Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein từ ba kích làm nguyên liệu thiết lập chuẩn

MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. BA KÍCH............................................................................................... 3
1.1.1. Tên khoa học................................................................................ 3
1.1.2. Mô tả cây ...................................................................................... 3
1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến ...................................................... 4
1.1.4. Công dụng .................................................................................... 5
1.1.5. Thành phần.................................................................................. 6
1.2. NHÓM HOẠT CHẤT IRIDOID GLYCOSID ................................. 8
1.3. MONOTROPEIN................................................................................. 9
1.3.1. Đặc điểm và tính chất ................................................................. 9
1.3.2. Tác dụng dược lý của monotropein......................................... 10
1.4. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ
DƯỢC LIỆU .............................................................................................. 11
1.4.1. Vài nét về chiết xuất dược liệu ................................................. 11
1.4.2. Vài nét về phân lập và tinh chế ................................................ 12
1.5. CHẤT CHUẨN ĐẶC TRƯNG TỪ DƯỢC LIỆU .......................... 12
1.5.1. Vài nét về chất chuẩn................................................................ 12
1.5.2. Khái quát về thiết lập chất chuẩn từ dược liệu ...................... 14


1.5.3. Tình hình nghiên cứu chất chuẩn kiểm nghiệm Ba kích ...... 16
1.6. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI
..................................................................................................................... 17
1.6.1. Sắc ký lớp mỏng ........................................................................ 17

1.6.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).......................................... 20
1.6.3. Phổ khối (MS) ............................................................................ 23
1.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)....................................... 24
1.6.5. Sắc ký cột ................................................................................... 25
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 28
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................... 28
2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................ 28
2.1.2. Chế phẩm ................................................................................... 28
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ...................................................... 29
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ ....................................................................... 29
2.2.2. Dung môi, hoá chất ................................................................... 30
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 31
2.3.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein từ Ba kích .... 31
2.3.2. Định tính, xác định cấu trúc monotropein tinh chế được ..... 32
2.3.3. Xác định hàm lượng monotropein tinh chế được .................. 32
2.3.4. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng
monotropein trong Ba kích ................................................................ 33
2.3.5. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng
monotropein trong chế phẩm chứa Ba kích ..................................... 35
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................ 36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 37


3.1. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ MONOTROPEIN TỪ
BA KÍCH.................................................................................................... 37
3.1.1. Chiết xuất iridoid glycosid ....................................................... 37
3.1.2. Phân lập và tinh chế monotropein từ hỗn hợp các iridoid
glycosid ................................................................................................. 39
3.2. ĐỊNH TÍNH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MONOTROPEIN TINH
CHẾ ĐƯỢC ............................................................................................... 42

3.3. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONOTROPEIN TINH CHẾ ĐƯỢC
..................................................................................................................... 45
3.3.1. Xác định tinh khiết bằng HPLC .............................................. 45
3.3.2. Xác định hàm ẩm bằng TGA ................................................... 47
3.4. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
MONOTROPEIN TRONG BA KÍCH.................................................... 48
3.4.1. Chuẩn bị mẫu ............................................................................ 48
3.4.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký ........................................................ 48
3.4.3. Xây dựng phương pháp phân tích monotropein trong Ba kích
............................................................................................................... 51
3.4.4. Thẩm định phương pháp phân tích monotropein trong Ba
kích ....................................................................................................... 52
3.5. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
MONOTROPEIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA BA KÍCH ............... 60
3.5.1. Chuẩn bị mẫu ............................................................................ 60
3.5.2. Xây dựng phương pháp phân tích monotropein trong chế
phẩm chứa Ba kích ............................................................................. 61
3.5.3. Thẩm định phương pháp phân tích monotropein trong chế
phẩm chứa Ba kích ............................................................................. 62
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................. 68


4.1. NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ, PHƯƠNG PHÁP CỦA ĐỀ TÀI . 68
4.1.1. Về chiết xuất, phân lập và tinh chế ......................................... 68
4.1.2. Cấu trúc monotropein tinh chế được ...................................... 68
4.1.3. Định tính, định lượng monotropein trong Ba kích và chế
phẩm chứa Ba kích bằng HPLC ........................................................ 68
4.2. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ............................................ 69
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 71
1. KẾT LUẬN ............................................................................................ 71

