Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời vitamin a, d, e trong sữa công thức và thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng bằng HPLC

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................... 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN ................................................................................................... 3
1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 3
1.1. Vai trò của vitamin A, vitamin D, vitamin E đối với cơ thể ....................................... 3
1.2. Đặc điểm lý, hóa của vitamin A, D, E ......................................................................... 4
1.2.1. Đặc điểm lý, hóa của vitamin A ............................................................................... 4
1.2.2. Đặc điểm lý, hóa của vitamin D ............................................................................... 5
1.2.3. Đặc điểm lý, hóa của vitamin E................................................................................ 5
2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 7
2.1. Phương pháp tách chiết vitamin A, D, E ra khỏi mẫu thực phẩm ............................... 7
2.1.1. Xử lý mẫu sơ bộ ....................................................................................................... 7
2.1.2. Tách chiết vitamin ra khỏi nền mẫu ......................................................................... 7
2.2. Một số kỹ thuật định lượng vitamin A, D, E ............................................................. 12
2.2.1. Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) ................................................... 12
2.2.2. Điện di mao quản.................................................................................................... 12
2.2.3. Sắc ký khí (GC) ...................................................................................................... 13
2.2.4. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ...................................................................................... 13
PHẦN 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 16

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu ............................................................. 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................... 16
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu ............................................................................... 16


2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 18
2.2.1. Phương pháp phân tích dự kiến .............................................................................. 18
2.2.2. Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký ........................................................................... 18

2.2.3. Tối ưu hóa điều kiện tách chiết .............................................................................. 18
2.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích ......................................................................... 19
2.2.5. Định lượng hàm lượng vitamin A, D, E trong một số thực phẩm trên thị trường . 21
2.3. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................................... 22
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................ 23
3.1. Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký ........................................................................ 23
3.1.1. Lựa chọn bước sóng phân tích................................................................................ 23
3.1.2. Lựa chọn cột sắc ký ................................................................................................ 23
3.1.3. Lựa chọn dung môi pha động và thành phần pha động .......................................... 23
3.1.4. Thể tích tiêm ........................................................................................................... 25
3.1.5. Nhiệt độ buồng cột ................................................................................................. 25
3.1.6. Lựa chọn tốc độ pha động ...................................................................................... 26
3.2. Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu phân tích ................................................................. 27
3.2.1. Ảnh hưởng của enzym đến quá trình thủy phân ..................................................... 27
3.2.2. Khảo sát thể tích KOH 20%/EtOH ......................................................................... 28
3.2.3. Khảo sát nhiệt độ thủy phân ................................................................................... 29
3.2.4. Khảo sát thời gian thủy phân .................................................................................. 30
3.2.5. Khảo sát dung môi chiết và tỷ lệ dung môi chiết ................................................... 31
3.3. Thẩm định phương pháp phân tích ............................................................................ 33
3.3.1. Tính thích hợp của hệ thống ................................................................................... 33
3.3.2. Độ đặc hiệu ............................................................................................................. 34
3.3.3. Khoảng tuyến tính .................................................................................................. 35


3.3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ............................................................. 36
3.3.5. Độ lặp lại ................................................................................................................ 37
3.3.6. Độ thu hồi ............................................................................................................... 38
3.4. Kết quả phân tích mẫu thực ....................................................................................... 40
PHẦN 4. BÀN LUẬN ..................................................................................................... 41
4.1. Về điều kiện sắc ký.................................................................................................... 41

4.2. Về xử lý mẫu ............................................................................................................. 41
4.3. Về thẩm định phương pháp phân tích ....................................................................... 42
4.4. Kết quả phân tích mẫu thực ....................................................................................... 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC:

(Association of Official Analytical Chemists) - Hiệp hội các nhà
hóa học phân tích

ACN:

Acetonitril

BHT:

Butylate hydroxytoluenen

EtOH:

Ethanol

GC:

Sắc ký khí

HPLC:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ISO:

(International Organization for Standardization): Tổ chức tiêu
chuẩn hóa quốc tế

LOD:

(Limit of detection) - Giới hạn phát hiện

LOQ:

(Limit of quantitation) – Giới hạn định lượng

MeOH:

Methanol

PA:

(Pure analysis) – tinh khiết phân tích

PDA:

(Photo diod array) – mảng diod quang

ppm:

(part per million) – phần triệu

RSD:

(Relative standard deviation) – độ lệch chuẩn tương đối

SD:

(Standard deviation) – độ lệch chuẩn

STT:

Số thứ tự

TCVN:

Tiêu chuẩn Việt Nam

THF:

Tetrahydrofuran.

UV-VIS:

(Ultra Violet – Visible) – tử ngoại khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Tóm tắt một số phương pháp xử lý mẫu phân tích vitamin A, D3, E
trong thực phẩm và thuốc ................................................................................. 9
Bảng 1.2. Một số điều kiện sắc ký lỏng phân tích vitamin A, D3, E ở Việt Nam
và trên thế giới .................................................................................................13
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống ................................33
Bảng 3.4. Kết quả xác định khoảng tuyến tính ...............................................36
Bảng 3.5. Kết quả xác định LOD, LOQ ..........................................................37
Bảng 3.6. Kết quả tính độ lặp lại.................................. ..................................37
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ thu hồi của vitamin A ....................................38
Bảng 3.8. Kết quả đánh giá độ thu hồi của vitamin D ....................................39
Bảng 3.9. Kết quả đánh giá độ thu hồi của vitamin E ....................................39
Bảng 3.10. Kết quả phân tích một số mẫu trên thị trường ..............................40


