nghiên cứu một số đặc tính sinh học của porcine circovirus type 2 (pcv2) phân lập tại việt nam dùng làm giống gốc để sản xuất vacxin
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.56 MB, 80 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-------
-------
TÔ NHƯ TƯỞNG
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2)
PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM DÙNG LÀM GIỐNG
GỐC ĐỂ SẢN XUẤT VACXIN
LUẬN VĂN THẠC SĨ
HÀ NỘI, NĂM 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-------
-------
TÔ NHƯ TƯỞNG
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2)
PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM DÙNG LÀM GIỐNG
GỐC ĐỂ SẢN XUẤT VACXIN
CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y
MÃ SỐ : 60.64.01.01
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS: HUỲNH THỊ MỸ LỆ
HÀ NỘI, NĂM 2015
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi, là một phần kết
quả của đề tài mã số KC.04.22/11.15 do PGS.TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ chủ trì. Kết quả
nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công
trình nào khác.
Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 02 tháng 12 năm 2015
Tác giả luận văn
Tô Như Tưởng
ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận
được sự quan tâm giúp đỡ của các tổ chức, cơ quan, các nhà khoa học, các thầy cô
giáo, bạn bè đồng nghiệp và những người thân trong gia đình.
Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các giảng viên khoa Thú y - Học
viện Nông nghiệp Việt Nam đã giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự hướng dẫn, giúp đỡ chân tình, đầy
trách nhiệm và hết lòng vì khoa học của PGS.TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình, đồng nghiệp đã
luôn quan tâm, động viên giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày 02 tháng 12 năm 2015
Tác giả luận văn
Tô Như Tưởng
iii
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan
ii
Lời cảm ơn
iii
Mục lục
iv
Danh mục chữ viết tắt
vii
Danh mục bảng
viii
Danh mục hình
ix
MỞ ĐẦU
1
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
1.1. Một vài nét về PCV2
3
1.1.1. Phân loại
3
1.1.2. Hình thái, cấu trúc
3
1.1.3. Tính chất nuôi cấy
5
1.1.4. Sức đề kháng
5
1.2. Thiệt hại kinh tế do bệnh gây ra
5
1.3. Đường xâm nhập và phương thức truyền lây của PCV2
6
1.4. Cơ chế sinh bệnh của PCVAD
7
1.4.1. Yếu tố phụ thuộc virus (Virus – dependent factors)
7
1.4.2. Yếu tố phụ thuộc vật chủ (Host – dependent factors)
8
1.4.3. Ảnh hưởng của hiện tượng đồng nhiễm (Effect of coinfection)
8
1.4.4. Ảnh hưởng của trạng thái miễn dịch của cơ thể (Effect of immune
9
modulation)
1.5. Các dạng biểu hiện của PCVAD
10
1.5.1. Nhiễm PCV2 thể cận lâm sàng
10
1.5.2. Hiện tượng nhiễm trùng hệ thống liên quan đến PCV2 (PCV2associated systemic infection)
11
1.5.3. Bệnh đường hô hấp liên quan đến PCV2 (PCV2-associated respiratory
12
disease)
iv
1.5.4. Hiện tượng viêm ruột liên quan đến PCV2 (PCV2-associated
12
enteritis)
1.5.5. Hiện tượng rối loạn sinh sản ở lợn liên quan đến PCV2 (PCV2associated reproductive failure)
12
1.5.6. Hội chứng viêm da thận liên quan đến PCV2 (PCV2-associated
13
PDNS)
1.6. Phương pháp chẩn đoán bệnh PCVAD
13
1.6.1. Xác định kháng thể kháng PCV2 bằng phản ứng kháng thể huỳnh
quang, IPMA, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) và phản ứng
trung hòa virus (serum virus neutralization assay)
13
1.6.2. Xác định PCV2 nucleic acids bằng phản ứng PCR và ISH
14
1.6.3. Xác định virus PCV2 hoặc kháng nguyên virus bằng IHC, phân lập
virus, IFA, FA trong mô bào và antigen-capture ELISA
15
1.7. Biện pháp can thiệp
16
1.7.1. Quản lý đàn tốt
16
1.7.2. Khử trùng chuồng trại
17
1.7.3. Khống chế hiện tượng đồng nhiễm
17
1.7.4. Sử dụng vacxin PCV2
17
Chương 2 NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
19
2.1. Nội dung nghiên cứu
19
2.2. Đối tượng nghiên cứu
19
2.3. Nguyên liệu
19
2.3.1. Chủng phân lập:
19
2.3.2. Các loại môi trường hóa chất
19
2.4. Địa điểm nghiên cứu
21
2.5. Phương pháp nghiên cứu
22
2.5.1. Phương pháp cấy chuyển virus
22
2.5.2. Phương pháp thu hoạch và lưu giữ PCV2 phân lập được
22
2.5.3. Phương pháp xác định TCID50 của PCV2 bằng phản ứng IFA
22
v
2.5.4. Phương pháp tách, tinh sạch ADN tổng số
24
2.5.5. Phương pháp thực hiện phản ứng real-time PCR
25
2.5.6. Phương pháp real-time PCR xác định TCID50 của PCV2
25
2.5.7. Các bước thực hiện phản ứng PCR
26
2.5.8. Phương pháp giải trình tự gen
27
2.5.9. Phương pháp gây miễn dịch cho thỏ
27
2.5.10. Phương pháp blocking ELISA phát hiện kháng thể kháng PCV2
28
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
30
3.1. Kết quả xác định hiệu giá TCID50/ml của các đời virus PCV2 phân lập được
lựa chọn làm giống gốc
30
3.1.1. Kết quả xác định hiệu giá các chủng virus qua các lần tiếp đời bằng
phản ứng IFA
30
3.1.2. Kết quả xác định hiệu giá bằng phương pháp realtime PCR định lượng
33
3.2. Kết quả xác định sự ổn định di truyền của PCV2
37
3.2.1. Kết quả PCR nhân lên đặc hiệu bộ gen PCV2
37
3.2.2 Kết quả giải trình tự gen PCV2
38
3.2.3. Kết quả phân tích cây phát sinh loài của các chủng PCV2 phân lập
39
3.2.4. Kết quả phân tích trình tự gen PCV2 ở các lần tiếp đời
40
3.2.5. Kết quả phân tích mối liên hệ gen ở các vùng quyết định kháng
nguyên giữa các chủng PCV2 phân lập
42
