Phân lặp vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi và antibio

Tóm tắt
Tính cấp thiết: Ngộ độc thực phẩm đã trở thành 1 trong những vấn đề cấp thiết cần
được giải quyết để bảo vệ sức khỏe con người, việc dùng chất bảo quản thực phẩm
hóa học đang bị hạn chế sử dụng vì những tác dụng phụ không có lợi của nó. Hiện
nay, đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng nhóm vi khuẩn lactic được phân lập
trong các loại thực phẩm lên men có khả năng sinh chất kháng khuẩn. Dạng chất
kháng khuẩn này có khả năng chống lại sự phát triển của mầm bệnh và được ứng
dụng như chất bảo quản thực phẩm.
Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập 1-2 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất
kháng khuẩn trong các thực phẩm len men và men tiêu hóa đông khô.
Nội dung nghiên cứu: Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm kiệu muối
chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio, khảo sát đặc điểm hình thái, kiểm tra sinh hóa
các chủng phân lập được, cuối cùng khảo sát khả năng sinh chất kháng khuẩn của
các chủng phân lập được.
Phương pháp: Kiểm tra khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn từ các dòng phân lập
bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch kết hợp với vi khuẩn chỉ thị
Escherichia coli.
Quá trình khảo sát được tiến hành trên 2 thí nghiệm:
- Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn lactic từ sản phẩm cơm mẻ, lạp xưởng tươi, kiệu
muối chua và antibio đồng thời thực hiện một vài kiểm tra nhận diện vi khuẩn lactic.
- Thí nghiệm 2: Khảo sát và chọn lọc các chủng vi khuẩn lactic sinh chất kháng
khuẩn.
Kết quả: Phân lập được 11 chủng vi khuẩn lactic và kiểm tra tính kháng khuẩn, trong
đó 5 chủng có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn: CM1, LX1, LX2, A1 và A2
nhưng tính kháng khuẩn của chúng khá yếu. Vì vậy, các chủng vi khuẩn lactic trong
các mẫu phân lập được sinh kháng khuẩn yếu.

iii


Lời cam kết

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu trong công
trình nghiên cứu này có xuất xứ rõ ràng. Những kết luận mới về khoa học của công
trình nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Long Xuyên, ngày 02 tháng 01 năm 2016
Phan Thị Bích Duyên

Nguyễn Thị Phương Thảo

iv


Mục lục
Nội dung

Trang

Lời cảm ơn ..........................................................................................................................i
Abstract ............................................................................................................................. ii
Tóm tắt ............................................................................................................................. iii
Lời cam kết .......................................................................................................................iv
Mục lục............................................................................................................................... v
Danh sách hình ............................................................................................................... viii
Danh sách bảng .................................................................................................................ix
Danh sách sơ đồ ................................................................................................................. x
Danh sách chữ viết tắt .......................................................................................................xi
Chƣơng 1 Giới thiệu......................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................................... 2
1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 2
Chƣơng 2 Lƣợc khảo tài liệu........................................................................................... 3

2.1. Giới thiệu về cơm mẻ, kiệu muối chua, lạp xưởng tươi và antibio ............................. 3
2.1.1. Cơm mẻ .................................................................................................................... 3
2.1.2. Kiệu muối chua ........................................................................................................ 3
2.1.3. Lạp xưởng tươi ......................................................................................................... 5
2.1.4. Antibio ..................................................................................................................... 5
2.2. Vi khuẩn lactic ............................................................................................................ 6
2.2.1. Đặc điểm chung........................................................................................................ 6
2.2.2. Sự phân bố................................................................................................................ 7
2.2.3. Phân loại vi khuẩn lactic .......................................................................................... 7
2.2.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic .................................................................. 9
2.2.5. Những ứng dụng của vi khuẩn lactic ..................................................................... 10
2.3. Quá trình lên men lactic ............................................................................................ 12
2.4. Sơ lược về vi khuẩn chủng chỉ thị Escherichia coli (E.coli) .................................... 13
2.4.1. Phân loại khoa học (Castellani & Chalmers, 1919) ............................................... 13
2.4.2. Đặc điểm cơ bản của Escherichia coli (Nguyễn Lân Dũng, 2008)........................ 13
v


2.5. Chất kháng khuẩn ...................................................................................................... 15
2.5.1. Tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic ................................................................... 15
2.5.2. Sơ lược về bacteriocin ............................................................................................ 15
2.5.2.1. Giới thiệu chung .................................................................................................. 15
2.5.2.2. Phân loại .............................................................................................................. 16
2.5.2.3. Cơ chế tác động ................................................................................................... 17
2.5.3. Lợi ích và hạn chế của bacteriocin ......................................................................... 18
2.6. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic trong và ngoài nước....................................... 19
2.6.1. Trong nước ............................................................................................................. 19
2.6.2. Ngoài nước ............................................................................................................. 20
Chƣơng 3 Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................. 21
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................................. 21