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của vitamin A, D3, E .........................................6
Hình 3.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ......................................24
Hình 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cột .................................25
Hình 3.4. Kết quả khảo sát tốc độ dòng ..........................................................26
Hình 3.5. Kết quả khảo sát hiệu quả của enzym đến kết quả định lượng .......28
Hình 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích KOH 20%/EtOH ............29
Hình 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân ......................30
Hình 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân .....................31
Hình 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết ............................32
Hình 3.10. Quy trình xử lý mẫu phân tích vitamin A, D, E ............................33
Hình 3.11. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu ........................................................34
Hình 3.12. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của pic trên phần mềm thiết bị

HPLC................................................................................. .............................35


ĐẶT VẤN ĐỀ
Vitamin là những chất hữu cơ có phân tử lượng thấp, không cung cấp
năng lượng nhưng có vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa của cơ
thể, có ảnh hưởng đến sức khỏe và bệnh tật.
Tuy mỗi ngày cơ thể chỉ cần một lượng rất nhỏ tính bằng miligam,
thậm chí microgam, tuy nhiên thiếu hoặc thừa các vitamin trong khẩu phần ăn
gây ra nhiều xáo trộn cho hoạt động hàng ngày của cơ thể thậm chí có thể gây
bệnh. Do vậy vitamin có vai trò quan trọng góp phần duy trì cuộc sống, giúp
cơ thể khỏe mạnh.
Trong công nghiệp thực phẩm, nghiên cứu phát triển các dạng thực
phẩm bổ sung vitamin và các vi chất dinh dưỡng đã trở thành một lĩnh vực
được quan tâm hàng đầu bởi những giá trị thiết yếu của sản phẩm góp phần
đáp ứng nhu cầu của thị trường và hứa hẹn mang lại nhiều lợi nhuận cho các
nhà kinh doanh thực phẩm. Cũng vì lý do đó, lĩnh vực kiểm nghiệm thực
phẩm ngày càng tiếp nhận kiểm nghiệm nhiều loại thực phẩm bổ sung
vitamin nói chung, vitamin tan trong dầu (vitamin A, vitamin D, vitamin E)
nói riêng để đánh giá chất lượng sản phẩm trên thị trường theo yêu cầu của
khách hàng và cơ quan quản lý. Vitamin A, E đều có hàm lượng cao trong
thực phẩm bổ sung, nên hiện nay có một số phương pháp thường qui định
lượng đồng thời hai loại vitamin này; tuy nhiên chưa có phương pháp thường
qui nào phân tích đồng thời cả 3 loại vitamin A, D, E trong thực phẩm vì
vitamin D có hoạt lực mạnh nên chỉ được bổ sung với hàm lượng nhỏ. Nghiên
cứu xây dựng phương pháp chiết tách và định lượng đồng thời các vitamin A,
D, E trong thực phẩm đặc biệt là các thực phẩm có nền mẫu phức tạp như sữa
công thức và thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng giúp tiết kiệm thời gian,
hóa chất phân tích, cho độ chính xác cao, đơn giản, dễ áp dụng trong điều
kiện các phòng thí nghiệm trong nước là một nhu cầu thiết thực. Vì vậy,

1


chúng tôi tập trung nghiên cứu đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng
đồng thời vitamin A, D, E trong sữa công thức và thực phẩm bổ sung vi
chất dinh dƣỡng” với những mục tiêu sau:
- Xây dựng phương pháp chiết và phân tích đồng thời vitamin A, D, E
trong sữa công thức và thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng.
- Ứng dụng quy trình đã xây dựng cho phân tích vitamin A, D, E trong một
số mẫu sữa công thức, thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng trên thị trường
Việt Nam.

2


PHẦN 1. TỔNG QUAN
1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu
1.1. Vai trò của vitamin A, vitamin D, vitamin E đối với cơ thể
Vitamin A có vai trò tạo sắc tố võng mạc giúp điều tiết mắt, cần thiết
cho quá trình biệt hóa các tế bào biểu mô ở da và niêm mạc, có vai trò bảo vệ
sự toàn vẹn của cơ cấu và chức năng của biểu mô khắp cơ thể, nhất là biểu mô
trụ của nhu mô mắt. Cùng với vitamin D, vitamin A có vai trò giúp cho sự
phát triển xương và tham gia vào quá trình phát triển cơ thể, đặc biệt ở trẻ em.
Nếu thiếu vitamin A trẻ em sẽ còi xương, chậm lớn. Trên hệ miễn dịch,
vitamin A giúp phát triển lách và tuyến ức là hai cơ quan tạo ra lympho bào
có vai trò miễn dịch của cơ thể, tăng tổng hợp các protein miễn dịch. Nhu cầu
vitamin A hàng ngày ở người lớn khoảng 750 - 1000 µg, ở trẻ em là 300 µg.
Khi cơ thể dư thừa vitamin A gây ra tình trạng đau bụng, buồn nôn, bơ phờ,
chậm chạp, phù gai thị, thóp phồng, vài ngày tiếp theo da bong toàn thân rồi

hồi phục dần khi đã ngừng thuốc. Ðối với phụ nữ có thai 3 tháng đầu, nếu
dùng quá 10.000 đơn vị vitamin A mỗi ngày kéo dài dễ bị dị dạng thai nhi.
Vitamin D có vai trò rất quan trọng trong quá trình tạo xương nhờ tác
dụng trên chuyển hóa các chất vô cơ mà chủ yếu là calci và phosphat.
Vitamin D cũng giúp điều hòa nồng độ calci trong máu. Khi thiếu vitmin D,
ruột không hấp thu đủ calci và phospho làm calci máu giảm, khi đó calci bị
huy động từ xương ra để ổn định calci máu nên gây hậu quả là trẻ em chậm
lớn, còi xương, chân vòng kiềng, chậm biết đi, chậm kín thóp. Người lớn sẽ bị
loãng xương, xốp xương, xương thưa dễ gãy. Phụ nữ mang thai thiếu vitamin
D có thể sinh ra trẻ khuyết tật ở xương. Ngoài ra, vitamin D còn tham gia quá
trình biệt hóa tế bào biểu mô và gần đây đang nghiên cứu về tác dụng ức chế
tăng sinh tế bào ung thư như ung thư tuyến tiết melanin, ung thư vú…[8].