3.3. Kết quả xác định khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của PCV2 trên động
vật thí nghiệm
43
3.3.1. Gây miễn dịch cho thỏ bằng các đời virus PCV2 đã lựa chọn
43
3.3.2. Kết quả kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của thỏ với các đời
PCV2 bằng phản ứng ELISA
45
3.3.3. Kết quả kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của thỏ với các đời PCV2
bằng phản ứng trung hòa
49
KẾT LUẬN
53
TÀI LIỆU THAM KHẢO
54
PHỤ LỤC
57
vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AND
: Axit Deoxyribo Nucleic
Cap
: Capsid protein
CAV
: Chicken anemia virus
CIA
: Chicken Infectiuos Anemia
IFA
:Indirect Immuno Fluorescent Assay
IHC
: Immunohistochemistry
ISH
: In situ hybridization
PCV
: Porcine circovirus
PCV1
: Porcine circovirus type 1
PCV2
: Porcine circovirus type 2
PCVAD
: Porcine circovirus type 2-associated disease
PDNS
: Porcine dermatitis and nephropathy syndrome
PMWS
: Postweaning multisystemic wasting syndrome
PRD
: Porcine reproductive disorders
PRDC
: Porcine respiratory diseases complex
ORF
: Open reading frame
Rep
: Replication protein
SIV
: swine influenza virus
TCID50
: Tissue
TTV
: Transfusion Transmitted Virus hay Torque teno virus
culture infectious dose 50
vii
DANH MỤC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
1.1
Thống kê số ca bệnh liên quan đến PCV2
2.1
Trình tự cặp mồi, đầu dò dùng xác định hiệu giá PCV2
20
2.2
Trình tự cặp mồi dùng nhân đặc hiệu bộ gen PCV2
20
2.3
Chu trình nhiệt hai giai đoạn của phản ứng real-time PCR*
25
2.4
Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đặc hiệu bộ gen PCV2
26
2.5
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân đặc hiệu bộ gen PCV2
27
3.1
Kết quả theo dõi chuẩn độ các chủng virus phân lập được
30
3.2
Hiệu giá TCID50 của các chủng virus phân lập được
31
3.3
Kết quả xác định giá trị Ct ở các độ pha loãng
35
3.4
Kết quả real-time PCR xác đinh hiệu giá của virus qua các đời
36
3.5
Kết quả PCR nhân đặc hiệu bộ gen các chủng PCV2 phân lập
37
3.6
Kết quả phân tích trình tự gen vùng quyết định kháng nguyên A- D
41
3.7
Kết quả phản ứng trung hòa PCV2 của mẫu huyết thanh thỏ gây miễn
dịch bởi PCV2
3.8
5
49
Kết quả phản ứng trung hòa PCV2 của mẫu huyết thanh thỏ gây miễn
dịch bởi PCV2
51
viii
DANH MỤC HÌNH
STT
Tên hình
Trang
1.1
Cấu trúc PCV2 Gillespie et al. (2009)
4
2.1
Sơ đồ vị trí cặp mồi nhân đặc hiệu bộ gen PCV2
21
3.1
Kết quả xác định TCID50 của chủng phân lập 03, đời 25 (100X)
32
3.2
Kết quả xây dựng đường chuẩn của phản ứng real-time PCR
34
3.3
Kết quả PCR nhân đặc hiệu bộ gen chủng phân lập số 05
38
3.4
Kết quả giải trình tự gen chủng phân lập số 07
39
3.5
Cây phát sinh loài của các chủng PCV2 phân lập
40
3.6
Trình tự gen vùng quyết định kháng nguyên A
42
3.7
Trình tự gen vùng quyết định kháng nguyên B
42
3.8
Trình tự gen vùng quyết định kháng nguyên C
42
3.9
Trình tự gen vùng quyết định kháng nguyên D
43
3.10
Gây miễn dịch cho thỏ bằng virus PCV2
44
3.11
Theo dõi nhiệt độ thỏ trước và sau khi gây nhiễm
44
3.12
Thân nhiệt của thỏ trước và sau khi gây miễn dịch
45
3.13
Lấy máu thỏ sau gây nhiễm để kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng
PCV2
3.14
46
Biến động hiệu giá kháng thể của thỏ sau gây miễn dịch với các chủng
PCV2
3.15
47
Biến động hiệu giá kháng thể của thỏ sau gây miễn dịch với các chủng
PCV2
3.16
48
Kết quả IFA xác định khả năng trung hòa PCV2 của mẫu huyết thanh
thỏ gây miễn dịch bởi PCV2 (virus số 03 đời 18, số 04 đời 20 và số 07
đời 16)
50
ix
MỞ ĐẦU
Porcine circovirus (PCV) là ADN virus nhỏ sợi đơn, tròn, không có vỏ bọc
bên ngoài, thuộc họ circoviridae. PCV1 (porcine circovirus type 1) được phát hiện
năm 1974 là một loại virus nhiễm trong tế bào nuôi cấy PK15 Tischer et al. (1982).
Mặc dù hiện nay PCV1 lưu hành rộng rãi ở đàn lợn khắp nơi trên thế giới nhưng nó
được biết đến là một virus không có khả năng gây bệnh cho lợn. Một chủng virus
khác được gọi là PCV2 (porcine circovirus type 2) được phát hiện tại Canada trong
những năm 1990 được xác định là nguyên nhân gây hội chứng liên quan tới PCV2
(Porcine circovirus type 2-associated disease, PCVAD). PCV2 tác động đến tế bào
lympho và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch như tế bào đơn nhân, đại thực bào
và tế bào tua (dendritic cell) gây suy giảm miễn dịch, tạo điều kiện thuận lợi cho
nhiều loại mầm bệnh khác xâm nhập và gây bệnh. Trong hầu hết các trường hợp lợn
có triệu chứng lâm sàng rõ khi PCV2 được gây nhiễm đồng thời với một số mầm
bệnh truyền nhiễm hoặc không truyền nhiễm khác Rovira et al. (2002). Tomas et al.
(2008) cho rằng PCV2 là điều kiện cần, cùng với các tác nhân gây nhiễm khác và
điều kiện ngoại cảnh để gây thành bệnh PCVAD.
Hiện nay có ít nhất 3 genotype của virus PCV2 được ghi nhận gồm PCV2a,
PCV2b và PCV2c Dupont et al. (2008). PCV2a và PCV2b đã được chứng minh có
liên quan đến hội chứng bệnh PCVAD với biểu hiện lâm sàng ở các mức độ khác
nhau; trong khi đó PCV2c chỉ được ghi nhận ở một số ít đàn lợn nuôi tại Đan Mạch.
Trước năm 2003, PCV2a và PCV2b đồng thời có mặt ở Châu Âu và Trung Quốc;
trong khi đó chỉ PCV2a có mặt ở Mỹ và Canada Allan et al. (2007); Chae and Choi
(2010). Từ năm 2003, đã có sự đột biến về sự lưu hành của PCV2b ở đàn lợn trên
thế giới, khiến cho PCVAD bùng phát tại nhiều nơi Chae and Choi (2010).
