Nghiên cứu khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) của vi khuẩn staphylococcus aureus phân lập được từ bò sữa

MỤC LỤC
Lời cam đoan....................................................................................................... ii
Lời cảm ơn ......................................................................................................... iii
Mục lục .............................................................................................................. iv
Danh mụch chữ viết tắt ....................................................................................... vi
Danh mục bảng ................................................................................................. vii
Danh mục hình ................................................................................................. viii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
1.1. Tình hình chăn nuôi bò sữa trên thế giới và tại Việt Nam ............................. 3
1.2. Một số hiểu biết về vi khuẩn Staphylococcus aureus..................................... 5
1.2.1. Hình thái............................................................................................. 5
1.2.2. Tính chất nuôi cấy .............................................................................. 5
1.2.3. Các yếu tố độc lực .............................................................................. 6
1.3. Hiểu biết về bệnh viêm vú ở bò sữa ........................................................... 15
1.4. Hiểu biết về màng sinh học của vi khuẩn .................................................... 16
1.4.1. Định nghĩa màng sinh học (biofilm) ................................................. 16
1.4.2. Sự hình thành màng sinh học ............................................................ 16
1.4.3. Vai trò của màng sinh học trong cơ chế gây bệnh của vi khuẩn ........ 18
1.4.4. Các phương pháp xác định sự hình thành màng sinh học .................. 19
1.4.5. Tác hại của màng sinh học ................................................................ 24
1.4.6. Một số biện pháp kiểm soát sự hình thành màng sinh học ................. 24
1.4.7. Ứng dụng có lợi của màng sinh học .................................................. 24
Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....... 26
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 26
2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................... 26
2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 26
2.4. Nguyên liệu, thiết bị ................................................................................... 26
2.4.1. Mẫu sữa ............................................................................................ 26
2.4.2. Môi trường dùng trong phân lập, thuần khiết, tăng sinh vi khuẩn ...... 26

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iv


2.4.3. Hóa chất thực hiện phản ứng catalase ............................................... 27
2.4.4. Hóa chất dùng tách chiết ADN tổng số ............................................. 27
2.4.5. Sinh phẩm, hóa chất dùng cho phản ứng PCR................................... 27
2.4.6. Môi trường, hóa chất nghiên cứu khả năng sản sinh biofilm ............. 28
2.4.7. Nguyên liệu tiêu hao ......................................................................... 29
2.4.8. Thiết bị phục vụ nghiên cứu ............................................................. 29
2.5. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 29
2.5.1. Phương pháp lấy mẫu sữa ................................................................. 29
2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn từ mẫu sữa ..................................... 30
2.5.3. Phương pháp thuần khiết S. aureus từ mẫu sữa ................................. 30
2.5.4. Phương pháp tách và tinh sạch ADN tổng số .................................... 31
2.5.5. Phương pháp PCR giám định loài ..................................................... 32
2.5.6. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn ................ 32
2.5.7. Phương pháp xác định khả năng hình thành biofilm.......................... 33
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 36
3.1. Kết quả thu thập mẫu sữa bò tại Phù Đổng và Cầu Diễn ............................. 36
3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Staphylococcus spp từ mẫu sữa ......................... 36
3.2. Kết quả giám định vi khuẩn phân lập được ................................................. 39
3.3. Kết quả xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn S.aureus .................... 46
3.4. Kết quả nghiên cứu khả năng sản sinh biofilm của Staphylococcus spp ...... 50
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 55
KẾT LUẬN ....................................................................................................... 55
ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 56

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


DANH MỤCH CHỮ VIẾT TẮT
ADN

: Acid Deoxyribo Nucleic

ELISA

: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

HA

: Hemagglutinin

HPAI

: Highly Pathogenic Avian Influenza

IP

: ImmunoPeroxidase

LL

: Lymphoid Leukosis

NA

: Neurominidas

OIE

: World Organisation for Animal Health

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RT – PCR

: Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction

TBP

: Tryptose phosphate broth

Y:

: Yeast extract

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


DANH MỤC BẢNG

Số bảng

Tên bảng

Trang

1.1:

Lượng sữa sản xuất trên thế giới (triệu tấn) ............................................... 4

2.1.

Trình tự mồi dùng giám định loài Staphylococcus spp. và
Streptococcus spp. .................................................................................. 28

2.2.

Chu trình nhiệt PCR dùng giám định loài Staphylococcus spp và
Sterptococcus spp ................................................................................... 32

3.1.

Tình hình thu thập mẫu sữa bò tại Phù Đổng và Cầu Diễn ...................... 36

3.2.

Tỷ lệ phân lập được vi khuẩn từ mẫu sữa tại Phù Đổng và Cầu Diễn .......... 37

3.3.

Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu sữa bò bị viêm/không viêm vú ........... 38

3.4.

Kết quả giám định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli ....................... 40

3.5.

Kết quả giám định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Streptoccocus
spp và Staphylococcus spp ...................................................................... 40

3.6.

Kết quả xác định vi khuẩn Staphylococcus spp và Streptococcus
spp bằng phản ứng PCR .......................................................................... 43

3.7.

Kết quả phân lập được vi khuẩn Staphylococccus spp từ sữa bò bị
viêm vú và không viêm vú ...................................................................... 45

3.8.

Kết quả xác định khả năng sản sinh biofilm của Staphylococcus spp........... 52

3.9.

Kết quả xác định mức độ sản sinh biofilm của Staphylococcus spp. ........ 52

3.10. Kết quả xác định mức độ sản sinh biofilm của Staphylococcus aureus .......... 53

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

1.1.

Quá trình hình thành màng sinh học (biofilm) ......................................... 16

1.2.

Quá trình giải phóng vi khuẩn ra khỏi màng sinh học ............................. 17

1.3.

Vai trò của màng sinh học trong cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn .............. 18

1.4.

Sự sản sinh màng sinh học của Staphylococcus epidemidis xác định
bằng phương pháp ống nghiệm ............................................................... 20

1.5.

Sự sản sinh màng sinh học của coagulase negative Staphylococci
xác định trên thạch bổ sung đỏ Congo .................................................... 21

1.6.

Mức độ hình thành biofilm trên thạch bổ sung đỏ Congo dựa theo
màu của khuẩn lạc .................................................................................. 22

1.7.

Dụng cụ cải tiến dùng trong nghiên cứu biofilm ...................................... 23

1.8.

Phương pháp slide- band xác định sự hình thành biofilm ........................ 23

2.1.

Tóm tắt các bước phân lập, thuần khiết S. aureus ................................... 30

2.2.

Sơ đồ xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn.................................. 33

2.3.

