Pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP
VI KHUẨN,NẤM GÂY BỆNH
1.Tầm quan trọng của môi trường:
Muốn nuôi cấy các vi khuẩn gây bệnh trong phòng thí nghiệm cần phải có các môi
trường dinh dưỡng,đó là hỗn hợp các chất đạm,đường,muối khoáng và vitamin thích
hợp,đảm bảo cho sự sinh sản và phát triển của vi khuẩn.
Việc pha chế các môi trường dinh dưỡng là một trong những khâu quan trọng nhất
trong công tác xét nghiệm vi khuẩn vì nếu môi trường không đảm bảo chất lượng sẽ cho
những kết quả sai lệch trong việc chẩn đoán,xác định các vi khuẩn gây bệnh.Vì vậy để đảm
bảo chất lượng của môi trường, việc pha chế môi trường phải được tiến hành một cách thận
trọng .
2. Các loại môi trường:
2.1. Dựa vào thành phần:
Môi trường được chia làm 2 loại: Môi trường tự nhiên và môi trường tổng hợp.
Môi trường tự nhiên là môi trường được điều chế từ các sản phẩm có nguồn
gốc động vật hoặc thực vật, ví dụ: môi trường khoai tây, môi trường nước mạch nha…
Môi trường tổng hợp là môi trường được điều chế từ các chất hoá học tinh
khiết, xác định và được lấy với những nồng độ cho trước.
2.2. Dựa vào trạng thái vật lý:
Môi trường được chia làm 3 loại:
Môi trường lỏng, ví dụ: môi trường canh thang…
Môi trường nửa lỏng nửa đặc, ví dụ: môi trường thạch mềm…
Môi trường đặc, ví dụ: môi trường thạch thường…
2.3. Dựa vào công dụng:
Dựa vào công dụng môi trường được chia ra làm 5 loại:
2.3.1. Môi trường cơ bản:
Môi trường cơ bản là môi trường phần lớn các vi khuẩn có thể phát triển được và là
nguyên liệu cơ bản để điều chế các môi trường khác. Môi trường cơ bản hay được sử dụng
nhất là môi trường thạch thường và canh thang.
2.3.2. Môi trường vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm:
Trong những trường hợp sau khi lấy bệnh phẩm không có điều kiện cấy ngay vào

môi trường nuôi cấy thích hợp mà phải vận chuyển đi xa với một thời gian nhất định, bệnh
phẩm phải được bảo quản trong môi trường vận chuyển về phòng xét nghiệm. một trong
những môi trường hay được sử dụng là môi trường Cary – Blair.
2.3.3. Môi trường tăng sinh:
Môi trường tăng sinh được sử dụng trong một số trường hợp vi khuẩn trong bệnh
phẩm quá ít, chúng ta cần làm tăng số lượng trước khi cây vào môi trường phân lập. ví dụ:
môi trường Mueller – Kauffman…
1


2.3.4.Môi trường phân lập:
Môi trường phân lập nhằm mục đích tách vi khuẩn cần tìm ra khỏi bệnh phẩm có lẫn
tạp khuẩn. vi vậy trong môi trường phân lập ngoài chất dinh dưỡng còn có các chất đảm
bảo sự phát triển ưu thế cho một loài hoặc một nhóm vi khuẩn nào đó, nhưng đồng thời lại
có chất hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của những loài vi sinh vật khác (môi trường ức
chế chọn lọc). do đó mỗi loài hoặc mỗi nhóm vi khuẩn sẽ có môi trường phân lập khác
nhau. Vi dụ: môi trường Endo, MC… sử dụng để phân lập vi khuẩn đường ruột, môi
trường Chapman để phân lập tụ cầu, môi trường Schoer phân lập vi khuẩn bạch hầu…
2.3.5. Môi trường xác định tính chất sinh vật hoá học:
Đây là môi trường sử dụng để phân biệt giữa loài vi khuẩn này với loài vi khuẩn
khác vi vây thành phần các môi trường này ngoài chất dinh dưỡng ra còn có các hoá chất
đặc biệt để phát hiện khả năng chuyển hoá của loại vi khuẩn cần định danh.
3..Các bước pha chế môi trường.
3.1 Pha chế từ các hóa chất riêng lẻ

Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất:
Phải có các dụng cụ pha chế bằng men sứ hoặc thủy tinh.Thường dung bình
nón thủy tinh có dung tích gấp đôi thể tích môi trường đủ để lắc kĩ.Không pha quá 1
đến 2 lít môi trường cho mỗi bình.Các dụng cụ phải được rửa thật sạch không lẫn các
chất khác:

Hóa chất dung pha chế phải tinh khiết,khô,không vốn cục,không đổi màu.

Cân đong:
Phải cân đúng chính xác,đặc biệt các hóa chất gây ức chế cho vi khuẩn(muối
mật,selenit,v.v.v.) thì phải dung cân có độ chính xác tới milligram.
Để tránh bỏ sót hoặc cân nhiều lần,mỗi khi cân xong thứ nào thì để riêng thứ
đó sang một bên.

Hòa tan
Phải dung nước cất hoặc nước khử khoáng để pha chế.Tùy theo tính chất của
hóa chất mà có thể hòa tan nóng hoặc lạnh.Môi trường không có thạch gelatin chỉ cần
hòa tan trong nước lạnh hoặc nóng để đảm bảo môi trường được pha chế trong điều
kiện êm dịu,nên nhớ rằng mọi môi trường đều dễ hỏng nếu đun quá sự cần thiết.
Nếu môi trường có thạch gelatin thì phải đun nóng để hòa tan hoàn toàn,khi
không còn các tiểu phần thạch dính trên thành bình.

Điều chỉnh PH của môi trường.
Mỗi loại vi khuẩn chỉ phát triển được ở một độ PH nhất định,vì vậy làm môi
trường nhất thiết phải Điều chỉnh PH thích hợp.
Việc Điều chỉnh PH của môi trường được tiến hành ở 45-50 độ C để PH cuối
cùng của môi trường sau khi hấp và để nguội không bị thay đổi nhiều.
Hóa chất dùng để thay đổi PH là Natri Hydroxit ( NaOH) 10-20% và axit
Clohidric 10-12%.Chỉ thị màu là phenol hoặc Bromphenol.
Cách pha chỉ thị màu xem phần kĩ thuật pha chế.
2



-

Làm sáng trong môi trường.
Môi trường phải được làm sáng trong để quan sát tốt sự phát triển của vi
khuẩn.
Các phương pháp làm trong thông thường là:
Đối với môi trường lỏng: lọc qua vải mịn hoặc giấy lọc.
Đối với môi trường thịt: muốn môi trường trong suốt không lờ đục thì phải
dùng Natri hydroxit điều chỉnh pH = 7,8- 8 và hấp 120 độ C trong 30 phút, để lắng cặn
rồi hấp 120 độ C trong 30 phút, để lắng cặn rồi lọc qua 2 lần giấy lọc.
Phương pháp làm sáng mầu là: một số môi trường có màu sẫm như môi
trường casein thủy ngân, canh thang, có thể ding than hoạt để loại màu. tùy theo môi
trường sẫm màu nhiều hay ít mà có thể dùng từ 5 đến 10g than hoạt tính cho 1 lít môi
trường; đun sôi 10 phút rồi lọc qua giấy lọc hoặc vải dày.