PCV2 có liên quan đến Hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa (postweaning
multisystemic wasting syndrome – PMWS); Hội chứng viêm da và viêm thận
(porcine dermatitis and nephropathy syndrome – PDNS); Hội chứng viêm đường
hô hấp (porcine respiratory diseases complex - PRDC) và Hội chứng rối loạn sinh
sản ở lợn (porcine reproductive disorders - PRD). Trong số các bệnh do circovirus
1
gây ra, PMWS được coi là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho
ngành chăn nuôi lợn. PMWS thường xảy ra ở lợn từ 7 – 16 tuần tuổi. Tỷ lệ ốm
thường dao động từ 4 - 30% (đôi khi lên đến 50 - 60%), tỷ lệ chết từ 4 - 20%
nhưng cũng có thể 50%.
Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu chứng tỏ sự lưu hành cũng
như ảnh hưởng do PCV2 gây ra ở đàn lợn Nguyễn Thị Thu Hồng và cs. (2006);
Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs. (2012).
Tại nhiều nước để phòng bệnh biện pháp hiệu quả là sử dụng vacxin. Ở Việt
Nam chưa có nghiên cứu nào về sản xuất vacxin phòng bệnh do PCV2 gây ra; vì
vậy vấn đề nghiên cứu nhằm tạo ra giống virus sử dụng để sản xuất vacxin phòng
bệnh từ các chủng PCV2 lưu hành gây bệnh ở đàn lợn tại Việt Nam là hết sức cần
thiết. Để có cơ sở giúp lựa chọn được chủng virus PCV2 thuần khiết qua nuôi cấy
trên môi trường tế bào, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu một số
đặc tính sinh học của Porcine circovirus type 2 (PCV2) phân lập tại Việt Nam
dùng làm giống gốc để sản xuất vacxin”.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:
Xác định được đặc tính sinh học của PCV2 phân lập được nhằm chọn được
chủng virus PCV2 có đặc tính kháng nguyên và ổn định để sản xuất vacxin.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn:
- Lựa chọn được chủng virus PCV2 có đặc tính kháng nguyên và ổn định.
- Là cơ sở để nghiên cứu sản xuất vacxin phòng hội chứng còi cọc ở lợn con
do PCV2 gây ra, giúp giảm giá thành sản phẩm và hạn chế thiệt hại kinh tế do bệnh
gây ra đối với ngành chăn nuôi lợn.
2
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một vài nét về PCV2
1.1.1. Phân loại
PCV2 thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae. Họ circoviridae gồm 3
giống, được xác định là nguyên nhân gây một số bệnh ở gia súc và gia cầm:
- Giống Anellovirus: gồm một số circovirus của người như Transfusion
Transmitted Virus hay Torque teno virus (TTV). Virus này được phát hiện lần đầu
tiên vào năm 1997 tại Nhật Bản và thường phân lập được từ bệnh nhân mắc bệnh
gan; tuy nhiên chúng không được coi là nguyên nhân gây bệnh. Một số nghiên cứu
gần đây cho thấy TTV cũng có thể gây bệnh cho một số loài vật nuôi khác như lợn,
và có thể phân lập được từ huyết thanh của lợn mắc PMWS tại Tây Ban Nha
(Francisco de Grau).
- Giống Gyrovirus: thành viên duy nhất của giống này là chicken anemia virus
(CAV) gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà (Chicken Infectiuos Anemia – CIA).
- Giống Circovirus: gồm các virus đã phát hiện được từ động vật như porcine
circovirus type 1 và 2 (circovirus ở lợn), canary circovirus (circovirus ở chim hoàng
yến), bovine circovirus (circovirus ở bò), goose circovirus (circovirus ở ngỗng), ostrich
circovirus (circovirus ở đà điểu), raven circovirus (circovirus ở quạ) và human
circovirus (circovirus gây hội chứng mệt mỏi mạn tính ở người).
Các chủng PCV2 phân lập được trên thế giới có cùng nguồn gốc với mức độ
tương đồng về kiểu gen khoảng 93% Larochelle et al. (2002).
Hiện nay, dựa vào kết quả giải trình tự gen, có 3 genotype PCV2 được chính
thức công nhận, ký hiệu từ PCV2a-2c Segales et al. (2008). Genotype PCV2a và
PCV2b lại có thể được chia thành các cluster khác nhau (ví dụ PCV2a có 5 cluster
2A-2E; PCV2b có 3 cluster 1A-1C).
1.1.2. Hình thái, cấu trúc
PCV mang bộ gen là ADN virus sợi đơn vòng chứa khoảng 1759 nucleotide
(PCV2) và khoảng 1767 - 1768 nucleotide (PCV2) Guo et al. (2010); Olvera et al.
3
(2007). Đây là một virus trần không có vỏ bọc bên ngoài. Bộ gen của PCV2 gồm 11
khung đọc mở ORFs (open reading frame) mã hóa cho các phân tử protein của virus,
trong đó hai khung đọc mở chính (ORF1 và ORF2) theo hướng ngược nhau. Hiện nay
trên thế giới các nghiên cứu về PCV thường tập trung vào ba ORF là ORF1, ORF2
và ORF3 Hamel et al. (1998).
Hình 1.1: Cấu trúc PCV2 Gillespie et al. (2009)
ORF1 mã hóa cho các protein liên quan đến sự nhân lên của virus (viral
replication protein – Rep), có khối lượng phân tử 35,8 kDa. Sự tương đồng amino
acid của phân tử protein quy định bởi ORF1 giữa PCV1 và PCV2 khoảng là 85%.
ORF2 mã hóa cho các protein liên quan đến sự hình thành vỏ capsid của virus
(capsid protein – Cap), có khối lượng phân tử 27,8 kDa. Sự tương đồng amino acid
của phân tử protein do ORF2 mã hóa giữa PCV1 và PCV2 là 66%. Sản phẩm ORF2
chứa các điểm quyết định kháng nguyên, kích thích sinh kháng thể chống lại virus,
vì vậy người ta sử dụng kháng thể nguồn gốc ORF2 như một công cụ để chẩn đoán
phân biệt PCV.
ORF3 mã hóa protein có khối lượng phân tử 11,9 kDa, được cho là có liên
quan đến hiện tượng apoptosis ở tế bào nhiễm virus; sự tương đồng amino acid của
protein này giữa PCV1 và PCV2 là 62%.
4
1.1.3. Tính chất nuôi cấy
Môi trường tế bào thận lợn PK15 rất thích hợp để nuôi cấy PCV2, virus nhân
lên trong nhân tế bào, nhưng không gây bệnh tích tế bào. Tischer et al. (1987) cho
biết tế bào PK15 được xử lý với glucosamine sẽ giúp cho sự nhân lên của PCV2 tốt
hơn. Do PCV2 không gây bệnh tích tế bào nên để khẳng định sự nhân lên của virus
cần phải làm phản ứng miễn dịch huỳnh quang hoặc PCR.