Các bước nghiên cứu khả năng hình thành biofilm của
Staphylococcus ....................................................................................... 35

3.1.

Phân lập vi khuẩn Streptococcus spp và Staphylococcus spp từ
mẫu sữa .................................................................................................. 41

3.2.

Thuần

khiết

các

chủng

vi

khuẩn

Streptococcus

spp

và

Staphylococcus spp phân lập được từ mẫu sữa ........................................ 42
3.3.

Kết quả PCR giám định Staphylococcus aureus ...................................... 46

3.4:

Khả năng sinh trưởng của S. aureus ở môi trường TPB và TPB+Y ......... 47

3.5:

So sánh khả năng sinh trưởng của S. aureus giữa môi trường TPB và
TPB+Y ................................................................................................... 48

3.6.

Biểu đồ đường cong sinh trưởng của S.aureus ........................................ 49

3.7.

Kết quả kiểm tra khả năng tạo màng sinh học của Staphylococcus ............... 50

3.8.

Màng sinh học nhuộm bằng tím kết tinh 1% (200X). .............................. 51

3.9.

Mức độ tạo màng sinh học của các chủng Staphylococcus spp ................ 53

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii

MỞ ĐẦU
Theo chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020, đàn bò sữa nước ta
tăng bình quân 11% năm, đạt khoảng 500 ngàn con (Quyết định 10/2008/QĐTTg), tỷ lệ sữa tươi sản xuất trong nước đáp ứng nhu cầu tiêu dùng tăng lên 35%
năm 2015 và 40% năm 2020 (Đỗ Kim Tuyên, 2007). Bên cạnh những thuận lợi
cho sự phát triển, ngành chăn nuôi bò sữa của nước ta đã và đang đối mặt với
nhiều thách thức, trong đó có vấn đề dịch bệnh. Một trong những bệnh thường
gặp, gây nhiều thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi bò sữa là bệnh viêm vú.
Ngay ở những nước có trình độ chăn nuôi phát triển như Canada, Mỹ, Hà Lan,
v.v... bệnh viêm vú ở bò sữa vẫn là một thách thức lớn, gây thiệt hại về kinh tế
hàng năm khoảng 300 triệu USD (Boldyreva E.M., 2014).
Về nguyên nhân vi khuẩn gây bệnh viêm vú, Staphylococcus aureus,
Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae,
Escherichia coli và Klebsiella được xác định là những loại mầm bệnh thường gặp
nhất (Bradley A.J., 2002, Olde Riekerink và cs., 2008). Đáng chú ý, những vi
khuẩn kể trên đều có khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) (Hassan A. et
al, 2011) nên giúp vi khuẩn bám dính, tồn tại lâu dài trên bề mặt biểu mô, đề
kháng tốt với hiện tượng thực bào và sự tác động của kháng sinh (Costerton, J.W.
và cs., 1999). Ở Việt Nam, các nghiên cứu về bệnh viêm vú ở bò sữa đã xác định
được 3 loại vi khuẩn gây bệnh chính là Streptococcus spp., Staphylococcus spp.
và Escherichia coli (Phạm Bảo Ngọc, 2003, Trương Quang và cs., 2008). Tuy
nhiên, chưa có công bố nào đặt vấn đề nghiên cứu khả năng hình thành biofilm
của chúng. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn vi khuẩn Staphylococcus
aureus là một vi khuẩn thường gặp nhất trong sữa bò làm đối tượng để thực hiện
đề tài "Nghiên cứu khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) của vi
khuẩn Staphylococcus aureus phân lập được từ bò sữa" nhằm làm sáng tỏ khả
năng sản sinh biofilm của các chủng vi khuẩn phân lập được.
Ý nghĩa khoa học của đề tài:
(1) Ở Việt Nam, đây là đề tài đầu tiên đặt vấn đề nghiên cứu khả năng sản
sinh biofilm của vi khuẩn phân lập từ sữa bò,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


(2) Kết quả nghiên cứu về khả năng sản sinh biofilm của vi khuẩn phân
lập từ sữa bò cung cấp cơ sở khoa học cho hướng nghiên cứu về (i) vai trò của vi
khuẩn sản sinh biofilm trong bệnh viêm vú bò sữa ở Việt Nam, và về (ii) khả
năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn sản sinh biofilm đối với một số loại
kháng sinh thường dùng trong điều trị bệnh viêm vú bò sữa ở nước ta.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
- Kết quả nghiên cứu của đề tài này sẽ giúp người chăn nuôi bò sữa nhận
thấy được tính chất nguy hiểm của vi khuẩn có khả năng sản sinh biofilm, từ đó
nâng cao được ý thức của người chăn nuôi trong công tác vệ sinh phòng bệnh.
- Từ kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ giúp cho cán bộ thú y cơ sở cũng
như các cơ quan chứ năng thấy được tính chất nguy hiểm của vi khuẩn và bệnh
viêm vú ở bò sữa, từ đó sẽ đưa ra các biện pháp phòng bệnh cũng như xử lý bệnh
hiệu quả.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình chăn nuôi bò sữa trên thế giới và tại Việt Nam
Phương thức chăn nuôi bò sữa thay đổi tuỳ theo điều kiện và tập quán của

từng nước. Các nước châu Âu và Bắc Mỹ có ngành chăn nuôi bò sữa theo hướng
chuyên dụng. Phần lớn ngành chăn nuôi bò sữa ở các nước đang phát triển thuộc
về các hộ chăn nuôi quy mô nhỏ. Số trang trại nuôi bò sữa ở các nước phát triển
có xu hướng giảm xuống, trong khi đó số hộ chăn nuôi bò sữa ở các nước đang
phát triển có xu hướng ổn định.
Hệ thống chủ yếu là bãi chăn-chuồng nuôi với việc sử dụng rộng rãi đồng
cỏ lâu năm, mùa hè chủ yếu dựa vào chăn thả trên đồng cỏ, còn mùa đông dùng
nhiều thức ăn bổ sung tại chuồng (cỏ ủ xanh, cỏ khô, thức ăn tinh). Tổng sản
lượng sữa tiêu thụ trên toàn thế giới không ngừng tăng lên trong những thập kỷ
gần đây.
Các nước phát triển ở châu Âu, Bắc Mỹ và châu Đại Dương sản xuất
tới 68% sản lượng sữa của thế giới với năng suất sữa bình quân cao hơn nhiều
so với các nước đang phát triển. Các nước phát triển có tống lượng sữa tiêu
thụ cũng như lượng sữa tiêu thụ bình quân ổn định. Trong khi đó tổng lượng
sữa tiêu thụ cũng như mức tiêu thụ sữa/người của các nước đang phát triển
không ngừng tăng lên.
Sản lượng sữa sản xuất trên toàn thế giới tăng bình quân hàng năm là
1,4%, riêng các nước đang phát triển ở châu Á là 6,6%. Một số nước như Trung
quốc, Thái Lan, Hàn Quốc có tốc độ tăng sản lượng sữa hàng năm tới 10% trong
những năm gần đây. Tuy nhiên các nước châu Á vẫn chưa sản xuất đủ sữa cho
nhu cầu tiêu thụ trong mỗi nước.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


