So sánh một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên chủ yếu của 02 chủng virus KTYPRRS01 và KTYPRRS02

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỀ CƯƠNG
LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP

TÊN ĐỀ TÀI:
“So sánh một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng

nguyên chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02”

Chuyên ngành: Thú y
Mã số:

Người hướng dẫn khoa học:
Người thực hiện: NGÔ THỊ HẠNH
Mã số học viên: 24150610
Lớp: CH25TYB

Hà Nội – 2016


I.

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine reproductive and
respiratory syndrome – PRRS) hay còn gọi là “Bệnh tai xanh ở lợn” đã gây ra thiệt
hại vô cùng to lớn cho ngành chăn nuôi lợn trên toàn thế giới. Lợn ở tất cả các lứa
tuổi đều cảm nhiễm, nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm với các
biểu hiện như sốt cao, da mẩn đỏ, tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết cao (Gao và cs, 2004; Chen
và cs, 2006). Loài lợn rừng cũng mắc bệnh, đây có thể coi là nguồn dịch thiên

nhiên.
Từ năm 2007 đến nay, tại Việt Nam, dịch PRRS xảy ra liên miên, có những diễn
biến phức tạp và có nguy cơ bùng phát ở tất cả các địa phương trong cả nước.
Theo báo cáo kết quả Hội thảo khoa học phòng chống hội chứng rối loạn hô
hấp và sinh sản ở lợn của Cục Thú y năm 2008 thì hiện tại ở Việt Nam đang tồn tại
cả hai chủng virus PRRS thuộc dòng Bắc Mỹ: Chủng cổ điển độc lực thấp và
chủng biến thể độc lực cao. Trong đó, chủng virus độc lực cao gây bệnh tại Việt
Nam thuộc dòng Bắc Mỹ.
Hiện nay Khoa thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã phân lập được một số
chủng virus PRRS từ các lợn có triệu chứng, bệnh tích khá điển hình của lợn mắc
PRRS,với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết cao tại một số tỉnh ở Việt Nam, trong đó có 02
chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02. Để phục vụ mục đích lựa chọn
chủng chế tạo vacxin, đánh giá hiệu quả của vacxin hoặc sản xuất chế phẩm sinh học
phòng trị bệnh cho vật nuôi thì việc nghiên cứu các đặc tính sinh học, sinh học phân
tử và tính kháng nguyên của các chủng virus phân lập đượclà điều vô cùng quan
trọng. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề xuất nghiên cứu đề tài: “So sánh một số
đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên chủ yếu của 02 chủng
virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02”.
2

2


1.2.

Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên
của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đã được phân lập, nhằm
phục vụ cho việc chọn chủng chế tạo vacxin, đánh giá hiệu quả của vacxin và sản

xuất chế phẩm sinh học phòng trị bệnh cho lợn.

3

3


II.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRS)
2.2. Lịch sử và tình hình dịch bệnh PRRS ở lợn
2.2.1. Lịch sử xuất hiện bệnh
2.2.2. Dịch bệnh trên thế giới
2.2.3. Tình hình bệnh tai xanh tại Việt Nam
2.3. Căn bệnh
2.3.1. Hình thái và cấu tạo của virus PRRS
2.3.2. Phân loại virus PRRS
2.3.3. Tính chất nuôi cấy của virus PRRS
2.3.4. Sức đề kháng của virus
2.3.5. Khả năng gây bệnh và độc lực của virus PRRS
2.4. Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây
2.5. Triệu chứng và bệnh tích
2.5.1. Triệu chứng
2.5.2. Bệnh tích
2.6. Chẩn đoán
2.6.1. Chẩn đoán lâm sàng
2.6.2. Chẩn đoán bằng phương pháp giải phẫu bệnh
2.6.3. Phát hiện virus

2.6.4. Chẩn đoán huyết thanh học
2.6.5. Chẩn đoán phân biệt
2.7. Các biện pháp phòng và trị hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
2.7.1. Phòng bệnh
4

4


2.7.2. Trị bệnh
III.
3.1.

ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu, địa điểm nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu:
- Virus: 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đã phân lập được từ
các đàn lợn mắc PRRS tự nhiên tại miền Bắc Việt Nam.
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, phòng thí
nghiệm bộ môn Bệnh lý thú y, trại nuôi động vật thí nghiệm – Khoa Thú y – Học
viện Nông nghiệp Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu, so sánh một số đặc tính sinh học của 02 chủng virus KTY-PRRS3.2.
3.2.1.