Để phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15 thường mất rất nhiều công
sức và thời gian do phải cấy chuyển nhiều lần, thường chỉ áp dụng trong nghiên cứu
để sản xuất vacxin phòng bệnh Tischer et al. (1987).
1.1.4. Sức đề kháng
PCV2 bền với nhiệt độ và chịu được trong điều kiện pH dao động lớn, có
khả năng sống được 72 giờ ở 800C, 30 phút ở nhiệt độ 70 - 750C và 1 giờ ở 560C; bị
bất hoạt ở pH 3 và bởi chloroform. Ở nhiệt độ phòng, sau 10 phút bị tác động bởi
một số chất sát trùng như chlorhexidine, formol, iodine và cồn thì hiệu giá của virus
sẽ giảm Larochelle et al. (2002).
1.2. Thiệt hại kinh tế do bệnh gây ra
PCV2 được coi là bệnh gây thiệt hại kinh tế nhất cho ngành chăn nuôi lợn tại
Mĩ. Theo thống kê của phòng chẩn đoán trường Đại học Thú y bang Iowa (Mĩ) số
ca mắc bệnh liên quan đến PCV2 (PCV2 associated disease – PCVAD) tăng rõ rệt
theo các năm như bảng 1.1:
Bảng 1.1. Thống kê số ca bệnh liên quan đến PCV2
Năm
Số ca mắc
Năm
Số ca mắc
1993
11
2000
665
1994
14
2001
749
1995
15
2002
1116
1996
18
2003
852
1997
37
2004
719
1998
130
2005
964
1999
449
2006
2095
5
PCV2 và bệnh do PCV2 lưu hành khắp nới trên thế giới. Tại Tây Ban Nha khi
kiểm tra 189 bệnh phẩm và 388 mẫu huyết thanh lợn thu thập được từ năm 1985 đến
1997 bằng phương pháp in situ hybridization (ISH) xác định sự có mặt của ADN của
virus và IPMA xác định kháng thể đặc hiệu kháng PCV2. Kết quả cho thấy 41,3%
(78/189) mẫu bệnh phẩm dương tính với PCV2 và 72,7% (282/388) mẫu huyết thanh
dương tính; chứng tỏ sự lưu hành PCV2 ở đàn lợn tại Tây Ban Nha từ những năm 1985.
Kháng thể kháng PCV2 cũng được xác định trong hầu hết mẫu huyết thanh
lợn thu thập tại Bắc Ailen từ năm 1973 đến năm 1999. Tỷ lệ mẫu huyết thanh
dương tính có sự tăng rõ rệt giữa các năm, cụ thể năm 1988 (100%; 80/80), năm
1999 (92,1%; 129/140) so với năm 1973 chỉ là 61,9% (56/80), năm 1981 (61,3%;
49/80), năm 1984 (55%; 44/80).
1.3. Đường xâm nhập và phương thức truyền lây của PCV2
Bằng thực nghiệm đã chứng minh được PCV2 có thể lây lan từ lợn sang lợn
Dupont et al. (2008). Trong trường hợp nhiễm trùng toàn thân, PCV2 có thể thải ra
ngoài qua dịch tiết của cơ thể, phân và nước tiểu. Thời gian thải virus của lợn nhiễm
PCV2 tự nhiên ≤ 13 ngày tuổi và kéo dài 209 ngày sau khi sinh hoặc sau 69 ngày
gây bệnh thực nghiệm. PCV2 có thể làm lây lan bệnh còn được phát hiện trong sữa
đầu của nái nhiễm virus và sẽ làm lây bệnh cho lợn con Shen et al. (2008).
Tinh dịch của lợn đực nhiễm PCV2 sẽ làm lây bệnh cho đàn nái sinh sản qua
phối giống. Qua thực nghiệm đã chứng tỏ được rằng lợn đực giống mắc bệnh có thể
bài thải PCV2 trong vòng 90 ngày. Khi phối giống bằng tinh dịch của những con
đực nhiễm một lượng lớn PCV2 là nguyên nhân gây rối loạn sinh sản ở lợn nái. Một
điều rõ ràng rằng sự lây lan của PCV2 qua đường thụ tinh phụ thuộc vào liều thụ
tinh, vì nếu tinh dịch chứa một lượng thấp PCV2 sẽ không làm cho lợn nái lây bệnh
Madson et al. (2009).
Khi lợn nái mang thai nhiễm PCV2 có thể truyền cho con con qua nhau thai.
Trong một nghiên cứu ở đàn lợn sinh sản biểu hiện triệu chứng bình thường, 40%
lợn con sinh ra mang PCV2 Shen et al. (2010) tuy nhiên cũng trong nghiên cứu này
có 46% lợn con sinh ra âm tính virus huyết; có thể cho thấy sự truyền qua nhau thai
không xảy ra.
6
Gây bệnh thực nghiệm cho lợn con thấy thời gian nung bệnh dao động từ 2-4
tuần. Trong cơ thể vật chủ, PCV2 đầu tiên sẽ tấn công rồi nhân lên ở hạch amidan
và các hạch lympho. PCV2 cũng tấn công tế bào lympho B rồi thông qua hệ thống
lympho đi khắp nơi đến các cơ quan của cơ thể (như lách, mảng Payer và hạch
lympho). Sau đó PCV2 bắt đầu tấn công tế bào lympho T và các tế bào đơn nhân
máu ngoại vi. Thời gian nhiễm trùng huyết cũng được xác định trong khoảng từ 714 sau khi gây nhiễm. Virus có thể tồn tại rất lâu trong cơ thể, thời gian xác định
được qua thực nghiệm lên đến 125 ngày sau gây nhiễm.
Trong các đường truyền lây của PCV2, môi trường đóng vai trò quan trọng.
Một nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng sự đồng nhiễm PCV2 với PRRS khiến
cho thời gian và lượng virus bài thải tăng lên, điều đó cũng có nghĩa lượng virus tồn
tại ngoài môi trường tăng lên. Đường truyền lây qua không khí giữa các trại có mật
độ chăn nuôi nhiều khiến cho người chăn nuôi cần đặc biệt quan tâm đến vấn đề vệ
sinh an toàn sinh học. Cũng đã có nghiên cứu xác định được lượng ADN của PCV2
với số lượng rất lớn 107 hạt virus/m3 không khí. Ngoài ra dụng cụ chăn nuôi, côn
trùng cũng đóng vai trò truyền lây PCV2. Việc sử dụng vacxin PCV2 phòng bệnh
cũng đã góp phần làm giảm đáng kể PCV2 ngoài môi trường.