2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 72


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitril

DAD

Detector Diod Array - Detector chuỗi (dãy) diốt phát quang

DĐVN

Dược điển Việt Nam

DMFM

Dung môi pha mẫu

H3PO4

Acid phosphoric

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

KH2PO4

Kali dihydrophosphat

LC-MS

Sắc ký lỏng – khối phổ

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ

Giới hạn định lượng

MeOH

Methanol

MS

Phổ khối

NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

PA

Đạt tinh khiết phân tích

RP-HPLC

Sắc ký lỏng pha đảo

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

SĐK

Số đăng ký

SKĐ

Sắc ký đồ

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TGA

Phân tích nhiệt trọng lượng

USP

Dược điển Mỹ

UV-VIS

Quang phổ tử ngoại – khả kiến

VKNTTW

Viện Kiểm nghiệm thuốc TW

VKNT TP.HCM Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng

Nội dung

Trang

1.1

Một số chất nhóm anthraquinon trong Ba kích

6

1.2

Một số chất nhóm iridoid trong Ba kích

7

2.1

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

30

2.2

Chương trình gia nhiệt của máy TGA

33

3.1

Kết quả xác định hàm ẩm monotropein bằng TGA

47

3.2

Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký

55

3.3

Kết quả khảo sát tính tuyến tính

56

3.4

Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với mẫu Ba kích

57

3.5

Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian với mẫu thử Ba

58

kích
3.6

Kết quả đánh giá độ đúng với mẫu thử Ba kích

59

3.7

Kết quả khảo sát LOD và LOQ

60

3.8

Kết quả khảo sát độ lặp lại với chế phẩm Hatkick

65

3.9

Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian định lượng

66

monotropein trong chế phẩm Hatkick
3.10

Kết quả đánh giá độ đúng với chế phẩm Hatkick

67


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Nội dung

Trang

1.1

Cây Ba kích (Morinda officinalis How) mẫu trồng tại Lục

4

Ngạn, Bắc Giang
1.2

Rễ Ba kích (Radix Morindae) mẫu trồng tại Lục Ngạn, Bắc

5

Giang
1.3

Công thức cấu tạo của monotropein

9

1.4

Đường nystose

16

1.5

Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

20

2.1

Chế phẩm HatKick

28

2.2

Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ và cộng hưởng từ hạt nhân

30

dùng trong nghiên cứu
3.1

SKĐ định tính Ba kích bằng sắc ký lớp mỏng

38

3.2

Phổ MS của phân đoạn A2

39

3.3

Phổ MS của phân đoạn B2

40

3.4

Sơ đồ chiết xuất monotropein từ Ba kích

41

3.5

Phổ 1H NMR của hợp chất monotropein

43

3.6

Phổ 13C NMR của hợp chất monotropein

43

3.7

Phổ khối phân giải cao của monotropein tinh chế được

44

3.8

Giá trị độ tinh khiết píc tại vị trí xuất hiện píc monotropein

45

3.9

SKĐ monotropein tinh chế so sánh với mẫu trắng

46

3.10

Phổ TGA của monotropein

47


3.11

Sắc ký đồ khảo sát hệ pha động

49

3.12

Kết quả quét phổ UV monotropein

50

3.13

SKĐ của mẫu chuẩn, mẫu thử Ba kích và mẫu trắng

52

3.14

Phổ tinh khiết píc mẫu chuẩn, mẫu thử Ba kích

53

3.15

Chồng phổ UV-Vis pic monotropein của chuẩn và pic

54

monotropein trong mẫu thử Ba kích
3.16

Độ phân giải giữa pic monotropein với pic tạp trên SKĐ

54

mẫu thử Ba kích
3.17

Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích

56

pic monotropein
3.18

SKĐ giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng

60

(LOQ)
3.19

SKĐ của mẫu chuẩn, mẫu trắng, mẫu thử Hatkick và

62

placebo
3.20

Phổ tinh khiết píc mẫu chuẩn, mẫu thử Hatkick

63

3.21

Chồng phổ UV-Vis monotropein chuẩn và mẫu thử Hatkick

64

3.22

Độ phân giải giữa pic monotropein với pic tạp trên SKĐ chế

64

phẩm chứa Ba kích


ĐẶT VẤN ĐỀ
Thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng được sử dụng rộng rãi ở
nhiều nước trên thế giới. Ngay tại Việt Nam, trong mấy năm gần đây việc sử

dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu đã và đang gia tăng. Thị trường
dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu vì thế rất đa dạng và phong phú về
nguồn gốc và chủng loại. Ngoài ra, các sản phẩm thực phẩm chức năng có
nguồn gốc từ dược liệu đã và đang phát triển mạnh mẽ.
Dược liệu dùng làm thuốc được cung cấp từ nguồn thu hái tự nhiên,
trồng trọt và nhập khẩu. Nguồn gốc dược liệu phức tạp, không rõ ràng, số
lượng lại lớn khó kiểm soát dẫn đến tình trạng dược liệu giả mạo, nhầm lẫn,
kém chất lượng vẫn được tự do lưu thông trên thị trường gây ảnh hưởng
không tốt đến độ an toàn, hiệu lực và chất lượng của các chế phẩm từ dược
liệu. Trong khi đó công tác kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu gặp nhiều
khó khăn do thiếu chất chuẩn với vai trò là hoạt chất hoặc chất đặc trưng cho
dược liệu. Chất chuẩn dùng cho dược liệu hiện nay thường được nhập từ
Trung Quốc với giá thành tương đối cao và nguồn hàng thường không ổn
định, ảnh hưởng đến công tác nghiên cứu và công tác kiểm tra chất lượng
thuốc thảo dược, do đó việc tạo lập chất chuẩn là cần thiết.
Dược liệu Ba kích (sau đây gọi chung là Ba kích) với những tác dụng
sinh học quý giá như làm tăng sức dẻo dai, tăng sức đề kháng, chống viêm,
tăng cường khả năng sinh dục… từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong dân
gian theo phương thức truyền thống là ngâm rượu hoặc trong các bài thuốc
đông y. Theo danh mục số đăng ký thuốc trong nước cấp SĐK từ 2010 đến
hết tháng 4/2016 hiện có 36 chế phẩm có thành phần Ba kích gồm: dạng viên
hoàn cứng, thuốc nước, viên nang cứng, cao lỏng, hoàn mềm và dược liệu,
ngoài ra còn rất nhiều thực phẩm chức năng chứa Ba kích cũng đang được
cấp phép lưu hành trên thị trường [4].
1


Thành phần hóa học chính của Ba kích là anthranoid và irridoids, trong
đó có một lượng đáng kể là monotropein (một chất thuộc nhóm iridoids). Tuy
nhiên, hiện nay chúng ta chưa thiết lập được các chất chuẩn là hoạt chất đặc

trưng cho Ba kích trong đó có monotropein để kiểm tra dược liệu này.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đòi hỏi phải có chất chuẩn nhằm bổ sung
vào quỹ chất chuẩn quốc gia phục vụ công tác kiểm tra và quản lí chất lượng
dược liệu nói chung và chế phẩm có chứa Ba kích nói riêng, chúng tôi tiến
hành đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein từ
Ba kích làm nguyên liệu thiết lập chuẩn” với các mục tiêu:
- Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein từ Ba kích có độ tinh
khiết đáp ứng yêu cầu làm nguyên liệu thiết lập chuẩn.
- Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng monotropein
trong Ba kích và chế phẩm chứa Ba kích.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. BA KÍCH
1.1.1. Tên khoa học
Cây Ba kích có tên khoa học là Morinda officinalis How., họ Cà phê
Rubiaceae.
Một số tên gọi khác: Ba kích thiên, dây ruột gà, chẩu phóng xì (Hải
Ninh), thau tày cáy (Tày), chồi hoàng kim, sáy cày (Thái), chày kiang dòi
(Dao), liên châu Ba kích, Medicinal indian mulberry (Anh) [5],[6],[8],[15].
1.1.2. Mô tả cây
Ba kích là một loại cây thân thảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn, dài
hàng mét. Thân non màu tím, có lông, sau nhẵn. Cành non có cạnh. Lá mọc
đối, hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, dài 6-14 cm, rộng 2,5-6
cm, cuống ngắn, lúc non có lông dày hơn ở mặt dưới, thường tập trung ở các
gân và mép lá, màu xanh lục, sau già lá ít lông hơn và có màu trắng mốc; lá
kèm mỏng, ôm sát vào thân. Hoa nhỏ, màu trắng sau hơi vàng, tập trung
thành tán ở đầu cành, dài 0,8-1,5cm; đài hoa hình chén hay hình ống gồm

những lá đài nhỏ phát triển không đều; tràng hoa hàn liền ở phía dưới thành
ống ngắn, nhị 4, bầu hạ. Quả hình cầu, rời nhau hoặc dính liền thành khối, khi
chín màu đỏ, mang đài còn lại ở đỉnh. Mùa hoa: tháng 5-6. Mùa quả: tháng 710 [5],[6],[8],[15].
Hiện nay Ba kích vẫn bị nhầm lẫn: do hình dáng giống với Ba kích lông
(Morinda cochinchinensis Lour), cây mặt quỷ (Morinda villosa Hook), cây
giang mủ (Zygostelma benthami Baillon var. lineare Cost) hoặc đôi khi do tên
gọi Dây ruột gà còn dùng chỉ Sam trắng - Bacopa monnieri (L.) Pennell.
(Herpestis monnieri (L.) Rothm.). Rau đắng biển, thyme - leaved gratiola
(Anh), họ Hoa mõm chó Scrophulariaceae hoặc Mộc thông – Clematis
chinensis Osbeck (C.minor L.). Họ Mao lương Ranunculaceae [16],[17].
3


