóng để xác định nồng độ và kích thƣớc đoạn ADN nghiên cứu là so

sánh với một đoạn ADN đã biết nồng độ và kích thƣớc [24]. Để thực hiện mục đích
này kỹ thuật điện di đã đƣợc sử dụng một cách thƣờng xuyên.
Với mục đích phân tách các đoạn ADN trên gel agarose hoặc polyacrylamide,
thang chuẩn ADN đã trở thành một công cụ rất hữu ích để đánh giá chất lƣợng, kích
thƣớc và nồng độ của mẫu ADN. Thang chuẩn thƣờng chạy cùng một lúc trên gel
với các mẫu ADN, sự so sánh giữa các băng ADN mẫu với các băng ADN thang
chuẩn cho phép ƣớc tính kích thƣớc và nồng độ các đoạn ADN chƣa biết [16]. Để
thang chuẩn có thể thực hiện vai trò quan trọng này thì mỗi băng trong thang chuẩn
ADN thƣơng mại luôn đƣợc mô tả chính xác kích thƣớc và nồng độ ADN tƣơng
ứng với lƣợng thể tích [40].
1.1.3. Sản xuất thang chuẩn ADN
1.1.3.1. Cung ứng và sản xuất thang chuẩn ADN trên thế giới
Thị trƣờng thang chuẩn ADN trên thế giới hiện có sự góp mặt của nhiều hãng
sản xuất và cung ứng danh tiếng nhƣ Fermentas - Đức [33]; Takara - Nhật Bản [46];
Invitrogen - Mỹ [35]… Kích thƣớc những đoạn ADN trong các thí nghiệm là khác
nhau, chính vì thế mà thang chuẩn ADN bán trên thị trƣờng cũng phân thành nhiều
loại, tùy thuộc số lƣợng băng, kích thƣớc băng ở từng hãng sản xuất [38, 47].
Những khác biệt đó đã góp phần tạo ra một thị trƣờng thang chuẩn đa dạng và
phong phú (Hình 3). Các thang chuẩn hiện có mặt trên thị trƣờng thƣờng gồm các
băng trong khoảng từ 5 bp đến 50.000 bp [43, 44].

5


Hình 3. Một số thang chuẩn ADN thƣơng mại bán trên thị trƣờng [33, 34].

1.1.3.2. Tiềm năng sản xuất thang chuẩn ADN tại Việt Nam
Sự phát triển của các phòng thí nghiệm sinh học phân tử tại Việt Nam góp
phần làm tăng nhu cầu sử dụng thang chuẩn ADN. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn
chƣa có một cơ sở trong nƣớc nào đăng ký cung ứng sản phẩm này. Thang chuẩn

hiện vẫn phải nhập khẩu từ các hãng sản xuất lớn trên thế giới với giá thành cao,

6


phụ thuộc thời gian đóng gói và vận chuyển đã ảnh hƣởng đến tính chủ động trong
các thí nghiệm và nguồn cung cấp.
Trong những năm gần đây, chúng tôi đƣợc biết Viện Vi sinh vật và Công nghệ
Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã thực hiện đề tài thiết kế thang chuẩn [2, 6]. Tại
Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học
Quốc gia Hà Nội cũng đã sản xuất thành công thang chuẩn ADN 4,6 kb với bƣớc nhảy
500 bp và hiện đang trong quá trình dùng thử [1]. Tuy nhiên, các sản phẩm thang chuẩn
này vẫn chƣa đƣợc thƣơng mại hóa. Chính vì vậy, mặc dù cho đến nay thang chuẩn ở
Việt Nam có nhu cầu sử dụng rất lớn, nhƣng vẫn chƣa có sự góp mặt của một nhà sản
xuất trong nƣớc.
1.1.3.3. Phương pháp sản xuất thang chuẩn ADN
Thang chuẩn ADN là một sản phẩm mang tính chất thƣơng mại. Vì vậy, mặc
dù mặt hàng này đƣợc bán rất rộng rãi trên thị trƣờng nhƣng các kỹ thuật liên quan
đến thiết kế và sản xuất lại không đƣợc công bố. Do đó, rất khó để có đƣợc một tài
liệu tham khảo về quy trình sản xuất thang chuẩn ADN. Từ những tài liệu hiếm hoi
mà chúng tôi tổng hợp đƣợc cho thấy có bốn phƣơng pháp chủ yếu đƣợc áp dụng để
thiết kế thang chuẩn ADN với những ƣu và nhƣợc điểm riêng [1, 2].
o Phương pháp hóa tổng hợp
Oligonucleotide là một polymer ngắn của acid nucleic, thông thƣờng dài
khoảng 50 base trở xuống. Mặc dù các oligonucleotide có thể đƣợc tạo ra bằng cách
cắt liên kết của các phân tử dài, nhƣng hiện nay chúng thƣờng đƣợc tổng hợp với
trình tự đặc hiệu từ các nucleoside phosphoramidite [30]. Các oligonucleotide đƣợc
sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau của di truyền học phân tử, chẳng hạn
nhƣ: sử dụng làm mồi trong các phản ứng PCR; dùng làm mẫu dò trong các phƣơng
pháp lai phân tử; trong nghiên cứu tạo đột biến điểm xác định vị trí hay giải mã

trình tự ADN... [5]. Phản ứng kéo dài chuỗi oligonucleotide diễn ra bằng việc gắn
thêm tiền chất nucleotide mới vào phía đầu 5’, nhƣ vậy ngƣợc chiều với phản ứng
kéo dài chuỗi ADN sử dụng enzyme ADN polymerase [4].

