Khoá luận tốt nghiệp bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học quả cây ươi – scaphium macropodum

TRƯỜNG ĐẠI HỌC s ư PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

PHẠM THỊ HỒNG VÂN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN

cứu THÀNH

PHẦN HÓA HỌC QUẢ CÂY ƯƠI SCAPHIUM MACROPODUM

KHĨA LUẬN
TỐT NGHIỆP
ĐẠI
•
•
• HỌC
•
Chun ngành: Hóa học hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học

T.s Nguyễn Văn Thanh

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN

Khố luận tốt nghiệp được hồn thành tại phịng Dược liệu Biển, Viện
Hố sinh Biển, Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

Với lịng biết ơn chân thành, em xin cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của TS.
Nguyễn Văn Thanh, đã trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành khố luận này.
Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới tập thể các cán bộ phòng Dược
liệu Biển, Viện Hoá sinh Biển đã tạo điều kiện giúp đỡ em hồn thành khố
luận tốt nghiệp.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng cùng các
thày cơ giáo trong khoa Hố học trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình
dạy dỗ và chỉ bảo cho em trong suốt 4 năm học tại trường.
Khóa luận tốt nghiệp khơng tránh khỏi một số thiếu sót vì vậy em rất
mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo cả các thầy cô và các bạn sinh viên quan
tâm.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, Tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Phạm Thị Hồng Vân


LỜI CAM ĐOAN

Khóa luận “ Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học quả cây Ư(ri
- Scaphỉum macropodum ” được hồn thành dưói sự hướng dẫn trực tiếp của
TS. Nguyễn Văn Thanh. Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của
riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực, khơng trùng
vói các khóa luận khác đã được công bố.

Hà Nội, Tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Phạm Thị Hồng Vân


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................ 1
Chương 1: TỔNG QUAN..................................................................................3
1.1. Tổng quan về cây ươi - Scaphium macropodum.................................. 3
1.1.1. Mô tả ................................................................................................3
1.1.2. Sinh thái, phân b ố ........................................................................... 3
1.1.3. Công dụng........................................................................................3
1.1.4. Thành phần hóa học........................................................................ 3
1.2. Tổng quan về các phương pháp chiết[3]............................................... 4
1.2.1. Đặc điểm chung............................................................................... 4
1.2.2. Cơ sở của quả trình chiết................................................................ 5
1.2.3. Quá trình chiết thực vậ t.................................................................. 5
1.3. Tổng quan về các phương pháp sắc kí[3]..............................................8
1.3.1. Đặc điểm chung của các phương pháp sắc k í ............................... 8
1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí....................................................... 8
1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc kỉ..................................................9
1.4. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu
cơ[4].............................................................................................................12
1.4.1. Đo điểm chảy..................................................................................12
1.4.2. Phổ hồng ngoại..............................................................................12
1.4.3. Phổ tử ngoại khả kiến....................................................................14
1.4.4. Phổ khối lượng...............................................................................14
1.4.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân..........................................................15
Chương 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u .............................. 17
2.1. Mau thực vật..........................................................................................17
2.2. Phương pháp phân lập các họp chất.................................................... 17
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ................................................................17

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế...............................................................17


2.2.3. Sắc ký cột (CC)............................................................................18
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hố học các họp chất........................ 18
2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) .................................................................. 18
2.3.2. Độ quay cực [a]ũ..........................................................................18
2.3.3. Phổ khối lượng (ESI-MS)...............................................................18
2.3.4. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR).................................................. 18
2.4. Dụng cụ và thiết b ị.............................................................................. 18
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết...................................................... 18
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc............................................19
2.5. Hoá chất.................................................................................................19
Chương 3: THựC NGHIỆM........................................................................... 20
3.1. Xử lý mẫu............................................................................................. 20
3.2. Phân lập các họp chất........................................................................... 20
3.3. Hằng số vật lý và các số liệu phổ của các chất................................... 24
3.3.1. Hợp chat SLT4: trans-p-coumarỉc acid........................................ 24
3.3.2. Hợp chat SLT5: 3,4-dihydroxybenzaldehyde................................ 24
3.3.3. Hợp chat SLT10: 3-methylbutan-l-ol ß-D-glucopyrano side.......25
3.3.4. Hợp chất SLT22: (R)-lasiodiplodin.............................................. 25
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................... 26
4.1. Xác định cấu trúc hố học của họp chất SLT4:íraní-/?-coumaric acid 26
4.2. Xác định cấu trúc hoá học của hợp chất SLT5: 3,4dihydroxybenzaldehyde.............................................................................. 29
4.3. Xác định cấu trúc hoá học của họp chất SLT10: 3-methylbutan-l-ol ßD-glucopyranoside...................................................................................... 31
4.4. Xác định cấu trúc hố học của họp chất SLT22: (Ỉ)-lasiodiplodin.... 37
KẾT LUẬN..................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 45

DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẮT

13C NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

*H NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

COSY
2D-NMR

Chemical Shift Correlation Spectroscopy
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
Two-Dimensional NMR

CC

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS

Phổ khối lượng va chạm electron

Electron Impact Mass Spectrometry

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence

IR

Phổ hồng ngoại Infrared Specữoscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

TLC

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ BẢNG BIỂU
Trang
Hình 2.1 : Hạt lười ươi - Scaphium macropodum, họ Trơm - Sterculiaceae 17

Hình 3.1: Sơ đồ chiết hạt ươi

21

Hình 3.2: Sơ đồ phân lập phân đoạn ETOAc

22

Hình 3.3: Sơ đồ phân lập phân đoạn CH2CI2

23

Hình 3.4: Sơ đồ phân lập phân đoạn nước

24

Hình 4.1 : Phổ ^-N M R của SLT4

26

Hình 4.2: cấu trúc hóa học của SLT4

27

Hình 4.3: Phổ 13C-NMR của SLT4

28

Hình 4.4: cấu trúc hóa học của SLT5

29

Hình 4.5: Phổ ’H-NMR của SLT5

30

Hình 4.6: Phổ 13C-NMR của SLT5

31

Hình 4.7: cấu trúc hóa học của SLT10

32

Hình 4.8: Phổ ^-N M R của SLT10

33

Hình 4.9: Phổ 13C-NMR của SLT10

34

Hình 4.10: Phổ HSQC của SLT10

35

Hình 4.11: Phổ HMBC của SLT10

36

Hình 4.12: Phổ 1H-NMR của SLT22

37

Hình 4.13: cấu trúc hóa học của SLT22

38

Hình 4.14: Phổ 13C-NMR của SLT22

38

Hình 4.15: Phổ HSQC của SLT22

40

Hình 4.16: Phổ HMBC của SLT22

41

Hình 4.17: Các tương tác HMBC chính của SLT22

42

Bảng 4.1 : Số liệu phổ NMR của SLT4

28

Bảng 4.2: số liệu phổ NMR của SLT5

30

Bảng 4.3: số liệu phổ NMR của hợp chất SLT10

32

Bảng 4.4: số liệu phổ NMR của SLT22

39


MỞ ĐẦU

Các sản phẩm thiên nhiên ngày càng được con người quan tâm và ứng
dụng rộng rãi bởi đặc tính ít độc, dễ hấp thụ và không làm tổn hại đến môi sinh.
Theo các tài liệu công bố hiện nay, có khoảng 60% - 70% các loại thuốc chữa
bệnh đang được lưu hành hoặc trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn
gốc tự nhiên.
Bằng các phương pháp thử hoạt tính sinh học hiện đại, có kết quả cao,
người ta đã tiến hành nghiên cứu các mẫu dịch chiết thực vật, nghiên cứu các
chất đã tách được từ các dịch chiết. Nhờ vậy mà phát hiện ra nhiều hợp chất có
hoạt tính sinh học q báu, tạo điều kiện vơ cùng thuận lợi cho việc phát triển
ngành y dược trong công cuộc chữa bệnh cứu người.
Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa lớn, độ ẩm cao (khoảng
trên 80%), Việt Nam hiện có một hệ thực vật rất phong phú với khoảng 12000
lồi, ừong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược cùng các
mục đích khác phục vụ cuộc sống con người.
Cùng với bề dày phát triển 4000 năm lịch sử của dân tộc, ngành đông y
đã dành được những thành tựu rực rỡ, nhiều phương thuốc cây cỏ động vật đã
được ứng dụng hiệu quả lưu truyền cho đến ngày nay. Đó là cơ sở rất quan

trọng cho việc phát triển ngành hoá học các hợp chất thiên nhiên.
Tuy nhiên đối với một đất nước còn hạn chế về nguồn vốn và cơ sở vật
chất như Việt Nam thì vấn đề đặt ra là làm thế nào để khai thác và sử dụng
nguồn tài nguyên một cách hiệu quả nhất cho xã hội.
Vì vậy tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Bước đầu nghiên cứu thành
phần hóa học quả cây Ươi - Scaphium macropodum”.
Cây ươi - Scaphium macropodum là cây thân gỗ, cao khoảng 30 m, mọc
ở các tình miền Trung và miền Nam nước ta. Quả ươi có tính mát, được sử
dụng ừong dân gian chữa các bệnh nhiệt, ho khan, đau họng, đau răng, đau mắt
1