3


Nhu cầu vitamin D hàng ngày ở người lớn khoảng 2,5 µg, ở trẻ em khoảng 10
µg.
Vitamin E có tác dụng chống oxy hóa (ngăn cản oxy hóa các thành
phần thiết yếu trong tế bào, ngăn cản tạo thành các sản phẩm oxy hóa độc hại),
bảo vệ màng tế bào khỏi sự tấn công của các gốc tự do, nhờ đó bảo vệ được
tính toàn vẹn của màng tế bào. Khi thiếu vitamin E có thể gặp các triệu
chứng: rối loạn thần kinh, yếu cơ, rung giật nhãn cầu, giảm nhạy cảm về xúc
giác, dễ tổn thương da, dễ vỡ hồng cầu, dễ tổn thương cơ và tim. Đặc biệt trên
cơ quan sinh sản khi thiếu vitamin E thấy tổn thương cơ quan sinh dục, gây
vô sinh [8]. Hàng ngày, người lớn cần khoảng 15 mg, ở trẻ em cần khoảng 7
mg vitamin E. Khi cơ thể thừa vitamin E có thể gặp các tác dụng phụ do
vitamin E thúc đẩy các tổn hại do quá trình ôxy hóa gây ra và khống chế các
tác nhân chống lão hóa khác. Biểu hiện dễ nhận thấy nhất khi dùng vitamin E
quá liều là tiêu chảy, đau bụng, rối loạn tiêu hóa, mệt mỏi, suy nhược...

Những triệu chứng này sẽ nhanh chóng mất đi sau khi ngừng thuốc do
vitamin E được đào thải nhanh ra khỏi cơ thể.
1.2. Đặc điểm lý hóa của vitamin A, vitamin D, vitamin E
1.2.1. Đặc điểm lý hóa của vitamin A
Vitamin A không phải là một chất mà là tên chung để chỉ nhiều chất có
hoạt tính sinh học tương tự nhau. Tất cả các dạng vitamin A đều có vòng beta
– ionon và gắn vào nó là một chuỗi isoprenoid. Trong thực phẩm có nguồn
gốc động vật, dạng chính của vitamin A là retinol, nhưng cũng có thể tồn tại
dưới dạng aldehyd là retinal hay dạng acid là acid retinoic. Chất thường được
gọi là vitamin A là retinol, có phân tử gam là 286,45 [3]. Hiện nay, vitamin A
còn được tạo ra bằng tổng hợp hóa học. Hoạt tính của vitamin A được xác
định bằng đơn vị quốc tế, 1 đơn vị quốc tế bằng 0,3 μg vitamin A hoặc 0,6 μg
β-caroten.

4


Vì retinol có hoạt tính sinh học quan trọng nhất và dạng chủ yếu chiếm
đa số nên trong phạm vi luận văn này chỉ nghiên cứu về retinol (sau đây gọi
tắt là vitamin A).
Vitamin A là những tinh thể hoặc bản mỏng màu vàng nhạt, nóng chảy
ở 63 – 64ºC, không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol và một số
dung môi hữu cơ. Do có hệ nối đôi liên hợp nên vitamin A dễ bị oxy hóa,
không bền vững trong không khí, ánh sáng, nhiệt độ cao hay khi có mặt của
các chất béo dễ bị hoặc đã bị oxy hóa. Vì vậy, phải bảo quản vitamin A ở chỗ
nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng, trong chai lọ thủy tinh màu vàng, bao bì kín,
thêm chất chống oxy hóa [4].
1.2.2. Đặc điểm lý hóa của vitamin D
Vitamin D là một nhóm gồm từ D2 đến D7, trong đó có 2 chất có hoạt tính
mạnh nhất là D2 và D3. Nói chung, về hoạt tính không có sự khác nhau nhiều

giữa vitamin D2 và D3 [7].
Đề tài này tập trung nghiên cứu về vitamin D3 (cholecalciferol). Hoạt tính
của 0,025µg vitamin D3 bằng 1 đơn vị quốc tế vitamin D3.
Vitamin D3 là những tinh thể trắng hoặc gần như trắng, dễ biến đổi khi tiếp
xúc với không khí, nhiệt độ và ánh sáng. Trong dung dịch, tùy thuộc vào nhiệt
độ và thời gian mà có thể xẩy ra hiện tượng đồng phân hóa thuận nghịch
thành pre-cholecalciferol. Vitamin D3 dễ tan trong chloroform, ethanol 96%
và ether, tan trong dầu béo; thực tế không tan trong nước. Dung dịch trong
các dung môi bay hơi không vững bền, nên dùng ngay.
1.2.3. Đặc điểm lý hóa của vitamin E
Vitamin E là thuật ngữ chỉ một nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học tương
tự nhau là α, β, γ, δ tocoferol, trong đó α-tocoferol có hoạt tính mạnh nhất.
Hoạt tính của 1 mg α-tocoferol bằng 1 đơn vị vitamin E.
Các vitamin E và ester của chúng là chất lỏng sánh như dầu, màu vàng
sáng, hầu như không mùi, không vị; không tan trong nước, tan trong ethanol,