7


Phƣơng pháp tổng hợp hóa học sử dụng các thiết bị hiện đại, dễ thực hiện,
nhanh chóng tổng hợp đƣợc bất cứ một trình tự ADN ngắn nào với độ tinh sạch và
chính xác cao (thông thƣờng đạt độ chính xác cao khi tiến hành tổng hợp các phân
tử ADN mạch đơn có độ dài tới 30 nucleotide [15]). Tuy nhiên, mặt hạn chế của
phƣơng pháp này là khó có thể tổng hợp đƣợc trình tự dài hơn 100 nucleotide mà
đảm bảo đƣợc số lƣợng và chất lƣợng mong muốn. Máy móc và các hóa chất tổng
hợp có giá thành cao, thang chuẩn tạo ra phải qua bƣớc tạo cặp bổ sung để chuyển
ADN sợi đơn thành dạng sợi kép. Do đó, phƣơng pháp này thƣờng áp dụng để tạo
thang chuẩn có kích thƣớc nhỏ, nhƣ thang chuẩn 5 bp hay 10 bp với nhu cầu sử
dụng không cao (Hình 4) [1].

Hình 4. Ảnh ADN ladder 5 bp (Fermentas) điện di trên agarose 5% và gel polyacrylamide 10% [33].

o Phương pháp áp dụng kỹ thuật PCR
Một phƣơng pháp nhân dòng gen in vitro đơn giản, hiệu quả, đƣợc sử dụng phổ
biến hiện nay ở hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử là phản ứng chuỗi
trùng hợp - PCR (polymerase chain reaction). Kỹ thuật này đƣợc Kary Mullis tìm ra
vào năm 1983, nhờ đó việc khuếch đại một đoạn ADN mong muốn đã trở nên dễ dàng,
nhanh chóng và chính xác hơn [8]. Kỹ thuật này còn đƣợc sử dụng để phát hiện một

8

trình tự nucleotide đặc hiệu trong một mẫu sinh học, thu nhận số lƣợng lớn một đoạn
ADN đích cho quá trình nhân dòng, hoặc các phân đoạn kết thúc dideoxynucleotide
trong phƣơng pháp giải trình tự, hay lắp ráp một gen tổng hợp. Một phản ứng PCR đặc
trƣng bao gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc [15]:
- Bƣớc biến tính: ADN khuôn dạng sợi đôi đƣợc biến tính bằng nhiệt độ để
tách thành hai sợi đơn [3].
- Bƣớc hồi tính: Nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng sẽ đƣợc làm nguội dần
xuống, cho phép các mồi liên kết bắt cặp bổ sung với hai sợi đơn ADN khuôn.
- Bƣớc tổng hợp: Nhiệt độ hỗn hợp phản ứng sẽ đƣợc tăng lên đến nhiệt độ
tối ƣu cho sự hoạt động của enzyme ADN polymerase. Quá trình tổng hợp ADN sẽ
đƣợc diễn ra theo chiều từ 3’ đến 5’ (Hình 5) [4, 8].

Hình 5. Kéo dài mồi bởi Taq ADN polymerase. Mồi đƣợc gắn vào trình tự bổ sung trên sợi
khuôn và Taq ADN polymerase kéo dài mồi bằng cách gắn chính xác các deoxynucleotide
(dNTP) theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung với sợi ADN khuôn, quá trình tổng hợp diễn ra
theo chiều 3’ - 5’.

Các ADN polymerase bền nhiệt sử dụng trong phản ứng PCR đƣợc tách
chiết từ một số loại vi khuẩn chịu nhiệt nhƣ Sulfolobus solfataricus, Bacillus
steriotherphilus, Pyrococus fumaricus. Tuy nhiên loại enzyme sử dụng phổ biến
nhất hiện nay là Taq ADN polymerase đƣợc tách chiết từ một loại vi khuẩn suối
nƣớc nóng Thermus aquaticus [8, 23].

9


Các mồi đƣợc thiết kế phải tuân thủ một số nguyên tắc sau: (1) Có tỷ lệ GC
chiếm từ 40 - 75%, khoảng cách giữa hai mồi thƣờng không dài quá 3 kb, các mồi
không đƣợc tạo cấu trúc bậc hai do liên kết giữa các nucleotide ngay trong một mồi [3].
Nhiệt độ gắn mồi (Tm) cũng đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR.