1.4. Cơ chế sinh bệnh của PCVAD
Bằng chứng thực tế cho thấy PCVAD là bệnh do nhiều nguyên nhân gây ra
và không phải tất cả lợn mắc PCV2 sẽ biểu hiện lâm sàng của PCVAD. Các yếu tố
được cho rằng ảnh hưởng đến sự nhiễm PCV2 được chia thành 4 nhóm chính gồm:
virus, vật chủ, hiện tượng đồng nhiễm và khă năng miễn dịch của cơ thể.
1.4.1. Yếu tố phụ thuộc virus (Virus – dependent factors)
Một tỷ lệ lớn lợn có triệu chứng lâm sàng khỏe mạnh nhưng bị nhiễm PCV2,
trong khi một số lại có triệu chứng bệnh nặng. Kết quả phân tích đặc điểm di truyền
và giải trình tự các chủng PCV2 phân lập được hiện nay đã không thể giải thích
được sự khác nhau trong biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở lợn. Bộ gen hoàn chỉnh
của 10 chủng PCV2 phân lập tại Hà Lan từ lợn nhiễm và không nhiễm PCVAD cho
thấy mức độ tương đồng dao động từ 95,6 đến 100%. Không có sự sai khác rõ rệt
giữa virus phân lập được từ lợn khỏe mạnh hoặc lợn bị bệnh, khiến cho các nhà
7
khoa học tin tưởng rằng sự khác nhau trong biểu hiện triệu chứng lâm sàng của
bệnh phụ thuộc vào các yếu tố khác ngoài virus.
Từ cuối năm 2004, đã có nhiều bằng chứng cho thấy sự thay đổi về triệu
chứng lâm sàng và mức độ trầm trọng của các ca bệnh có liên quan đến PCV2 tại
Ontario và Quebec, Canada Gagnon et al. (2007). Các nhà chăn nuôi, chẩn đoán và
nghiên cứu đã ghi chép quan sát của họ về biến đổi bệnh tích ở Ontario, bao gồm
hiện tượng phù phổi, viêm ruột dạng hạt, hạch lympho bị teo nặng kèm theo một số
lượng lớn tiểu thể bao hàm do circovirus gây ra, hoại tử hạch lympho liên quan đến
PCV2. Phân tích cho thấy các chủng PCV2 đã thay đổi về type. Một số quan sát
tương tự cũng được ghi nhận tại Quebec, Canada.
1.4.2. Yếu tố phụ thuộc vật chủ (Host – dependent factors)
Một nghiên cứu thuần tập Cohort study được tiến hành để điều tra khả năng
kháng bệnh do PCV2 gây ra ở lợn Pietrain bằng cách điều chỉnh đặc tính di truyền
thông qua thụ tinh nhân tạo ở 4 trại lợn mắc PMWS. Một nửa nái của trại được thụ
tinh với tinh dịch của lợn Pietrain và số còn lại được thụ tinh với tinh dịch của
giống lợn vẫn thường dùng ở trại. Bệnh liên quan đến PCV2 ở đàn lợn con sinh ra
bởi đực giống Pietrain không khác biệt so với lợn đực giống khác dựa vào chỉ tiêu
PCV2 trong máu, tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết. Ngược lại, một thử nghiệm thực tế sử dụng
5000 nái được chia thành 3 nhóm khác nhau (100% Pietrain, 50% Đại Bạch/50%
Pietrain và 25% Đại Bạch/75% Duroc) đã chứng tỏ đặc tính di truyền của động vật
đã ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng biểu hiện triệu chứng bệnh PCVAD như tăng tỷ lệ
chết của lợn con dòng Đại Bạch/Duroc so với 2 dòng kia.
1.4.3. Ảnh hưởng của hiện tượng đồng nhiễm (Effect of coinfection)
Nghiên cứu thực nghiệm gây bệnh đồng nhiễm cho lợn bằng PCV2 và virus
PPV, PRRSV hoặc vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae đã làm tăng lượng PCV2
và bệnh tích liên quan đến PCV2 cũng như tăng tỷ lệ (incidence) lợn mắc PCVAD.
Thực tế khả năng kích thích ảnh hưởng của sự đồng nhiễm đến sự nhân lên của
PCV2 và bệnh PCVAD được phát hiện rất vô tình khi gây nhiễm lợn (gnotobiotic
pig) với chất lọc dịch nuôi cấy tế bào và dịch lọc huyễn dịch bệnh phẩm hạch
lympho của lợn mắc PCVAD tự nhiên. Gây bệnh thực nghiệm khi tiêm cho lợn đã
8
gây triệu chứng lâm sàng của PCVAD; tuy nhiên, cả PCV2 và PPV đều được tìm
thấy trong dịch tiêm bệnh phẩm và cả ở lợn.
Hiện tượng đồng nhiễm phổ biến xảy ra ở 484 lợn ở Mĩ mắc PCV2 hệ thống
được tổng kết năm 2002. PRRSV được xác định ở 52% (251/484) các ca bệnh; M.
hyopneumoniae phát hiện được trong 36% (172/484), vi khuẩn bại huyết và/hoặc
viêm phổi trong 22% (105/484), cúm lợn (swine influenza virus – SIV) trong 5,4%
(26/484) và nhiễm trùng PCV2 đơn chỉ có ở 2% (9/484) ca bệnh. Virus gây bệnh
Giả dại cũng nhiễm đồng thời với PCV2 trong các ca bệnh PCVAD cũng đã được
ghi nhận ở lợn có hiện tượng hoại tử hạch amidan và viêm hạch lympho.
Pogranichniy et al. (2002) đã tiến hành nghiên cứu bệnh-chứng những lợn có triệu
chứng còi cọc và có bệnh tích vi thể đặc trưng của PCVAD với lợn đối chứng
không có triệu chứng lâm sàng cũng như không có bệnh tích đặc trưng của PCVAD.
1.4.4. Ảnh hưởng của trạng thái miễn dịch của cơ thể (Effect of immune modulation)
Kích thích hệ miễn dịch: Một số nghiên cứu chỉ ra kích thích hệ thống miễn
dịch có thể khiến cho lợn nhiễm PCV2 bị bệnh với biểu hiện bệnh tích đặc trưng
của PCVAD. Krakowka et al. (2011) đã gây bệnh thực nghiệm bằng cách kích thích
đáp ứng miễn dịch của lợn (gnotobiotic pig) với limpet hemocyanin trong bổ trợ
Freund không hoàn toàn, sau đó gây nhiễm với PCV2. Dựa trên kết quả bước đầu
đã có bằng chứng cho thấy ảnh hưởng của các chất bổ trợ trong vacxin đến nguy cơ
hình thành bệnh liên quan đến PCV2; giúp khẳng định giả thuyết cho rằng một số
chất bổ trợ vacxin, trong điều kiện nhất định có thể khiến cho lợn mắc bệnh liên
quan đến PCV2. Ngược lại, một số tác giả đã chứng minh được rằng PCVAD có thể
do nhiễm PCV2 mà không cần tác nhân đồng nhiễm hay yếu tố kích thích miễn
dịch, PCV2 có thể là nguyên nhân nguyên phát gây bệnh trong một số trường hợp.