Hình 1.1: Cây Ba kích (Morinda officinalis How)
mẫu trồng tại Lục Ngạn, Bắc Giang
1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến
Ở Việt Nam: Cây mọc hoang ở ven rừng, phân bố phổ biến ở vùng đồi
núi thấp của miền núi và trung du ở các tỉnh phía Bắc: Quảng Ninh, Vĩnh
Phú, Hà Tây, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang. Ba kích cũng mọc nhiều ở phía
nam Trung Quốc: Quảng Đông, Quảng Tây… Thời gian thu hoạch thường
vào tháng 10-11, cũng có thể vào mùa xuân để tận dụng lấy giống trồng ngay.
Bộ phận dùng: Rễ (Radix Morindae).
Chế biến: Rễ được rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, phơi khô tới khi
không dính tay, đập nhẹ cho bẹt, phơi đến khô hoặc sấy nhẹ đến khô [3],[5],
[16].

4


Hình 1.2: Rễ Ba kích (Radix Morindae) mẫu trồng tại Lục Ngạn, Bắc Giang

1.1.4. Công dụng
Theo Đông y: Ba kích là vị thuốc có tính ôn, vị ngọt hơi cay, quy kinh
thận. Có tác dụng ôn thận trợ dương, mạnh gân cốt, trừ phong thấp
[1],[15],[16],[29].
- Đối với bệnh nhân nam giới có hoạt động sinh dục không bình thường,
Ba kích có tác dụng làm tăng khả năng giao hợp, đặc biệt đối với những
trường hợp giao hợp yếu và thưa. Ba kích có tác dụng tăng cường sức dẻo dai,
mặc dù nó không làm tăng đòi hỏi tình dục, không thấy có tác dụng kiểu
androgen. Có tác dụng hỗ trợ và cải thiện hoạt động sinh dục cũng như điều
trị vô sinh cho những nam giới có trạng thái vô sinh tương đối và suy nhược
thể lực.
- Đối với người tuổi già, bệnh nhân có biểu hiện mệt mỏi, kém ăn ít ngủ,
người gầy yếu, Ba kích có tác dụng tăng lực rõ rệt thể hiện qua những cảm
giác chủ quan như đỡ mệt mỏi, ngủ ngon, ăn ngon miệng và những dấu hiệu
khách quan như tăng cân nặng, tăng cơ lực. Đối với bệnh nhân đau mỏi các
khớp thì sau khi dùng Ba kích dài ngày các triệu chứng đau mỏi giảm rõ rệt.
5


Một số nghiên cứuu cho thấy
th nhóm bệnh nhân dùng phốối hợp Ba kích và
vitamin B1 có kếtt quả
qu tốt hơn nhóm dùng Ba kích đơn thuầần.
- Trong nhân dân, Ba kích là một
m vị thuốc bổ trí não và tinh khí, dùng
chữa các bệnh liệtt dương,
dươ
sớm xuất tinh, di mộng
ng tinh, phụ
ph nữ kinh nguyệt

không đều phong thấấp cước khí, gân cốt yếu mềm, lưng gốii đau
đ mỏi.
1.1.5. Thành phần
Theo các nghiên cứu
c đã được công bố, thành phầnn hóa học
h chính của Ba
kích là anthranoid
nthranoid (anthraquinon) và iridoid [17],[23],[27],[28],[31],[32]
[28],[31],[32],[33].
Ngoài ra trong Ba kích còn có một
m số hợp chất đường,
ng, hợp
h chất sterol,
hợp chấtt saponintriterpen kiểu
ki ursan, 1 vài acid amin…
Bảng
ng 1.1: Một số chấtt nhóm anthraquinon trong Ba kích
Stt
Tên khoa học
h
Công thức phân tử
C16H12O6
1 1,6-dihydroxy--2,4dimethoxyanthraquinone

2 1,6-dihydroxy--2methoxyanthraquinone

C15H10O5

3 1-hydroxy-2methoxyanthraquinone

C15H10O4

4 1-hydroxy-2methylanthraquinone

C15H10O3

5 Physcion

C16H12O5

6

Công thức
th cấu tạo


Bảng
ng 1.2: Một số chấtt nhóm iridoid trong Ba kích
Stt
Tên khoa học
h
1 Monotropein