Dựa trên trình tự đã biết của một phân tử ADN kích thƣớc lớn, các cặp mồi
khác nhau đã đƣợc thiết kế tùy thuộc kích thƣớc băng, số lƣợng băng và bƣớc nhảy
giữa các băng ADN trong thang chuẩn sản xuất. Thông qua phản ứng PCR hay
Multiplex PCR sử dụng các cặp mồi này sẽ khuếch đại các đoạn ADN kích thƣớc
mong muốn. Các đoạn ADN sẽ đƣợc tinh sạch và phối trộn theo tỷ lệ nồng độ nhất
định tạo thang chuẩn ADN. Loại thang chuẩn này có kích thƣớc băng và bƣớc nhảy
mong muốn, phƣơng pháp thực hiện đơn giản, dễ ứng dụng trong điều kiện của
nhiều phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, mặt hạn chế của phƣơng pháp này là các hóa
chất đi kèm có giá thành cao, các băng thang chuẩn thƣờng không rõ nét [1, 7].
o Phương pháp sử dụng các enzyme cắt giới hạn
Các endonuclease hay các enzyme cắt giới hạn là những phần của hệ thống
cải biến giới hạn (restriction modification - RM đƣợc sử dụng bởi vi khuẩn và có
thể ở một số sinh vật nhân sơ khác để bảo vệ chúng khỏi ADN ngoại lai) [27]. Các
enzyme này nhận biết những trình tự đặc hiệu trong phân tử ADN và cắt đối xứng
liên kết phosphodieste của mỗi sợi tại các vị trí nhận biết. Đồng thời đóng vai trò
quan trọng trong việc bảo vệ các tế bào vi khuẩn chống lại sự xâm nhiễm của virus
(bacteriophage) [13, 15]. Dựa vào cấu tạo và nhu cầu cofactor mà các enzyme cắt
giới hạn có thể đƣợc phân chia thành ba loại khác nhau là type I, II và III [32, 39].
Trong đó, những enzyme có vị trí cắt tại trình tự nhận biết đặc hiệu gọi là enzyme
cắt giới hạn type II. Đây là nhóm enzyme cắt giới hạn đƣợc sử dụng phổ biến nhất
trong các nghiên cứu về sinh học phân tử [18].
Các enzyme cắt giới hạn type II đóng vai trò quan trọng trong quy trình nhân
dòng gen. Khi một mẫu ADN đƣợc xử lý với một trong những enzyme này ở một
điều kiện, thành phần phản ứng không đổi sẽ luôn tạo ra cùng một tổ hợp các đoạn
ADN trong những lần cắt khác nhau. Do đó, enzyme cắt giới hạn type II trở thành

10


một công cụ hữu hiệu trong sản xuất thang chuẩn ADN [15]. Thang chuẩn loại này

chủ yếu sử dụng các phân tử ADN kích thƣớc lớn có sẵn trong tự nhiên, thao tác
đơn giản dễ thực hiện, giá thành rẻ. Tuy nhiên chính việc sử dụng các phân tử ADN
có sẵn trong tự nhiên lại trở thành một nhƣợc điểm lớn của phƣơng pháp này, vì vị
trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn là ngẫu nhiên, nên các băng của thang chuẩn
loại này có bƣớc nhảy không xác định [16].
o Kỹ thuật ADN tái tổ hợp
ADN tái tổ hợp là phân tử ADN đƣợc tạo thành từ hai hay nhiều trình tự ADN
của các loài sinh vật khác nhau. Trong kỹ thuật di truyền, ADN tái tổ hợp thƣờng đƣợc
tạo ra từ việc gắn những đoạn ADN có nguồn gốc khác nhau vào trong vector tách
dòng. Những vector tái tổ hợp sau đó thƣờng đƣợc biến nạp vào Escherichia Coli. Một
thí nghiệm tái tổ hợp ADN cơ bản thƣờng tuân thủ theo bốn bƣớc sau [15]:
Bƣớc 1: Đoạn ADN chèn mong muốn sẽ đƣợc xử lý bằng enzyme cắt giới
hạn, tạo đầu tận cùng 3’ và 5’ phù hợp.
Bƣớc 2: Vector tách dòng cũng đƣợc xử lý bằng enzyme cắt giới hạn tƣơng
ứng với đoạn ADN chèn.
Bƣớc 3: Thực hiện phản ứng nối đoạn ADN đích vào vector tách dòng tạo
vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào chủ và nuôi cấy
trong điều kiện thích hợp để nhân lên số lƣợng lớn.
Bƣớc 4: Chọn lọc các tế bào vi khuẩn nhận vector tái tổ hợp.
Vector tái tổ hợp sẽ đƣợc cắt bằng enzyme cắt giới hạn để tạo ra thang
chuẩn. Thang chuẩn loại này có giá thành rẻ, đơn giản, dễ thực hiện, thời gian bảo
quản lâu, lại có thể chủ động đƣợc kích thƣớc của các băng trong thang chuẩn. Đây
là phƣơng pháp đƣợc áp dụng nhiều nhất trong sản xuất thang chuẩn tại các trung
tâm sản xuất chế phẩm sinh học lớn hiện nay [6].
Cũng chính từ những ƣu điểm của phƣơng pháp ADN tái tổ hợp có thể khắc
phục những nhƣợc điểm của phƣơng pháp PCR, chúng tôi đã kết hợp hai phƣơng