Đóng ống môi trường:
Tùy theo yêu cầu sử dụng mà có thể đóng môi trường vào ống 12, 16 hoặc
18mm hoặc bình cầu.
Dụng cụ đơn giản để đóng môi trường có thể là phễu có vòi cao su hoặc bình
lắng gạn có van đóng mở. Các dụng cụ đóng môi trường phải sạch và vô trùng. Khi
đóng chú ý không để môi trường dính vào miệng ống, lọ.

Khử trùng môi trường
- Phải khử trùng ngay sau khi đóng vào ống hoặc vào bình, vì nếu để lâu nhiệt độ
thích hợp các tạp trùng sẽ phát triển làm ảnh hưởng đến chất lượng môi trường.
- Các môi trường có ure, hyposulfite dễ bị phân hủy bởi nhiệt độ cao phải khử trùng
bằng cách lọc qua Seitz hoặc hấp cách thủy ở nhiệt độ 60-70 độ C.
- Các môi trường có trứng hoặc huyết thanh thì khử trùng ở nhiệt độ 70-80 độ C
- Các môi trường thông thường khác thường khử trùng ở 110độC trong 30 phút hoặc
121độ C trong 15 phút. Nếu bình môi trường trên 1 lít thì khử trùng 121độ C trong 20
phút.
- Sau khi khử trùng và áp suet lò giảm xuống không thì chuyển môi trường ra lò ,

không nên để môi trường hâm nóng lâu trong lò, càng không nên để môi trường qua đêm
trong lò, vì như vậy môi trường sẽ bị sẫm màu và kém chất lượng.
- ở huyện, xã nếu không có lò hấp môi trường có thể đun sôi cách thủy 100độ C
trong 30 phút lion 3 ngày, các nha bào sẽ bị phá hủy ở tỷ lệ khá cao

Đổ đĩa môi trường:
- Một số môi trường cần đổ đĩa thì sau khi hấp khử trùng, để nguội 45- 50độ C rồi
đổ lên đĩa khi môi trường nóng trên 50 độ C để tránh hơi nước đọng lại trên mặt nắp hộp
lồng.
- Trước khi rót môi trường ra đĩa, phải quay tròn bình môi trường để trộn đều.
- Các bọt khí trên bề mặt môi trường được phá bằng cách dùng một ngọn đèn ga lia
nhẹ trên mặt bọt khí hoặc dùng dầu piopet đã đốt nóng, châm vào bọt khí.

3


- Nếu bề mặt môi trường ướt thì phải làm khô trong tủ ấm ở nhiệt độ 30-40 độ C
trong 20-30 phút trước khi cấy.

Kiểm tra vô trùng:
Môi trường được để vào tủ ấm qua đêm để kiểm tra vô trùng (3 – 5% số lượng đĩa sản
xuất).

Chuẩn bị dụng cụ, hóa
chất
Cân đong
Hoà tan
Điều chỉnh pH
Làm trong sáng môi
trường

Đóng ống môi
trường
Khử trùng môi trường
Đổ đĩa
Kiểm tra vô trùng
Các bước pha chế môi trường từ các chất riêng lẻ
3.2. Pha chế bột từ môi trường khô
Hiện nay nhiều phòng xét nghiệm vi sinh được cung cấp các loại môi trường chế sẵn
dưới dạng bột khô. Các môi trường này được làm từ các nguyện liệu, hóa chất tinh khiết
nên chất lượng môi trường được đảm bảo và ổn định hơn và việc cân đong pha chế cũng
đơn giản tiện lợi hơn. Tuy nhiên việc pha chế các môi trường từ bột khô cũng phải làm
theo các bước trên và cần chú ý một số điểm sau:
- Phải dùng nước mới cất hoặc nước khoáng trung tính để pha chế.
- Nếu môi trường còn mới và pha với nước trung tính thì không phải điều chỉnh lại
PH, nhưng nếu môi trường cũ, cần kiểm tra và điều chỉnh PH quy định trên lọ môi trường.
3.3. Các hiện tượng và nguyên nhân gây sai hỏng môi trường.

4


Có nhiều hiện tường và nguyên nhân gây sai hong môi trường, chúng ta cần biết để
tìm cách khắc phục. Dưới đây là 1 số hiện tượng và nguyên nhân chính:
3.3.1.Môi trường quá cứng là do
- Thạch không thích hợp hoặc cân đong không chính xác, làm tăng lượng thạch quá
quy định
3.3.2. Môi trường có độ cứng quá thấp là do
- Thạch không thích hợp hoặc lượng thạch quá ít
- Thạch chưa được tan hoàn toàn
3.3.3.Vi khuẩn phát triển kém là do:
- Có các chất úc chế trong bình chứa, trong mẫu thử

- Vi khuẩn trong mẫu thử bị phá hủy trước khi cấy
- Liều lượng các thành phần cơ bản trong môi trường không đúng
3.3.4. Vi khuẩn phát triển quá mạnh là do
- môi trường sấy, hấp quá nhiệt đọ quy định ,làm hỏng các chất ức chế tạp khuẩn
- cấy vào quá nhiều chất thử
3.3.5.Khuẩn lạc bị nhòe là do
- bề mặt môi trường quá ẩm ướt
- cấy vào môi trường quá nhiều chất thử
- hấp môi trường quá nhiệt độ quy định, làm hỏng chất ức chế
3.4.Bảo quản môi trường
3.4.1. đối với các môi trường khô
- bảo quản ở nôi khô, tránh ánh sang, nhiệt độ từ 10 đến 12 độ c.
- Lọ môi trường phải luôn luôn được đậy chặt sau khi dùng vì nếu bị hở môi
trương hấp thụ nước sẽ làm thay đổi độ PH và bị vón cục.
Trong điều kiện lý tưởng( khô mát tối) lọ môi trường có thể được nhất 5 năm,
kể từ khi sản xuất.
3.4.2. đối với môi trường đã pha chế
- Bảo quàn trong túi băng chất dẻo nhiệt độ 4-10°C các ống môi trường có Thể đẻ
được từ 1-2 tháng.
- Nếu ở nhiệt độ phòng chỉ được 1-2 tuần.
Tài liệu thâm khảo :
1. Kỹ thuật cơ bản và đảm bảo chất lượng trong xét nghiệm vi sinh y học – NXB Y Học2008.
2. Các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh – Viện vệ sinh dịch tễ trung ương.