3.2. Mẫu nghiên cứu......................................................................................................... 21
3.3. Thiết kế nghiên cứu ................................................................................................... 21
3.4. Công cụ nghiên cứu .................................................................................................. 21
3.4.1. Thiết bị và dụng cụ................................................................................................. 21
3.4.2. Môi trường và hóa chất: ......................................................................................... 22
3.5. phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 23
3.5.1. Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu: cơm mẻ, kiệu muối chua, lạp
xưởng tươi, antibio và quan sát đặc điểm hình thái, kiểm tra sinh hóa để nhận diện vi
khuẩn lactic ...................................................................................................................... 23
3.5.1.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ kiệu muối chua ........................................................ 23
3.5.1.2. Phân lập vi khuẩn lactic từ cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio ............................. 24
3.5.1.3. Khảo sát đặc điểm hình thái và kiểm tra sinh hóa để nhận diện vi khuẩn lactic. 25
3.5.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic
phân lập được ................................................................................................................... 28
3.5.2.1. Chuẩn bị dịch ly tâm vi khuẩn lactic................................................................... 28
3.5.2.2. Chuẩn bị dịch huyền phù của dòng chỉ thị vi khuẩn E.Coli................................ 28
3.5.2.3. Thử khả năng sinh chất kháng khuẩn .................................................................. 28
Chƣơng 4 Kết quả và thảo luận .................................................................................... 31
4.1. Kết quả phân lập chủng vi khuẩn lactic trong 4 mẫu sản phẩm, quan sát hình thái
khuẩn lạc, nhuộm gram và kiểm tra sinh hóa các chủng vi khuẩn phân lập được ........... 31
vi


4.1.1. Kết quả phân lập chủng vi khuẩn lactic trong 4 mẫu sản phẩm và quan sát hình
thái khuẩn lạc của chúng .................................................................................................. 31
4.1.2. Kết quả nhuộm gram và kiểm tra sinh hóa các chủng vi khuẩn phân lập được ..... 34
4.2. Kết quả xác định và chọn lọc những chủng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn cao
.......................................................................................................................................... 40
Chƣơng 5 Kết luận và kiến nghị ................................................................................... 44
5.1. Kết luận ..................................................................................................................... 44

5.2. Kiến nghị ................................................................................................................... 44
Tài liệu tham khảo ............................................................................................................ 45

vii


Danh sách hình
Nội dung

Trang

Hình 1: Cơm mẻ ........................................................................................................... 3
Hình 2: Kiệu muối chua ............................................................................................... 4
Hình 3: Lạp xưởng tươi ................................................................................................ 5
Hình 4: Antibio ............................................................................................................ 6
Hình 6: Vi khuẩn lactic hình que ................................................................................. 6
Hình 5: Vi khuẩn lactic hình cầu ................................................................................. 6
Hình 7: Vi khuẩn E.coli ............................................................................................. 14
Hình 8: Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli ............................................................................. 14
Hình 9: Vi khuẩn E.coli chụp dưới kính hiển vi 100X ............................................. 14
Hình 10: Mô tả vòng kháng khuẩn trên đĩa petri ....................................................... 29
Hình 11: Hình thái khuẩn lạc trên mẫu Antibio: A1 .................................................. 33
Hình 12: Hình thái khuẩn lạc trên mẫu cơm mẻ: CM2 .............................................. 33
Hình 13: Hình thái khuẩn lạc trên mẫu Kiệu: K1 ...................................................... 34
Hình 14: Hình thái khuẩn lạc trên mẫu Lạp xưởng tươi: LX1 ................................... 34
Hình 15: Hình thái tế bào vi khuẩn của chủng A1 ..................................................... 36
Hình 16: Hình thái tế bào vi khuẩn của chủng CM2.................................................. 36
Hình 17: Hình thái tế bào vi khuẩn của dòng K1 ....................................................... 37
Hình 18: Hình thái tế bào vi khuẩn của dòng LX1 .................................................... 37
Hình 19: Kết quả kiểm tra sinh hóa của chủng A1 .................................................... 38

Hình 20: Kết quả kiểm tra sinh hóa của chủng CM2 ................................................. 38
Hình 21: Kết quả kiểm tra sinh hóa của chủng K1 .................................................... 39
Hình 22: Kết quả kiểm tra sinh hóa của chủng LX1 .................................................. 39
Hình 23: Vòng kháng khuẩn của chủng A1 ............................................................... 41
Hình 24: Vòng kháng khuẩn của chủng A2 ............................................................... 41
Hình 25: Vòng kháng khuẩn của chủng CM1 ............................................................ 42
Hình 26: Vòng kháng khuẩn của chủng LX1............................................................. 42
Hình 27: Vòng kháng khuẩn của chủng LX2............................................................. 43

viii


Danh sách bảng
Nội dung

Trang

Bảng 1: Các chi vi khuẩn lactic, kiểu lên men và sản phẩm chính .............................. 8
Bảng 2: Thành phần môi trường MRS Broth ............................................................. 22
Bảng 3: Thành phần môi trường Nutrient .................................................................. 22
Bảng 4: Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn và quan sát đặc điểm hình thái khuẩn
lạc ............................................................................................................................... 32
Bảng 5: Kết quả kiểm tra sinh hóa các chủng vi khuẩn lactic phân lập được............ 35
Bảng 6: Kích thước vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn .................................. 40

ix


Danh sách sơ đồ
Nội dung

Trang

Sơ đồ 1: các bước phân lập vi khuẩn lactic từ kiệu muối chua .................................. 23
Sơ đồ 2: phân lập vi khuẩn lactic từ cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio ...................... 25
Sơ đồ 3: quy trình nhuộm gram ................................................................................. 26
Sơ đồ 4: kiểm tra khả năng sinh chất kháng khuẩn .................................................... 30