11

pháp này một cách linh hoạt trong nghiên cứu của mình với mục tiêu thiết kế thang
chuẩn ADN 100 bp.
1.1.3.4. Những thuận lợi và khó khăn trong sản xuất thang chuẩn ADN
bước nhảy nhỏ
o Thuận lợi
Thang chuẩn 5 bp đến không quá 200 bp là những thang chuẩn ADN bƣớc
nhảy nhỏ, với dải băng ADN phổ biến trong khoảng từ 5 bp đến 4000 bp dễ dàng sử
dụng trong nhiều mục đích thí nghiệm khác nhau nhƣ: nghiên cứu các đoạn ADN
kích thƣớc bé (ADN satellite,...); kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR; kiểm tra sản
phẩm phản ứng cắt ADN bằng enzyme giới hạn; kiểm tra kích thƣớc đoạn chèn
trong nhân dòng;... [33]. Để có đƣợc một con số thống kê cụ thể về mức độ tiêu thụ
các sản phẩm này của những công ty sản xuất là rất khó khăn, có thể do đây là
thông tin nội bộ nên đã không đƣợc công bố rộng rãi. Tuy nhiên, nhìn vào thị
trƣờng giá cả phong phú của nhóm thang chuẩn này có thể thấy đây là bộ sản phẩm
đƣợc nhiều công ty đầu tƣ sản xuất, cung ứng với tiềm năng kinh tế cao [43, 44].
o Khó khăn
Sản xuất thang chuẩn bƣớc nhảy nhỏ hầu hết áp dụng phƣơng pháp hóa tổng
hợp cho các đoạn ADN có kích thƣớc không quá 100 bp [4] và phƣơng pháp PCR
cho các đoạn ADN kích thƣớc lớn hơn [7, 24]. Các đoạn ADN kích thƣớc mong
muốn sau khi đƣợc tổng hợp, phải trải qua bƣớc tinh sạch, xác định nồng độ và phối
trộn theo tỷ lệ xác định để tạo thang chuẩn hoàn chỉnh. Nhƣ vậy, việc sản xuất bộ
thang chuẩn này không chỉ gặp nhiều khó khăn trong thao tác thí nghiệm, qua nhiều
công đoạn, mà còn đòi hỏi hóa chất, trang thiết bị hiện đại có giá thành cao. Giá bán
các loại thang chuẩn này vì thế cũng cao hơn (Bảng 1).
Bảng 1. Giá thành thang chuẩn ADN bƣớc nhảy nhỏ năm 2011 của một số hãng sản xuất,
chƣa bao gồm thuế nhập khẩu tham khảo trên website: www.uoftmedstore.com.

Hãng sản xuất
Fermentas - Đức

Số đƣờng chạy

ADN ladder
5 bp
10 bp
20 bp

100

12

Giá thành
152,96 $
135,85 $
128,25 $


10 bp
173,80 $
100
25 bp
163,90 $
Takara - Nhật Bản
20 bp
100
21,00 ¥
Nghiên cứu thiết kế thang chuẩn bƣớc nhảy nhỏ gặp khá nhiều khó khăn trong
Invitrogen - Mỹ

lựa chọn phƣơng pháp sản xuất, các bƣớc thí nghiệm, chi phí sản phẩm. Đây là một bài

toán khó cho các nhà sản xuất khi muốn thƣơng mại hóa bộ sản phẩm này.
1.2. THANG CHUẨN 100 bp
1.2.1. Thị trƣờng ADN ladder 100 bp
ADN ladder 100 bp thƣờng gồm dải băng có kích thƣớc từ 100 bp đến 3000 bp,
đƣợc sản xuất và cung ứng bởi nhiều hãng sản xuất danh tiếng trên thế giới nhƣ:
Fermentas - Đức; Takara - Nhật Bản; Invitrogen - Mỹ; New England Biolab - Anh;
Roche - Thụy Sỹ; Promega - Mỹ. ADN ladder 100 bp của từng hãng sản xuất lại có
số lƣợng băng và giá thành sản phẩm khác nhau (Hình 6 A, Bảng 2). Một số hãng
thƣơng mại còn kết hợp sử dụng ADN ladder 100 bp với loại thang chuẩn ADN
khác (ADN ladder 500 bp; High Range ADN ladder,…), nhằm tăng dải kích thƣớc
băng ADN cũng nhƣ tăng tính ứng dụng của loại sản phẩm này (Hình 6 B) [33, 36].
Chính những điều đó đã góp phần tạo ra một thị trƣờng thang chuẩn 100 bp đa dạng
và phong phú, đáp ứng mọi nhu cầu của ngƣời sử dụng [41, 42].
Bảng 2. Giá thành ADN ladder 100 bp năm 2010 của một số hãng thƣơng mại chƣa bao
gồm thuế nhập khẩu, tham khảo trên webside: www.lablife.org.

Hãng sản xuất
Fermentas - Đức
Invitrogen - Mỹ
New England Biolabs - Anh
Promega - Thụy Sỹ
Roche - Mỹ

Số đƣờng
chạy điện di
100
100
100
100
100

13

Giá bán sản phẩm
chƣa bao gồm thuế
62 $
198 $
53 $
148 €
218 $


Hình 6. (A): ADN ladder 100 bp của một số hãng sản xuất thƣơng mại [41]; (B): Ảnh
ADN ladder 100 bp kết hợp với ADN ladder 500 bp (Fermentas) [33].