5


2. KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
2.1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
2.1.1. các môi trường cơ bản

+ môi trường cấy vi khuẩn ưa khí
 nước thịt ½
Thịt bò hoặc trâu 500g
Nước cất 1000ml
- Thịt bò hoặc trâu loại tốt, lọc sạch gân, mở, xay hoặc băm nhỏ, lấy 500g ngâm vào
l000ml nước đựng trong nồi nhôm hoặc men để trong tủ lạnh qua một đêm (nếu trời lạnh
có thể để bên ngoài).
-Sáng hôm sau lấy ra đun từ từ cho tới sôi, vớt hết bọt và khuấy đều. Duy trì độ sôi âm ỉ
trong 1 giờ vứi lửa nhỏ, thỉnh thoảng khuấy đều.
- lọc qua giấy lọc để loại mỡ
- them nước cất vào cho đủ 1000ml
Có thể dùng ngay, nếu muốn để dành thì đóng chai hấp khử trùng 110độ c trong 30 phút
Để giảm thể tích có thể làm nước thịt 1/1( 1 kg thịt với 1 l nước) khi dùng sẽ pha đôi 1
phần nước thịt, 1 phần nước cất
Nước thịt tốt phải có từ 500 – 600 mg axitamin trong 1 lít
Nước thịt là môi trường cơ sở đẻ pha chế canh thang thường, thạch thường v.v...
 canh thang thường
Pha chế từ nước thịt bò
- nước thịt bò 1000ml
- peptone bột 10g
- muối tinh khiết (NACL) 5g
- đun nóng khuấy đều cho tan hết muối và peptone
- điều chỉnh ph 7,8 – 8 bằng dung dịch NAOH
- hấp 120 độ c trong 30 phút và để nguội cho lắng cặn
- chắt lấy phần nước trong, điều chỉnh PH 7,4 – 7,6
- đun sôi lại rồi lọc qua giấy lọc cho trong
- đóng ống 16mm, mỗi ống 5mm. hấp khử trùng 110độ c trong 30 phút.
Pha chế từ cao thịt bò:
- cao thịt bò 5g
- peptone bột 10g

- muối tinh khiết 5g
- nước cất 1000ml
- đun nóng, khuấy đều cho tan hết các chất
- điều chỉnh ph 7,4-7,6 rồi lọc trong
- đóng ống 16mm, mỗi ống 5ml, hấp khử trùng 110độc trong 30phut.
Canh thanh thường dùng để cấy các loại vị khuẩn ưa khí nói chung, thường dùng để kiểm
tra vô khuẩn.
6


 Thạch thường
Pha chế từ nước thịt bò:
- nước thịt bò 1000ml
- peptone bột 10g
- muối tinh khiết 5g
- thạch sợi 20g
ph=7- 7,2
- đun nóng nước thịt, peptone, muối cho tan
- điều chỉnh ph từ 7,8-8 bằng dung dich NAOH 20%
- cho thạch đã rửa sạch, cắt nhỏ vào
- hấp 120độ c trong 30 phút
- kiểm tra lại ph xem đã đạt yêu cầu chưa 7,4-7,6
- lọc qua bong gạc khi môi trường còn nóng rồi phân phối vào bình cầu 250ml
hoặc vào ống nghiệm mỗi ống từ 5-6ml
- hấp 110độ c trong 30 phút, các ống nghiệm phải để nằm nghiêng cho thật đông
Pha chế từ cao thịt bò
- Cao thịt bò
5g
- Pepton bột

lOg

- Muôi tinh khiết (NaCỈ)

5g

- Thạch bộl

18-20g

- Nước cất
1000 ml
Đun sôi cho tới khi các hóa chất tan hoàn toàn. Chú ý khuấy để thạch không bị khô cháy
(có the làm tan thạch trong nồi hấp 100°c trong 10 phút)
Đicu chỉnh pH 7,4 - 7,6
đóng ống nghiộm mỗi ống 5,6 ml hoặc binh cầu 250 ml
Hấp khử trùng 110°c trong 30 phút, đem ra để ống môi trường nằm nghiêng cho thạch
dông.
Môi trường làm từ cao thịt thì tinh khiết hơn nước thịt tươi nên không phải qua giai đoạn
hẩp lắng cặn 120°c trong 30 phút.
Thạch thường là môi trường cơ sở để chế ra nhiều loại môi trường khác.
 canh thang glucoza 1%
Canh thang thường1000 ml
Glucoza
10g
Hòa tan glucoza trong canh thang, điều chinh pH = 7,6.Đóng ống môi ông 5-6 ml. Hấp
110°c trong 30 phút
Môi trường dùng nuôi cấy vi khuần ưa glucoza
 thạch mềm giữ chủng

7


- Pepton

10g

- Muối tinh khiết

5g

* Cao thịt

3g

- Cao mcn

6g

- Thạch

6g

đun sôi khuấy đều hòa tan hoàn toàn các chất. Điều chinh pH = 7,6. Đóng ông 12 mm, mỗỉ
ổng 3-4 ml. Hấp 110°c trong 30 phút.
2.1.Môi trường cấy vi khuẩn kị khí.
2.1.1.Canh thang V.F. (Thịt-Gan, Viandc Foỉc) :
Thịt bò xay
Gan bò xay
Pcpsin hiệu giá 5o0

Axít clohydric nguyên chất
Nước cất nóng 600C
Cho tất cà vào nồi men, để tủ ấm 48-50°C trong 18 giờ, cứ 2 giờ khuấy một lần, sau đó
đem đun sôi từ từ lên 80°c trong 20 phút để hủy mcn pepsin. Diều chỉnh pH = 7,4, lọc và
hấp 120°c trong 30 phút.
Cứ một lít môi trường trên thêm vào 2g glucoza, lọc trong, đóng vào ống co, mỏi ống cho
1 bi thủy linh. Hấp 110°c trong 15 phút.
Chú ý : Nếu không có pcpsin, thì có the thay lOg pcpsin hằng 2000g dạ dày lợn băm nhỏ.
Trước khi dùng nên đun sôi cách thủy ống môi trường đê làm mất không khí có thể
sinh ra trong môi trường trong quá trình bào quản.
2.1.2.- M ôi trường thịt băm :
Canh (thang V.F (ph = 7,4)
12 ml
Thịt băm đã nấu chín
0,5g.
Đóng vào ống nghiệm, hấp 110°c trong 30 phút Thịt băm có khả năng khử oxy trong môi
trường.
Cách làm thịt băm :
Thịt bò đã ép hết nước, cho vào chai rộng miệng, đậy nút bông gạc, hấp 120°c trong 30
phút. Bảo quản ở 4°c. Trước khi dùng phải luộc bã thịt trong nước cất, ép hết nước thừa và
cho vào mỗi ống môi trường độ 0,5g.
Môi trường gan cục:
Canh thang V.F (pH = 7,4) 12ml
Gan bò luộc chín thái nhỏ hạt lựu
0,5g Đóng vào ống nghiệm. Hấp 110°c trong
30 phút
8


Gan bò cỏ khả năng khử oxy trong môi trường.