x


Danh sách chữ viết tắt
A: Antibio
CM: Cơm mẻ
K: Kiệu
LAB: Vi khuẩn Lactic
LX: Lạp xưởng

xi


Chƣơng 1
Giới thiệu
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, ngộ độc thực phẩm đã trở thành một trong những vấn đề cấp thiết cần
được giải quyết để bảo vệ sức khỏe con người. Bên cạnh đó, việc dùng chất bảo quản
thực phẩm hóa học đang bị hạn chế sử dụng vì những tác dụng phụ không có lợi của
nó. Theo thống kê của Bộ Y tế, hàng năm có khoảng 200 – 600 trường hợp ngộ độc
thực phẩm, trong đó chiếm 50% là ngộ độc do vi sinh vật (Lương Đức Phẩm, 2005).
Ở nước ta, các sản phẩm lên men truyền thống đã có từ rất lâu đời và được ứng dụng

rộng rãi trong đời sống và trong các ngành công nghiệp thực phẩm. Thực phẩm tạo
thành do quá trình lên men lactic từ các chủng vi khuẩn rất phong phú và công nhận
an toàn đối với người sử dụng. Tuy nhiên, từ trước đến nay vi khuẩn vẫn luôn bị hiểu
lầm là loài vi sinh vật gây hại vì con người thường gắn liền chúng với bệnh tật.
Nhưng trên thực tế, có rất nhiều loại vi khuẩn có lợi cho chúng ta. Trong hệ tiêu hóa
của chúng ta có một hệ vi sinh vật với số lượng rất lớn, trong đó có hơn 400 loài vi
khuẩn khác nhau (Melissa Peterson et al., 2002), đặc biệt là chủng vi khuẩn lactic.
Người ta đã chứng minh chắc chắn rằng nhiều loại vi khuẩn lactic sản sinh ra chất
kháng khuẩn (Pongtep Wilaipun et al., 2002). Hoạt động kháng vi sinh vật của nhóm
vi khuẩn này đã được ứng dụng hơn 10.000 năm qua và con người đã có thể kéo dài
thời gian sử dụng của nhiều loại thực phẩm thông qua quá trình lên men do vi khuẩn
này lên men. Phần lớn hiệu quả bảo quản của vi khuẩn lactic là do khả năng sinh
tổng hợp nhiều thành phần có tác dụng ức chế như: các acid hữu cơ, H2O2, và
bacteriocin (Lindgren & Dobrogosz, 1990; Piard & Desmazeaud, 1992). Do đó, việc
sử dụng các dòng vi khuẩn có lợi để ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh hiện
đang được chú trọng, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lactic. Trong tương lai có thể sử
dụng trong bảo quản thực thực phẩm như một biện pháp sinh học (Hugas et al.,
2003). Nhóm vi khuẩn này có ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn với acid lactic là
nguyên liệu cần thiết của nhiều ngành công nghiệp. Đặc biệt, trong công nghiệp chế
biến và bảo quản thực phẩm như sữa chua, các loại dưa từ rau củ, các loại sản phẩm
thủy sản lên men (Lương Đức Phẩm, 2004) do đó ta có thể ứng dụng nó trong việc
sản xuất các chế phẩm probiotic có lợi cho sức khỏe. Hơn nữa, hệ vi sinh khuẩn
lactic là một trong những nguồn vi sinh vật sinh ra bacteriocin, dạng chất kháng
khuẩn có khả năng chống lại sự phát triển của các mầm bệnh và được ứng dụng như
chất bảo quản thực phẩm, điển hình là nisin.
Ở Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic xuất hiện cũng khá phổ biến chủ yếu trong sản phẩm
lên men truyền thống như dưa cải muối chua, sữa chua, cơm mẻ, nem chua và một số
sản phẩm men tiêu hoá đông khô. Nên vấn đề sản xuất và bảo quản thực phẩm lên
men an toàn cũng rất cấp thiết.

1


Đề tài “Phân lập vi khuẩn lactic trên rau quả muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi và
antibio có khả năng sinh chất kháng khuẩn” được thực hiện. Nhằm làm tiền đề cho
việc nghiên cứu dòng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn cao để ứng dụng
trong sản xuất và bảo quản thực phẩm lên men.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập được 1 - 2 chủng vi khuẩn có khả năng sinh chất kháng khuẩn trong các sản
phẩm kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio và khảo sát khả năng kháng
khuẩn của chúng.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp
xưởng tươi, antibio và khảo sát đặc điểm hình thái, kiểm tra sinh hóa các chủng
phân lập được.
Khảo sát khả năng sinh chất kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập
được.

2


Chƣơng 2
Lƣợc khảo tài liệu
2.1. Giới thiệu về cơm mẻ, kiệu muối chua, lạp xƣởng tƣơi và antibio
2.1.1. Cơm mẻ
Lên men cơm mẻ chủ yếu là lên men vi khuẩn lactic có nhiều chủng loại vi khuẩn
lactic tham gia theo kiểu đồng hình hay dị hình. Hệ vi sinh vật trong cơm mẻ truyền
thống gồm: tuyến trùng, nẩm men và vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic lên men chua
(sản sinh acid lactic) từ tinh bột chín (Nguyễn Văn Bá, 2008).
C6H12O6

CH3CHOCOH +

Kcal (lên men đồng hình)

(Acid lactic)
Bản thân vi khuẩn lactic tạo nên chất kháng sinh cần thiết để diệt các vi sinh vật có
hại khác nên rất có lợi cho người ăn. Cũng nhờ những đặc tính này mà ăn cơm mẻ
sống có lợi hơn nhiều khi ăn cơm mẻ chín.