Công thức phân tử
C16H22O11

2 Morindolid

C15H22O8

3 Morofficinalosid

C16H24O11

4 Asperulosid

C18H22O11

5 Acid asperulosidic

C18H24O12

7

Công thức
th cấu tạo


1.2. NHÓM HOẠT CHẤT IRIDOID GLYCOSID
Iridoid là một nhóm các monoterpenoid glycosid thường được gặp nhiều
nhất trong thực vật, cho đến nay người ta đã biết đến trên 600 chất thuộc
nhóm này [3].
Về cấu tạo Iridoid là những glycosid có bộ khung của phần aglycon gồm
2 đơn vị isopren. Chúng gồm một vòng cyclopentan nối với một vòng
hydropyran. Khi tạo thành glucosid, phần đường thường gặp là glucose nối
vào vị trí số 1 trên vòng hydropyran theo dây nối acetal [3],[7].
Iridoid gồm các nhóm:
- Iridoid có aglycon gồm đủ 10 carbon: Geniposid, gardenosid,
gardosid trong quả Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis.), loganin trong lá
Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.), monotropein trong rễ Ba kích

(Morinda officinalis How)...
- Iridoid có phần aglycon không đủ 10 carbon: Rehmaniosid, catalpol
trong Sinh địa (Rehmania glutinosa (Gaertn.) Libosch.
- Iridoid có phần aglycon trên 10 carbon: Plumericrin trong vỏ cây đại
(Plumeria rubra L. var acutifolia (Poir) Bailay).
Iridoid glycosid có tính chất dễ tan trong nước, cồn loãng, methanol.
Thường dùng cồn 50% hoặc methanol để chiết xuất. Dưới tác dụng của
enzyme có sẵn trong cây, iridoid glycosid bị biến đổi thành các sản phẩm màu
đen. Ngoài enzyme, iridoid glycosid cũng dễ bị thủy phân bằng acid. Dưới tác
dụng của kiềm NaOH, Ba(OH)2 thì các nhóm ester bị cắt.
Để định tính nhóm hoạt chất này, người ta thường dùng phương pháp
sắc ký giấy hay sắc ký lớp mỏng (SKLM), ngoài ra có thể đo quang phổ hồng
ngoại. Phần lớn các hợp chất iridoid có nhóm mang màu –O-C=C-CO-O- nên
thể hiện băng hấp thu trong vùng tử ngoại ở 233-238. Trên phổ IR các hợp

8


chất iridoid thường
ng có tín hiệu
hi ở 1722 cm-1 (-COCH3) và 1660 cm-1 (-C=C-O)
[3].
Trong tự nhiên các hợp
h chất iridoid hay gặpp trong các họ
h thực vật:
Rubiaceae (lá mơ
ơ lông, Ba kích), Euphorbiaceae, Apocynaceae (thông thiên,
bông sứ),
), Plantaginaceae (mã đề), Verbenaceae (cỏ roi ngự
ựa), Cornaceae (sơn

thù du), Valerinaceae, Gentianaceae (long đởm),
m), Caprifoliaceae (kim ngân),
Oleaceae, Ericaceae, Loganiaceae (mã tiền),
ti n), Scrophulariaceae (sinh địa,
huyền sâm)… [3].
1.3.. MONOTROPEIN
1.3.1. Đặc điểm vàà tính chất
ch
- Công thứcc phân tử:
t C16H22O11 [3].
- Khối lượng
ng phân tử:
t 390,34.
- Tên khoa học: [1S-(1a,4aa,7b,7aa)]-1-(b-D-Glucopyranosyloxy)
Glucopyranosyloxy)1,4a,7,7a-tetrahydro--7-hydroxy-7-(hydroxymethyl)cyclopenta[c]pyran
(hydroxymethyl)cyclopenta[c]pyran-4carboxylic acid.
ridoid [3].
- Thuộc nhóm iridoid
- Monotropein có công thức
th hóa học như sau [3]:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo củaa monotropein
9


- Tỷ trọng: 1,73 g/cm3.
- Tính chất:
+ Bột kết tinh màu trắng.
+ Nhiệt độ nóng chảy: 175oC
+ Tan tốt trong nước, ethanol và methanol.

+ Cực đại hấp thụ (trong ethanol): 235nm.
1.3.2. Tác dụng dược lý của monotropein
Các nghiên cứu gần đây cho thấy monotropein có tác dụng chống viêm.
Monotropein được phát hiện ức chế biểu hiện của nitric oxid synthase
(iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), yếu tố hoại tử u α (TNF-α) và
interleukin-1β (IL-1β) mRNA trong các đại thực bào RAW 264.7 gây bởi
lipopolysaccharide (LPS) [25]. Việc xử lý bằng monotropein đã làm giảm tác
dụng kết dính ADN của nhân κB (NF-κB). Monotropein cũng ngăn chặn sự
phosphoryl hóa và suy giảm ức chế κB-α (IκB-α) và do đó hoán vị NF-κB.
Trong mô hình viêm ruột kết gây bởi dextran sulfate sodium (DSS),
monotropein làm giảm chỉ số hoạt động bệnh (DAI), hoạt động
myeloperoxidase (MPO) và các biểu hiện protein liên quan đến viêm thông
qua ngăn chặn sự hoạt hóa NF-κB ở niêm mạc ruột [24].
Tóm lại, những phát hiện này gợi ý tác dụng chống viêm của
monotropein chủ yếu liên quan đến sự ức chế các biểu hiện của chất trung
gian gây viêm, thông qua khử hoạt tính NF-κB và hỗ trợ vai trò chữa bệnh
của nó trong viêm ruột kết [24].