1.2.2. Sản xuất ADN ladder 100 bp
ADN ladder 100 bp thƣơng mại hiện bán trên thị trƣờng thƣờng gồm dải băng
kích thƣớc rộng, bƣớc nhảy giữa hai băng kế tiếp là 100 bp giúp thang chuẩn ADN loại
này đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu khác nhau. ADN ladder 100 bp
đƣợc đầu tƣ, sản xuất và cung ứng bởi nhiều hãng sản xuất trên thế giới [37, 47]. Từ
những tài liệu mà chúng tôi có đƣợc cho thấy hầu hết thang chuẩn loại này đƣợc sản
xuất nhờ áp dụng kỹ thuật PCR [7], Multiplex PCR [24], kỹ thuật ADN tái tổ hợp [17].
Giá thành ADN ladder 100 bp thƣơng mại tƣơng đối cao [7, 24].
Tại phòng thí nghiệm của chúng tôi thang chuẩn ADN 100 bp có nhu cầu sử
dụng hàng ngày. Chúng tôi đặt mua thang chuẩn từ nƣớc ngoài nên không chủ động
đƣợc nguồn cung cấp, phụ thuộc thời gian vận chuyển, giá thành cao do phải chịu
thêm thuế nhập khẩu và chi phí vận chuyển. Xuất phát từ nhu cầu sử dụng và những
khó khăn khi đặt hàng chúng tôi tiến hành đề tài “Thiết kế thang chuẩn ADN”
bƣớc nhảy 100 bp.

14


CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Hệ Vector
1. Vector pJET1.2 là vector tách dòng sản phẩm PCR, nằm trong bộ kit
“CloneJETTM PCR Cloning Kit” của hãng Fermentas - Đức [12] (Phụ lục 01).
2. Vector pGEX-4T-1-Bre là vector pGEX-4T-1 (Phụ lục 02) mang đoạn
ADN kích thƣớc 114 bp, đƣợc cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh
học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
3. Vector pJET1.2-8×100 là vector pJET1.2 mang các đoạn ADN kích thƣớc
100 bp tự nối.
2.1.2. Các cặp mồi cho phản ứng PCR
Cặp mồi Bre-F1/Bre-R1 đƣợc thiết kế để nhân bản đoạn ADN kích thƣớc
108 bp từ đoạn ADN 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre.
Cặp mồi pJET1.2-F/pJET1.2-R thiết kế dựa trên trình tự của vector pJET1.2,
cung cấp theo “CloneJETTM PCR Cloning Kit” [12].
Cặp mồi pJET-800-F/pJET-800-R đƣợc thiết kế để khuếch đại đoạn ADN
kích thƣớc 1000 bp từ vector pJET1.2-8×100.
Các mồi đƣợc cung cấp bởi hãng Bioneer - Hàn Quốc và IDT - Mỹ. Trình tự
các cặp mồi đƣợc thể hiện trong Bảng 3.
Bảng 3. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.

Cặp mồi
Bre-F1
Bre-R1

Trình tự (5’-3’)
ccg gaa ttc atg atc gag ggt agg aag ctt aaa aat ttt g

ccg gaa ttc aca ctg gcc act gag ttt gc
Trong đó: gaa ttc là vị trí cắt của enzyme giới hạn EcoRI

pJET1.2-F
pJET1.2-R

cga ctc act ata ggg aga gcg gc
aag aac atc gat ttt cca tgg cag

pJET-800-F
pJET-800-R

aac act tgt gcc tga aca cca tat c
gaa aat ctt gag aga ata aaa gaa gaa cat cg

15


2.1.3. Chủng vi sinh vật
o Chủng E.coli DH5α
Chủng E.coli DH5α đƣợc tạo ra từ chủng E.coli DH5 bởi Doug Hanahan vào
năm 1985. Chủng vi khuẩn này đƣợc sử dụng phổ biến trong kỹ thuật ADN tái tổ
hợp do nó mang một vài đặc điểm đặc trƣng sau [25]:
- Đột biến bất hoạt gen mã cho endonuclease nội bào, giúp bảo vệ plasmid.
- Đột biến loại bỏ gen mã cho enzyme EcoKI sẽ bảo vệ các vị trí cắt của enzyme
này trên phân tử ADN khi chúng không đƣợc methyl hóa.
- Mang gen Δ(lacZ)M15 mã cho thụ thể nhận alpha (alpha acceptor) cần thiết
cho quá trình sàng lọc xanh - trắng trên nhiều hệ vector.
Chủng E.coli DH5α đƣợc chúng tôi sử dụng trong biến nạp vector pJET1.2-8×100.
o Chủng E.coli BL21(DE3)

Chủng E.coli BL21 (DE3) đƣợc cải biến từ chủng E.coli tự nhiên và sử dụng
làm vật chủ biểu hiện thông dụng với hầu hết các promoter (nhƣ lac, tac,…). Chủng
vi khuẩn này mang hai đặc điểm cơ bản [31]:
- Đột biến gen mã cho protease ngoài màng tế bào, giúp bảo vệ các protein
đƣợc biểu hiện khỏi sự phân giải protein.
- Loại bỏ gen mã cho protease lon một enzyme làm giảm sút protein vi khuẩn
và ức chế sự phân chia tế bào cho tới khi quá trình sửa chữa nhiễm sắc thể đƣợc
hoàn thành.
Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng nguyên liệu ban đầu là chủng E.coli BL21 (DE3)
mang vector pGEX-4T-1-Bre.
2.1.4. Hóa chất và trang thiết bị
o Hóa chất
- Taq ADN polymerase (Fermentas - Đức);
- dNTP mix 2 mM (Sigma - Mỹ, Takara - Nhật Bản);
- Các enzyme cắt giới hạn (Fermentas - Đức, New England Biolabs - Anh);