2.1.3.Thạch Veillon (Vây-ông) :
Thạch thường
1 lít
Glucoza
15 g
Kalinitrat 0,5 g
. Đun sôi thạch, cho glucoza và kali nitrat vào. Lắc đều rồi lọc
phân phối vào mỗi ống 15ml (nếu ống có đường kính nhỏ 8mm thì cho vào 7 ml).
. Hấp 110°c trong 20 phút. Để ống thẳng đứng cho thạch đông
không để nghiêng. Trước khi dùng phải tái sinh bằng cách đun sôi cách thủy 10 phút.
+ Môi trường dùng nuôi cấy chung cho vi khuần ưa khí và ki khí.
2.1.4. Môi trưòng thiognicolat:
- Pcpton bột
15g
- Cao mcn

5g

- Glucoza

5g

- L-cystin

' 0,5g

- Muối tinh khiết (NaCl)

*• 2,5g

- Natri thioglycolat

0,5g

- Thạch

0,5g

- Rcsa/urin

0,001 g

- Nước cất
1 lít
. đun nóng để hòa lan các chất, trừ glucoza, thiognicolat và rcsazurin. Riêng L-cyslin hòa
lan trong ít nước cất có pha thêm 5 - 6ml dung dịch natri hydroxyt 10% rồi đồ vào hỗn hợp
trên.
. Kiềm hóa pH = 8 - 8,2 bằng natri hiydroxyt
. Đun sôi 5 - 1 0 phút, khuấy đều cho tan hết thạch rồi bù nước vào cho đủ thể tích ban
đầu; thêm glucoza, thioglycolat,
. Lọc qua 2 lăn giấy lọc hoặc qua vải
. Điều chỉnh ph = 7,2 - 7,3, thêm rcsa/urin
đóng ống lOml.hấp khử trùng 110°c trong 30 phút
Hiệnn nay tại nhiều phòng thí nghỉệm lớn trên thế giới môi trường thioglycolat được dùng
đẻ thử vô trùng các chế phẩm sinh vật học và dược phẩm để tìm các vi khuần ưa khí và kị
khí.
Chú ý:
Môi trường không đề quá 7 ngày ở nhiệt độ phòng

9

-

Nếu là môi trường mới pha thì không phải đun lại
Trước khi dùng, nếuu môi trường đã để 2 - 3 ngày thì phải đun lại.
Môi trường không được dùng nếuu nó đã trở nên hồng và mầu hồng không mất di khi đun
sôi.
b/ CÁC MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP :
+ Môi trường phân lập vi khuẩn ưa khí.
7- Môi trường phân lập tụ cầu :
Môi trường Chapman (Sápman)
Thạch thường
1 lít
Muối tinh khiết
(NaCl)
65 g :
Dường manìt
10 g
Đỏ phcnol DD
1% 3 - 5 ml
. đun sôi thạch, điều chỉnh pH = 7,0 - 7,2, cho muối đường manit và dung dịch đỏ phcnol
vào.
. đóng vào ống nghiệm như đóng ống thạch thường. Hấp 110°c trong 30 phút. Ống môi
trường có màu đỏ da cam.
Tụ cầu gây bệnh có khả năng sử dụng đường manil làm cho môi trường bỉ axit hóa do đó
màu môi trưởng chuyển sang vàng.
Cách pha dung dịch đỏ phenol:
-Đỏ phenol .
•

lg
-Nước cất 100 ml
Hòa tan đỏ phcnol trong nước căt nóng 70°c, lọc qua giấy lọc, đựng lọ nút kín.
2« môi trường phân lập liên cầu và phế cầu:
Thạch máu:
Thạch thường
150 ml
Máu thỏ hoặc cừu 15 ml
Đun cho thạch tan chảy ra, để nguội 50°c, thêm máu đá loại tơ huyết và vô khuẩn vào bình
thạch. Quay tròn bình cho máu hòa tan đều trong thạc. Màu thạch đỏ tươi là tốt. Nếu màu
ngả đen là máu đã quá chín. Đóng ngay vào ống nghiệm l8mm bằng pipete vô khuần, mỗi
ống 10 ml.
Thạch máu có Gentainyxin :
Cách làm như thạch máu nhưng có thêm gêntamyxin 5 mcg trong 1 ml môi trường.
3- Môi trường phân lộp não mô cầu và lậu cầu :
Canh thang máu.
Một ống canh thang thường + 15-20 giọt máu thỏ hoặc cừu vô khuẩn.
Thạch máu Sôcôla (Chocolate) :
Làm như thạch máu rồi đun cách thủy 80°c trong 10 phút. Chú ý lắc tròn bình thạch luôn
để nguội 45 - 50°c đồ đĩa.
4Môi trường phân lập Pasteurella tularensis :
10


Môi trường trứng.
Dung đjch Natri clorua 9%
40 ml
Lồng đỏ trứng'
60 ml
Cho vào một bình nón vô khuằn lắc kĩ, đóng ổng 10 ml đề nghiêng hấp 75°c trong 1 giờ.

Thạch natri sunlfit
Thạch thường pH = 7,4 100 mỉ
Dung dịch natri sulíit 10%
0,25 ml
Dung dịch tím gcnlian 1 %o
2 - 4 ml
' Máu cừu hoặc huyết thanh
2 ml
Cho các dung dịch hóa chất vào bình thạch đun cho tan hết để nguội 45 – 50 0 c, cho thêm
máu cừu hoặc huyết thanh lắc đều tránh nổi bọt, đổ ra đĩa hoặc đóng vào ống nghiệm.
Chú ý : lượng tím gentian không cho quá qui định trên vì sẽ ức chế các loại vỉ khuẩn, kề cả
vi khuẩn dich hạch không mọc được.
Môi trường phân ìập Brucella:
Thạch Tryptosc (Tryptô):
- Tryptosc
20g
- Glucoza
lg
- Natrỉ Clorua
5g
- Thiamỉn Clorhyđrat

0,005g

- Thạch

15g

- Nước cất vừa đủ
1 lít

Đun cho tan thạch rồi cho các hóa chất vào, điều chỉnh pH = 7,2 - 7,4. Hấp 110°c trong 30
phút.
6-Môi trường phân lập Hacmophilus:
Thạch máu Socola có bacitraxin.
Làm như thạch máu socola có thêm bacitraxỉn 300 mcg trong 1 ml môi trường.
7- Môi trường phân lập vi khuẩn đường ruột:
Các vi khuẩn đường ruột lẩy từ các bệnh phẩm trước khi đưa vào phân lập cần cấy truyền
qua một số môi trường vận chuyển bảo quản và môi trường tăng sinh.
+ Môi trường vận chuyền và bảo quản.
Môi trrờng Cary - Bỉair:
Natri thioglycolat
Dinalri Pholíat (Na2HPƠ4)
Nalri Clorua
Thạch
Dung dịch Canxi Clorua (CaCb) 1%
Nước cốt vừa dủ
11


pH = 8-8,2
. Đun sôi cách thủy cho tan hết các chất và môi trường trở nên trong (không đun sôi trực
tiếp). Đề nguội 50°c thêm 9ml dung dịch Canxi Clorua 1% mới pha trong nước.
. Điểu chỉnh pH = 8,4 với Natri Hydroxyt 10%. Đóng ống 16 mm, mỗi ống 8 ml. Khử
trừng trong lò hấp 100°c hoặc đun sôi cách thủy trong 15 phút.
Môi trường Cary - Blair được dùng đểbảo quản và vận chuyển các vi khuẩn Salmonclla,
Shigclỉa, E.Coli, Vibrio.
Dung dịch đệm Glyxerin.
Glyxerin trung tính
1000 ml
Nước muối sinh lí 8,5%0