5


các dung môi hữu cơ và các dầu béo (riêng dạng muối succinat là bột màu
trắng). Do trong phân tử có các carbon bất đối nên vitamin E có các đồng
phân quang học. Các đồng phân hữu truyền (dạng D) thường có hoạt tính
mạnh hơn các đồng phân tả truyền (dạng L). Các tocoferol trong tự nhiên ở
dạng D, loại tổng hợp dạng racemic. Các vitamin E dễ bị oxy hóa với các tác
nhân: tia tử ngoại, chất béo đã bị ôi, một số kim loại nặng và môi trường kiềm.
Vì vậy, cần phải bảo quản vitamin E trong chai lọ kín, đổ đầy, thủy tinh màu
vàng, để chỗ nhiệt độ thấp, tránh sánh sáng [3], [4].
Vitamin E tự nhiên tồn tại dưới 8 dạng khác nhau, trong đó có 4 tocoferol
và 4 tocotrienol. Các tocoferol và tocotrienol đều có dạng α, β, γ, δ; mỗi dạng
có hoạt tính sinh học khác nhau chút ít. Dạng α-tocoferol có công thức phân

tử là C29H50O2 và phân tử lượng là 430,7 (g/mol) chiếm chủ yếu trong tự
nhiên và có hoạt tính quan trọng nhất, vì vậy nó thường được lấy tên chung là
vitamin E. Ngày nay, vitamin E chủ yếu được điều chế bằng phương pháp
tổng hợp hóa học [5], [6]. Trong phạm vi luận văn này chỉ nghiên cứu dạng
đồng phân α-tocoferol.

Công thức cấu tạo
Công thức cấu tạo của
Công thức cấu tạo
của vitamin A
vitamin D3
của vitamin E (α(retinol)
(cholecalciferol)
tocoferol)
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của vitamin A, D3, E

Trong thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng và sữa công thức, vitamin
A thường được bổ sung với hàm lượng từ 400 - 600µg/100g, vitamin D
thường được bổ sung với hàm lượng từ 4 – 11µg/100g; vitamin E thường

6


được bổ sung với hàm lượng từ 4,5 – 8mg/100g tùy vào từng loại thực phẩm
với mục đích dành cho lứa tuổi, đối tượng, tình trạng sức khỏe khác nhau.
2. Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu
2.1. Phƣơng pháp tách chiết vitamin A, D, E ra khỏi mẫu thực phẩm
2.1.1. Xử lý mẫu sơ bộ
- Mẫu sữa bột được đồng nhất kỹ trước khi cân, sữa lỏng được lắc đều cho
đồng nhất trước khi cân.

- Mẫu thực phẩm thực phẩm bổ sung dạng viên nén được nghiền, trộn kỹ;
dạng viên nang được chọn ngẫu nhiên; dạng siro, dạng lỏng được lắc đều trước
khi cân.
2.1.2. Tách chiết vitamin ra khỏi nền mẫu
Tỷ lệ chất béo trong các thực phẩm chứa vitamin tan trong dầu chủ yếu
gồm các triglycerid, một lượng rất ít các sterol, carotenoid, phospholipid và
một lượng nhỏ các thành phần gần giống mỡ. Tất cả các chất này ức chế khả
năng hòa tan của các loại vitamin tan trong dầu. Một phần các vitamin này
liên kết với phức hợp lipoprotein do đó cần phải phá vỡ liên kết để giải phóng
vitamin ra khỏi các phức hợp. Như vậy cần có phương pháp chiết tách phù
hợp để chiết các vitamin ra khỏi nền mẫu trước khi tiến hành định lượng [35].
Có một số phương pháp chiết vitamin tan trong dầu ra khỏi nền mẫu thực
phẩm như: xà phòng hóa, chiết bằng cồn, sử dụng enzym, chiết bằng dung
môi hữu cơ, chiết bằng dung môi siêu tới hạn [28,41,45,38,57,].
* Xà phòng hóa
Xà phòng hóa là cách truyền thống để giải phóng các vitamin trong các
nền mẫu phức tạp sau đó chiết lỏng – lỏng bằng dung môi hữu cơ.
Một phần các vitamin tan trong dầu trong thực phẩm tồn tại ở dạng liên
kết với các phức hợp lipoprotein, và do đó cần phá vỡ các liên kết protein chất béo để giải phóng các vitamin này. Xà phòng hóa thường được sử dụng
để giải phóng các liên kết hoặc phá vỡ dạng ester của vitamin A, D, E [23].

7


Quá trình xà phòng hóa được tiến hành trong môi trường kiềm mạnh; điều
này giúp giảm sự có mặt của các chất khác trong nền mẫu hòa tan vào dung
môi hữu cơ trong quá trình chiết sau này. Quá trình xà phòng hóa được tiến
hành bằng cách thêm dung dịch NaOH hoặc KOH ở nhiệt độ môi trường hoặc
nhiệt độ cao với sự có mặt của chất chống oxy hóa và môi trường khí trơ.
Ngay sau quá trình xà phòng hóa luôn luôn là quá trình chiết bằng dung môi

hữu cơ như diethyl ether, diisopropyl ether, chloroform, n-hexan hoặc các hỗn
hợp của chúng [2, 1, 36].
* Thủy phân bằng enzym
Nhiều loại enzym thường được sử dụng trong công nghệ thực phẩm để
thủy phân nhiều liên kết hóa học đặc hiệu khác nhau như enzym amylase xúc
tác thủy phân tinh bột, lipase, protease xúc tác phản ứng thủy phân triglycerid
thành axit béo và glycerol. Đối với phân tích vitamin trong thực phẩm, các
enzym thường được sử dụng trong phân tích vitamin K vì vitamin này không
bền trong môi trường kiềm, sau đó chiết trực tiếp bằng dung môi hữu cơ.
Phương pháp này đã phát triển thành phương pháp thường qui [14], chứng tỏ
enzym có hoạt lực thủy phân thực phẩm tốt, giúp giải phóng vitamin ra khỏi
nền mẫu, giúp quá trình chiết diễn ra thuận lợi. Tác giả Xiuping và cộng sự đã
có nghiên cứu bổ sung enzym protease trong môi trường kiềm (dung dịch
amoniac) để thủy phân mẫu thức ăn chăn nuôi, sau đó chiết bằng ethanol [56].
* Chiết bằng dung môi hữu cơ
Chiết lỏng – lỏng là một kỹ thuật rất phổ biến trong định lượng các
vitamin. Sau quá trình xà phòng hóa, các vitamin tan trong dầu luôn được
tách ra khỏi nền mẫu bằng cách chiết lặp lỏng – lỏng nhiều lần bằng các dung
môi hữu cơ không phân cực (petroleum ether, n-hexan, n-heptan). Pha hữu cơ
được cô lại bằng thiết bị cất quay hoặc thổi khô, sau đó hòa tan chất phân tích
bằng dung môi pha động [23].
* Chiết lỏng siêu tới hạn