16


- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Lubertini broth (LB) gồm các thành phần:
1% trypton; 0,5% cao nấm men ; 0,5% NaCl; 1,2% agar (môi trƣờng đặc) [23];
- Các kit tách dòng gen của Fermentas - Đức [12, 14], tinh sạch sản phẩm
PCR và tinh sạch ADN của Bioneer - Hàn Quốc [9, 10], tinh sạch plasmid và ADN
của Qiagen - Đức [19, 20];
- Thang chuẩn 100 bp và 1 kb của Takara - Nhật Bản, Fermentas - Đức,
New England Biolabs - Anh;
- Các hóa chất khác đều đạt độ tinh sạch cao dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử.
o Trang thiết bị
Các thiết bị và máy móc phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm
Sinh Y - Khoa Sinh học; Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm

Công nghệ Enzyme - Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc
gia Hà Nội.

17


2.2. SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM
Toàn bộ quá trình nghiên cứu đƣợc tóm tắt trong Hình 7.

Hình 7. Sơ đồ nghiên cứu thiết kế thang chuẩn ADN SY - 100.

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết plasmid từ vi khuẩn
Plasmid tách chiết từ tế bào vi khuẩn theo hai phƣơng pháp:
o Tách chiết plasmid sử dụng môi trường kiềm có SDS [21]
+ 1,5 ml dịch vi khuẩn bão hòa đƣợc đem ly tâm 8000 vòng/phút ở 40C trong
10 phút, thu cặn, để khô
+ Thêm 100 µl dung dịch I (50 mM Tris-HCl, pH 8, glucose 50 mM, 10 mM
EDTA pH 8), vortex tan cặn, ủ nhiệt độ phòng 10 phút
+ Thêm 200 µl dung dịch II (0,2 N NaOH, 1% SDS), đảo đều, ủ đá 3 phút
+ Thêm 150 µl dung dịch III (3 M potassium acetate, pH 5), đảo đều, ủ đá 5 phút

18


+ Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu dịch trong
+ Bổ sung 1 thể tích Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1), vortex đều
+ Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha trên
+ Bổ sung thêm 0,6 lần thể tích Isopropanol, ủ nhiệt độ phòng 20 phút
+ Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu tủa

+ Để khô tủa hoàn toàn, hòa với nƣớc khử trùng hoặc TE 1X, pH 8
Mẫu plasmid đƣợc bảo quản ở -200C.
o Tinh sạch plasmid sử dụng Kit của Qiagen [19]
Plasmid sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR đƣợc tinh sạch bằng
QIAprep Spin Miniprep Kit với quy trình đƣợc hƣớng dẫn cụ thể trong “QIAprep®
Miniprep Handbook” [19].
2.3.2. Kỹ thuật nối các đoạn ADN
Một phản ứng nối các đoạn ADN thƣờng diễn ra trong tổng thể tích từ 10 - 20 µl ở
40C đến 370C, sử dụng enzyme T4 ADN ligase, dung dịch đệm chứa Mg2+ và ATP [11, 14].
T4 ADN ligase tham gia xúc tác hình thành liên kết phosphodiester giữa các đầu tận cùng
(có thể là đầu bằng hoặc đầu so le) của các đoạn ADN [11].
Trong nghiên cứu của chúng tôi, đoạn ADN kích thƣớc 108 bp khuếch đại từ phản
ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 sẽ đƣợc cắt hoàn toàn với EcoRI (GˇAA TTC) tạo
đầu so le. Sản phẩm phản ứng cắt là các đoạn 100 bp sẽ tham gia phản ứng tự nối diễn ra ở
140C qua đêm. Các bƣớc làm đƣợc chúng tôi tuân thủ theo quy trình phản ứng nối tham
khảo trong “CloneJETTM PCR Cloning Kit” [12], “Gene JETTM PCR Cloning Kit
procedure” [14] và “FastDigest® & Conventional Restriction Enzymes” [13].
2.3.3. Biến nạp theo phƣơng pháp sốc nhiệt
Vector pJET1.2 mang đoạn chèn đƣợc biến nạp vào tế bào E.coli DH5α theo
phƣơng pháp sốc nhiệt. Tế bào khả biến DH5α đã đƣợc xử lý với CaCl 2 giúp màng
tế bào trở nên xốp hơn làm tăng khả năng tiếp nhận ADN. Biến nạp theo phƣơng
pháp sốc nhiệt gồm các bƣớc sau:

19


o Tạo tế bào khả biến [21]
Tất cả các bƣớc ly tâm trong quy trình làm tế bào khả biến đƣợc thực hiện ở
6000 vòng/phút, 40C trong 20 phút.
-

Nuôi 50 ml dung dịch tế bào E.coli DH5α trong môi trƣờng LB lỏng tại

370C, lắc 200 vòng/phút, tới khi dung dịch tế bào có giá trị mật độ quang (Optical
Density - OD) ở bƣớc sóng 600 nm nằm trong khoảng từ 0,4 - 0,6
-