Bảng 1.1: Lượng sữa sản xuất trên thế giới (triệu tấn)
Năm

1965

1975

1985

1995

2000

2003

Châu Phi

11,5

14,1

18,5

22,2

27,2

28,7

Châu Á

45,0

58,1

89,1

128,5

159,2

172,4

Châu Âu

136,5

156,7

181,7

159,9

161,9

160,7

Bắc Mỹ và

69,2

69,4

83,2

90,0

97,4

99,3

Nam Mỹ

16,8

22,6

27,4

40,4

44,9

46,5

Châu Đại dương

13,0

12,9

14,2

17,8

23,5

25,1

Toàn Thế giới

364,6

424,6

512,7

536,9

579,1

600,9

Trung Mỹ

Nguồn: FAO Statistics (2004)
Tại Việt Nam
Việt Nam vốn không có ngành chăn nuôi trâu bò sữa truyền thống nên
không có các giống trâu bò sữa chuyên dụng đặc thù nào. Chăn nuôi bò
sữa xuất hiện ở Việt Nam từ những năm đầu của thế kỷ XX, dưới thời kỳ Pháp
thuộc. Trong những năm 1920-1923 người Pháp đã đưa các giống bò chịu
nóng như bò Red Sindhi (thường gọi là bò Sin) và bò Ongole (thường gọi là
bò Bô) vào Tân Sơn Nhất, Sài Gòn và Hà Nội để nuôi thử và lấy sữa phục vụ

người Pháp ở Việt Nam. Tuy nhiên số lượng bò sữa thời đó còn ít (khoảng
300 con) và năng xuất sữa thấp (2-3 kg/con/ngày). Từ đó đến nay bò Red
Sindhi đã được lai tạo với bò địa phương hình thành nên loại bò Lai Sin kiêm
dụng được nuôi rộng rãi trong cả nước.
Nhìn chung, ngành chăn nuôi bò sữa phát triển mạnh từ đầu những năm
1990 đến 2004. Tuy nhiên, hiện tại tổng sản lượng sữa tươi sản xuất trong nước
mới chỉ đáp ứng được khoảng 20-25% lượng sữa tiêu dùng, còn lại phải nhập
khẩu từ nước ngoài. Sau một số năm phát triển quá nóng, từ năm 2005 sự phát
triển của ngành chăn nuôi bò sữa cũng đã chững lại và bộc lộ một số nhược điểm.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


Những nhược điểm của ngành chăn nuôi bò sữa ở nước ta từ năm 2005
đến nay chủ yếu do hai lý do chính. Thứ nhất là quy mô chăn nuôi bò sữa ở nước
ta vẫn là quy mô nông hộ, do đó mà vệ sinh chuồng trại, vệ sinh phòng bệnh cho
vật nuôi không đảm bảo dẫn tới bò dễ bị bệnh, vì thế mà năng suất và chất lượng
sữa không cao. Nguyên nhân thứ hai dẫn tới chăn nuôi bò sữa khó khăn đó là giá
thành thức ăn chăn nuôi, thức ăn dinh dưỡng bổ sung ngày một tăng cao( từ năm
2005 đến này tăng khoảng 5,5 đến 6,3%), thêm vào đó diện ích đồng cỏ xanh để
lấy thức ăn cho bò cũng không đáp ứng đủ nhu cầu chăn nuôi. Từ đó dẫn tới hiệu
quả chăn nuôi thấp, mặt khách giá thành thu mua sữa từ các công ty sữa lại thấp
vì vậy mà người chăn nuôi không tha thiết với chăn nuôi bò sữa vì không mang
lại lợi ích kinh tế cao. Đây là những lý do khiến cho chăn nuôi bò sữa ở nước ta
phát triển chậm trong suốt một thời gian dài.
1.2. Một số hiểu biết về vi khuẩn Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus do Robert Koch phát hiện năm 1878 sau khi thực
hiện phân lập từ mủ ung nhọt. Năm 1880 Louis Paster cũng đã thực hiện tiến

hành phân lập và nghiên cứu về Staphylococcus aureus
1.2.1. Hình thái
Staphylococcus aureus (còn được gọi là tụ cầu vàng) có dạng hình cầu,
gram (+), đường kính 0,8 – 1µm và đứng thành hình chùm nho, hình thức tập hợp
này do vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian
Trong bệnh phẩm thì vi khuẩn thường thường họp lại từng đôi một hay tạo
thành những đám nhỏ. Vi khuẩn này không di động, không có lông, không sinh
nha bào.
1.2.2. Tính chất nuôi cấy
Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, là
vi khuẩn kỵ khí tùy nghi. Phát triển được ở nhiệt độ 10 - 450C, mọc tốt ở 370C
nhưng tạo sắc tố tốt ở 200C.
Ở môi trường canh thang thì sau 5 - 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ
thì làm đục rõ, để lâu có thể lắng cặn.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


Ở môi trường thạch, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh, đường kính
khoảng 1 - 2 mm, có thể có màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng, tương
đối lớn sau 24 giờ.
Ở môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn
toàn. Tụ cầu vàng tiết ra năm loại dung huyết tố (hemolysin): α, β,γ, δ, ε.
1.2.3. Các yếu tố độc lực
1.2.3.1. Các protein bề mặt và các protein tiết ra môi trường
Protein A (SPA): tất cả các chủng tế bào Staphylococcus aureus đều có
lớp protein A bao xung quanh. Lớp protein này có tác dụng gắn phần Fc của IgG
và do đó vô hiệu hóa tác dụng của kháng thể này. IgG là loại kháng thể có tỷ lệ