đỏ và bệnh kiết lị. Tuy nhiên, hiện chưa có nhiều tài liệu cơng bố về thành phàn
hố học cũng như ứng dụng dược lý của loại quả này.
Khoá luận này tập trung nghiên cứu thảnh phần hóa học của hạt quả ươi
tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm thuốc mới,
các giải pháp điều trị bệnh.
Nội dung của khoá luận gồm:
1. Phân lập hợp các họp chất hóa học từ hạt quả ươi bằng các phương pháp
chiết và sắc ký.
2. Xác định cấu trúc hoá học của các họp chất đã phân lập được bằng các
phương pháp phổ.

2


Chương 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cây ươi - Scaphium macropodum
1.1.1. Mô tả

Cây to cao 20-25 m hay hơn ; cành có góc, lúc non có lơng màu hung,
về sau nhẵn. Lá mọc tập trung ở đỉnh cành ; phiến to dài 10 - 20 cm, rộng 6 12 cm, thơng thường có 3 thùy, nhất là lúc lá cịn non, màu lục sáng, khơng
lơng ; cuống lá dài 10 - 30 cm. Hoa nhỏ. Quả nang vói 1 - 5 quả đại cao 10 15 cm, mặt ngoài màu đỏ, mặt trong màu bạc, vỏ quả mỏng. Hạt to bằng ngón
tay hình bầu dục hay thn dài 2,5 - 3,5 cm, rộng 1,2 - 2,5 cm, màu đỏ nhạt,
đính ở gốc quả[l].
1.1.2. Sinh thái, phân bố
Cây mọc rải rác trong rừng, ra hoa tháng 3 - 5, có quả tháng 6 - 7. Ở
nước ta cây có mặt ở các tỉnh Thừa Thiên - Huế, Đà Nằng, Quảng Nam, Kon
Tum, Gia Lai, Đăc Nông, Lâm Đồng, Quảng Ngãi, Bình Định, Bình Thuận,
Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu. Kiên Giang. Trên thế giới cây mọc
ở các nước Trung Quốc, Thái Lan, Campuchia, Malaixia, Inđônêxia[l].
1.1.3. Công dụng
Hạt ươi được coi là một loại thuốc bổ mát, thêm tân dịch có thể dùng
nhiều hay dùng ln, khơng hại. Thường ngày có thể dùng vài ba hạt cho vào
cốc nước nóng ngâm một lúc cho hạt nở ra rồi thêm đường vào cho đủ ngọt
uống giải khát và trừ các bệnh nhiệt, trị các chứng đau ruột và các bệnh đường
tiêu hóa[l].
1.1.4. Thành phần hóa học
Đến nay mới có duy nhất 1 cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học
của hạt ươi, cơng bố năm 2014 bởi nhóm nghiên cứu của L.M. Ramadhan AI
Muqarrabun (Malaixia và Nhật Bản) công bố 1 họp chất sequiterpene mới đặt
tên là malayscaphiol (1) và 3 chất đã biết là lupeol (2), lupenone (3) và
3


stigmasterol (4) từ hạt ươi Scaphium macropodum. Các họp chất 2, 3, 4 thể
hiện hoạt tính gây độc tế bào yếu trên các dòng tế bào HT-29 và MDA-MB[2].

1. malayscaphiol
2. lupeol

„ ,
3. lupenone

4. stigmasterol

1.2. Tổng quan về các phương pháp chỉết[3]
1.2.1. Đặc điểm chung
Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình
chuyển một chất hoà tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác khơng hồ
tan với nó.
Mục đích: Sử dụng phương pháp chiết để chuyển một lượng nhỏ chất
nghiên cứu trong một thể tích lớn dung mơi này vào một thể tích nhỏ dung mơi
khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm
giàu. Ngồi ra cịn dung phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các
chất ừong một hỗn họp phức tạp với điều kiện thích họp. Phương pháp này
thường được dung để phân tách các hợp chất tự nhiên có trong thực vât.

4


1.2.2. Cơ sở của quá trình chiết
Cơ sở của quá trình chiết là dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất
ừong hai chất lỏng không tan lẫn với nhau. Sự phân bố khác nhau là do tính tan
khác nhau của các chất trong pha lỏng.
Quá trình chiết dựa trên định luật phân bố Nerst:
K a = C a/C b

với

Ka: hằng số phân bố.