10


1.4. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ DƯỢC
LIỆU
1.4.1. Vài nét về chiết xuất dược liệu
Chiết xuất dược liệu có vai trò rất quan trọng trước hết là để lấy được
các chất có trong dược liệu dưới dạng cần thiết (dung dịch, bột) toàn phần
hoặc tinh khiết hơn cho mục đích nghiên cứu hoặc điều trị.
Phương pháp chiết xuất dược liệu bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng
cụ chiết và phương pháp chiết.
Có nhiều cách phân loại phương pháp chiết xuất dựa vào các yếu tố khác

nhau [9],[11]:
- Căn cứ vào nhiệt độ: Chiết nóng; Chiết nguội.
- Căn cứ vào chế độ làm việc: Phương pháp chiết gián đoạn; Phương
pháp chiết bán liên tục; Phương pháp chiết liên tục.
- Căn cứ vào chuyển động tương hỗ giữa 2 pha: Phương pháp chiết
ngược dòng; Phương pháp chiết xuôi dòng; Phương pháp chiết chéo
dòng.
- Căn cứ vào áp suất làm việc: Phương pháp chiết ở áp suất thường (áp
suất khí quyển); Phương pháp chiết ở áp suất giảm (áp suất chân
không); Phương pháp chiết ở áp suất cao (chế độ làm việc có áp lực).
- Căn cứ vào trạng thái làm việc của 2 pha: Phương pháp ngâm; Phương
pháp ngấm kiệt.
- Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp dùng siêu
âm; Phương pháp khí hoá lỏng; Phương pháp tạo dòng xoáy.
Các iridoid glycosid nói chung và monotropein nói riêng thường dễ tan
trong nước, cồn loãng hoặc methanol. Thường dùng nước hoặc cồn 50% làm
dung môi chiết xuất, sử dụng kết hợp các phương pháp: cô đặc, lọc, kết tinh,
sắc ký, chiết dung môi... Ngoài ra, methanol cũng được dùng để hạn chế tạp.
11


Tùy theo mỗi loại iridoid glycosid mà có phương pháp phân lập và tinh
chế khác nhau phù hợp. Thông thường, dùng phương pháp sắc ký cột, sắc ký
chế hóa hoặc kết tinh phân đoạn trong các dung môi thích hợp.
1.4.2. Vài nét về phân lập và tinh chế
Để phân lập và tinh chế ta có thể dùng các phương pháp sau [1],[9],[11]:
- Tách phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau và
không hòa lẫn nhau.
- Tách bằng sắc ký cột.
- Tách qua cột sắc ký nhiều lần với chất hấp phụ là polyamid, cellulose,

silica gel, C-18, sephadex LH-20,...
- Kết tinh lại trong dung môi thích hợp.
- Tách bằng sắc ký lỏng điều chế.
1.5. CHẤT CHUẨN ĐẶC TRƯNG TỪ DƯỢC LIỆU
1.5.1. Vài nét về chất chuẩn
Các chất chuẩn (chất đối chiếu) là chất đồng nhất đã được xác định là
đúng để dùng trong các phép thử đã được qui định về hóa học, vật lý, sinh
học. Trong các phép thử đó, các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với
các tính chất của chất cần thử. Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp
với mục đích sử dụng. Chất đối chiếu được dùng trong các phép thử sau [2]:
- Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại.
- Định tính, định lượng bằng phương pháp quang phổ tử ngoại - khả
kiến, quang phổ huỳnh quang.
- Các phép thử định tính, tạp chất và định lượng bằng phương pháp sắc
ký.
- Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật.
- Các phép chuẩn độ thể tích, phân tích trọng lượng.
12