cao nhất (70%) trong các loại kháng thể và đóng vai trò quan trọng nhất trong
chống nhiễm trùng.
Protein gắn fibronecctin A và B (fibronecctin binding Proteins A and B,
FnBPA, FnBPB) bám vào thụ thể fibronecctin trên bề mặt tế bào biểu mô, gen
mã hóa đã được xác dịnh là FnBPA và FnBPB . Yếu tố kết tụ A và B (
Clumping factor A and B, CIfA, CIfB): adherin gắn vào fibronecctin tạo các yếu
tố kết tụ CIfA và CIfB hoạt hóa gây ngưng tụ tiểu cầu.
Protein gắn collagen (collagen binding Proteins, Can): adherin đẩy mạnh
sự gắn kết của protein với collagen, sự tương tác với collagen là bước quan trọng
trong việc thúc đẩy sự gắn kết của vi khuẩn gây tổn hại mô. Sư gắn kết này gây
ra bệnh viêm xương tủy và nhiễm trùng khớp.
Protein gắn sialoprotein xương (Bone sialoprotein binding Proteins, Bbp):
adherin cho sialoprotein xương gây ức chế các Bbp với các tế bào tụ cầu, làm
giảm khả năng đề kháng của xương gây ra các bệnh về viêm khớp.
Protein nhạy cảm plasmin (Plasmin – sensitive Protein, PIs): là protein có
bề mặt lớn, có thể tương tác với vi khuẩn và tế bào cơ thể như là fibronectin,
kháng thể. Làm cho vi khuẩn không thể bám dính được.
Protein liên quan tới Biofilm (Biofilm – associated Proteins , Bap): cấu
trúc của biofilm là các vi khuẩn và lớp vỏ glycocalyx bản chất là polysaccharide
có thể tương tác với vi khuẩn đang xâm nhập tổ chức, giúp các vi khuẩn này bám

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


vào thành tế bào, không bi đào thải ra bên ngoài, tránh được các tác động của
thực bào, kháng thể và kháng sinh.
Protein gắn elastin (elastin binding Proteins, EbpS): adherin đẩy mạnh sự
gắn kết của các protein với elastin gây ảnh hưởng đến động mạch và làm cho

máu ngưng lưu thông trong cơ thể.
Protein gắn ngoại tế bào (Extracellular matrix – binding Proteins, Ehb):
protein cộng hợp rất lớn ở vách tụ cầu vàng, thúc đẩy sự kết dính các protein với
vật chủ như laminin và fibronectin ở người, tạo thành các chất gian bào trên bề
mặt của biểu mô và trên bề mặt nội mô.
Các protein bề mặt hoặc protein tiết của tụ cầu vàng tham gia vào các tác
dụng sinh học khác nhau của chúng.
1.2.3.2. Các yếu tố xâm lấn
a. Hemolysin
Có 4 loại Hemolysin được xác định là α, β, γ và δ . Một chủng tụ cầu có
thể tạo thành nhiều hơn một loại hemolysin. Đó là những phẩm vật bản chất
protein gây tan máu β nhưng tác động khác nhau trên những hồng cầu khác nhau.
Chúng có tính sinh kháng. Một vài loại hemolysin gây hoại tử da tại chỗ và giết
chết sinh vật thí nghiệm.
b. Leucocidin
Mặc dù một số staphylolysin chứa độc tố bạch cầu, nhưng chỉ một độc tố
tụ cầu thật sự độc với bạch cầu và được gọi là leucocidin. Tụ cầu gây bệnh có thể
bị thực bào như tụ cầu không gây bệnh nhưng lại có khả năng phát triển bên
trong bạch cầu
Độc tố này có bản chất là protein, chúng tạo ra các protein nhiều thành
phần và gây tổn hại màng, không chịu nhiệt và gây độc cho bạch cầu người và
thỏ, không gây độc cho bạch cầu các loài động vật khác. Nó cũng có tác dụng
hoại tử da thỏ
Một số chủng S.aureus tiết ra 1 loại độc tố gọi là Panton-Valentine
leucocidin (PVL), độc tố này có mặt trong cơ thể người khỏe mạnh (khoảng
0,6%) gây triệu chứng bệnh viêm khớp, viêm phổi ở người.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7

PVL là 1 synergohymenotropic exotoxin. Đây là 1 độc tố thuộc họ độc tố gồm 2
thành phần và hoạt động thông qua sự hỗ trợ của 2 protein. Độc tố này gây ức
chế các tế bào bạch cầu hạt, đại thực bào kích thích bạch cầu ở người tạo ra các
enzyme (glucuronidaza và lysozyme), các thành phần chemotactic (LeucotrieneB4 và interleukin-8) và chất chuyển hóa oxy gây hoại tử các tế bào
Các PVL hoạt động mạnh gây vỡ màng và phân giải tế bào, sau đó tác
động lên các tế bào chủ như bạch cầu trung tính. Ngoài ra, PVL còn làm tổn
thương các mô, tạo các tế bào máu ngoại vi trong quá trình lây nhiễm sinh bệnh
viêm phổi.
Leucocidin bao gồm 2 mảnh F và S và có thể tách rời bằng sắc ký ion,
trọng lượng phân tử là 32000 và 38000 Dalton. Nếu tách rời hai mảnh này thì
mất tác dụng gây độc
c. Hyaluronidase
Enzyme này phân giải các acid hyaluronic của mô liên kết, đây là 1 thành
phần chính của cơ chất ngoại bào của các mô trong cơ thể.
Enzyme này nhiễm vào mô và tạo ra 1 nguồn carbon và năng lượng giúp
vi khuẩn lan tràn vào mô.
Các nghiên cứu cho thấy các protein từ Staphylococcus aureus UAMS1thể hiện dạng đột biến do 2 protein sarA và sarA agar gây ra, và sự tham gia của
protein sarA là điều quan trọng của độc tính trong quá trình hoạt động của
hyaluronidase.
Vai trò chính của S.aureus hyaluronidase vẫn chưa được tìm hiểu rõ ràng,
chỉ biết sự tham gia của sarA là 1 yếu tố quan trọng đối với 1 số độc tính được
thể hiện bởi S.aureus hyaluronidase.
Các coagulase có thể cô lập được hyaluronidase trong 1 số trường hợp,
các phản ứng DNAse là 1 trong những yếu tố giúp cho hyaluronidase hoạt động.
d. Coagulase
Coagulase là một protein ngoại bào liên kết với prothrombin trong vật chủ
để hình thành 1 phức hệ gọi là staphylothrombin. Prothrombin bị biến đổi thành
enzyme thrombin nhờ enzyme prothrombinase. Các protease hoạt đông đặc trưng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


của thrombin đã có các quá trình hoạt hóa trong phức hệ dẫn đến việc chuyển đổi
fibrin (dạng không hòa tan) thành fibrinogen (dạng hòa tan).
Còn theo các nghiên cứu của Soulier, Tager và Zajden thì coagulase và
prothrombin không có hoạt tính enzyme, sự tham gia của chúng tạo nên các phức
hợp bền với các hoạt động ly giải đặc hiệu gọi là Staphylothrombin,
staphylocoagulase không có hoạt tính ly giải, chúng phản ứng một cách chuyên
biệt với các prothrombin và hoạt hóa các hợp chất này để đưa đến sự kết hợp các
fibrinogen thành khối fibrin. Sơ đồ hoạt động như sau:
Staphylocoagulase
Staphylothrombin
Prothrombin
Fibrinogen