01 và KTY-PRRS-02
- Xác định hiệu giá của 02 chủng virus PRRS nghiên cứu
- Xác định khả năng gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus PRRS nghiên cứu
- Xác định sự ổn định về một số đặc tính sinh học 02 chủng virus PRRS nghiên

cứu qua các đời cấy chuyển.
- Xác định đường biểu diễn sự nhân lên của 02 chủng virus nghiên cứu
3.2.2. Nghiên cứu, so sánh đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTYPRRS-01 và KTY-PRRS-02
- Giải trình tự gen 02 chủng virus PRRS nghiên cứu
- So sánh trình tự gen giữa 02 chủng virus PRRS nghiên cứu với nhau và với các
chủng virus tham chiếu trên ngân hàng gen.
- Xây dựng cây sinh học phân tử cho thấy mối quan hệ di truyền của 02 chủng
virus PRRS nghiên cứu với các chủng virus khác trong ngân hàng gen.
3.2.3. Nghiên cứu, so sánh tính kháng nguyên của 02 chủng virus KTY-PRRS01 và KTY-PRRS-02
- Gây bệnh cho lợn thực nghiệm bằng 02 chủng virus nghiên cứu
- Theo dõi triệu chứng lâm sàng của lợn thực nghiệm
5

5


- Nghiên cứu chỉ tiêu virus huyết ở lợn thực nghiệm
- Nghiên cứu biến đổi bệnh lý của lợn thí nghiệm
- Nghiên cứu sự phân bố của virus PRRS trên lợn thực nghiệm
3.3.

Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào
- Khôi phục tế bào
- Cấy chuyển tế bào
- Thu tế bào
3.3.2. Phương pháp phân lập virus PRRS trên tế bào tổ chức
3.3.3. Phương pháp xác định TCID50
3.3.4. Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus

3.3.5. Phương pháp tách chiết RNA
3.3.6. Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR
- Tiến hành phản ứng RT- PCR
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
3.3.7. Phương pháp giải trình tự gen
3.3.8. Phương pháp xử lý số liệu
3.3.9. Phương pháp gây bệnh thực nghiệm
3.3.10. Phương pháp ELISA
3.3.11. Phương pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể.
3.3.12. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý kiểm tra bệnh tích vi thể
IV. KẾT QUẢ DỰ KIẾN ĐẠT ĐƯỢC
4.1. Kết quả nghiên cứu, so sánh một số đặc tính sinh học của 02 chủng virus
KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
4.1.1. Kết quả xác định hiệu giá của 02 chủng virus PRRS nghiên cứu
Bảng 4.1. Thông tin sơ bộ về nguồn gốc 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và
KTY-PRRS-02

6

6


Tên chủng

STT

Nguồn gốc mẫu phân lập

virus

1

KTY-PRRS-01

2

KTY-PRRS-02

Triệu chứng chủ yếu

Bảng 4.2. Kết quả xác định hiệu giá của 03 chủng virus PRRS Hua 01, PRRS
Hua 02 và chủng virus PRRS vắc-xin
Hiệu giá virus

STT

Tên chủng virus

1

KTY-PRRS-01

2

KTY-PRRS-02

3

Chủng virus PRRS vắc-xin

TCID50/25µl

4.1.2. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus PRRS nghiên
cứu
Bảng 4.3. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và
KTY-PRRS-02
(tính theo% diện tích tế bào bị phá hủy so với tổng số diện tích đáy bình nuôi cấy)
Mẫu

KTY-PRRS-01

CPE theo thời

24h

gian sau khi

36h

gây nhiễm

48h

virus

60h
72h

7

7

KTY-PRRS-02

Chủng vắcxin


84h
96h
108h

4.1.3. Kết quả xác định sự ổn định về đặc tính sinh học 02 chủng virus PRRS
nghiên cứu qua các đời cấy chuyển.
Bảng 4.4. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và
KTY-PRRS-02 qua các đời cấy chuyển
CPE (%)
Virus

Virus PRRS
vắc-xin

KTY-PRRS01

KTY-PRRS02

8

Giờ

Đời 1

24h
36h
48h
60h
72h
84h
96h
24h
36h
48h
60h
72h
84h
96h
24h
36h
48h
60h
72h
84h
96h

8

Đời 3

Đời 5

4.1.4. Kết quả xác định đường biểu diễn sự nhân lên của 02 chủng virus PRRS
nghiên cứu.
Bảng 4.6. Hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-01 (lgTCID50)
Thời gian
lg TCID50
Virus trong tế bào

24hpi

36hpi

48hpi

60hpi

72hpi

84hpi

96hpi

KTY-PRRS-01
Virus giải phóng
ngoài tế bào
KTY-PRRS-01
Virus ở trong tế
bào chủng vắc-xin
Virus ở dịch ngoài
tế bào chủng vắcxin

Bảng 4.6. Hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-02 (lgTCID50)
Thời gian
lg TCID50
Virus trong tế bào

24hpi

36hpi

48hpi

KTY-PRRS-02
Virus giải phóng
ngoài tế bào
KTY-PRRS-02
Virus ở trong tế
bào chủng vắc-xin
Virus ở dịch ngoài
9