8


Chiết lỏng siêu tới hạn sử dụng CO2 siêu tới hạn đã được mô tả trong
một số bài báo và cũng đưa ra một số kết quả khả quan vì CO2 siêu tới hạn có
khả năng hòa tan mạnh các chất không phân cực. Kỹ thuật này giúp tách các
vitamin ra khỏi nền mẫu thực phẩm, huyết thanh, kem, sữa công thức, thuốc

mỡ [53, 47]. Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn có ưu điểm nhanh, hạn chế
công sức, tốn ít dung môi nhưng chi phí trang bị đắt, hầu hết các phòng kiểm
nghiệm thực phẩm tại Việt Nam chưa ứng dụng được kỹ thuật này.
* Chiết pha rắn
Chiết pha rắn là phương pháp chiết dựa vào sự phân bố của chất phân
tích giữa hai pha lỏng và rắn. Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được nhồi
vào các ống nhỏ. Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha
rắn sẽ được giữ lại trên ống. Các chất này được rửa giải khỏi pha rắn bằng
một dung môi khác phù hợp. Thông thường thể tích dung môi rửa giải nhỏ
hơn nhiều so với thể tích dung dịch mẫu. Kỹ thuật này tiến hành khá nhanh,
độ thu hồi tốt, tốn ít dung môi hơn so với chiết lỏng – lỏng. Trong nhiều
nghiên cứu trước, các tác giả đã ứng dụng được kỹ thuật chiết pha rắn trong
phân tích vitamin D và các dạng chuyển hóa của nó trong máu, dịch cơ thể,
thức ăn chăn nuôi [41, 50, 58].
Bảng 1.1. Tóm tắt một số phương pháp xử lý mẫu phân tích vitamin A, D3, E
trong thực phẩm và thuốc
Phƣơng pháp
tiêu chuẩn/ bài
báo khoa học/
công trình
nghiên cứu

A

D

X
Dược điển Việt
Nam IV [6]
X

AOAC 992.06
[12]

X

E

Dạng bào chế/ nền
mẫu

Phƣơng pháp xử lý mẫu

Chế phẩm phức tạp
hoặc chứa vitamin
A hàm lượng thấp
viên nén/ thuốc
uống dạng giọt/
dung dịch tiêm

Xà phòng hóa bằng KOH/ ethanol và
chiết bằng dung môi ether.

Sữa công thức cho
trẻ

9

Hòa tan chế phẩm bằng toluen và
pha loãng bằng pha động.
Xà phòng hóa mẫu bằng dung dịch

KOH/ nước. Chiết bằng dung môi nhexan + methylen chloride (3:1).


Phƣơng pháp
tiêu chuẩn/ bài
báo khoa học/
công trình
nghiên cứu

A

AOAC 995.05
[13]

D

X

X

TCVN 8973 :
2011 (EN
12821 : 2009)
[3]

Dạng bào chế/ nền
mẫu

Sản phẩm công
thức và hỗ trợ tiêu

hóa cho trẻ nhỏ

X

AOAC 992.03
[11]
TCVN 89721:2011 (EN
12823-1 :2000)
[2]

E

Sữa công thức cho
trẻ

Thực phẩm

X

TCVN 8276 :
2010 (EN
12822 : 2000)
[1]

Thực phẩm

X

Dionex (2009)
[31]

X

X

Cao Công
Khánh (2010)
[8]

X

X

Nhiều loại thực
phẩm (bơ, dầu, mỡ,
margarin, các loại
thực phẩm khác)
Nước uống dinh
dưỡng
Sữa (bột, lỏng)

Dược điển Mỹ
36 [55]

X

X

X

Viên nang

Semahat K.,
Onur B.,
Huseyin K. [49]

X

X

X

Viên nén
multivitamins

Xiuping X.,
Jinming Y.,
Pingly H. [58]

X

X

X

Thức ăn chăn nuôi

10

Phƣơng pháp xử lý mẫu

Xà phòng hóa mẫu, chiết bằng dung
môi n-hexan, sau đó làm bay hơi
dung môi, rồi sử dụng chiết pha rắn,
dịch chiết đem định lượng.
Xà phòng hóa bằng KOH/ nước,
chiết bằng n-hexan : methylen
chlorid (3:1)
Xà phòng hóa bằng KOH/ ethanol +
chất chống oxy hóa acid ascorbic sau
đó chiết bằng dầu nhẹ/ n-hexan/
diethyl ether
Xà phòng hóa bằng KOH/Ethanol +
chất chống oxy hóa, sau đó chiết
bằng dung môi hữu cơ, làm sạch
bằng sắc ký lỏng bán điều chế, sắc
ký bản mỏng
Xà phòng hóa bằng KOH/ethanol
(hoặc methanol) + chất chống oxy
hóa, sau đó chiết bằng n-hexan
Hòa tan mẫu trong pha động A
(dung dịch acid formic 0.015%)
Xà phòng hóa bằng KOH/EtOH sau
đó chiết bằng dung môi n-henxan.
Phương pháp 1: Chiết trực tiếp bằng
dung môi n-hexan +
dimethylsulfoxide
Phương pháp 2: Xà phòng hóa bằng
KOH/ pyrogallol, chiết bằng dung
môi n-hexan + methylene chloride