Một vấn đề cấn lưu ý nữa là với các loại vacxin đang dùng, thì thời gian sử dụng
vacxin có chất bổ trợ và tuổi của lợn tại thời điểm nhiễm PCV2 có thể là yếu tố khiến
cho bệnh bùng phát. Một nghiên cứu của Opriessnig et al. (2006) đã xác định xem liệu
thời gian tiêm vacxin (loại vacxin M. hyopneumoniae đã được thương mại hóa) có ảnh
hưởng đến sự nhân lên của PCV2 và mức độ trầm trọng của bệnh tích có liên quan đến
PCV2 hay không và đã kết luận rằng bệnh tích liên quan đến PCV2 của lợn không hoặc
ảnh hưởng rất ít khi lợn được tiêm vacxin 2-4 tuần trước thời điểm bị nhiễm PCV2.
9
Suy giảm miễn dịch. Mười hai lợn (gnotobiotic pig) được gây nhiễm với
PCV2 ở thời điểm 1 ngày tuổi Krakowka et al. (2002). Trong đó có 4 lợn được
uống cyclosporine hàng ngày, 4 lợn được tiêm bắp corticosteroid (triamcinolone
aceonide suspension) hai lần 1 tuần. Với nhóm lợn được xử lý cyclosporine đã có
hiện tượng tăng sự nhân lên của PCV2 và thúc đẩy sự lây lan của PCV2 trong tế
bào gan. Các phản ứng viêm đặc trưng của PCVAD không xuất hiện mặc dù mô bào
chứa một lượng lớn virus; do đó có thể kết luận bệnh tích viêm u hạt là do hệ miễn
dịch của cơ thể. Trong một nghiên cứu khác Kawashima et al. (2003) sử dụng 7 lợn
mổ bụng lấy thai, không bú sữa đầu được gây nhiễm PCV2 qua xoang bụng và nhỏ
mũi. Ba trong số 7 lợn được xử lý với dexamethasone ở ngày tuổi thứ 8 và có biểu
hiện viêm hạch lympho dạng u hạt mà không quan sát được bệnh tích này ở nhóm
lợn chỉ gây nhiễm PCV2. Điều đó giúp nhóm tác giả có thể kết luận rằng
dexamethasone đã ảnh hưởng đến sự nhiễm PCV2 trong mô lympho và gây suy giảm
miễn dịch qua trung gian tế bào có thể là tác nhân gây bệnh PCVAD.
1.5. Các dạng biểu hiện của PCVAD
1.5.1. Nhiễm PCV2 thể cận lâm sàng
Một chẩn đoán PCV2 thể cận lâm sàng dựa vào tiêu chí mặc dù có mặt
PCV2 nhưng không gây thành bệnh ở lợn (ví dụ: lượng kháng nguyên PCV2 nhỏ
liên quan đến hiện tượng lợn có bệnh tích rất ít). Dựa vào kết quả nghiên cứu thực
nghiệm gây bệnh PCV2 cho lợn người ta xác định được sự nhiễm PCV2 và bệnh
tích có thể giới hạn ở 1 đến 2 hạch lympho ở lợn mà không có biểu hiện lâm sàng.
Tuy nhiên, thực nghiệm cũng chỉ rõ rằng việc nhiễm PCV2 có liên quan đến việc
giảm hiệu quả sử dụng vacxin.
Hiện tượng viêm hoại tử hạch lympho liên quan đến PCV2 ở từng hạch
lympho của lợn khỏe mạnh cũng được mô tả. Bệnh tích chủ yếu là các nang lympho
bị hoại tử ở giữa và giới hạn ở 1-2 hạch lympho. Sự sai khác này chưa thực sự rõ ràng
khi so sánh với các trường hợp xác chết có hạch lympho sưng to bị tích thu hoặc
không được phép sử dụng làm thực phẩm cho người được chuyển từ các lò giết mổ
đến phòng chẩn đoán để khẳng định hiện tượng viêm hoại tử hạch lympho.
10
1.5.2. Hiện tượng nhiễm trùng hệ thống liên quan đến PCV2 (PCV2-associated
systemic infection)
Triệu chứng đầu tiên là hiện tượng giảm tăng trọng hoặc giảm tốc độ tăng
trưởng, lợn nhợt nhạt, có chứng hoàng đản, gầy còm và khó thở. Lợn mắc bệnh có
thể khó thở, ho và ỉa chảy phân sẫm màu. Bệnh tích đại thể bao gồm hiện tượng
sưng hạch lympho. Phổi thường xẹp và có các điểm hoại tử, trong trường hợp mạn
tính thận có các nốt hoại tử trắng. Một số trường hợp dạ dày bị xuất huyết và loét.
Cũng như tên gọi của bệnh, hiện tượng nhiễm trùng hệ thống liên quan đến PCV2
được đặc trưng bởi bệnh tích viêm dạng hạt hoặc teo ở các tổ chức lympho và/hoặc
phổi, gan, thận, tim và ruột.