2000 ml
Điều chỉnh pH = 8 với dinatriphotíat (Na2HPƠ4). Hấp khử trùng 110°c trong 30 phút.
Dung dịch đệm glyxcrin dùng đề vận chuyển Salmonclla, Shigclla, E.Coli. Không dùng
cho Vibrio và Campylobacter.
+ Môi trường tăng sinh :
Môi trường Mueller - KauỊf mann.
. Chuẩn bị các dung dịch.
Dung dịch I: Canh thang thường
90 ml
Canxi cacbonat
5g
Cho canxi cacbonal vào bình cầu có canh thang. Hấp 110°c trong 30 phút
Dung dịch II: Natri hyposunif 50g
Nước cất 100 ml
Hòa tan, lọc qua nến lọc, dựng vào lọ vô trùng. Nếu không có nến lọc thì khử trùng trong
lò hấp 100°c trong 30 phút.
- Dung dịch III: Iot
25 g
Kaliuni Iodua
20 g
Nước cất 100 rnl
Trộn đều iot và kali iodua trong cối sứ, cho dẫn nước vào khuấy đều cho tan hết, đựng
trong lọ màu có nút thủy tinh dùng dần.
Dung dịch IV: Xanh brilỉan (Vert Briỉỉiant) Nước cất
Cho Xanh brilỉan vào cối, nghiền nhỏ, đồ dần nước cất vào khuấy cho tan
0,1 g 100 ml hết.
. Pha môi trường hoàn chinh.
Trong bình cầu đựng dung dịch I, dùng ống hút lấy lOml dung dịch II, 2 ml dung dịch III,
1 ml dung dịch IV, lắc đều, đề lắng cặn 24 giờ, sau đó đóng vào ống nghiệm, mỗi ống 5
ml.

Môi trường này có tác dụng hạn chế phần lớn các tạp khuằn và thích hợp cho Salmonella
phát triền. Từ môi trường này sẽ cấy truyền qua các môi trường đặc như ss, Endo để có
khuần lạc riêng biệt. Muốn tìm Shigella thì cấy thẳng vào các môi trường đặc nói trên,
không cần qua môi trường Mueller KauíTmann.
12


+ Môi trường Tetrathionat:
Dung dịch cơ bản :
I Pepton
5g
Muối mật 1 g
Canxicacbonat
10 g
Natrihyposuníìt 30 g
Nước cất
Đun nhỏ để hòa tan, điều chỉnh pH - 7,2 - 7,4. Hấp 100°c trong 30 phút. Trước khi dùng
cho 2 ml dung dịch iot dưới đây vào 100 ml dung dịch cơ bản.
Dung dịch iot:
-Iot
6g
- Kali iodua
5g
- Nước cất
20ml
Môi trường tctrathionat dùng để làm phong phú Salmonclla Nước peplon kỉềmt mặn :
Pcpton
10g
Natri Clorua
15g

Glyxerỉn
1,25g
Nước cất
1000ml
Hòa tan các chất, điều chỉnh pH = 9 - 9,2 với dung dịch nalri hydroxyt 40%. Đóng Ống,
hấp 110°c trong 30 phút. Nước pcptone kiềm mặn dùng để làm phong phú ỉbrỉo.
Môi trường Seỉcnil.
Pcpton
5g
Lactoza
4g
Photíat bipotasic (K2HPO4) 10g
Natrỉ sclcnỉt
4g
L-cyslin
0.01g
Nước cất
1000ml
Hòa (tan các chất trong nước cẩt, lọc qua nến lọc. Đóng vào ống nghiệm vô khuẩn, mỗi
ống 10 ml.
Môi trường này có khả năng tìm thấy Salmonclla nhiều hơn là môi trường Mucllcr
Kauíímann.
+ môi trương phân lập:
Thạch Bitmut sun/ lí (Wilson Blaỉr):
- Cao thịt
5g
- Pepton

10 g

- Glucoza

5g

13


- Natri photíal disodic (Na2HPƠ4)

4g

• Fcrơ suníat

03 g

- Bỉlmut suníit

8g

- Xanh brilian (dang dịch 0,5% trong nước)

5 ml

* Thạch

20g

- Nước cất

1000 ml

Cho tất cả các chất vào nước, đun sôi và khuấy liên tục tới khi các chất hòa tan hoàn loàn,
điều chỉnh pH 7,4 - 7,6 chất kết tủa được tạo thành mà không hòa tan, để nguội 45 - 50°c,
trộn đều và đồ đĩa. Môi trường này dùng dề phát hiện vi khuẩn nhóm Salmonella.
Môi trường Dezaxicolat Xiírat Lactoza (DCL Agar):
Pcpton
5g
Cao thịt
5g
Lactoza
10 s
Nalri Xitrat 8,5 g
Nalrỉ hyposuníit 8.5g
Feric Xilrat 1 8
Natrỉ dczoxycolat 5 g
Đỏ trung tính dung dịch 1%
2,5 ml
Thạch20 g
Nước cất 1000 ml
- Cho peplon, cao thịt, thạch vào nước đun tan hoàn toàn, rồi thêm lactoza, nalri Xỉtrat,
Fcric Xitrat, dczoxycolat.
. Điều chỉnh pH = 7,3 - 7,5 rồi thêm đỏ trung tính vào.
. Đóng bình cầu 200 ml. Hấp 110°c trong 15 phút đề nguội 80°c rồi thêm một cách vô khuẩn
10 ml dung dịch Natri hyposunttl 17% (17g Na hyposuníit pha trong 100 ml nước cất).
Trộn đều đồ đĩa.
Môi trường này dùng đc phân lập Samonella và Shigclỉa.
Môi trường En do :
Pepton
10 g
K2HPO4 3,5 g

Natri suníìt 2,5 g
Lactoza
10 g
Thạch
20 g
Dung dịch Fuchsỉn 10% trong cồn 90° 4 ml
14


. Đun sôi hòa tan các chất . Điều chinh pH = 7,6. Đóng bình cầu mỗi bình 100 ml. Hấp
110°c trong 20 phút. Đề nguội 45 - 50°c rồi đồ ra hộp lồng. Môi trường có màu hồng nhạt.
Môi trường Endo dừng để phân lập E.Coli. Trên môi trường này E.Coli có khuẩn lạc màu
đỏ với một nước bóng kim loại.
Môi trường McConkey (MăcConkây) :
*
■
- Pepton
20g
- Lactoza

10 g

- Muối mật

1,5 g

- Natrỉ Clorua

5g

- Thạch

20g

- Dung dịch đỏ trung tính 1%

0,6 mỉ

- Nước cất

1000 ml

. Đun nhỏ lửa, khuẩy đều để hòa tan các chất
. Điều chinh pH = 7,2 - 7,4 rồi cho đỏ trung tính và tím tinh thề vào.
. Phân phối vào bình cầu, hấp 110°c Irong 30 phút. Đc nguội 45 - 50°c rồi ra hộp lồng.