9

60hpi

72hpi

84hpi

96hpi

tế bào chủng vắcxin

4.2. Kết quả nghiên cứu, so sánh đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng
virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
4.2.1. Kết quả giải trình tự gen các chủng virus PRRS nghiên cứu
4.2.2. Kết quả so sánh trình tự gen giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với
nhau và với các chủng virus tham chiếu trên ngân hàng gen.
Bảng 4.7. Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gen ORF7 giữa các chủng virus
nghiên cứu với chủng virus tham chiếu
TT Vị Trí

Nucleotide TT Vị Trí

Nucleotide

sai khác

TT

Vị Trí

sai khác

Nucleotide
sai khác

1
2
3

Bảng 4.8. Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gen ORF5 giữa các chủng virus
nghiên cứu với chủng virus tham chiếu
TT Vị Trí

Nucleotide TT Vị Trí

Nucleotide

sai khác

sai khác

TT

Vị Trí

Nucleotide
sai khác

1
2
3

4.2.3. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử cho thấy mối quan hệ di truyền của
các chủng virus PRRS phân lập được với các chủng virus khác trong ngân hàng
gen.
4.3. Kết quả nghiên cứu, so sánh tính kháng nguyên của 02 chủng virus KTYPRRS-01 và KTY-PRRS-02
4.3.1. Kết quả gây bệnh cho lợn thực nghiệm
10

10


4.3.2. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của lợn thực nghiệm
Bảng 4.9. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể của lợn thí nghiệm
bằng phương pháp ELISA
Lô thí nghiệm 1
TN1.1 TN1.2 TN1.3

Lô thí nghiệm 2
TN2.1 TN2.2 TN2.3

Lô đối chứng
ĐC1
ĐC2

S/P
Kết quả

4.3.3. Kết quả nghiên cứu chỉ tiêu virus huyết ở lợn thực nghiệm
Bảng 4.10. Kết quả xét nghiệm PRRSV bằng phương pháp RT-PCR
Ngày gây
nhiễm

Lô TN1 gây nhiễm

Lô TN2 gây nhiễm

chủng KTY-PRRS-01
Máu

Swab

chủng KTY-PRRS-02
Máu
Swab

0
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21

11

11

Lô đối chứng
Máu

Swab


12

12


4.3.4. Kết quả theo dõi hàm lượng kháng thể PRRS ở lợn thực nghiệm
Bảng 4.11. Hàm lượng kháng thể kháng PRRSV của một số ngày sau gây nhiễm tính theo S/P

Lô
Lô
1
Lô
2
Lô
Đ
C

Ngày
Lợn

1
S/P

3
KQ

S/P

5
KQ

S/P

7
KQ

S/P

9
KQ

S/P

11
KQ

TN1.1
TN1.2
TN1.3
TN2.1
TN2.2
TN2.3
ĐC1
ĐC2

13

13

S/P

13

KQ

S/P

15
KQ

S/P

17
KQ

S/P

19
KQ

S/P

21
KQ

S/P

KQ


4.3.5. Kết quả nghiên cứu biến đổi bệnh lý của lợn thí nghiệm
Bảng 4.12. Bệnh tích đại thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm 2 chủng KTYPRRS-01 và KTY-PRRS-02
Lợn

STT

1
2
3
4
5
6
7
8
9

Cơ quan

Bệnh tích các cơ
quan

Gây nhiễm KTY-PRRS- 01

Gây nhiễm KTY-PRRS- 02

TN1.1

TN2.1

TN1.2

TN1.3

TN2.2

TN2.3

Đối chứng

ĐC 1

ĐC 2

Hạch
lâm ba
Phổi
Tim
Lách
Ruột
Thận
Dạ dày
Não
Gan

Bảng 4.13. Bệnh tích vi thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm 2 chủng KTYPRRS-01 và KTY-PRRS-02
Lợn
STT

1
2
3
4
5
6

7
8
9

Cơ quan

Bệnh tích các cơ
quan

Gây nhiễm KTY-PRRS- 01

Gây nhiễm KTY-PRRS- 02

TN1.1

TN2.1

TN1.2

TN1.3

Hạch
lâm ba
Phổi
Tim
Lách
Ruột
Thận
Dạ dày
Não

Gan

14

14

TN2.2

TN2.3

Đối chứng

ĐC 1

ĐC 2


15

15


V.

KẾ HOẠCH THỰC HIỆN

STT

NỘI DUNG

1

Thông qua đề cương

1

Kết quả nghiên cứu, so sánh một số đặc tính sinh học của 02 chủng virus KTY-P

2

Nghiên cứu, so sánh đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-0

3

Nghiên cứu, so sánh tính kháng nguyên của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và K

4

Báo cáo tiến độ

5

Phân tích số liệu và viết luận văn

6

Bảo vệ luận văn
Giáo viên hướng dẫn
(Ký và ghi rõ họ tên)

Học viên thực hiện đề tài
(Ký và ghi rõ họ tên)

16

16


17

17