Ủ mẫu trên đá khoảng 30 phút

-

Ly tâm thu cặn tế bào

-

Hòa cặn trong 15 ml dịch chứa MgCl2 80 mM và CaCl2 20 mM cho đến khi

tạo dịch đồng nhất. Ly tâm thu cặn tế bào
-

Hòa tan cặn trong CaCl2 100 mM tạo dịch đồng nhất, sao cho mật độ tế bào

có giá trị OD 600 bằng 1
-

Ủ mẫu ở 40C qua đêm

-

Bổ sung glycerol 100% đến nồng độ 15%

-

Chia hỗn hợp tế bào khả biến vào các ống eppendorf 1,5 ml, bảo quản ở -800C.
o Biến nạp [15, 21]:

-

Lấy tế bào khả biến từ -800C để cùng hỗn hợp nối ADN trên đá 5 phút

-

Bổ sung 5 µl sản phẩm nối vào ống tế bào khả biến, búng nhẹ, ủ trên đá 20 phút

-

Sốc nhiệt tại 420C trong 90 giây, để ngay lại trên đá 2 phút

-

Bổ sung 1 ml LB lỏng, ủ 370C trong 20 phút, sau đó lắc 200 vòng/phút ở

370C trong 30 phút
-

Ly tâm hỗn hợp 6000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, giữ lại 100 µl

dịch và cặn
-

Hòa cặn tạo dịch đồng nhất trong 100 µl còn lại, đem trải trên đĩa thạch LB

có kháng sinh
-

Nuôi cấy vi khuẩn ở điều kiện vô trùng, 370C qua đêm.

20


2.3.4. Phản ứng PCR
Trong nghiên cứu của chúng tôi, có ba cặp mồi đƣợc sử dụng cho các mục
đích thí nghiệm khác nhau:
-

Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 khuếch đại đoạn 108 bp dựa trên

trình tự đoạn 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre.
-

Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi pJET1.2-F/R và khuôn là vector tái tổ hợp

pJET1.2-8×100.
-

Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi pJET-800-F/R với khuôn là vector

pJET1.2-8×100 khuếch đại đoạn 1000 bp đƣợc cắt không hoàn toàn bằng HpaII
tạo thang chuẩn 100 bp.
Thành phần và điều kiện thực hiện các phản ứng PCR thay đổi theo từng cặp

mồi (Bảng 4).
Bảng 4. Thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR.

Thành phần phản ứng
H2 O
Đệm Taq ADN polymerase 10X
dNTP mix (2 mM mỗi loại)
Taq ADN polymerase (1 u/µl )
Mồi xuôi: Bre-F1
pJET1.2-F
pJET-800-F
Mồi ngƣợc: Bre-R1
pJET1.2-R
pJET-800-R
ADN

Điều kiện
- Biến tính 940C, 5 phút ở giai đoạn đầu
- Chu kỳ lặp lại
o Biến tính: 940C, 30 giây
o Gắn mồi:
680C, 75 giây (với cặp mồi Bre-F1/R1);
600C, 30 giây (với cặp mồi pJET1.2-F/R);
660C, 30 giây (với cặp mồi pJET-800-F/R)
o Tổng hợp: 720C, 45 - 60 giây
- Tổng hợp 720C, 5 - 7 phút ở giai đoạn sau
cùng

2.3.5. Xác định nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ
Nồng độ và độ tinh sạch của ADN trong các thí nghiệm đƣợc xác định bằng

quang phổ kế, với độ hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm (là độ hấp thụ của ADN) và 280 nm
(là độ hấp thụ của protein). Nồng độ ADN đƣợc tính theo công thức:
[ADN ] = A260 × n × 50 (µg/ml)

21


Trong đó:
A260

: độ hấp thụ của ADN ở bƣớc sóng 260 nm

n

: số lần pha loãng mẫu

50 µg/ml

: nồng độ ADN sợi đôi ứng với A260 = 1

ADN đạt độ tinh sạch khi tỷ lệ A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0.
2.3.6. Phản ứng cắt ADN sử dụng enzyme cắt giới hạn
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai enzyme cắt giới hạn là EcoRI
(GˇAA TTC) và HpaII (CˇCGG) (Fermentas).
- Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 có kích thƣớc 108 bp sẽ đƣợc
cắt hoàn toàn bằng enzyme EcoRI (GˇAA TTC) tạo đầu dính.
- Vector pJET1.2-8×100 mang đoạn ADN kích thƣớc mong muốn sẽ đƣợc
cắt không hoàn toàn bằng enzyme EcoRI (GˇAA TTC) kiểm tra vị trí cắt.
- Sản phẩm PCR kích thƣớc 1000 bp đƣợc cắt không hoàn toàn bằng enzyme
HpaII (CˇCGG) tạo thang chuẩn ADN SY - 100.

2.3.7. Tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR
Tùy mục đích trong từng thí nghiệm mà sản phẩm PCR của chúng tôi đƣợc
tinh sạch theo hai cách khác nhau.
- Sản phẩm PCR sử dụng khuôn là sản phẩm tự nối các đoạn 100 bp sẽ đƣợc
điện di lƣợng lớn trên gel agarose. Sử dụng bộ kit của Bioneer với các bƣớc tiến
hành đƣợc hƣớng dẫn cụ thể trong “AccuPrep® Gel Purification Kit” [9] để tinh
sạch ADN.
- Sản phẩm phản ứng PCR kích thƣớc 1000 bp và các đoạn ADN của thang
chuẩn tạo ra trong phản ứng cắt không hoàn toàn sẽ đƣợc loại muối, dimer nhờ bộ
kít tinh sạch sản phẩm PCR của Qiagen. Các bƣớc tiến hành và những lƣu ý quan
trọng đƣợc hƣớng dẫn chi tiết trong “QIAquick® PCR Purification Kit (50)” [20].