Hình 1: Cơm mẻ (Nguyễn Anh Tuấn, 2011)
2.1.2. Kiệu muối chua
Quá trình lên men lactic trong muối chua kiệu chia thành ba giai đoạn: (Internet8)
Giai đoạn 1: Muối ăn (NaCl) có nồng độ 2,5 – 3% khi muối kiệu sẽ làm cho môi
trường ưu trương đường và các chất từ tế bào kiệu một phần sẽ khuếch tán ra môi
trường, do đó vi khuẩn lactic cùng các vi sinh vật khác cùng phát triển.
Giai đoạn 2: Do vi khuẩn lactic phát triển mạnh, nên pH môi trường giảm xuống 3 –
3,5 làm ức chế các vi khuẩn khác, chỉ còn vi khuẩn lactic phát triển, chúng chiếm ưu
thế tuyệt đối, kiệu trở nên chua, ngon. Đây là giai đoạn quyết định, nếu không tạo
được ưu thế của vi khuẩn lactic, thì các vi khuẩn khác sẽ phát triển làm kiệu khú bởi
các nguyên nhân sau:
3


- Kiệu rửa không kỹ, làm dập nát, có nhiều tạp khuẩn.
- Cho muối không đúng 2,5 – 3% (nếu quá 5 – 6% sẽ ức chế cả vi khuẩn lactic, nếu
dưới 3% thì nhiều tạp khuẩn sẽ phát triển lấn át).
- Không đậy, nén kỹ, không tạo được điều kiện kỵ khí cho vi khuẩn lactic phát triển.
pH là yếu tố rất quan trọng, nếu vi khuẩn lactic phát triển ưu thế thì pH sẽ là 3 – 3,5,
còn nếu không thì vi sinh vật khác sẽ phát triển (pH 4,5 – 5: vi khuẩn gây thối hoạt

động, pH 5 – 5,5: vi khuẩn đường ruột phát triển, pH 2,5 – 3: nấm men dại hoạt
động, pH 1,2 – 3: nấm mốc phát triển).
Giai đoạn 3: Khi kiệu đã chua, pH giảm xuống đến 3, thì ngay cả vi khuẩn lactic
cũng bị ức chế, nếu cứ để tự nhiên như vậy thì các nấm men dại, nấm mốc sẽ bắt đầu
phát triển phân giải axit lactic thành CO2 và H2O, pH tăng lên, sản phẩm bắt đầu có
váng (váng dưa, váng cá) và môi trường giảm chua, có mùi mốc, có nhiều bọt khí
(nấm men dại thường có là Geotrichumcandidum).
Khi muối kiệu lên men lactic ra sẽ có thành phẩm đạt yêu cầu:
- Tạo được sinh khối vi khuẩn có ích, át các sinh vật gây thối.
- Gây chua, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm.
- Chuyển kiệu về dạng “chín sinh học” do đó mà hiệu suất tiêu hóa tăng. Nếu muốn
giữ sản phẩm không cho “quá lactic” thì có thể giữ ở nhiệt độ thấp (20C-40C) đồng
thời bổ sung chất diệt nấm như bensozt natri 1%, dịch chiết tỏi, gừng, giềng... Cần
nói thêm rằng vi khuẩn lactic không phá vỡ tế bào thực vật, nên kiệu muối chua vẫn
có hình dạng gần như không thay đổi.

Hình 2: Kiệu muối chua (Trịnh Huyền Na, 2014)

4


2.1.3. Lạp xƣởng tƣơi
Lạp xưởng tươi là sản phẩm thịt lên men phổ biến của một số tỉnh miền Tây: Tiền
Giang, Sóc Trăng… với sự phối trộn hài hòa giữa thịt, mỡ, một số phụ gia và sự lên
men lactic của hệ vi sinh vật làm cho lạp xưởng chua có kết cấu, hương vị và màu
sắc đặc trưng. Vì hàm lượng nước trong sản phẩm còn cao (khoảng 45%) nên sản
phẩm có cấu trúc mềm hơn lạp xưởng khô và để tránh hư hỏng phải bảo quản sản
phẩm ở nhiệt độ lạnh.

Hình 3: Lạp xƣởng tƣơi (Nguyễn Hòa, 2008)

2.1.4. Antibio
Cơ chế tác động có ích của Lactobacillus acidophilus chứa trong antibio bao gồm:
- Lactobacillus acidophilus có khả năng tạo ra các chất có tác dụng kiềm khuẩn trực
tiếp như: acid lactic, lactocidin, acidophilin.
- Lactobacillus acidophilus kích thích miễn dịch không chuyên biệt của niêm mạc:
tăng sự tổng hợp IgA.
- Lactobacillus acidophilus ức chế tương tranh sự xâm nhập của các vi khuẩn gây
bệnh.
Do đó, Antibio tăng cường chức năng bảo vệ niêm mạc ruột, giúp ngăn ngừa sự tấn
công của các vi sinh vật gây bệnh, làm giảm độc tính của các độc tố, kích thích miễn
dịch cục bộ và miễn dịch ngoại biên, kích thích hoạt động của các enzym tiêu hóa
thức ăn (Internet6).