C a, C b

: nồng độ chất hồ tan trong hai pha lỏng A, B khơng tan lẫn.

1.2.3. Quá trình chiết thực vật
1.2.3.1. Hợp chất tự nhiên trong cây:
Dựa vào chức năng sinh học, người ta chia các họp chất trong cây thành
hai nhóm lớn:
-

Chất chuyển hoá sơ cấp (primary metabolite).

-

Chất chuyển hoá thứ cấp (secondary metabolite).

Chất chuyển hoá sơ cấp là chất tham gia vào quá trình sinh trưởng của
cây như các hydrat cacbon, lipit, axit amin. Nói chung chúng là thành phần
khơng thể thiếu trong cây cỏ.
Chất chuyển hoá thứ cấp là những chất mà vai trị chủ yếu của chúng
khơng phải để ni sống và phát triển cây cỏ, chúng có thể có ở cây này và
vắng mặt ở cây kia. Có rất nhiều giả thiết về vai trò của chúng trong thực vật.
Có ý kiến cho rằng chúng là những chất thải, góp phần giải độc cho cây
(ancaloid, tỉnh dầu), góp phàn bảo vệ chống các tác nhân làm hại cây
(ílavonoid, saponin, tinh dầu, terpenoid...), hoặc góp phàn tạo màu sắc, quyến
rũ ong bướm giúp cho sự phát triển nịi giống (ílavonoid, carotenoid...) v.v...
Do có các tác dụng sinh lý và dược lý như tác dụng kháng sinh, diệt nấm,
tác dụng ức chế hoặc gây độc đối với tế bào, tác dụng kích thích hoặc ức chế

sinh trưởng và các tác dụng khác mà các chất trao đổi bậc hai là đối tượng
nghiên cứu quan trọng trong các lĩnh vực như y dược học, nông nghiệp.
5


Trong cây các họp chất hữu cơ có tính chất hố lý rất khác nhau, chúng
tồn tại ở dạng hồ tan trong nước, dầu béo hoặc tinh dầu. Các chất hoà tan trong
nước (dịch tế bào) là các hydro cacbon phân tử bé (monosacarit, oligosacarit),
một số polysacarit (pectin, gôm), các glycozit (saponin, flavonoid...), muối
ancaloid của các axit hữu cơ, axit hữu cơ, axit amin, muối amin. Các chất tan
trong dầu béo và tinh dầu là các hydro cacbon, monoterpen, secquiterpen,
sterol, carotenoid và các dẫn xuất phenyl propanoid. Dầu béo và tinh dầu được
khu trú ừong các bộ phận riêng biệt của cây như ở hạt (dầu béo), ở hạch tiết
của lá, vỏ thân (tinh dầu).
Ngồi ra trong cây cịn chứa các muối vơ cơ. Các muối vơ cơ này ít tham
gia vào tác dụng sinh lý của dược liệu, tuy nhiên đây chính là các nguồn ngun
tố vi lượng khơng thể thiếu đối với cây cỏ. Ở một số loài các muối vơ cơ cũng
có một số tác dụng như tác dụng lợi tiểu của muối kali (natri) ừong râu ngô, tác
dụng trị vi khuẩn của lưu huỳnh trong họ cải, tác dụng trị bướu cổ của các họp
chất iốt của các loại tảo biển.
Mặt khác trong cây cũng có mặt các loại enzyme, do đó trong q trình
nghiên cứu, nếu không khống chế sự hoạt động của các enzyme này thì các
glycozit có thể bị thuỷ phân một phàn hoặc tồn phần làm thay đổi tính phân
cực, do đó thay đổi độ hoà tan của họp chất trong dung mơi.
1.23.2. Chọn dung mơi chiết
Các họp chất chuyển hố thứ cấp ừong cây có độ phân cực khác nhau,
dung mơi dừng cho các quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận với các
đặc điểm là cần hoà tan tốt những chất đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ,
có tính ừơ (khơng phản ứng với chất nghiên cứu), những dung môi này cần
được chưng cất trước khi sử dụng vì nếu lẫn các chất khác sẽ làm ảnh hưởng

đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Một số chất dẻo lẫn trong dung
môi như diankylphtalat, tri-n-butyl-axetylcitrat, tributylphosphat