22


2.3.8. Kỹ thuật điện di
Điện di (electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là kỹ thuật để phân
tách các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng
nhƣ kích thƣớc, hình dạng hay điểm đẳng điện (isoelectric point) [29]. Kỹ thuật
điện di sử dụng:
- Một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trƣờng đều.
- Một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử. Có hai loại gel
đƣợc sử dụng phổ biến trong kỹ thuật điện di ADN là gel agarose và polyacrylamide.
Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) đƣợc liên kết chéo với nhau tạo thành
một hệ thống mạng lƣới với kích thƣớc các mắt lƣới tùy thuộc vào nồng độ chất cao
phân tử (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo [29].
- Các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, đồng vị phóng xạ,…)
để phát hiện vị trí các phân tử ADN trên gel sau khi điện di [3, 28].
Do điện tích âm của khung phosphate (phosphate backbone), các đoạn ADN
dịch chuyển từ điện cực âm sang cực dƣơng (qua các lỗ gel trong phƣơng pháp điện

di trên gel). Các đoạn ADN kích thƣớc nhỏ có thể dễ dàng di chuyển qua các lỗ gel
vì vậy dịch chuyển tới cực dƣơng nhanh hơn các đoạn ADN kích thƣớc lớn [16].

23


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KHUẾCH ĐẠI VÀ TẠO ĐOẠN ADN CÓ KÍCH THƢỚC 100 bp
3.1.1. Khuếch đại đoạn ADN bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi
Bre-F1/R1
Phân tích trình tự đoạn ADN kích thƣớc 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre
(Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội), chúng tôi nhận thấy đoạn 114 bp mang một vị trí cắt của
enzyme giới hạn EcoRI (GˇAA TTC) tại nucleotide thứ ba tính từ đầu 5’ của đoạn
chèn. Sử dụng phần mềm thiết kế mồi FastPCR và trình tự đoạn ADN kích thƣớc
114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre, chúng tôi thiết kế cặp mồi Bre-F1/R1 mang vị trí
nhận biết của EcoRI ở đầu 5’ (Hình 8). Sản phẩm phản ứng PCR sử dụng plasmid
pGEX-4T-1-Bre làm khuôn với mồi Bre-F1/R1 là đoạn ADN kích thƣớc 108 bp với
hai đầu có vị trí của enzyme EcoRI. Do đó, đoạn 108 bp sau khi đƣợc cắt hoàn toàn
bằng EcoRI sẽ thu đƣợc một đoạn ADN kích thƣớc 100 bp.

Hình 8. Sơ đồ minh họa thiết kế cặp mồi Bre-F1/R1 dựa trên trình tự đoạn 114 bp trong
vector pGEX-4T-1-Bre.

o Phản ứng PCR khuếch đại đoạn ADN kích thước 108 bp
Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 khuếch đại đoạn 108 bp trong
plasmid pGEX-4T-1-Bre đƣợc thực hiện ở một số nhiệt độ gắn mồi khác nhau, qua
đó chúng tôi đã xác định điều kiện và thành phần phản ứng tối ƣu nhƣ sau:

24

Thành phần phản ứng
H2O
Đệm Taq ADN polymerase 10X
dNTP mix (2 mM mỗi loại)
Taq ADN polymerase (1 u/µl )
Bre-F1 (10 µM)
Bre-R1 (10 µM)
ADN
Tổng thể tích

Thể tích
(µl)
10,0
1,5
1,0
0,5
0,5
0,5
1,0
15,0

Điều kiện
- Biến tính 940C trong 5 phút ở giai
đoạn đầu
- Chu trình đƣợc lặp lại 30 lần
o Biến tính 940C trong 30 giây
o Gắn mồi 680C trong 75 giây
- Tổng hợp 720C trong 7 phút ở giai

đoạn sau cùng

Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên agarose 2%. Kết quả điện di cho
thấy chúng tôi đã khuếch đại thành công đoạn 108 bp (Hình 9).

Hình 9. Điện di sản phẩm PCR đoạn 108 bp trên agarose 2%. 1: ADN Ladder 100 bp; 2: Sản
phẩm PCR kích thƣớc 108 bp.

Băng điện di sản phẩm PCR sáng rõ chứng tỏ:
- Cặp mồi Bre-F1/R1 đƣợc thiết kế có tính đặc hiệu cao.
- Đã khuếch đại thành công lƣợng lớn đoạn ADN kích thƣớc 108 bp.
3.1.2. Tạo đoạn 100 bp bằng phản ứng cắt với EcoRI
Để thu đƣợc lƣợng lớn đoạn ADN kích thƣớc 100 bp, đoạn ADN kích thƣớc
108 bp đƣợc cắt hoàn toàn bằng enzyme EcoRI. Phản ứng gồm thành phần nhƣ sau:

25