Môi trường này dùng để phân lập Samonclla, Shlgell;
1
Môi trường ss (Salmonclla - Shigcỉla Algar) :

E.Coli.

- Cao thịt

5g

- Pcpton • 'V

5g

- Lacto/a

10g 1

- Muối mật

8,5 g 1

- Natri Xỉtrat

8,5 g

- Natri hyposuníỉt

8,5 g

15


-SátXitrat

1g

- Xanh brilian (dung dịch 0,1% trong nước)

0,3 ml •

• Đỏ trung tính (dung dịch 1% trong nước)

2,5 ml

-

Nước cất 1000 ml
. đun sôi nhỏ lửa, khuẩy đều để hòa tan các chất.
. Điều chỉnh pH = 7 - 7,2. Để nguội 45 - 50°c rồi đổ ra hộp lồng. Không hấp.
Môi trường này dùng để phân lập Salmonclla và Shỉgclla.
Môi trường TCBS (Thiosulíate - Citratc Bile Saks) :
- Pcpton
10 g
- Cao men
5g
- Natri Xitrat

10 g

- Nalri ihiosuníat

. 10g

- Mật bò khô

5g

- Natri cholatc

3g

- Feric Xitrat

ig

- Natri Clorua

10 g

- Sacaroza

20g

- Xanh bromothymol (dung dịch 0,2%)

20 ml

- Xanh ihymol (dung dịch 1%)

4 ml

- Thạch

15 g

- Nước cất vừa đủ

1 lít.

Đun sôi khuấy đều tới khi tan hoàn toàn các chất. Không hấp. Để nguội 45-50°c, điều
chỉnh pH = 8,6 rồi đồ ra hộp.
Môi trường này dùng đè phân lập Vibrio cholerae có khuẩn lạc mầu vàng.
Pha dung dịch xanh bromthymol 0,2%:

Cho 2,5 ml dung dịch NaOH 0,1N vào 47,5 ml nước cất rồi thêm 0,lg xanh bromolhymol.
Pha dung dịch xanh thymoy 1%:
Cho 2,2 ml dung dịch NaOH 0,1N vào 7,8 ml nước cấl rồi thêm 0,lg xanh thymoy
- Pcpton
10g

16


- Natrỉ Clorua

5g

- Cao thịt

4g

- Thạch

20g

- Nước cất
1 lít
Đun sôi khuấy đều để hòa tan hoàn toàn các chất. Điều chỉnh pH = 8,4, đóng vào bình câu,
hấp 110°c trong 30 phút. Đề nguội 45-50°C rồi dồ ra hộp tông.
Môi trường này dùng để phân lập Vibrio cholerae. Trên môi trường này khuẩn lạc của V.
cholerac trong suốt. Còn các vi khuẩn đường ruột khác thì cỏ khuẩn lạc đục và lớn hơn.
Mói trường xanh brillian
- Cao thịt
3g

- Pcpton
10g
- Natri clorua

5g

- Lactoza

lOg

- Sacaroza

lOg

- Đỏ phenol (dung dịch 0,2%)

40 ml

•Xanh brilian (dungdịch 0,5%)

2,5 ml

- Thạch

20g

- Nước cất

960 ml

Cho tất cả các thành phần vào nước, đun sôi và khuấy liên tục tới khi các chất hòa tan hoàn
toàn. Đề nguội 50-60°C, điều chỉnh pH = 7-7,2, đóng bình cầu hấp 110°c trong 30 phuts, đc
nguội 45-50°C rồi đổ ra hộp pctric.
Môi trường xanh briliar dùng để phân lập Salmonclla. Trênn môi trường này Salmonclla có
khuẩn lạc mầu hồng nhạt mờ, đường kính 1-3 mm.
8- Môi trường phân lập trực khuẩn bạch hầu:
Môi trường huyết thanh đông (Lô’eff icr) :
Huyết thanh bò300 ml
Canh thang glucoza 1% 100 ml
Pha canh thang glucoza 1%, lọc trong, hấp 110°c trong 30 phút.
Hỗn hợp canh thang và huyết thanh theo công thức, lọc qua phễu có gạc đã hấp khử trùng.
Đóng ống 18 mm, tránh không có bọt trong ống, xếp nghiêng vào lò hấp, ngày đầu 75°c
trong 1 giờ, ngày hôm sau 75°c trong 30 phút.

17


Kiểm tra vô trùng ở 37°c trong 24 giờ.
Bảo quàn ở tủ lạnh.
Chú ý: Nhiệt độ nóng quá môi trường sẽ bị sủi bọt.
Môi trường Schroer (Xkrô-e) :
Thạch thường pH — 7,5-7,6
Dung dịch cơ bản
Máu cừu đã loại tơ huyết
Dung dịch kali tcnlurit 5%
Dung dịch cơ bản gồm có:
Canh thang thường
100ml
Pepton bột
18g

Natri axetat
0,62g
Glyxcrin
4ml
Hấp 110°c trong 30 phút.
Cách làm môi trường:
Đun sôi thạch cho tan đều, cho dung dịch cơ bản vào khi nhiệt độ xuống 45°c cho dung
dịch Kali tenlurit và máu cừu vào lắc thật đều, đổ ra hộp lồng. Tất cả các công tác pha chế
môi trường đều thực hiện trong đicu kiện vô khuẩn. Sau đó để tủ ấm 37°c trong 24 giờ để
kiểm tra vô khuẩn rồi đề tủ lạnh dùng dần.
Dung dịch kali tenlurit pha với nước cất vô khuẩn, pha xong không cần khử khuẩn, bảo
quản ở tủ lạnh.
Môi trường phân lập trực khuân lao:
Môi trường Lơvcnxlen (Lổwenstein):
* Dung dịch cơ bản
150 ml
- Bột khoai tây hấp

6g

- Dung dịch xanh malachit 2%

12 ml

-Trứng gà

9-10 quả

Dung dịc cơ bản gõm có:
- Asparagin

4

- Kali hydrophoơa! (KII2PO4)

1g

- Manhcgi sunfat

1g

- Natri Xitral

1g

- Glyxcerin

10 ml

g

18


- Nước cất

1 lít

Đun nhỏ lửa và khuấy đều cho tới khi tan hết các hóa chất. Điều chỉnh pH = 7,2 (nếu pH
cao thì hạ bằng axit xilric, nếu thấp thì cho ammoniac). Lọc qua giấy lọc cho thật trong.