6


... do trong quá trình sản xuất hay bảo quản, sẽ làm sai lệch kết quả phân lập
ừong các quá trình nghiên cứu hố thực vật. Clorịrm, etanol và metanol là
những dung mơi thường được lựa chọn trong q trình chiết sơ bộ một bộ phận
của cây như lá, thân, rễ, hoa...
Người ta cho rằng dung mơi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng
tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được triệt để hơn các
thành phàn có trong tế bào. Ngược lại, khả năng phân cực của clorịrm thấp
hơn, có thể rửa các chất nằm ngoài tế bào.
Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các
hợp chất phân cực trung bình và thấp, vì vậy khi chiết với ancol thì các chất
này sẽ bị hồ tan đồng thời. Thường thì dung mơi cồn trong nước dường như
có đặc tính tốt nhất cho q trình chiết sơ bộ.
Sau khi chiết, dung môi được tách ra bằng máy cô quay ở nhiệt độ không
quá 45°c, với các họp chất chịu nhiệt thì có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
1.2.3.3. Quả trình chiết
Có thể thực hiện một trong hai phương pháp sau:
• Q trình chiết sử dụng bình chiết Soxhlet:
Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất
rắn một thời gian rồi rút ra, dừng thiết bị này để chiết nhiều làn liên tục và để
tiết kiệm dung mơi.
• Chiết ngâm:
Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết dung môi ra (chiết
nguội). Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết
thực vật vì nó khơng địi hỏi nhiều cơng sức. Thơng thường bình chiết ngâm

khơng được sử dụng như phương pháp chiết liên tục vì mẫu được ngâm trong
dung mơi khoảng 24h sau đó lấy chất chiết ra. Việc kết thúc quá trình chiết
được xác định bằng một số cách như:

7


- Với các ancaloid, có thể kiểm tra sự xuất hiện của các họp chất này
bằng sự tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như: Dragendorff,
Mayer...
- Với các flavonoid, do chúng thường là các chất màu nên khi dịch chảy
ra khơng cịn màu cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết.
-

Trong trường hợp các lacton của secquiterpen và các glycozit trợ tim
phản ứng Kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc
khi cho phản ứng với anilin axetat cho biết sự xuất hiện của các
Hydratcacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.

Như vậy tùy thuộc vào mục đích cần lấy chất gì để lựa chọn dung mơi thích
họp và thực hiện quy trình chiết họp lý để đạt hiệu quả cao nhất.
1.3. Tổng quan về các phương pháp sắc kí[3]
1.3.1. Đặc điểm chung của các phương pháp sắc kí
Sắc kí là một phưomg pháp vật lý dùng để tách riêng các thành phần ra
khỏi hỗn hợp bằng cách phân bố chúng ra hai pha: một pha có bề mặt rộng gọi
là pha tĩnh (hay là pha cố định) và pha kia là một chất lỏng hoặc khí gọi là pha
động (hay là pha di động), di chuyển đi qua pha tình. Trong quá trình sắc kí, pha
động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác,
quá trình hấp phụ và giải hấp phụ lặp đi lặp lại. Kết quả là các chất có ái lực lớn
hơn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn so với chất tương tác yếu hơn. Nhờ

đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua q trình sắc kí.
1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha
động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc
của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ dung dịch gọi là định luật
hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuữ:
n = noc bC/(l + bC)
Với:
8


- n: lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
- na,: lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào
đó.
- b: hằng số...
-

C: nồng độ của dung dịch.

1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc kí
Trong phương pháp sắc kí, pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái
khí hay lỏng), cịn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng
thái tập họp của pha động người ta chia sắc kí thành hai nhóm: sắc kí khí và
sắc kí lỏng.
ỉ . 3.3.1.Sắc kí lỏng
Đây là phương pháp sắc kí dùng chất lỏng làm pha động. Trong sắc kí
lỏng có các loại cụ thể sau:
a) Sắc kí giấy:
Sắc kí giấy là phương pháp phân tích với pha tĩnh là một loại giấy đặc
hiệu dùng trong sắc kí. Chất thử được chấm lên giấy rồi triển khai sắc kí bằng

dung mơi thích họp trong một bình triển khai kín. Sau khi đã triển khai xong,
giấy được làm khô rồi làm hiện màu để xác định các vết chất có trong hỗn họp
chất thử. Trừ các chất có màu có thể phát hiện ngay bằng mắt thường, các chất
khơng màu có thể được phát hiện bằng 2 phương pháp: hóa học và vật lý.
Với phương pháp hóa học, người ta dùng các thuốc thử hiện màu đặc
trưng cho từng loại họp chất. Thuốc thử được pha thành dung dịch có nồng độ
thích hợp rồi cho tác dụng lên giấy bằng cách phun lên bề mặt giấy hoặc nhúng
giấy vào thuốc thử.
Với phương pháp vật lý, có thể hiện màu bằng cách soi vào đèn u v vì
nhiều hợp chất hữu cơ hấp thụ được các tia cực tím.
b) Sắc kí lớp mỏng