Fibrin

Coagulase là dấu hiệu để nhận biết S.aureus trong phòng thí nghiệm. Tuy
nhiên chưa có bằng chứng nào cho thấy coagulase là một yếu tố gây độc. Một số
ý kiến cho rằng các vi khuẩn đã tự bảo vệ mình khỏi thực bào và miễn dịch bằng
cách gây đông máu
Có một vài nhầm lẫn cho rằng coagulase chính là yếu tố đông kết
(clumping). nhưng một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi thiếu coagulase thì vẫn
duy trì sự hoạt động của yếu tố đông kết, trong khi yếu tố đông kết vẫn thể hiện
coagulase 1 cách bình thường.
e. Staphylokinase

Staphylokinase (Sak) là 1 protein tạo ra bởi 136 amino acid và được sản
xuất bởi các chủng S.aureus
Sau khi kích hoạt plasminogen, tiền thân của protease plasmin phân giải
fibrin. Về mặt cấu trúc, Sak có cấu trúc tương đồng với các chất kích hoạt
plasminogen khác, chứa một vị trí gắn plasminogen và 1 vùng serine protease.
Tuy nhiên, Sak không phải là 1 enzyme. Nó tạo thành 1 phức hợp với
plasminogen có thể chuyển đổi các phân tử plasminogen khác thành plasmin, 1
enzyme mạnh phân hủy protein ngoại bào. Ái lực cao của phức hợp Sak –
plasminogen với fibrin hình thành nên một tác nhân gây tan huyết.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


Sak có thể tạo điều kiện cho S.aureus để plasminogen gắn với thụ thể trên bề mặt
tế bào vi khuẩn và qua đó đẩy mạnh quá trình xâm nhập vào các mô chủ
Đây là một enzyme đặc trưng cho các chủng gây bệnh ở người, giúp tụ
cầu phát triển trong các cục máu và gây vỡ các cục máu này, tạo nên tắt mạch.
f. β-lactamase
Sự kháng lại kháng sinh của tụ cầu vàng là một đặc điểm rất đáng lưu ý.
Đa số tụ cầu vàng kháng lại penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được men
penicillinase nhờ gen trên R-plasmid
Sự đề kháng penicillin của tụ cầu vàng là do đa số tụ cầu vàng sản xuất được
enzym β-lactamase
Một số còn kháng lại được methicillin gọi là methicillin resistance S.
aureus (viết tắt là MRSA), do đó tạo ra được các protein gắn vào vi trí tác động
của kháng sinh
Hiện nay, một số rất ít tụ cầu còn đề kháng được với cephalosporin, các
thế hệ. kháng sinh được dùng trong các trường hợp này là vancomycin.

g. Một số enzyme khác
S.aureus

còn

có

thể

có

sự

hiện

diện

của

protease,

lipase,

deoxyribonuclease và các acid béo. Đây là những yếu tố để cung cấp các chất
dinh dưỡng cho các vi khuẩn và có thể nó còn gắn vai trò trong quá trình gây
bệnh. Các enzyme này giúp kéo dài sự sống của các vi khuẩn.
1.2.3.3. Các yếu tố chống lại sự tự vệ của tế bào chủ
a. Capsular polysacharide
Phần lớn các chủng lâm sàng của Staphylococcus aureus đều hiện diện
một polysacharide bề mặt của một trong hai serotype (kiểu huyết thanh) 5 hoặc 8.

Nó được gọi là microcapsule bởi vì nó chỉ có thể xác định được bằng kính hiển vi
điện tử không giống như một số các vi khuẩn khác được nhìn thấy dễ dàng bằng
kính hiển vi ánh sáng
Capsular polysaccharide (CP) chống lại các cơ chế phòng vệ của cơ thể cũng
như đề kháng kháng sinh. Các CP bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực bào bằng cách
không cho các kháng thể tạo hiện tượng opsonin hóa trên vách vi khuẩn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10


Do không có hiện tượng opsonin hóa nên các đại thực bào và bạch cầu
trung tính tiếp cận kém hoặc không thể tiếp cận được vi khuẩn
Các thực bào không tiêu diệt được vi khuẩn thì càng cố gắng tiết nhiều
cytokine hơn nữa nhằm làm sạch vi khuẩn xâm nhập, nhưng chính điều này lại
thu hút các bạch cầu đa nhân và đại thực bào khác đến ổ viêm.
Phần lớn các CP chống lại được thực bào là do ngăn cản các tế bào thực
bào bám, ức chế sinh C3 convertase và C3b của bổ thể, hoặc che phủ C3b làm
cho thực bào không nhận ra.
Các chủng S.aureus phân lập từ bệnh nhiễm trùng thể hiện một mức độ
cao polysaccharide nhưng nhanh chóng bị mất khả năng khi nuôi cấy trong
phòng thí nghiệm.
Chức năng của các capsular polysacharide không phải hoàn toàn là độc tính.
b. Protein A
Protein A là một protein bề mặt của S.aureus mà IgG gắn kết các phân tử
theo vùng Fc. Các mảnh Fc này là của globulin miễn dịch. Chính nhờ hiện tượng
gắn kết này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. mảnh Fc của globulin miễn dịch
có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa .Trong huyết thanh vi khuẩn
làm cho IgG phá vỡ opsonization và phagocytosis

Các mảnh Fc chính là các receptor cho các đại thực bào, quá trình gắn kết
trên giúp cho tụ cầu vàng tránh không bị thực bào bởi các đại thực bào
Đột biến của S.aureus thiếu protein A có hiệu quả hơn phagocytosed trong
ống nghiệm, các đột biến trong các trường hợp bị lây nhiễm thí nghiệm có hiện
tượng giảm độc tính.
c. Exofoliative exotoxins
Đây là một ngoại độc tố, gây nên hội chứng phỏng rộp và chốc lở da
(scaded skin syndrome) ở trẻ em, gồm 2 loại là ETA và ETB.
* Cơ chế gây bệnh:
ET gây ra sự phân ly bên trong lớp biểu bì giữa các lớp tế bào sống và
chết làm da phồng phồng lên, làm mất dần đi những lớp biểu bì da mất nước và
cứ thế tiếp tục nhiễm trùng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