5


Hình 4: Antibio (Thanh Hoài, 2013)

2.2. Vi khuẩn lactic
2.2.1. Đặc điểm chung
Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae (Bergey, 1979) và được
xếp vào 4 chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc, ngày nay
người ta bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc giống
Bifidobacterium.
Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm này có đặc điểm sinh thái khác nhau nhưng đặc tính
sinh lý tương đối giống nhau. Tất cả đều có đặc điểm chung là vi khuẩn
Gram dương, thử nghiệm oxydase và catalase âm tính, hình que hay hình cầu, lên
men carbohydrate tạo sản phẩm chính cuối cùng là acid lactic (Abee et al., 1999).
Vi khuẩn lactic có khả năng phân giải H2O2 để tạo ra nước và O2 để phát triển.

Hình 5: Vi khuẩn lactic hình cầu
(Hoàng Văn Vinh, 2006)

Hình 6: Vi khuẩn lactic hình que
(Hoàng Văn Vinh, 2006)

6


2.2.2. Sự phân bố
Ít gặp trong đất và nước, thường phát triển trong những môi trường có chứa nhiều
chất hữu cơ phức tạp như:
- Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thường gặp Lactobacillus lactic, Lactobacillus
bulgarius, Lactobacillus helviticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus ferment,
Lactobacillus brevis, Streptococcus diacetyllactis. Để tồn tại trong môi trường sữa vi
khuẩn lactic tổng hợp ATP từ cơ chất lactose.
- Trên bề mặt thực vật và xác thực vật đang bị phân giải hay có Lactobcillus
plantanium, Lactobcillus delnikii, Lactobcillus ferment, Lactobacillus brevis,
Streptococcus lactis... Chúng còn được tìm thấy trên các loại rau quả, trái cây.
- Trong ruột và các niêm dịch ở người và động vật có Lactobacillus acidophilus,
Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus salivanius, Streptococcus
pyogenes, Bifidobacterrium, Pneumococcus.
2.2.3. Phân loại vi khuẩn lactic
Dựa vào quá trình lên men đường: có 2 loại
- Vi khuẩn lactic đồng hình: Streptococus lactic, Streptococcus cremoris,… Vi
khuẩn lên men lactic đồng hình sản sinh 85%- 95% acid lactic. Do thiếu porphyrin
và cytochrom, không có chuỗi vận chuyển electron nên chúng thu năng lượng bằng
con đường lên men bắt buộc. Trong tế bào vi khuẩn có chứa enzymealdolase và
triosophotphatizomerase.
- Vi khuẩn lactic dị hình: Vi khuẩn lên men lactic dị hình sản sinh 50% acid

lactic, 25% cồn và 25% acid acetic. Nhóm vi khuẩn này gồm có các vi khuẩn sinh
hương Streptococcus votrovorus, Streptococcus paracotrovorus, Streptococcus
diactylactis,... và Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermenti,...

7


Bảng 1: Các chi vi khuẩn lactic, kiểu lên men và sản phẩm chính (Lê Văn Việt Mẫn,
2014)
Chi và dƣới chi

Sản phẩm chính
Kiểu lên men
(Tỷ lệ phân tử)

Cấu hình của acid
lactic

Streptococcus

Đồng hình

Lactat

L(+)

Pediococcus

Đồng hình

Lactat

DL và L(+)

Lactobacillus

Đồng hình

Lactat

Thermobacterium

Đồng hình

Lactat

D(-), L(+), DL

Streptobacterium

Dị hình

Lactat : axetat

D(-), L(+), DL

(tùy tiện)

1:1

Dị hình

Lactat : axetat : CO2

Betabacterium

DL

1:1:1
Leuconostoc

Dị hình

Lactat : axetat : CO2

D(-)

1:1:1
Bifidobacterium

Dị hình

Lactat : axetat

L(+)

2:3
Dựa vào hình thái: người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que,
kích thước thay đổi tùy loài.
- Giống Streptococcus có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế bào 0,5 m 1 m. Sau khi phân chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc

chuỗi ngắn.
- Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5 m 0,8 m và chiều dài khoảng 1,6 m. Trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi
tròn, chiều dài khoảng 1-3 m. Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi,
không tạo thành đám tập trung.
- Giống Lactobacillus có dạng hình que. Tùy vào điều kiện của môi trường sống mà
hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài. Sắp xếp thành chuỗi hay
đứng riêng lẻ.
- Giống Pediococcus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn. Có hoạt tính thủy
phân protein rất yếu.
- Giống Bifidobacterium là những trực khuẩn, khi mới phân lập có thể phân nhánh
dạng chữ Y, V và tập hợp thành khối. Sau nhiều lần cấy truyền chúng trở thành dạng
trực khuẩn thẳng hoặc hơi cong.
Dựa vào tính mẫn cảm với oxi: có 3 nhóm
8


-Vi khuẩn lactic kỵ khí nghiêm ngặt
- Vi khuẩn lactic yếm khí tùy tiện: Pediococcus cerevisiae
- Vi khuẩn lactic vi hiếu khí (hiếu khí tùy tiện)
Dựa vào nhiệt độ phát triển tối ưu: Các vi khuẩn ưa ấm có nhiệt độ tối thích từ 250C
– 370C, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích từ 500C – 650C, nhóm ưa lạnh phát
triển ở nhiệt độ 50C hoặc thấp hơn (Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008)
- Vi khuẩn lactic ưa ấm: Streptococus lactic, Lactobacillus casei, L. plantarum,…
- Vi khuẩn lactic ưa nhiệt: Streptococus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, L.
helvetcus,…
2.2.4. Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn lactic
Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Chúng
không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như cacbon,
nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như
vitamin, muối vô cơ… (Lê Văn Việt Mẫn, 2004).