Một hệ thống cho điểm sử dụng 7 mô lympho và xác định mức độ trầm trọng
của bệnh tích, lượng kháng nguyên PCV2 và sự phân bố bệnh tích. Tóm tắt như
sau: mỗi mô lympho (ví dụ hạch lympho khí phế quản, hạch bẹn nông, hạch màng
treo ruột, hạch amidan và lách) được ghi điểm từ 0 đến 9 (hạch bị teo nhỏ điểm từ
0-3, viêm dạng u hạt điểm từ 0-3, PCV2 IHC điểm từ 0-3). Điểm riêng lẻ của 7 tổ
chức được cộng lại và chia đều. Tùy thuộc vào giá trị cuối cùng, một con lợn được
xếp loại như không có bệnh tích liên quan đến PCV2 (0 điểm), bệnh tích liên quan
nhẹ (điểm từ 1-3), bệnh tích liên quan đến PCV2 trung bình (điểm từ 4-6) hoặc
bệnh tích nặng (điểm từ 7-9). Hệ thống cho điểm này rất có ý nghĩa để phân loại
mức độ trầm trọng khi gây bệnh thực nghiệm trong đó có cả PCVAD. Tuy nhiên
trong thực tế lâm sàng, vì thường một bộ các cơ quan lympho thường không được
lấy đầy đủ. Các tác giả đã đề xuất để chẩn đoán nhiễm trùng PCV2 hệ thống cần
chứng minh kháng nguyên PCV2 có ít nhất trong 1 cơ quan lympho (hạch lympho,
hạch amidan, lách) hoặc trong 1 cơ quan lympho (hạch lympho, hạch amidan, lách)
và ít nhất 1 cơ quan hệ thống (ví dụ phổi, gan, thận và ruột) hoặc trong 2 cơ quan hệ
thống như phổi, gan, thận, ruột. Nếu lượng kháng nguyên PCV2 nhiều chỉ liên quan
đến 1 cơ quan đặc hiệu, được xếp vào bệnh hệ thống ví dụ đường hô hấp liên quan
đến PCV2 (PCV2-associated respiratory disease), bệnh đường tiêu hóa liên quan
đến PCV2 (PCV2-associated enteritis) hoặc hội chứng rối loạn sinh sản liên quan
đến PCV2 (PCV2-associated reproductive failure) hơn là sử dụng cụm từ bệnh hệ
11
thống liên quan đến PCV2 (PCV2-associated systemic infection). Nếu chỉ có một
lượng ít kháng nguyên PCV2 nhưng bệnh tích nặng, được xếp là bệnh PCVAD mạn
tính. Với sự kết hợp điểm bệnh tích và lượng kháng nguyên PCV2 cũng có thể đánh
giá được giai đoạn của bệnh.
1.5.3. Bệnh đường hô hấp liên quan đến PCV2 (PCV2-associated respiratory disease)
Nghiên cứu lâm sàng hiện chỉ ra rằng PCV2 có thể đóng vai trò quan trọng
trong bệnh đường hô hấp phức hợp ở lợn (porcine respiratory disease complex –
PRDC). PRDC là hiện tượng bệnh lý gặp chủ yếu ở lợn từ 8-26 tuần tuổi và có liên
quan đến nhiều tác nhân bệnh lý gây bệnh như PRRSV, SIV và M. hyopneumoniae.
PRDC đặc trưng bởi hiện tượng giảm khả năng tăng trọng, giảm khả năng chuyển
hóa thức ăn, biếng ăn, sốt, ho và khó thở. Có thể chẩn đoán nhầm lẫn giữa bệnh
nhiễm trùng hệ thống liên quan đến PCV2 (PCV2-associated systemic infection) và
viêm phổi liên quan đến PCV2 (PCV2-associated pneumonia). Hiện tượng viêm
tiểu phế quản với viêm kẽ phổi được ghi nhận lần đầu tiên trong hội chứng còi cọc
ở lợn con PMWS Clark EG (1997). Bệnh viêm phổi liên quan đến PCV2 đặc trưng
bởi hiện tượng viêm kẽ phổi lympho bào đến dạng u hạt, viêm tơ huyết phế quản và
viêm phế quản loét hoặc hoại tử từ nhẹ đến nặng.
1.5.4. Hiện tượng viêm ruột liên quan đến PCV2 (PCV2-associated enteritis)
Các trường hợp viêm ruột ở lợn liên quan đến PCV2 ngày càng tăng trong
thời gian gần đây. Trên thực tế hầu hết các ca bệnh xảy ra ở lứa tuổi lợn từ 8 đến 16
tuần tuổi. Các trường hợp bệnh viêm ruột liên quan đến PCV2 thường có triệu
chứng lâm sàng và biểu hiện gần giống với hiện tượng viêm hồi tràng thể mạn tính
và á cấp tính liên quan đến tác nhân gây bệnh là Lawsonia intracellularis. Niêm
mạc ruột thường sưng dày lên, hạch màng treo ruột cũng sung rất to. Kiểm tra bệnh
tích vi thể để khẳng định hiện tượng viêm ruột dạng u hạt, liên quan đến kết quả
nhuộm hóa mô miễn dịch có rất nhiều kháng nguyên PCV2.
1.5.5. Hiện tượng rối loạn sinh sản ở lợn liên quan đến PCV2 (PCV2-associated
reproductive failure)
Đã có những báo cáo cho biết hiện tượng rối loạn sinh sản liên quan đến
PCV2 ở miền Tây nước Canada từ năm 1999 West et al. (1999). Triệu chứng lâm
12
sàng ở những đàn bị bệnh gồm hiện tượng sảy thai, thai chết non, khô thai và tỷ lệ
chết ở lợn con theo mẹ cao. Lợn bị ảnh hưởng chủ yếu là lợn nái hậu bị hoặc những
đàn mới gây. Ngoại tâm mạc bị viêm tơ huyết hoặc viêm hóa mủ đến hoại tử với số
lượng lớn kháng nguyên PCV2 là bệnh tích điển hình của lợn bị sảy thai hoặc thai
chết non.
1.5.6. Hội chứng viêm da thận liên quan đến PCV2 (PCV2-associated PDNS)
PDNS được đặc trưng bởi hiện tượng viêm da cấp tính (tiến triển từ biểu
hiện da có màu tím đến hiện tượng có các nốt tròn đỏ tím, giữa nhân màu đen tập
trung nhiều nhất ở vùng da mỏng gần chân), sốt, bỏ ăn. Một bệnh tích đại thể rất
đặc trưng là thận có các nốt hoại tử màu trắng và xuất huyết điểm. Kiểm tra bệnh
tích vi thể có hiện tượng viêm mạch máu hệ thống với biểu hiện viêm thận tiểu cầu
tơ huyết và hoại tử, hoại tử da.
1.6. Phương pháp chẩn đoán bệnh PCVAD
Thời điểm 2007, kĩ thuật ISH và hóa mô miễn dịch (IHC) được coi là gold
standard để xác định PCV2 trong chẩn đoán PCVAD. Hiện nay sử dụng kĩ thuật
PCR hoặc real time PCR giúp chẩn đoán bệnh chính xác.
1.6.1. Xác định kháng thể kháng PCV2 bằng phản ứng kháng thể huỳnh quang,
IPMA, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) và phản ứng trung hòa
virus (serum virus neutralization assay)
Phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp. Phản ứng này không tự động và
kết quả đọc không theo chủ quan. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp IFA
để xác định PCV2 được nhiều tác giả mô tả. Hiện nay phản ứng IFA dựa trên khung
đọc mở ORF2 protein của virus được phát triển, cho thấy phản ứng IFA dựa trên
toàn bộ virus PCV2 có độ nhạy tương đối chỉ bằng 57,1% so với phản ứng dựa vào
ORF2 protein. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang cũng được mô tả để xác định
kháng thể kháng PCV1, có tính đặc hiệu. Các nghiên cứu chỉ ra rằng có phản ứng
chéo thấp giữa PCV1 và PCV2 khi kiểm tra bằng phản ứng IFA.