Phân phối vào bình cầu mỗi bình 150 ml. hấp 110°c trong 30 phút.
Cách làm môi trường :
Trứng gà tươi, soi qua đèn soi trứng để kiểm tra nếu quả nào đốm đen thì loại ra.
Dùng bàn chải xà phòng cọ thật sạch, để ráo nước rồi ngầm trong cồn 90° trong 30 phút.
Lấy một ống có 6g bột khoai tây đã hấp khừ trùng 110°C/30 phút, đổ vào bình cầu
có 150 ml dung dịch cơ bản lắc đều rồi dun sôi cách thủy cho tới khi bột được hòa tan
dung dịch trờ nên sền sệt thì lấy ra.
Vớt trứng ra, đập từng quả vào trong cốc thủy tinh đã sấy, đánh tan đều rồi đổ vào
bình cầu có dung dịch cơ bản và bột khoai tây. Thêm xanh malachil dã hẫp rồi lác đều. Lọc
qua vải gạc đã khử khuẩn rồi đỏng vào ống nghiệm l8mm, mỗi ống 6-7 ml, tránh có bọt
trong ống. Để nằm nghiêng trong lò hấp cho nhiệt độ lên 85°c trong 45 phút. Để tủ ấm
37°c trong 24 giờ. Kiểm tra vô khuẩn, để tủ lạnh dùng đần.
+ Môi trường phân lập vi khuẩn kị khí.
/- Môi trường Wilson Blair
Môi trường chọn lọc của Beercns để phân lập Risiclla.
Thạch V.F glucoza800 ml
Mật bò lọc 200 ml
Natri azit 0,lg
Điều chỉnh pH = 7,4, phân phối vào ống nghiệm 18mm mỗi ống 6-7 ml. Hấp 110°c trong
30 phút.
Môi trường natri azit và lục ánh :
Để phân lập vi khuẩn loài Sphacrotilus, Vcillonella và Fusobacterium.
Cứ mỗi ống thạch đũa V.F glucoza đã đun chảy, cho thêm 0,5 ml dung dịch Natri azit và
lục ánh.
Cách pha:
Nalri azit 0,10g
Lục ánh
8 mg
Nước cất 100 ml.
C/MÔI TRƯƠNG PHÂN BIỆT HAY XÁC ĐỊNH:

Môi trường phân biệt là loại môi trường dùng để nghiên cứu những đặc tính sinh vật hóa
học để xác định các loại vi khuẩn gây bệnh.
Một số môi trường dược dùng hiện nay là :
1 - Môi trường Kligler ( K I A ) :
I
Cao thịt
3g
Cao men
3g
19


-

Pepton
2()g
Natri Clorua 5g
Lactoza
lOg
Fcric Xitrat 0,5g
Glucoza
lg
Natri thiosunfat 0 5g
Đỏ phenol dung dịch 0,5%
6 ml
Thạch 2g
-Nước cất 1 lít.
. Cho thạch vào nước, đun sôi khuấy liên tục cho tới khi tan hoàn toàn (hoặc hấp 100°C),
lần lượt thêm các hóa chất vào để hòa tan.
. Điều chỉnh pH = 7,4, rồi thêm 6 ml dung dịch đỏ phenol 0,5%, khuấy đều, phân phối vào

ống nghiệm 12 mm mỗi ống đóng 3 ml, hấp 110°c trong 30 phút, rồi để ống môi trường
nằm nghiêng, sao cho mặt nghiêng dài khoảng 2 cm. Môi trường dùng để tìm tính phân
giải đường lactoza, glucoza, tìm khí hydro sunfua và sinh hơi.
2- Môi trường Ure Indol:
- L-Tryptophan
3g
- Photfat monopotasic

lg

- Photfat dipotasic

1g

- Nalri Clorua

5g

- ure

20g

- Dung dịch đỏ phenol trong cồn

2 ml

- Nước cất

1 lít

Cách pha dung dịch đỏ phenol:
hòa lan 0,25g đỏ phenol trong 50 ml cồn 90° c và thêm 50 ml nước cất.
Cách pha môi trường:
đun nóng 50-60°C để hòa tan các hóa chất, điều chỉnh
ph
=
7,2, thêm dung dịch
dỏ phenol, lọc qua Seitz rồi đóng vào ống nghiệm vô khuẩn mỗi ống 1-2 ml
.Có thể khử khuẩn ở lò hấp : 75°c trong 1 giờ,
hôm sau : 65°c trong 30 phút
Môi trường dùng đề tìm tính phân giải ure và tìm indol. Sau khi cấy 24 gỉờ nếu mầu đỏ da
cam trở thành đỏ cánh sen là dương tính, nếu vẫn đỏ da cam như cũ là âm tính, ngay sau đó

20


nhỏ 2 giọt thuốc thừ côvắc vào nếu có ỉndol thì sẽ thấy vòng đỏ tươi xuất hiện. Nếu không
cố ỉndol thì vòng không có màu xuất hiện.
3'Môi trường mannit di dộng:
Phepton 20g
Kali natri 1g
Manittol
10g
Dung dịch dỏ phenol 1%trong nước 4ml
Thạch 4g
Nước cất 1lit
. đun sôi khuấy đều để hòa tan hoàn toàn các hóa chất. Điều chỉnh pH = 7,6. Thêm dung
dịch đỏ phenol, đóng vào ống 12mm, mỗi ống 3 ml, Hấp 1l0°c trong 3 phút.
. Môi trường này dùng để tìm tính di dộng và tính phân giải đường mannit. Nếu đường
mannit bị phân giải thì môi trường bị axit hóa do đó màu môi trường sẽ chuyển từ đỏ sang

vàng.
4. Môi trường Ornithin Decacboxylaza (ODC)
Acginin dehydrolaza (ADH) và môi trường lysine decacboxylaza (LDC):
ODC
ADH
LDC
L- lysine monoclohydray
5g
L- ocnithin
5g
l- acginin
5g
cao men
3g
3g
3g
glucoza
1g
1g
1g
bromocresol( 1,6g/100ml cồn 95°)
1ml
1ml
1ml
Đun nóng nhẹ để hòa tan các hóa chất. Điều chỉnh pH = 6,5. Thêm chỉ thị bromocresol,
môi trường có màu đỏ ánh tím. Lọc trong, đóng vào ống 12mm mỗi ống 1-2 ml. Hấp 1 10°c
trong 15 phút.
Những môi trường này dùng để tìm tính khử cacboxyl và khử hydro. Nếu phản ứng dương
tính thì môi trường bi kiềm hóa và chuyển sang màu tím.
- Nalri Clorua

.5g
- Manhesi sunfat
0,2g
- Amoni photfat (NH4)2HPƠ4

1g

- Dipotasic photfat (K2HPO4)