Nhu cầu dinh dưỡng cacbon:
- Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit
(glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các
polysaccarit (tinh bột, dextrin)
- Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế
bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ.
Nhu cầu dinh dưỡng nitơ:
- Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì
vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ
có sẵn trong môi trường.
- Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton,
dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,… Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được
sử dụng nhiều nhất và hiệu quả nhất. Tuy nhiên, ở quy mô công nghiệp không thể sử
dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
Nhu cầu về vitamin:
- Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên
rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loại vi khuẩn lactic không có
khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin.
Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay
dịch tự phân nấm men…
Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác:

9


- Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác
cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ.
- Một số axit hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn
lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn
xuất của các acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản

các chủng vi khuẩn lactic.
- Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng
đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng
các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.
Nhu cầu muối vô cơ khác:
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô
cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, phospho, lưu
huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn
định cấu trúc tế bào.
2.2.5. Những ứng dụng của vi khuẩn lactic
Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn cacbon hydrat khác nhau mà các chủng
vi khuẩn lactic đã được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất và chế biến (Lê Văn
Việt Mẫn, 2004).
 Những ứng dụng trong công nghệ thực phẩm:
Trong công nghệ thực phẩm, việc sử dụng quá trình lên men lactic không chỉ nhằm
mục đích bảo quản mà còn nhằm đưa ra thị trường các loại thực phẩm có tính chất và
hương vị mong muốn. Các ứng dụng chủ yếu gồm:
- Chế biến các sản phẩm sữa:
+ Ngoài khả năng lên men làm cho sữa không bị hỏng, các chủng vi khuẩn lactic còn
có nhiều khả năng đặc biệt khác. Nhờ đó mà người ta đã sản xuất hàng loạt các sản
phẩm từ nguồn nguyên liệu sữa ban đầu.
+ Như lợi dụng khả năng làm đông tụ sữa của vi khuẩn Streptococcus lactic để sản
xuất sữa chua hay khả năng tạo ra các mùi vị, tạo các chất thơm của chủng
Leuconostoc để sản xuất bơ, phomat…
- Sản xuất bánh mì đen:
+ Đây là loại bánh mì có chất lượng cao bên cạnh quá trình lên men bởi nấm men tạo
rượu etylic và CO2.
+ Người ta còn sử dụng quá trình lên men của vi khuẩn lactic để tạo vị chua và
hương thơm đặc trưng cho sản phẩm.
- Ủ thức ăn gia súc:

10


+ Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong các trang trại chăn nuôi. Thức ăn
khi ủ không những giảm được sự tổn thất giá trị dinh dưỡng mà còn bổ sung nhiều
loại vitamin do vi sinh vật tổng hợp. Phương pháp này dựa vào sự chuyển hóa đường
có sẵn trong nguyên liệu của vi khuẩn lactic.
+ Để khối ủ chua thức ăn gia súc có chất lượng tốt, người ta thường sử dụng vi khuẩn
lactic thuần khiết như: Lactobacillus plantarum, Thermobacterium cerealle.
- Muối chua rau quả
+ Cũng như ủ chua thức ăn gia súc, vấn đề muối chua rau quả cũng nhằm thực hiện
hai mục đích:
Bảo quản nguyên liệu
Làm tăng giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan
+ Đây là phương phương pháp vừa chế biến vừa bảo quản rau quả rất phổ biến, được
sử dụng nhiều trong gia đình cũng như trong kĩ nghệ đồ hợp. Hiện nay có nhiều sản
phẩm muối chua được sản xuất và sử dụng và sử dụng rộng rãi như dưa cải muối
chua, dưa chuột muối chua…
- Sản xuất acid lactic và muối lactat
Ngoài việc ứng dụng trong các sản phẩm lên men, người ta còn sử dụng các chủng
lactic như Lctobacterium coaglulans và Lactobacillus delbrueckii để sản xuất ra một
lượng lớn acid lactic và muối lactat dùng làm chất phụ gia thực phẩm.
 Ứng dụng trong y học:
- Sinh ra acid lactic, tạo ra nhiều chất chống vi khuẩn khác nhau như acid hữu cơ,
diacetyl, hydrogen peroxide và các bacteriocin nên ngăn cản được sự hiện diện và
phát triển của các vi khuẩn gây bệnh như Ecoli, Salmonella (gây tiêu chảy), vi khuẩn
Pylori (gây viêm loét dạ dày) và nấm Candida.
- Phòng ngừa và ngăn chặn rối loạn tiêu hóa, giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột,
khôi phục lại cân bằng vi khuẩn tự nhiên trong cơ thể, chuyển lactose thành acid

lactic, hạn chế dị ứng do cơ thể không dung nạp được lactose.
- Hơn thế nữa, vi khuẩn lactic còn có tác dụng giảm cholesterol, kháng các tác nhân
gây ung thư. Vài chủng vi khuẩn sinh ra những enzyme có khả năng chuyển những
chất tiền sinh ung thư, những tác nhân sinh ung thư như glucosidase, azoreductase
thành bệnh ung thư.Vi khuẩn lactic có khả năng ức chế sự phát triển các tế bào ung
thư, ức chế hoạt động của các vi khuẩn sinh ra enzyme và phân huỷ nitrosamine.
- Một số vi khuẩn lactic có khả năng bảo vệ chống lại sự phân hủy và đột biến DNA
in vitro và in vivo.
 Một số ứng dụng khác:
- Ứng dụng trong ngành công nghệ vật liệu