9


sắc kí lớp mỏng (SKLM) là phương pháp phân tích dung dịch chất phân
tích di chuyển ừên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một
chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thảnh phần chuyển dịch với
tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở các vị trí
khác nhau.
Chất hấp phụ thường được sử dụng ừong SKLM là silicagel tráng trên
đế nhôm hay đế thủy tinh. Trong quá trình hấp phụ, sẽ xảy ra sự tranh giành
giữa dung môi và chất tan để chiếm chỗ trên bề mặt chất hấp phụ, và khi đạt
được cân bằng, mỗi chất tan sẽ ở một vị trí khác nhau ừên bản mỏng.
Đe tiến hành sắc kí, chất tan được chấm lên bản thảnh từng vết chấm
nhỏ, sấy cho dung môi bay hơi hết rồi triển khai với hệ dung mơi thích hợp
trong một bình triển khai kín. Để kiểm ừa vết chất có thể sử dụng thuốc thử
hiện màu hoặc soi bằng đèn u v . Thuốc thử hiện màu có thể là hơi ammoniac
hoặc dung dịch axit sunhiric 10%. Đe hiện vết người ta nhúng bản vào thuốc
thử hoặc phun lên bản mỏng sau đó hơ bản trên bếp điện hoặc sấy nóng để vết

xuất hiện từ từ. Phương pháp này thường được sử dụng để kiểm tra và định
hướng cho sắc kí cột.
Một hình thức SKLM khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu hợp
chất tự nhiên là SKLM điều chế, dùng để điều chế, thu chất trực tiếp. Ở phương
pháp này, quá trình thực hiện tương tự SKLM và sau khi triển khai xong, soi
ƯV để xác định vết rồi cạo lấy lớp silicagel chứa chất cần điều chế, tiến hành
rửa giải để thu chất.
c) Sắc kí cột
Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm
các loại silicagel (có kích thước hạt rất khác nhau) pha thường và pha đảo
(YMC, ODS, dianion). Chất hấp phụ được nhồi vào cột (phổ biến nhất là cột
thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ảnh số đĩa lý thuyết
hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số
10


đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại.Tuy nhiên, nếu chất
hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số
trường họp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì sẽ gây hiện tượng tắc cột
(dung mơi khơng chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất để kích thích
dung mơi chảy (áp suất trung bình - MPC, áp suất cao - HPLC).
Tỷ lệ đường kính so với chiều cao cột (L/D) phụ thuộc vào yêu càu tách
(phụ thuộc vào lượng chất và chất cụ thể).
Tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của
dung môi là Rf, với mỗi chất khác nhau giá trị Rf khác nhau. Nhờ sự khác nhau
này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn họp.
Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa lên cột
bằng các phương pháp khác nhau.Nếu lượng chất nhiều và chạy thơ thì phổ
biến là tẩm chất vào silicagel rồi làm khơ tơi hồn tồn sau đó đưa lên cột. Nếu
tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất vào dung mơi

chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Nhồi cột khô: theo cách này chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi
cịn khơ sau đó gõ nhẹ lên thành cột để đưa chất hấp phụ xếp chặt trong
cột. Dùng dung môi chạy cột để rửa giải.
- Nhồi cột ướt: chất hấp phụ được hịa tan trong dung mơi chạy cột với
lượng dung mơi tối thiểu. Sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần
thiết
Khi chuẩn bị cột cần lưu ý khơng được để có bọt khí trong cột (nếu có bọt
khí sẽ gây nên hiện tượng chảy rối trong cột, và giảm hiệu quả tách).Và cột
không được nứt, gãy, rị.
Tốc độ chảy của dung mơi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ
dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Nếu tốc độ chảy quá chậm thì sẽ
kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
11