(3:1)
Mẫu nghiền thành dạng bột mịn và
hòa tan bằng dung môi
TFA:methanol (80:20), ly tâm thu
dịch chiết.
Xà phòng hóa bằng NH3/ethanol có
bổ sung enzym savinase proteinase,
sau đó chiết pha rắn bằng cartridges
Oasis HLB


Qua tóm tắt một số phương pháp tiêu chuẩn và bài báo nghiên cứu về
phân tích vitamin A, D, E trong thuốc và thực phẩm, chúng tôi có nhận xét
sau:
- Chưa có phương pháp kiểm nghiệm thường qui (TCVN, AOAC, EN,
ISO...) hướng dẫn định lượng đồng thời vitamin A, D, E trong thực phẩm nói
chung và sữa công thức, thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng nói riêng.
- Đối với các chế phẩm thuốc, thành phần chế phẩm và dạng bào chế
tương đối đơn giản như viên nang, viên nén, dung dịch…với hàm lượng
vitamin thường cao hơn trong các sản phẩm thực phẩm, phương pháp xử lý
mẫu không quá phức tạp: có thể xà phòng hóa hoặc không, sau đó chiết bằng
dung môi ít phân cực [6,18,51,55]. Trong khi đó, thực phẩm bổ sung vi chất
dinh dưỡng, sữa công thức thường có thành phần nền mẫu phức tạp, thường
có thêm nhiều thành phần dinh dưỡng khác, đặc biệt là các loại lipid, peptid,
phospholipid, hàm lượng từng loại vitamin trong đó không cao, đòi hỏi quá
trình xử lý mẫu phức tạp hơn để chiết tách được vitamin đem định lượng. Nếu
nền mẫu chưa được xử lý triệt để sẽ ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân tích,
đặc biệt với những chất phân tích có mặt với hàm lượng nhỏ trong mẫu như
vitamin D3.
Trong nghiên cứu này lựa chọn phương pháp xà phòng hóa vì phương

pháp này phù hợp với việc chiết tách vitamin A, D, E, loại trừ chất béo và
lipid hiệu quả, chi phí thấp. Hơn nữa, nếu như trong các chế phẩm thuốc,
dạng tồn tại của các loại vitamin đã biết trước thì trong sữa công thức sử dụng
nguyên liệu từ tự nhiên nên các vitamin tồn tại ở nhiều dạng khác nhau; trong
thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng các vitamin A, E thường tồn tại ở dạng
ester để hạn chế sự oxy hóa. Ở khía cạnh đánh giá mức độ dinh dưỡng chỉ
quan tâm đến hoạt lực tổng của từng loại vitamin, do đó, phương pháp xà
phòng hóa không chỉ giúp giải phóng các vitamin ra khỏi liên kết với các
thành phần khác trong thực phẩm mà còn giúp chuyển vitamin từ dạng ester

11


sang dạng ancol, giúp tiết kiệm chi phí sử dụng chuẩn làm việc trong quá
trình phân tích, thuận tiện trong quá trình tính toán kết quả. Tuy nhiên, việc
bổ sung thêm enzym trong quá trình xà phòng hóa vừa giúp phá vỡ các liên
kết ester, vừa phá vỡ các liên kết peptid trong nền mẫu, do đó quá trình chiết
vitamin tiếp theo bằng dung môi diễn ra thuận lợi hơn [41, 54].
Các sterol, carotenoid, vitamin tan trong dầu không bị xà phòng hóa
nên được chiết ra khỏi hỗn hợp sau khi thủy phân bằng dung môi hữu cơ, sử
dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng, tiến hành chiết lặp lại nhiều lần để chuyển tối
đa lượng vitamin có trong mẫu phân tích sang pha dung môi hữu cơ. Quá
trình chiết thực hiện trong các dụng cụ thủy tinh tối màu, loại khí oxy bằng
cách sục nitơ, thêm chất chống oxy hóa để hạn chế tối đa các vitamin bị oxy
hóa. Dịch chiết được đem cất quay chân không để bay hơi dung môi. Quá
trình cất cần tiến hành trong bình cất quay luôn được làm đầy bởi dung môi
cất quay hoặc sục khí nitơ để hạn chế tối đa sự oxy hóa [48]. Cắn được hòa
tan bằng dung môi pha động với thể tích thích hợp để tiến hành chạy HPLC.
2.2. Một số kỹ thuật định lƣợng vitamin A, D, E
2.2.1. Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS)

UV-VIS là phương pháp định lượng nhanh, thao tác tiến hành đơn giản,
do đó phương pháp cũng được dùng để định lượng độc lập hoặc đồng thời các
vitamin A, D, E trong một số chế phẩm thuốc và thực phẩm [23, 24].
Tuy nhiên phương pháp UV-VIS có nhược điểm là tính đặc hiệu không
cao, nhất là khi có mặt của các tạp chất khác, nhất là các sản phẩm phân hủy
của vitamin. Trong thực tế, các mẫu thực phẩm sau quá trình lưu thông trên
thị trường không tránh khỏi tình trạng thoái hóa, biến chất, đặc biệt là các
vitamin A, D, E vốn rất dễ bị oxy hóa.
2.2.2. Điện di mao quản
Điện di mao quản từng được sử dụng rộng rãi trong thập kỷ trước để
phân tách và xác định nhiều hoạt chất sinh học quan trọng, ưu điểm của