11


- Ứng dụng trong ngành mỹ phẩm
Ngoài những mặt có lợi được ứng dụng và phát huy, vi khuẩn lactic còn gây ra
những tác hại. Gây ra hiện tượng vẫn đục và bị chua trong công nghệ sản xuất bia,
nước ngọt, rượu vang, làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng của sản phẩm. Do đó
chúng ta cần phải có biện pháp phòng và chống lại những ảnh hưởng xấu đó (Lê Văn
Việt Mẫn, 2004).
2.3. Quá trình lên men lactic
Lên men lactic là quá trình thu năng lượng nhờ vi khuẩn lactic, bao gồm sự biến đổi
một phân tử đường thành 2 phân tử axit lactic và năng lượng tách ra (Lương Đức
Phẩm et al., 2009):
C6H12O6

CH3HONCOOH + 0,075x106J

Lượng sản phẩm tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi
trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, nói chung thì acid lactic thường chiếm

40% lượng đường đã được phân hủy, acid sucxinic 20%, rượu etylic chiếm 10%,
acid axetic 10% và các loại khí gần 20%.
Dựa vào sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men, người ta chia vi khuẩn lactic
thành 2 nhóm là lên men đồng hình và lên men dị hình.
-

Lên men đồng hình (điển hình):

+ Trong trường hợp này acid pyruvic được tạo thành theo sơ đồ Embden-MayerhorfParnas (EMP). Sau đó acid pyruvic sẽ tạo thành axit lactic dưới tác dụng của enzyme
lactadehydrogenase.
+ Sản phẩm chính là acid lactic 90% – 98%
+ Sản phẩm phụ là ethanol, acid acetic, CO2, acetone.
+ Chủ yếu thuộc 2 giống Lactobacterium (trực khuẩn) và Streptococcus. Một số
chủng điển hình: Lactobacterum bungaricum, Streptococcus lactic…
-

Lên men dị hình (không điển hình):

+ Xảy ra trong trường hợp vi khuẩn lactic không có các enzyme cơ bản, vì vậy
xilulose 5-phosphate sẽ tạo thành theo con đường pento-phosphate (PP).
+ Chỉ có 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngoài ra còn tạo ra các sản phẩm
phụ khác như: acid acetic, ethanol, CO2. Các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo
thành ester có mùi thơm.
+ Có men decacboxylase để phân hủy acid pyruvic, CO2, CH3CHO. Tuy nhiên
không phân hủy hết được acid pyruvic.
+ Cho độ tinh khiết không cao và phức tạp.
+ Chủ yếu thuộc 2 giống Lactobacillus và Bacterium. Một số chủng điển hình:
Bacterium coli, Lactobacillus brevis…
12

2.4. Sơ lƣợc về vi khuẩn chủng chỉ thị Escherichia coli (E.coli)
2.4.1. Phân loại khoa học (Castellani & Chalmers, 1919)
Vực (domain): Bacteria
Ngành (phylum): Proteobacteria
Lớp (class): Gamma Proteobacteria
Bộ (ordo): Enterobacteriales
Họ (familia): Enterobacteriaceae
Chi (genus): Escherichia
Loài (species): E. coli
2.4.2. Đặc điểm cơ bản của Escherichia coli (Nguyễn Lân Dũng, 2008)
Kích thước: 2 – 3 m x 0,5 m
Khuẩn lạc tròn, màu trắng đục
- Đặc điểm nuôi cấy:
Sống hiếu khí và kị khí tùy tiện
Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 50C – 400C, nhiệt độ tối ưu: 370C
pH thích hợp 7,0 – 7,2
Trên môi trường thạch dinh dưỡng NA tạo khóm tròn ướt (dạng S) màu trắng đục.
Trên môi trường Rapid‟ E.coli tạo khuẩn lạc màu tím.
Trên môi trường Macconkey, Endo, SS tạo khóm hồng đỏ.
Trên các môi trường đường.
- Các phản ứng sinh hóa: Indol dương, Methyl Red (phản ứng MR) dương tính,
Voges-Proskauer (phản ứng VP) âm tính và Citrat âm tính, H2S âm tính, hoàn
nguyên nitrat thành nitrit, Lysine decarboxylaza dương tính.
0

Đun 550C trong 1 giờ hoặc 60 C trong 30 phút sẽ bị tiêu diệt.
Dễ bị diệt bởi các thuốc sát trùng thông thường.