1.3.3.2.sẳc kỉ khí
Đây là phương pháp sắc kí dùng chất khí làm pha động. Chất thử có thể
là chất khí lỏng hoặc chất rắn được chuyển thành thể bay hơi và nhờ một luồng
khí trơ làm chất tải dẫn đi qua pha tĩnh. Nếu pha tĩnh là một chất rắn thì gọi là
sắc kí khí - rắn. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì gọi là sắc kí khí - lỏng. Ở sắc kí
khí - rắn, chất rắn được dừng là những chất có tính hấp phụ như Silicagel, than
hoạt tính, oxit nhơm.ở sắc kí khí - lỏng, chất lỏng được phân tán mỏng như
một lớp phim trên bề mặt một chất rắn ừơ gọi là nền. Khi chất thử được khí tải
dẫn đi qua pha tĩnh, chứng bị tách riêng ra tùy theo hệ số phân bố của mỗi thành
phần trong hỗn hợp chất thử đối với pha tĩnh.
1.4. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc của các họp chất
hữu cơ[4]
Khi đã phân lập được một hợp chất hữu cơ, điều quan ừọng là phải xác

định được cấu trúc của chúng. Để có thể thực hiện được điều này cần phải phân
tích bằng nhiều phương pháp kết họp với nhau.
1.4.1. Đo điểm chảy
Đối với chất rắn kết tinh thì điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất quan
trọng, nó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của họp chất. Nếu điểm
chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau
khơng q 0.5°c thì có thể xem sản phẩm kết tinh đã tinh khiết. Nếu một hợp
chất kết tinh có điểm chảy cịn thấp rất xa so với điểm chảy lí thuyết thì chứng
tỏ sản phẩm thu được chưa tinh khiết và phải tinh chế và kết tỉnh lại.
Trong nhiều trường họp, với việc xác định được điểm chảy có thể đưa ra
được kết luận hoặc nhận định sơ bộ về họp chất càn nghiên cứu bằng các đem
đi so sánh, đối chiếu với các tài liệu đã có sẵn.
1.4.2. Phổ hồng ngoại
Các họp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong
vùng 10 000 - 100 000 cm'1 và biến thành năng lượng của dao động phân tử.
12


Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa trên sự khác nhau của các dao động của
các liên kết ừong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của các tia hồng ngoại.
Như vậy phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ của 2 dạng năng lượng là năng lượng
dao động và năng lượng quay.
Tần số hay độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng
tương đối của các nguyên tử, liên kết và vào cấu trúc hình học của chúng. Với
mỗi hợp chất khác nhau chứa các liên kết khác nhau thì sự hấp thụ hồng ngoại
là khác nhau. Dựa ừên những đặc điểm này mà ta có thể xác định được các
nhóm chức trong họp chất hữu cơ bằng cách đo và phân tích phổ hồng ngoại.
Dưạ vào sự hấp thụ đặc trưng của các nhỏm chất mà có thể chia phổ hồng
ngoại thành 3 vùng: vùng sóng ngắn từ 4000 - 1300 cm'1, vùng sóng dài từ
909 - 650 cm'1 và vùng sóng trung bình từ 1300 - 909 cm'1

Trong vùng sóng ngắn các nhóm chức hữu cơ bị hấp thụ là OH, NH,
CO,... Nếu khơng có dải hấp thụ trong vùng 1850 - 1540 cm'1 là khơng có
nhóm CO, khơng có dải hấp thụ ở 3650 - 3200 cm'1 là khơng có nhóm OH
phenol hoặc ancol. Các họp chất thơm hoặc tạp thơm thường có dải hấp thụ
nằm trong khoảng 1600 - 1300 cm'1 .
Vùng sóng dài đặc trưng cho các hấp thụ của dao động biến dạng. Nếu
khơng có dải hấp thụ trong khoảng 909 - 605 cm'1 là họp chất khơng có cấu
trúc thơm. Các hấp thụ của dao động biến dạng của vịng thơm và biến dạng c
- H ngồi mặt phẳng của các hợp chất thơm và tạp thơm xuất hiện với cường
độ mạnh và thường có liên quan đến nhóm thế của các hợp chất. Nếu có dải
hấp thụ rộng với cường độ mạnh thì rất có thể có mặt các dime của axit
cacboxilic, của amin, amit. Nếu có các dải ở gần 1000 cm'1 thì rất có thể có cấu
trúc olefin.
Vùng sóng trung bình được gọi là vùng chỉ vân tay vì nó được dừng để
so sánh hình dạnh các dải hấp thụ với mẫu chuẩn xem có đồng nhất hay không.