IPMA. Đây là phản ứng không tụ động, end point được xác định theo chủ
quan. IPMA để xác định PCV2 được sử dụng rộng rãi. Các kiểm tra so sánh liên phòng
phản ứng IFA và IPMA với 20 mẫu huyết thanh được thực hiện tại các phòng thí nghiệm
13
khác nhau ở Châu Âu và Canada thấy có sự khác biệt lớn về hiệu giá giữa các phòng.
Nhìn chung IPMA cho hiệu giá cao hơn IFA, việc sử dụng paraformaldehyde để cố định
tiêu bản cho hiệu giá cao hơn sử dụng acetone hoặc cồn ethyl.
ELISA. Phản ứng ELISA có độ nhạy để định tính và định lượng kháng thể
kháng PCV2 trong huyết thanh. Hiện có một số báo cáo về việc sử dụng phản ứng
ELISA để xác định kháng thể kháng PCV2. Kit đã được thương mại hóa (Ingezim
PCV IgGa) để xác định kháng thể IgG và kit Ingezim PCV IgMa) để xác định Ig M
tại các nước Châu Âu. Việc so sánh Ig G và IgM rất có ý nghĩa để xác định thời
gian nhiễm PCV2: giá trị IgM ≥ IgG: giai đoạn đầu (early active infection) nhiễm
PCV2 (khoảng 21 ngày sau khi nhiễm); giá trị IgM < IgG: giai đoạn nhiễm (active
infection) PCV2 (khoảng 20 – 50 ngày sau khi nhiễm); nếu giá trị IgG cao và IgM
âm tính: giai đoạn nhiễm cuối (late or resolving infection of covalescent) (khoảng 2
tháng sau khi nhiễm) Segales et al. (2005). Một loại phản ứng ELISA khác nữa là
kit cạnh tranh (competitive hay blocking) ELISA. Đây là phản ứng đặc hiệu xác
định kháng thể kháng PCV2 (SERELISA PCV2 Ab Mono Blockingb) được sử dụng
phổ biến ở Châu Âu. Kit ELISA cũng được sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng
PCV2 trong phân Lopez et al. (2005).
Serum-virus neutralization assay. Phản ứng trung hòa kháng thể xác định
PCV2 đã được mô tả trong nhiều tài liệu. Kháng thể trung hòa được xác định trong
15 và 28 ngày sau khi nhiễm PCV2 tương ứng với thời gian nhiễm bảo hộ hoặc biến
mất của PCV2 ở lợn gnotobiotic. Vì PCV2 không gây bệnh tích tế bào nên để đánh
giá phản ứng trung hòa virus phải thông qua phản ứng miễn dịch huỳnh quang (FA)
hoặc phản ứng immunoperoxidase. Với yêu cầu xử lý tế bào trước khi nuôi cấy để
đồng bộ hóa chu kì của tế bào khiến cho phản ứng trung hòa virus rất khó thực hiện,
và hiệu giá end-point có thể kém chính xác. Thông thường, tỷ lệ phần trăm các mẫu
dương tính sẽ giảm nếu sử dụng phản ứng trung hòa virus.
1.6.2. Xác định PCV2 nucleic acids bằng phản ứng PCR và ISH
PCR. Hiện nay có một số phản ứng PCR được sử dụng để xác định PCV2 nucleic
acid. Có nhiều loại PCR được sử dụng như sau: 1) Multiplex PCR. Có hơn 1 trình tự gen
đích được khuếch đại so với phản ứng PCR đơn. Một số kĩ thuật multiplex PCR có thể
14
xác định được PCV2/PCV1; PCV2/PPV và PCV2/pseudorabies virus/PPV; 2) Phản ứng
nested PCR. Để có thể xác định một lượng rất nhỏ đoạn gen đích; 3) Multiplex-nested
PCR được sử dụng để xác định PCV1/PCV2/PPV và PCV1/PCV2; 4) Quantitative
real-time PCR là phản ứng cho phép xác định được lượng PCV2 genomic copy
number trong huyết thanh hoặc mô bào. Phản ứng PCR được kết hợp trong 1 bước,
giúp giảm thời gian thực hiện; 5) Reverse transcription PCR dùng để xác định
PCV2 RNA, có mặt trong quá trình nhân lên của PCV2. Phản ứng này yêu cẩu phải
có AND bổ sung (complementary DNA) cho sự khuếch đại sau này.
ISH. Kĩ thuật này sử dụng một DNA probe gắn nhãn tương ứng với một phần
đặc hiệu của bộ gen virus (PCV2 genome). Một số phản ứng ISH xác định nhiều
virus cùng nhân lên trong mô bào như PCV1/PCV2; PCV2/PRRSV và PCV2/PPV.
1.6.3. Xác định virus PCV2 hoặc kháng nguyên virus bằng IHC, phân lập virus,
IFA, FA trong mô bào và antigen-capture ELISA
IHC. IHC sử dụng kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng để xác định kháng
nguyên PCV2 trong mô bào đã được cố định trong formalin, đúc phiến paraffin.
Với phương pháp này, có thể xác định được vị trí của virus trong mô bào. Nó cũng
xác định lượng virus ở mức tối thiểu 108 PCV2 genome trên 500ng DNA để có thể
nhìn rõ khi nhuộm IHC. Một phép so sánh giữa IHC và ISH với các mô bào lấy thừ
lợn bị bệnh được bảo quản 6 tháng trong dung dịch formol 10% trước khi đúc
paraffin cho thấy cả hai phương pháp đều có thể xác định được kháng nguyên hoặc
nucleic acid trong các mô bào được kiểm tra. ISH được cho là đặc hiệu hơn so với
IHC, đặc biệt khi so sánh với trường hợp IHC sử dụng kháng thể đa dòng.
Phân lập virus (virus isolation). Tế bào PK15 giúp cho sự nhân lên của virus
in vitro và các tế bào này có thể được gây nhiễm với dịch cơ thể hoặc huyễn dịch
bệnh phẩm lấy từ lợn nghi ngờ mắc PCV2. Tế bào được xử lý glucosamine cho thấy
hỗ trợ rất hiệu quả cho sự nhân lên của virus. Bệnh tích tế bào do PCV2 gây ra
không quan sát được nên để xác định sự nhân lên của virus cần phải sử dụng phản
ứng miễn dịch huỳnh quang hoặc nhuộm immunoperoxidase. Việc phân lập PCV2
ít được thực hiện do mất nhiều thời gian và ít hiệu quả, vì virus đòi hỏi thời gian cấy
chuyền lâu và tự dung giải trong mô bào trong quá trình vận chuyển khiến cho khả
15