Những độc tố này có khả năng esterase và proterase và nó tấn công những
protein có chức năng duy trì sự nguyên vẹn của các tế bào biểu bì
Bệnh thường bắt đầu với sự nhiễm trùng da tại những vị trí xác định nhưng
sau đó vi khuẩn bắt đầu sản sinh độc tố ảnh hưởng đến da trên toàn bộ cơ thể
Trẻ phát sốt, phát ban và phồng da. Phát ban bắt đầu từ miệng lan rộng
đến bụng, tay, chân. Khi vết phồng bị bể ra thì phát ban kết thúc. Lớp da ngoài
cũng bị choc ra và bề mặt trở nên đỏ. Đau giống như một vết bỏng.
1.2.3.4. Các siêu kháng nguyên
a. Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1 )
Độc tố shock nhiễm độc thường gặp ở những người phụ nữ có kinh dùng
bông băng dày bẩn hoặc những người bị nhiễm trùng vết thương, hay còn gọi là
nhiễm trùng huyết. Độc tố này khó phân biệt với enterotoxin F của tụ cầu vàng

Trong một số trường hợp nhiễm khuẩn gram âm, các nội độc tố bản chất
là polysaccharide kích thích hoạt hóa đại thực bào giải phóng TNF (Tumor
necrosis factor, yếu tố hoại tử u) và các interleukin 1, 2. Các cytokine này tham
gia vào cơ chế sốc do nhiễm khuẩn huyết, cách thức gây độc y như nội độc tố
LPS cơ chế như sau:
- Cấu trúc của LPS gồm 3 phần: phần lõi, chuỗi bên đặc hiêu O mang tính
kháng nguyên đặc hiệu và lipid A chịu trách nhiệm về độc tính.
-

Phân tử LPS nằm trong màng ngoài và phần lipid A của phân tử có tác

dụng gắn LPS vào vách vi khuẩn.
-

LPS được giải phóng từ màng ngoài của vách vi khuẩn gram âm, vào máu

gắn với protein (LPS binding protein) tạo thành phức hợp. LPS bám vào thụ thể
(phân tử CD14) hoặc trực tiếp với TLR-4 (toll like receptors-4) trên monocyt và
đại thực bào.
-

Chúng kích thích tế bào tiết ra TNF-α (tumor necrosis factor alpha), IL-1

(interleukin-1), IL-6, IL-8 và PAF (platelet activating factor) dẫn đến sốt, giãn
mạch và tăng tính thấm huyết tương gây giảm huyết áp, giảm máu đến cơ quan,
giảm chức năng gan, thận và hô hấp.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12

Trong các trường hợp nhiễm độc thức ăn do S.aureus và hội chứng sốc do
nhiễm độc lượng cytokine cao cũng gây ra những triệu chứng nhất định.
Trong hội chứng sốc nhiễm độc cũng xuất hiện các triệu chứng như của
nhiễm độc do độc tố ruột như:
-

Các độc tố ruột hoạt động như những chất kích thích phân bào hoạt hóa tất

cả các tế bào T biểu hiện 1 họ gene V (thụ thể của tế bào T).
-

Các cytokine do các tế bào T giải phóng ra khi được hoạt hóa bởi các siêu

kháng nguyên SE sẽ gây nên nhiều triệu chứng sốt, ỉa chảy, sốc trong nhiễm độc
thức ăn do S.aureus.
Trong trường hợp này ngoại độc tố của tụ cầu được gọi là độc tố 1 gây hội
chứng sốc, hoạt động như 1 siêu kháng nguyên kích thích các tế bào T hoạt hóa
đại thực bào tiết ra nhiều TNF.
Các vi khuẩn sống bên trong tế bào thực bào có khả năng hoạt hóa tế bào
T dẫn tới phá hủy các mô. Các cytokine do các tế bào T hoạt hóa tiết ra sẽ tập
trung các đại thực bào và hoạt hóa chúng để hình thành các khối u.
Các enzyme lysosom được giải phóng từ các khối u này sẽ gây ra hoại tử
đáng kể các mô.
b. Enterotoxin
* Cấu trúc:
Là những chuỗi protein đơn tương đối chịu nhiệt, mỗi chuỗi có vị trí
kháng nguyên riêng biệt. Không bị hủy bởi sự đun nấu, trọng lượng phân tử từ
28000-30000 dalton, bao gồm 6 type ký hiệu từ A-F.

Đặc điểm chính là có vòng cystein ở giữa giúp ổn định cấu trúc phân tử và
kháng sự phân giải protein.
Có các chuỗi amino acid, trong đó nhiều nhất là aspartic, glutamic, lysin,
tyrosine.
*Phân loại:
Số loại SE khác nhau ở nhiều tài liệu khác nhau tùy thuộc vào năm phát
hiện và vai trò của các SE trong các vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu. Do số
lượng SE khá lớn nên rất cần thiết phải phân loại và sắp xếp chúng.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


Năm 1962, người ta đưa ra hệ thống sắp xếp các độc tố theo bảng chữ cái.
Đầu tiên 5 loại SE được tìm thấy và phân loại dựa vào tính chất kháng nguyên của
chúng, đó là độc tố A (SEA), độc tố B (SEB), độc tố C (SEC), độc tố D (SED) và
độc tố E (SEE). Trong đó SEC được chia thành SEC1, SEC2, SEC3. Sau đó, các SE
mới cùng với các gen tương ứng được tìm thấy và đánh dấu từ SEG đến SER và
SEU. Không có độc tố SEF, vì F là ký tự để chỉ TSST-1.
Tuy nhiên sự liên quan giữa các SE mới này đến các vụ ngộ độc thì chưa
rõ, hiện nay hầu hết các bộ test thương mại chỉ thích hợp để xác định các độc tố
từ SEA đến SEE là các độc tố thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc, khoảng 5%
các vụ ngộ độc do các độc tố enterotoxin mà ta chưa biết gây ra.
Trong các loại độc tố trên thì SEA thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc
do tụ cầu. Các dòng S.aureus tạo độc tố SEA có tần số cao nhất trong các mẫu
thực phẩm (61.5%) và trên những người khỏe mạnh (53,6%).
SEA là nguyên nhân của 75% các vụ ngộ độc do tụ cầu, tiếp đến là SED,
SEC và SEB, các vụ dịch do SEE thường rất ít gặp.
* Tính chất:

SE là những protein đơn giản, hút ẩm, dễ tan trong nước và nước muối, là
những protein cơ bản, độ đẳng điện pI là 7-8,6, trừ SEG và SEH có độ đẳng điện
pI tuần tự là 5,6 và 5,7. Độ ẩm cao nhất là 277 nm, cao hơn so với những protein
thông thường.
Dù có 1 mức độ tương đồng giữa các SE, nhưng vẫn có sự khác nhau giữa
các trình tự amino acid làm cho các độc tố có các vị trí kháng nguyên khác nhau.
SE giàu lysine, acid aspartic, acid glutamid và tyrosine. Hầu hết có vòng
cystein tạo cấu trúc thích hợp có thể liên quan đến hoạt tính gây nôn. Chúng có
tính ổn định cao, kháng với hầu hết các enzyme phân hủy protein và vì thế chúng
giữ được hoạt tính trong ống tiêu hóa sau khi được ăn vào bụng.
Chúng còn kháng với chymotrypsine, rennin và papain. Đặc biệt, tính bền
nhiệt là một trong những tính chất quan trọng nhất của các SE trong lĩnh vực an
toàn thực phẩm. Chúng không bị phân hủy ở 1000C trong 30 phút, thậm chí ở
1210C trong 28 phút thì những SE vẫn giữ được hoạt tính sinh học (khi thí

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14


nghiệm trên mèo). Tính kháng nhiệt của SE trong thực phẩm cao hơn so với môi
trường nuôi cấy.
1.3. Hiểu biết về bệnh viêm vú ở bò sữa
Nguyên nhân bệnh viêm vú ở bò sữa do vệ sinh chuồng trại, vệ sinh vắt
sữa không tốt, tạo điều kiện cho các vi khuẩn (như liên cầu khuẩn, tụ cầu
khuẩn, song cầu khuẩn hay trực khuẩn gây mủ) hay nấm Candida albicals xâm
nhập vào bầu vú và gây bệnh. Sữa là môi trường rất tốt cho các loại vi khuẩn
trên phát triển. Đặc thù của bệnh là tuyến vú bị viêm, sữa bị biến đổi về lý
tính và hóa tính, làm giảm sản lượng và phẩm chất sữa. Thùy vú tổn thương,
nếu viêm nặng bầu vú teo và mất khả năng tiết sữa, thú bị đào thải. Gồm ba

nguyên nhân chính sau:
- Nguyên nhân xuất phát do chính bản thân bò sữa tuỳ thuộc vào cá thể
của bò như bò có bầu vú quá to và dài dễ gây xây xát, lổ thông đầu vú to dễ rò rỉ,
bò cao sản ... là những điều kiện để bộc phát bệnh.
- Vi sinh vật gây nhiễm : Vi sinh vật là một vật thể rất nhỏ chỉ nhìn qua
kính hiển vi, chúng sống trong các tổ chức, tế bào, cơ thể của động vật, một số ở
dạng thực vật như: nấm, mốc..; dạng động vật như: vi trùng, siêu vi trùng…
Vi sinh vật có ảnh hưởng rất lớn trên sức khẻo con người và động vật qua
khả năng lây nhiễm chúng có nhiều loại (type) phát triển gây bệnh. Chúng hiện
diện trong không khí, thức ăn, chuồng trại, người vắt sữa, đất, phân, nước tiểu.
Chúng có thể xâm nhập vào cơ thể động vật qua thở, uống, ăn, vết thương, lổ
núm vú…
Các vi sinh vật này sẽ phát triển nhanh chóng , chúng sẽ hấp thụ dinh
dưỡng bằng cách hại máu, hại tế bào…Nhưng bên cạnh đó, nguy hiểm hơn là
chúng sẽ tiết ra các độc tố (toxin). Các độc tố sẽ làm ảnh hưởng đến cơ thể, và
giảm chức năng hoạt động của các cơ quan trong cơ thể. Khi vi trùng xâm nhập
vào tuyến sữa, chúng sẽ tấn công các tế bào tiết sữa để lấy dưỡng chất và từ đó
làm ảnh hưởng đến khả năng tiết sữa của tuyến sữa. Cụ thể như tụ cầu khuẩn
(Staphylococus) chiếm 5,4% trường hợp, trong đó S.aureus (vi khuẩn Gram +) là
vi khuẩn gây bệnh mạnh và thường ở dạng cấp tính. Vi khuẩn này xâm nhập và

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 15


tấn công vào các tế bào nang và có tính kháng penicilline (có những chủng vi
khuẩn có khả năng hình thành penicillinaza phân huỷ penicilline), vì vậy nó rất
khó xử lý. Bên cạnh đó, nó còn sản sinh ra các độc tố (coagulaza, hemolysine)
gây co thắt mạch máu và hoại tử mô tế bào.

1.4. Hiểu biết về màng sinh học của vi khuẩn
1.4.1. Định nghĩa màng sinh học (biofilm)
Màng sinh học là một tập hợp các vi sinh vật liên kết chặt chẽ với nhau ở
trên bề mặt vật chất và được bao bọc bởi chất nền ngoại bào (extracellular
matrix) có thành phần chính là polysaccharide (Donlan, 2002). Tế bào vi sinh vật
nằm trong màng sinh học khác biệt với những tế bào vi sinh vật tự do (planktonic
bacteria) ở các gen được biểu hiện.
1.4.2. Sự hình thành màng sinh học
Màng sinh học có thể hình thành ở tất cả các loại bề mặt hữu sinh (biotic)
như mô bào, hoặc vô sinh (abiotic) như bề mặt dụng cụ y tế, đường ống, v.v…
Sự hình thành màng sinh học là một quá trình phức tạp và ở trạng thái động.

Hình 1.1. Quá trình hình thành màng sinh học (biofilm)
Nguồn: (Simões et al., 2010)
*Chú thích:
- Substratum pre-conditioning by ambient molecules:quá trình phủ bề mặt.
- Cell deposition: tế bào lắng đọng.
- Cell adsorption: tế bào hấp phụ.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 16


- Deposition: quá trình lắng đọng.
- Cell-to-cell sigaling and onset of exopolymer production: vật chất dẫn
truyền thông tin.
- Convective and diflusive transport O2 and nutrients: vận chuyển O2 và
dinh dưỡng.
- Replication and growth: nhân rộng và tăng trưởng.

- Secretion of polysaccharide matrix: tạo chuỗi polysaccharide
- Detachment, erosion and sloughing: tách rời, bong tóc khỏi tế bào
Theo (Simões et al., 2010), các giai đoạn được mô tả ở hình 1.1. được bắt
đầu bởi (1) quá trình phủ bề mặt (substratum) bởi các hợp chất cao phân tử có
trong môi trường. (2) Tiếp đến là quá trình lắng đọng (deposition) thụ động (đối
với vi khuẩn không di động, hoặc chủ động (đối với vi khuẩn có khả năng di
động). Giai đoạn (3) và (4) là quá trình gắn kết hoặc bong tróc vi khuẩn ở trên bề
mặt. (5) Những vi khuẩn còn giữ lại trên bề mặt sau giai đoạn (3) và (4) tiết ra
vật chất dẫn truyền thông tin (cell- to- cell signaling molecules) và quá trình tiết
ra lớp màng polymer ngoại bào được kích hoạt. Mặc dù tế bào vi khuẩn nằm
trong lớp màng sinh học bị cố định, quá trình trao đổi chất, tương tác giữa các tế
bào (quorum sensing) vẫn luôn diễn ra (6, 7, 8). Vi khuẩn nằm trong màng sinh
học có thể được giải phóng khỏi lớp biofilm (9) như mô tả ở hình 1.2.