- Các phép thử sinh học.
- Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng.
Ngoài ra, các chất đối chiếu còn được dùng để [14]:
- Thẩm định một phương pháp mới.
- Chuẩn hóa các chất đối chiếu khác.
- Khẳng định giá trị pháp lý của một phương pháp đã chuẩn hóa.
Trong các phép thử định tính, định lượng, xác định tạp sử dụng các kỹ
thuật: sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao, quang phổ hồng ngoại, quang
phổ tử ngoại khả kiến, quang phổ huỳnh quang… được sử dụng phổ biến
trong công tác kiểm nghiệm và giám sát chất lượng thuốc hiện này đều dựa

nhiều vào chất chuẩn.
Các chất chuẩn theo Dược điển Mỹ (USPRS), Dược điển Châu Âu
(EPRS), Dược điển Quốc tế (ICRS) và chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS)
được thiết lập với sự hợp tác của nhiều phòng thí nghiệm độc lập trên thế giới
và được sản xuất tại các trung tâm như:
- Hội đồng chất đối chiếu Dược điển Mỹ (USP Reference Standard
Committee);
- Ban thư ký Kỹ thuật thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu (Technical
Secretariat of the European Pharmacopoeia Commission);
- Trung tâm hợp tác về các chất chuẩn hoá học của Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO Collaborating Centre for Chemical Reference Substances).
- Chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS) được thiết lập với sự đánh giá hợp
tác của các nước trong khối ASEAN theo chương trình Hợp tác kỹ thuật giữa
các nước ASEAN về lĩnh vực Dược phẩm; và Viện Kiểm Nghiệm Thuốc
Trung Ương – Bộ Y tế là thành viên chính thức đánh giá, thiết lập chất chuẩn.

13


Thông thường một chất đối chiếu được đánh giá bởi các nội dung chính
[21]:
- Định tính.
- Định lượng.
- Mất khối lượng do làm khô.
- Tạp chất liên quan.
- Độ tinh khiết.
1.5.2. Khái quát về thiết lập chất chuẩn từ dược liệu
Bất cứ quốc gia nào cũng đều cần phải thiết lập và sản xuất các chất
chuẩn đối chiếu hóa học ở mức quốc gia giúp cho công tác kiểm tra, giám sát
chất lượng thuốc và nguyên liệu làm thuốc. Khi sử dụng một chất nào đó từ

dược liệu để làm thuốc thì cần phải thiết lập chất chuẩn đối chiếu hóa học (gọi
tắt là chất chuẩn) để kiểm nghiệm chất đó.
Trong những năm gần đây, có một số chất chuẩn là những dược chất đặc
trưng của dược liệu được sản xuất đạt mức độ tinh khiết nhất định. Trong số
đó, chỉ có một số ít chất chuẩn có thể tiếp cận mua được, nhưng thường có giá
rất đắt (thường là đắt hơn khoảng 10 lần so với dược chất tương ứng). Chất
chuẩn có độ tinh khiết càng cao thì giá càng đắt.
Dược điển Mỹ hiện đang duy trì một số chất chuẩn đối chiếu hóa học
của các hợp chất chiết xuất từ thực vật như quercetin USP CRS, rutin USP
CRS, silybin USP CRS… Viện Kiểm nghiệm Dược phẩm và Sinh phẩm
Trung Quốc (NICBPB), Viện Kiểm nghiệm thuốc Hàn Quốc và Viện kiểm
nghiệm thuốc Nhật Bản cũng đã thiết lập được nhiều chất chuẩn đối chiếu hóa
học chiết ra từ dược liệu dùng cho kiểm nghiệm dược liệu, thuốc có nguồn
gốc dược liệu và thuốc đông dược. Chất chuẩn quốc gia chiết ra từ dược liệu
được coi là tài sản quốc gia, qui trình thiết lập chất chuẩn quốc gia thường
được bảo hộ và giữ bí mật. Chính vì vậy, những chất chuẩn này ở các nước
14


rất ít khi bán ra ngoài, nếu có bán thì phải xin ý kiến nhà chức trách. Hiện
nay, Viện Kiểm nghiệm Dược phẩm và sinh phẩm Trung Quốc chủ trương
không bán chất chuẩn chiết từ dược liệu mà chỉ trao đổi chuẩn với các đối tác
như Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương Việt Nam.
Tại Việt nam, cung cấp chất chuẩn chính thức gồm:
- Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương (VKNTTW) đã cung cấp hơn
300 chất chuẩn tân dược và 10 chất chuẩn từ dược liệu gồm acid chlorogenic,
conessin, holothurin B, kaemferol, malloapeita, myricetin, nuciferin,
phyllanthin và sylibin [20].
- Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. HCM (VKNT TP.HCM) cung cấp 213
chất chuẩn tân dược và 18 chất chuẩn từ dược liệu gồm acid aristolochic,

acid gallic, acid oleanolic, asiaticosid, berberin HCl, colchicin, curcumin,
damnacanthal, diacerein, diosgenin, epigallocatechin (ECGC), ginsenosidRb1, ginsenosid-Rg1, hesperidin, majonosid-R2, quercetin, rutin, syllibin
[19].
Hiện nay, nếu VKNTTW và VKNT TP.HCM không chủ động được
nguồn chất chuẩn, đặt biệt là chất chuẩn chiết từ dược liệu thì ngành Dược nói
chung và công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc nói riêng sẽ gặp nhiều
khó khăn, có thể kể đến như:
- Không kiểm nghiệm được chất lượng dược liệu một cách đầy đủ và
toàn diện.
- Không kiểm tra giám sát chất lượng các dạng bào chế có nguồn gốc từ
dược liệu đang lưu hành trên thị trường một cách đầy đủ.
- Không tiêu chuẩn hóa được các thuốc sản xuất trong nước bào chế từ
dược liệu hoặc chiết xuất từ dược liệu về mặt hàm lượng dược chất, do đó
không giúp được ngành dược bào chế ra các thuốc có chất lượng cao phục vụ
nhu cầu phòng và chữa bệnh.
15