1g

- Natri Xitrat

2g

- Thạch

20g

- Nước cất vừa đủ

1 tít

21


- Xanh bromolhymọl (dung dịch.10 ml.
1,5% trong cồn 90°)
Đun sôi nhỏ lửa, khuấy đều tới khi các hóa chất tan hoàn toàn. Điều chỉnh pH = 7,2. Thêm
dung dịch xanh bromothymol. Môi trường có màu xanh lá cây. Đóng ống12mm mỗi ống 3

ml. Hấp 110°c trong 30 phút. Đem ra để nghiêng cho môi trường đông lại.
Môi trường này dùng để tìm các vi khuẩn chuyển hóa Xitrat. Nếu phản ứng dương tính thì
môi trường sẽ chuyển sang màu xanh nước biển.
6/ Môi trường Basikow:
Cao thịt
5g
Pcpton
10g
Natri Clorua 5g
Xanh bromothymol (dung dịch
1,5% rong cồn)
1,5 mỉ.
. Đun nóng, khuấy đều để hòa tan hóa chất . Điều chỉnh pH = 7,2
. Thêm xanh bromothymol, môi trường có màu xanh lá cây.
.Lọc, đóng ông 12mm, mỗi ống 3 ml cố 1 ống hơi. Hấp 110°c trong 30 phút
Môi trường Basikow dùng để thử tính lên men đường và sinh hơi. Khi dùng thì thêm 0,2
ml dung dịch đường, để 37°c trong 24 giờ. Nếu phảm ứng dương tính thì môi trưởng
chuyển sang màu vàng. Phải theo dõi trong 2 tuần hiện tượng mới dứt khoát đối với vi
khuẩn lên men chậm.
Nồng độ các dung dịch đuờng cần pha để dùng với môi trường Baslkovv.
Đường Mannil: 20%
Đường
Lactoza
:
20%
Glucoza: 20%
- Mannoza: 20%
Makoza: 30%
- Ramnoza: 10%
Sacarôza: 30%

- Arabinoza: 30%
7- Môi trường Clark-Lubs.
Pepton
5g
Bipotasic pholíat (K2HPO4) 5g
Glucoza
5g
Nước cất
1 lít
đun sôi để hòa tan các hóa chất, điều chỉnh pH = 7,5 lọc trong. Đóng ống 12mm, mỗi ống 3
ml, hấp 110°c trong 30 phút.
Môi trường Clark-Lubs dùng để tìm phản ứng đỏ melhyl và phản ứng axctyỉ melhyl
cacbinol (AMC).
Cách tìm phản ứng đỏ metliyl.
Cấy vi khuẩn vào môi trường Clark-Lubs, để tủ ấm 37°c trong 4 ngày, nhỏ
2-3 giọt dung dịch đỏ methyl 0,5% trong cồn 60°, nếu dương tính sẽ có màu đỏ, âm tính có
màu vàng nhạt hoặc không màu.
22


Cách tìm phản ứng Axetyl Meihyl Cacbinol (A MC)
Cấy vi khuẩn vào môi trường Clark-Lubs, đề tủ ấm 37°c trong 24 giờ, thêm 5 giọt dung
dịch NaOH 16% trong nước, lắc nhẹ. Nếu dương tính sẻ có màu đỏ, nếu âm tính sẽ có màu
vàng nhạt.
B- MỒI TRƯỜNG DÙNG TRONG CÔNG TÁC KIỀM TRA NƯỚC, THỰC PHẦM
Canh thang lactoza loãng
Cao thịt
5g
. - Pepton 10g
Natri Clorua 5g

Latza 5g
-Nước cất 1 lít
đun sôi hòa tan các hóa chất. Điều chỉnh pH = 7,2. Lọc trong, phân phối, vào ống nghiệm,
mỗi ống 10 ml, có ống Dơ- Ham. Hấp 110°c trong 30 phút.
2/Canh thang Lactoza đặc.
Cao thịt
5g
Pepton
10g
Natri Clorua 5g
lactoza.
lOg
Nước cất . 1 lít
Pha chế như canh thang loãng.
Canh thang zactoza - mật bò loãng:
- Cao thịt
5g
- Pcpton

10g

- Natri Clorua

5g

- Loctoza

10g

- Mật bò khô

1.5g

- Nước cất

1 lít

- Xanh brilian (dung dịch 1% trong0,2 ml.
cồn)
đun sôi hòa tan các chất. điều chỉnh pH = 7,4. Thêm dung dịch xanh brilian. Lọc trong,
đóng ống 16mm, mỗi ống 5-6 ml có ống Đơ-han. Hấp 110 c trong 20 phút.
4- Canh thang lactoza mật bò đặc:
- Cao thịt
5g

23


- Pepton

10g

- Natri Clorua

5g

- Giucoza

20g

- Mật bò khô

3g

- Xanh briỉian (dung dịch 1%
Irong côn)

0,4 m!

- Nước cất
1 lít.
Pha chế như canh thang loãng nhưng đóng ống 18 mm mỗi ống 10 ml có ống Dơ-ham. Hấp
110°c trong 20 phút.
5/Môi trường Uyn-xơn-Dle (wilson Blair)
(xct nghiệm nước uổng tìm CL. Welchi) :
Thạch thường
1 lít
Glucoza
20g
Đun thạch và glucoza cho tan đều, đóng ống to 20 ml mỗi ống. Hấp 110 c trong 30 phút.
6/Thạch Bilniut sunf it của Wiỉson Blair.
C- MÔI TRƯỜNG NƯỒI CẤY NẤM MỐC.
I/Môi trường Saboiiraud 2% (Saburô) :
Pepton
10g
Glucoza
20g
Thạch20g
Nước cất 1 lít.
đun sôi, khuấy đều cho tới khi tan hoàn toàn các hóa chất. Điều chỉnh pH = 6. Đóng ống

16mm, mỗi ống 5-6 ml. Hấp 110°c trong 30 phút. Đem ra để nghiêng cho môi trường đông
lại.
2- Môi trường giữ giống :
Pcpton
30g
Thạch
20g
Nước cất
1 lít
Làm như môi trường sabouraud.
CÁCH PIIA DUNG DỊCH CHỈ THỊ MÀU ĐO PHI MÔI TRƯỜNG
Dung dịch mẹ: Đỏ phenol 0,4%:
Đỏ phenol
0,1g
NaOH N/20
5,7ml
Nước cất vừa đủ 25ml
Nghiền đỏ phenol với NaOH, thêm nước cất.
24


Đo pH từ 6,8 - 8,4
Khi đo pH phải pha loãng 10 lần dung dịch mẹ và đựng chai thủy tinh trung tính. Thỉnh
thoảng màu dung dịch pha loãng ngà vàng thì nhúng NaOH N/20 ở đầu ống hút Pasteur rồi
cho vào lọ chi thị, màu đỏ sẽ lại có.
5Dung dịch mẹ xanh Bromothymol 0,4%:
Xanh Bromothymoỉ
0,1g
NaOH N/20
3,2ml

Nước cất vừa đủ
25ml
Đề đo pH từ 6-7,6. Khi đo pH cũng pha loãng 10 lần dung dịch mẹ này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1
- Kĩ thuật xét nghiệm vi sinh vật và kí sinh trùng
NXBYhọc, 1972.
2
- Một số phương pháp nghiên cúu vi sinhvật.
NXB Khoa học kĩ thuật, 1972
3
-Handbook Culture Media, Merk, 1983.
4
-Manual for laboratory Investỉgations of Acute Kntcric Inĩections, 1983.

25