13


Ví dụ: nếu có dải hấp thụ OH ở 3550 - 3200 cm'1thì vị trí dải hấp thụ c - o tại
đây sẽ giúp ta phân biệt được chi tiết hơn về cấu trúc của phenol hoặc ancol đó.
1.4.3. Phổ tử ngoại khả kiến
Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và vùng khả kiến của họp chất hữu cơ
phụ thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử. Sự hấp thụ ấy gây ra sự chuyển
dịch các điện tử từ orbitan ở trạng thái cơ bản lên các orbitan có năng lượng
cao hơn ở trạng thái kích thích.Tuy nhiên chỉ có một số dạng cấu trúc trong hợp
chất hữu cơ mới có sự hấp thụ ấy nên việc ứng dụng phổ u v cũng chỉ giới hạn
trong một số lớp chất mà chủ yếu là các chất có cấu trúc dây nối đôi liên họp.
Đặc điểm của phổ tử ngoại là phổ của một chất phức tạp có thể giống với
phổ của một chất đơn giản nếu hai chất ấy có cùng một nhóm cấu trúc giống

nhau. Chính vì thế phổ tử ngoại thường được dùng để xác định cấu trúc của
họp chất hữu cơ một cách sơ bộ.
1.4.4. Phổ khối lượng
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân
tử chất nghiên cứu dưới sự bắn phá của một chùm ion từ bên ngoài. Phổ MS
còn cho các pic ion mảnh khác nhau và dựa vào đó người ta có thể xác định
được cơ chế phân mảnh và từ đó dựng lại được cấu trúc hóa học của các họp
chất. Hiện nay có rất nhiều các loại phổ khối lượng và các phương pháp chủ
yếu vân thường được dùng là:
• Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy): dựa
vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm electron bắn phá
có năng lượng khác nhau. Thơng thường là 70eV.
• Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy) gọi
là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng
bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS. Do đó dữ liệu phổ thu
được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá
vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
14


1.4.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương phápphổ hiện đại và hữu hiệu
nhất hiện nay .Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và
hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của họp chất,
kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon)
là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (*H và 13C) dưới tác dụng của
từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển
dịch hố học (chemical shift) .Ngồi ra, đặc trưng của phân tử còn được xác
định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).

- Phổ ^-N M R: Trong phổ ^-N M R , độ chuyển dịch hố học (ơ) của các
proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai
hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phàn. Dựa vào những đặc
trưng của độ chuyển dịch hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được
cấu trúc hố học của hợp chất.
- Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử
cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau.
Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230ppm.
•

Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer).
Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau.Trên phổ

DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất.Tín hiệu của CH và CH3 nằm
về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135°. Trên phổ DEPT 90°
chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
•

Phổ 2D-NMR.
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của

các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ
yếu thường được sử dụng như sau:

15


- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các
tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác ừên phổ này.
Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương

tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ

W h

COSY

(HOMOCOSY)

(1H-1H

Chemical Shift

Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác của H- H, chủ
yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần
của phân tử được nối ghép lại với nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ
biểu diễn tương tác xa ừong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên
phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định
về cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu
diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên
kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định ừong khơng gian. Dựa vào kết
quả phổ này có thể xác định cấu trúc khơng gian của phân tử.
Người ta cịn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences
để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng
bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía
về không gian cũng như gàn nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và
cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn.

16


Chương 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1. Mấu thưc vât
«

m

Mâu hạt ươi - Scaphium macropodum (Miq.) Beumée được thu hái vào
tháng 5 năm 2013 tại tỉnh Lâm Đồng và được TS. Nông Văn Duy, viện Nghiên
cứu Khoa học Tây Nguyên định loài. Tiêu bản (số TN3/309) được lưu giữ tại
viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên - Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng
nghệ Việt Nam.

Hình 2.1: Hạt ươi - Scaphium macropodum, họ Trôm - Sterculỉaceae
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
2.2.1, Sắc kỷ lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC~Alufolien
60 F254 (Merck 1,05715), RP 18 F254S (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại
ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4
10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nống ừên bếp điện từ từ đến
khỉ hiện màu.
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel
60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai
17

bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung
dịch H2SO410%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để
xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung
mơi thích hợp.
2.2.3. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và
pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh).
Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 pm, FuJisilisa Chemical Ltd.).
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hố học các họp chất
2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)
Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa
sinh biển.
2.3.2. Độ quay cực fa]D
Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của
Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2.3.3. Phổ khối lượng (ESI-MS)
Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron spray Ionization mass
spectra) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hố học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.3.4. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): ^-N M R (500 MHz) và 13C-NMR
(125 MHz) được đo ừên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện
Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.4. Dung cu và thiết bỉ
2.4.1. Dung cu và thiết bi tách chiết
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được
sử dụng bao gồm:
+ Bình chiết 30 lít
18