12


phương pháp này là có độ phân giải cao, chi phí thấp, có thể tiến hành định
lượng nhiều mẫu trong khoảng thời gian ngắn. Điện di mao quản cũng được
áp dụng để định lượng các loại vitamin tan trong nước và trong dầu [30, 34,
48]. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là độ nhạy kém, lượng mẫu
sử dụng nhỏ dẫn đến sai số lớn khi phân tích hàm lượng lớn do hệ số pha
loãng cao.
2.2.3. Sắc ký khí (GC)
Trong những năm 1960, trước khi HPLC phát triển, GC đã được ứng
dụng rộng rãi để xác định các vitamin tan trong dầu trong thực phẩm. Sau đó,
với việc chuyển từ công nghệ cột nhồi sang cột mao quản thì hiệu quả ứng
dụng của kỹ thuật GC phát triển mạnh mẽ. Kỹ thuật này đòi hỏi quá trình
chuẩn bị mẫu phức tạp để loại bỏ lipid, sterol và một số tạp chất khác ra khỏi
nền mẫu. Đồng thời, phải dẫn xuất các vitamin này để tăng khả năng bay hơi
và tăng độ bền vững của chúng trong nhiệt độ cao [7, 27, 51] .
2.2.4. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC có một lợi thế quan trọng hơn so với GC và các kỹ thuật sắc ký
khác khi phân tích vitamin trong thực phẩm nói chung, vì HPLC có thể phát
hiện khá chọn lọc các loại vitamin, quá trình xử lý mẫu không quá phức tạp, ít
khi cần dẫn xuất hóa. Với lý do trên, để xác định các vitamin tan trong dầu
nói chung với một độ chính xác và độ lặp lại chấp nhận được thì HPLC là một
phương pháp được lựa chọn hiện nay [1,2,10-18].
Bảng 1.2. Một số điều kiện sắc ký lỏng phân tích vitamin A, D, E ở Việt Nam
và trên thế giới
Phƣơng pháp
tiêu chuẩn/ bài
báo khoa học/
công trình
nghiên cứu
Dược điển Việt
Nam IV [6]

A

D

X
X

E

Dạng bào chế/
nền mẫu

Điều kiện sắc ký

Chế phẩm phức
tạp hoặc chứa
vitamin A hàm
lượng thấp
viên nén/ thuốc

Pha động: Methanol - ethyl acetat – nước
(90 : 7 : 3); tốc độ dòng: 1,5 - 2,0
ml/phút; thể tích tiêm: 20 l; Cột C18
(25 cm  4 mm) hạt 5-10µm
Pha động: Hexan-n-pentanol (997 : 3)

13


Phƣơng pháp
tiêu chuẩn/ bài
báo khoa học/
công trình
nghiên cứu

AOAC 992.06
[12]

A

D

X

AOAC 992.03
[11]

X

X

TCVN 8973 :
2011 (EN 12821 :
2009) [3]

X

TCVN 8276 :
2010 (EN 12822 :
2000) [1]

X

Dionex (2009)
[31]

X

X

Cao Công Khánh
(2010) [8]

X

X

Dược điển Mỹ 36
[55]

X

Dạng bào chế/
nền mẫu

Điều kiện sắc ký

uống dạng giọt/
dung dịch tiêm

Tốc độ dòng: 2 ml/phút
Cột thép không gỉ (25 cm × 4,6 mm, cỡ
hạt 5 µm)
Pha động n-hexan + isoproyl ancol (100
+ 0,25, thể tích/thể tích); Cột 15cm *
4,6mm, cỡ hạt nhồi 5µm;
Pha động ACN + MeOH + ethyl acetat
chạy gradient, tốc độ dòng thay đổi từ 0,7
đến 2,5ml/ phút, thể tích tiêm 250µm, cột
C18 25cm * 4,6mm, cỡ hạt 5µm
Pha động n-hexan + isopropyl alcohol
(99,92 + 0,08%), cột 25cm *4.6mm cỡ
hạt 5µm.

Sữa công thức
cho trẻ

X

AOAC 995.05
[13]

TCVN 89721:2011 (EN
12823-1 :2000)
[2]

E

X

X

Sản phẩm công
thức và hỗ trợ
tiêu hóa cho trẻ
nhỏ
Sữa công thức
cho trẻ

Thực phẩm

Pha động n-hexan : n-butanol (98: 2), tốc
độ dòng 2ml/ phút, cột pha thuận, thể tích
bơm 50µl.

Thực phẩm

Pha động MeOH : nước = 95 :5 (hoặc
93 :7), có sử dụng nội chuẩn D2 ; cột pha
đảo C18 đường kính 4-4,6mm,dài 2530cm, cỡ hạt 5µm.

Nhiều loại thực
phẩm (bơ, dầu,
mỡ, margarin,
các loại thực
phẩm khác)

Pha động: n-hexan + di-isopropyl ete (80
+ 20), tốc độ dòng 1,5ml/ phút.

Nước uống dinh
dưỡng

Sữa (bột, lỏng)

Viên nang

14

Pha động: kênh A (acid formic/ H2O
0,015%); kênh B (MeOH: ACN = 17:83)
100% kênh A trong 3 phút đầu, 0  45%
kênh B trong 5 phút sau, 45  100%
kênh B trong 0,1 phút, 100% kênh B

trong 16,9 phút, từ 0  100% kênh A
trong 5 phút cuối cùng.
Pha động MeOH : nước theo gradient,
cột sắc ký pha đảo C18, tốc độ dòng 1ml/
phút, nhiệt độ cột 40ºC.
Pha động: n-hexan; cột 4,6mm*15mm,
hạt nhồi 3µm L8; tốc độ dòng 1ml/ phút,
detector UV 325nm.
Pha động: n-hexan + isopropyl alcohol
(99+1); cột 4,6mm*15mm, hạt nhồi 3µm
L8; tốc độ dòng 1ml/ phút, detector UV


Phƣơng pháp
tiêu chuẩn/ bài
báo khoa học/
công trình
nghiên cứu

A

D

E

Dạng bào chế/
nền mẫu

Semahat K., Onur
B., Huseyin K.