13

Hình 7: Vi khuẩn E.coli (Lynn Yarris, 2011)

Hình 8: Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli (Madprime, 2005)

Hình 9: Vi khuẩn E.coli chụp dƣới kính hiển vi 100X
(Võ Thành Thìn, 2012)
14


2.5. Chất kháng khuẩn
2.5.1. Tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic
Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh ra các acid hữu cơ, chúng tạo ra môi
trường không thích hợp cho sự phát triển của những vi sinh vật gây bệnh hay gây hư
hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức
năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế bào, ức chế quá trình vận chuyển
chủ động của màng tế bào. Acid lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm pH
nội bào hoặc tự oxi hoá, làm dừng quá trình trao đổi chất, gây chết những tế bào
nhạy cảm với nó (Lê Văn Nhương và et al., 2009).
Hơn thế nữa, vi khuẩn lactic biểu thị một loạt các hoạt động kháng khuẩn. Trong số
các hoạt động đó, việc sản xuất acid lactic và acid acetic là quan trọng nhất. Ngoài
ra, một số chủng vi khuẩn lactic được biết đến để sản xuất các hợp chất kháng khuẩn
như ethanol, acid formic, acid béo, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin,
reutericyclin và đặc biệt là bacteriocin. Bên cạnh việc sản xuất ra hợp chất như
bacteriocin, một số vi khuẩn lactic còn có thể tổng hợp peptide kháng khuẩn khác
góp phần vào việc bảo quản thực phẩm một cách an toàn. Một trong những đặc điểm
của các hợp chất kháng khuẩn là khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh đường
ruột như Escherichia coli, Salmonella và nhóm Vibrio spp. (De Vuyst & Leroy,
2007).

2.5.2. Sơ lƣợc về bacteriocin
2.5.2.1. Giới thiệu chung
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein.
Loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin
đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong cơ thể con người gây ra các vấn đề
về sức khỏe, nhưng bacteriocin bị ảnh hưởng bởi tác động của các enzyme như
trypsin, pepsin, α-chymotrypsin…
Những sản phẩm do vi khuẩn sinh ra có khả năng gây ức chế những vi khuẩn khác có
rất nhiều như enzyme, antibiotic, bacteriocin... Hiện nay người ta đã phát hiện ra
nhiều loại bacteriocin do vi khuẩn tổng hợp nên như nisin (Lactococcus lactis),
subtilin (Bacillus subtilis), pediocin (Pediococcus acidilactici)…
Người ta đã đưa ra nhiều tiêu chí để định nghĩa bacteriocin, những tiêu chí này được
dùng trong nhiều trường hợp, áp dụng với nhiều mức độ khác nhau để định nghĩa
những loại bacteriocin khác nhau. Những tiêu chí như sau:
- Phạm vi ức chế đối với những loại khác
- Sự có mặt của loại protein hoạt động
- Cách thức hoạt động có tính kháng khuẩn
- Loại tế bào mà nó tác dụng
15


- Những yếu tố di truyền
- Do quá trình tổng hợp sinh học có tính ức chế
Năm 1953, thương phẩm nisaplin xuất hiện trên thị trường như chất bảo quản thực
phẩm và đến năm 1969, tổ chức WHO công nhận nisin là chất bảo quản an toàn có
nguồn gốc sinh học. Trong công nghệ thực phẩm, nisin là bacteriocin được nghiên
cứu và ứng dụng rộng rãi nhất trong chế biến và bảo quản một số loại thực phẩm như
phomat, xúc xích, sữa chua, một số loại sản phẩm thịt, rau quả đóng hộp...Trong y
dược, bacteriocin còn được ứng dụng như một chế phẩm sinh học để điều trị một số
bệnh như viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đường tiêu hoá...

Ngoài ra, reuterin và dẫn xuất của reutericyclin cũng có thể ức chế các vi khuẩn
Gram âm và Gram dương, nấm và động vật nguyên sinh như giun, sán... Các
diacetyl, acetaldehyde và acetoin cũng có tác dụng kìm hãm đối với các vi sinh vật
có hại ngay cả ở nồng độ thấp.
2.5.2.2. Phân loại
Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc phân loại
các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang là vấn đề tranh cãi.
Các bacteriocin thường được phân loại kết hợp với các chỉ tiêu khác nhau . Những
tiêu chí chính là họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và cuối cùng là
trình tự chuỗi amino acid (Desriac et al., 2010). Một cách tổng quát, bacteriocin
được chia thành 3 lớp: lớp I, lớp II và lớp III.
Lớp I
Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5 kDa), bền nhiệt
và tác động lên cấu trúc màng. Một thành viên nổi tiếng của nhóm này là nisin
(Parada et al., 2007). Các Lanbiotic được chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib dựa trên
sự tương đồng cấu trúc.
- Phân lớp Ia
Phân lớp Ia gồm các peptide dạng thuôn dài, linh hoạt và tích điện dương, chúng
hoạt động bằng cách hình thành các lỗ trong màng tế bào chất của các loài vi khuẩn
nhắm đến (Ouwehand & Vesterlund, 2004).
Nisin thuộc nhóm này. Đây là một peptide được hình thành bởi 34 amino acid. Có 2
biến thể của nisin được ghi nhận là nisin A và nisin Z, chúng chỉ khác nhau bởi
amino acid thứ 27: histidine trong nisin A được thay thế bởi asparagin trong nisin Z.
Loại bacteriocin này, được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic, được sử
dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm. Nó có phổ kháng khuẩn Gram (+) rộng,
E.coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hưởng bởi nisin khi màng ngoài của
chúng bị phá hỏng. Nisin được cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả đối với
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của Bacillus
spp. Và Clostridium spp. (Ouwehand & Vesterlund, 2004). Chúng được sử dụng chủ
16