Từ những
ng lý do trên cho thấy
th ngành Dược đứng trướcc nhiệm
nhi vụ cấp bách
phải chủ động nguồnn chất
ch chuẩn và xây dựng được Quỹ chất
ch chuẩn quốc gia
trong đó có các chấtt chuẩn
chu chiết ra từ dược liệu nhằm đáp ứng kịp thời công
tác đảm bảo chấtt lượng
lư
thuốc, phục vụ bảo vệ, chăm

ăm sóc và nâng cao sức
s
khỏe nhân dân.
1.5.3. Tình hình nghiên cứu
c chất chuẩn kiểm nghiệm Baa kích
1.5.3.1.
1. Tình hình nghiên cứu
c ở trong nước
Theo Dược
ợ điển Việt
Vi Nam (DĐVN), chuyên luận
ận Ba kích còn
c khá đơn
giản và chưa được tiêu chuẩn về mặt hóa học, chỉ đưa
ưa vào với
v một số chỉ tiêu
đại diện [1].
Qua tham khảo
ảo các tài
t liệu cho thấy đến nay, trong nước
nư chưa có công
trình nào nghiên cứuu về chiết xuất và tinh chế monotropein
onotropein làm chất chuẩn.
1.5.3.2.
.2. Tình hình nghiên cứu
c ở ngoài nước
Dược điểnn Trung Quốc
Qu tiêu chuẩn hóa Ba kích dự
ựa vào hàm lượng
đường

ng nystose. Trong chuyên luận
lu liên quan, chỉ tiêu định
nh lượng
l
kiểm soát
hàm lượng đường
ng nystose sử
s dụng phương pháp sắcc ký lỏng
l
hiệu năng cao
dùng detector tán xạạ bay hơi [22], trong khi DĐVN chưa
ưa có chỉ
ch tiêu này và
việc sử dụng
ng detector tán xạ
x bay hơi cũng chưa phổ biến.

Hình 1.4: Đường nystose
(β-D-Fruf-(2->1)
>1)-β-D-Fruf-(2->1)-β-D-Fruf-(2<-->1)
>1)-α-D-Glup)

16


Nhìn chung, việc kiểm nghiệm Ba kích và các chế phẩm đông dược chứa
Ba kích gặp nhiều khó khăn về mặt phương tiện kỹ thuật cũng như đòi hỏi
kinh phí cao, nên ở thời điểm hiện tại không phù hợp với mặt bằng chung của
các phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Bên cạnh đó nhu cầu thực tế cần có chất
chuẩn để kiểm nghiệm Ba kích ngày càng tăng đòi hỏi công tác nghiên cứu,

thiết lập chất chuẩn phục vụ công tác kiểm nghiệm Ba kích dần trở lên cấp
thiết.
1.6. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI
1.6.1. Sắc ký lớp mỏng
1.6.1.1. Nguyên tắc
SKLM là một kỹ thuật sắc ký, trong đó pha tĩnh chứa chất hấp phụ được
trải thành lớp mỏng, mịn và đồng nhất, được cố định trên phiến kính hoặc
phiến kim loại, nhựa; pha động là một hệ gồm một dung môi đơn thuần hoặc
hỗn hợp nhiều dung môi phối hợp với nhau theo tỷ lệ quy định. Sắc ký được
tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt các chất cần
tách. Trong quá trình di chuyển qua chất hấp phụ, các cấu tử (thành phần
trong hỗn hợp mẫu thử) di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với
những tốc độ khác nhau dẫn đến việc tách và phân bố khác nhau trên lớp
mỏng. Kết quả thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng, ở đó, các thành phần
của mẫu thử phân bố rải rác dọc theo đường đi của dung môi động. Cơ chế
của sự tách có thể là hấp phụ phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay phối
hợp nhiều cơ chế, trong đó một loại nào đó trội lên ít hoặc nhiều, tùy thuộc
vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi pha động [2],[18].
Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu
các chất phân tích có màu) hoặc soi tử ngoại ở các bước sóng 254nm, 366nm
hoặc phun thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng (thiết bị
densitometer, một thiết bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả
17