Hình 1.2. Quá trình giải phóng vi khuẩn ra khỏi màng sinh học
Theo (Costerton et al., 1999), quá trình giải phóng này chịu sự tác động cơ
học (physical detachment) của dòng vật chất bao quanh biofilm, cũng như bởi sự
phân hủy cục bộ (local hydrolysis) lớp polysaccharide ngoại bào và giải phóng vi
khuẩn tự do.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 17


1.4.3. Vai trò của màng sinh học trong cơ chế gây bệnh của vi khuẩn
Hình 1.3 cắt nghĩa một phần vai trò của màng sinh học trong cơ chế sinh
bệnh (Costerton et al., 1999). Đối với vi khuẩn tự do (planktonic bacteria), chúng
có thể bị tiêu diệt bởi kháng thể và quá trình đại thực bào, đồng thời cũng mẫn
cảm với kháng sinh. Vi khuẩn nằm trong lớp màng sinh học (sessile

communities) được bao bọc bởi lớp polysaccharide ngoại bào, do vậy đề kháng
với kháng thể đặc hiệu, hiện tượng thực bào và sự tác động của kháng sinh. Do
tính chất lạ, màng sinh học cũng thu hút sự tập trung của đại thực bào, giải phóng
enzyme và gây ra tổn thương cho mô bào xung quanh vị trí vi khuẩn hình thành
màng sinh học. Do quá trình hình thành màng sinh học là một quá trình động, vi
khuẩn nằm trong lớp màng này có thể được giải phóng dưới dạng vi khuẩn tự do,
phát tán tới các vị trí khác trong cơ thể.

Hình 1.3. Vai trò của màng sinh học trong cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn
Một số vi sinh vật được xác định có khả năng sản sinh màng sinh học
trong quá trình phát triển gồm: Haemophilus influenza, Escherichia coli,
Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia,
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Actinomyces israeli,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 18


Acinetobacter baumanii, Actinobacillus equuli, Aeromonas hydrophila, Listeria
monocytogenes, Salmonella enteric, Bacillus cereus, Bacillus anthracis, v.v…
(Costerton et al., 1999, Clutterbuck et al., 2007, Djordjevic et al., 2002, Scher et
al., 2005, Auger et al., 2009, Lee et al., 2007). Về thành phần vi sinh vật, màng
sinh học có thể bao gồm một hoặc nhiều loài vi khuẩn khác nhau (Thornton et
al., 2011, Yang et al., 2011).
1.4.4. Các phương pháp xác định sự hình thành màng sinh học
Hiện nay, có khá nhiều phương pháp được dùng để định tính hoặc định
lượng sự hình thành màng sinh học của vi sinh vật, ví dụ như: định lượng trên đĩa
nuôi tế bào (Tissue Culture Plate (TCP)), ống nghiệm (Tube method (TM)), thử
khả năng tạo chất nhày (slime) trên thạch bổ sung đỏ Congo (Congo Red Agar

(CRA), bioluminescent assay, piezoelectric sensors, và phương pháp huỳnh
quang (Hassan et al., 2011). Cũng theo tác giả trên, phương pháp định lượng
màng sinh học TCP có ưu điểm nổi trội so với các phương pháp đơn giản khác
như TM và CRA (Hassan et al., 2011). Bên cạnh các phương pháp nêu trên,
người ta cũng có thể phát hiện sự có mặt của gen quyết định khả năng sản sinh
màng sinh học, như gen eno, icaA, icaD và bap của vi khuẩn S. aureus và
coagulase negative Staphylococci (Darwish and Asfour, 2013).
1.4.4.1. Phương pháp xác định biofilm trong ống nghiệm (tube method)
Đây là phương pháp đầu tiên dùng để xác định biofilm của vi sinh vật, và
được mô tả lần đầu tiên bởi (Christensen et al., 1982) trong nghiên cứu khả năng
sản sinh chất có khả năng bám dính của chủng Staphylococcus epidemidis. Trong
phương pháp này, ống ly tâm nhựa 15 ml được dùng để nuôi vi khuẩn và tạo bề
mặt cho sự bám dính của vi khuẩn. Vi khuẩn được nuôi cấy tĩnh trong môi
trường TSB ở 37oC sau 18 đến 24 giờ. Sau thời gian nuôi cấy, môi trường được
loại bỏ và lớp vi khuẩn bám dính bên trong lòng ống được nhuộm bằng trypan
blue. Kết quả của phương pháp xác định biofilm trong ống nghiệm được trình
bày ở hình 1.4.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 19


Hình 1.4. Sự sản sinh màng sinh học của Staphylococcus epidemidis xác định
bằng phương pháp ống nghiệm
Vi khuẩn S. epidemidis chủng RP-12 có khả năng sản sinh chất bám dính
trong quá trình sinh trưởng (hình 1.4A) và vi khuẩn S. epidemidis chủng SP-2
không có khả năng sản sinh chất bám dính (hình 1.4B). Phương pháp ống nghiệm
chỉ có ý nghĩa định tính, do vậy rất khó phát hiện được những chủng vi khuẩn chỉ
sản sinh biofilm ở mức độ yếu. Trong phương pháp ống nghiệm, một số tác giả

cho rằng việc kéo dài thời gian nuôi cấy tĩnh vi khuẩn lên 48 giờ có thể làm rõ
kết quả hình thành biofilm (Freeman et al., 1989).
1.4.4.2. Phương pháp xác định biofilm trên thạch bổ sung đỏ Congo
Phương pháp này lần đầu tiên được mô tả bởi (Freeman et al., 1989) nhằm
cải tiến những nhược điểm của phương pháp ống nghiệm của (Christensen et al.,
1982). Trong phương pháp này, vi khuẩn được ria cấy trên thạch BHI (brain
heart infusion agar) được bổ sung thuốc nhuộm đỏ Congo ở nồng độ 0,08%.
Theo tác giả (Freeman et al., 1989), cơ chế cụ thể của thuốc nhuộm Congo trong

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 20