[49]

X

X

X

Viên nén
multivitamins

Xiuping X.,
Jinming Y.,
Pingly H. [58]

X

X

X

Thức ăn chăn
nuôi

Điều kiện sắc ký

265nm.
Pha động: methanol : acetonitrile: nước
(46,5: 46,5: 7,0); cột 4,6mm*25mm, hạt
nhồi L1; tốc độ dòng 3ml/ phút, detector

UV 291nm, nhiệt độ cột 40ºC.
4 phút đầu pha động TFA:MeOH (95:5),
6 phút sau giảm dần TFA và duy trì đến
20 phút tỷ lệ TFA:MeOH (5:95), cuối
cùng lại tăng dần TFA đến tỷ lệ
TFA:MeOH (95:5).
Pha động MeOH:nước (98:2), Cột C18
15cm*4,6cm, cỡ hạt 5µm, tốc độ dòng
1ml/ phút, thể tích tiêm 10µl, nhiệt độ cột
35ºC.

Từ bảng tóm tắt trên cho thấy, sắc ký lỏng hiệu năng cao là một
phương pháp rất phổ biến để định lượng các vitamin tan trong dầu, tuy nhiên
một số phương pháp phân tích thường qui hướng dẫn phân tích độc lập
vitamin A, D, E thì lại sử dụng cột sắc ký pha thuận, dung môi pha động là
các dung môi không phân cực như n-hexan, isooctan, có thể bổ sung thêm
butanol, diethylether [1, 2, 13, 15, 17].... Nhược điểm của phương pháp này là
dung môi độc hại, độ lặp lại của hệ thống khi sử dụng cột pha thuận thường
kém hơn pha đảo, thời gian lưu thường không ổn định.
Do đó, đề tài đã nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu bằng kỹ thuật xà
phòng hóa có bổ sung enzym, chiết tách vitamin bằng dung môi hữu cơ và tối
ưu hóa thông số sắc ký giúp định lượng đồng thời 3 loại vitamin A, vitamin D,
vitamin E trong thực phẩm bằng HPLC, sử dụng cột phân tích pha đảo.

15


PHẦN 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và phƣơng tiện nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu kiểm tra đánh giá nồng độ vitamin A, D, E bao gồm :
- Sữa công thức có vitamin A, D, E.
- Thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng.
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
2.1.2.1. Trang thiết bị, vật tư nghiên cứu
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao UFLC với detector PDA (Shidmazu,
Nhật).
- Máy cất quay chân không Eyela (Tokyorikarika, Nhật).
- Máy quang phổ hấp thụ UV-VIS UV1800 (Shidmazu, Nhật).
- Bếp cách thủy (WNB22, Memmert).
- Cân phân tích độ chính xác 0,1mg và 0,01mg AL204 (Mettler Toledo, Thụy
Sĩ).
- Cân kỹ thuật độ chính xác 0,01g ML802 (Mettler Toledo, Thụy Sĩ).
- Tủ sấy Shellab (Sheldon, Mỹ).
- Pipet các loại (Hirschmanm, Đức).
- Bình định mức các loại Isolab (Đức).
- Phễu chiết (Isolab, Đức).
- Bình cất quay chân không (Schott Duran, Đức).
- Ống nghiệm thủy tinh loại 15ml (Isolab, Đức).
2.1.2.2. Hóa chất, thuốc thử
- Chuẩn Retinol 99,5% (Sigma, Mỹ).
- Chuẩn cholecalciferol 99,5% (Sigma, Mỹ).
- Chuẩn D,L-α-tocoferol 99,5% (Sigma, Mỹ).
16


- Methanol ≥ 99,9% (Merck, Đức).
- Tetrahydrofuran (THF) ≥ 99,9% (Merck, Đức).
- Dicloromethan ≥ 99,9% (Merck, Đức).
- N-hexan (PA, Trung Quốc).

- Petroleum ether 30:60 (PA, Trung Quốc).
- Ethanol (EtOH, PA, Trung Quốc).
- Butyl Hydroxy Toluen (BHT, PA, Trung Quốc).
- Kali hydroxid (KOH), (PA, Trung Quốc).
- Enzym alkaline protease > 500 U/g (PA, Sigma, Mỹ).
* Pha các dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác 20 mg chất chuẩn vitamin A, 25 mg
chất chuẩn vitamin D, 500mg chất chuẩn vitamin E bằng cân phân tích hoà
tan và chuyển vào 03 bình định mức 100ml, định mức bằng methanol ở nhiệt
độ phòng, lắc kỹ được các dung dịch chuẩn gốc vitamin A 200 ppm, vitamin
D 250 ppm, vitamin E 5000ppm.
Các dung dịch chuẩn gốc bảo quản ở 4ºC, sử dụng ổn định được trong
6 tháng, kiểm tra lại nồng độ khi cần thiết.
- Dung dịch chuẩn trung gian: Lấy chính xác 1 ml mỗi loại dung dịch chuẩn
gốc vitamin A, D, E bằng pipet vào trong bình định mức 5ml, định mức tới
vạch bằng methanol ở nhiệt độ phòng, lắc đều hỗn hợp, pha mới dung dịch
này hàng ngày.
- Dung dịch chuẩn làm việc: Từ các dung dịch chuẩn trung gian, tiến hành
pha loãng vào các bình định mức sao cho được dãy chuẩn dung dịch vitamin
A, D, E có nồng độ loãng 20; 50; 100; 500; 1000, 4000 lần so với các dung
dịch chuẩn gốc.

17


2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân tích dự kiến [11-16]
Dựa trên những phân tích trong phần Tổng quan ở trên, chúng tôi dự
kiến xây dựng phương pháp phân tích đồng thời vitamin A, vitamin D,
vitamin E trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC với detector PDA bao gồm các giai đoạn sau:
- Thủy phân các mẫu thực phẩm bằng KOH 20% trong ethanol với sự có mặt
của enzym protease.
- Chiết mẫu bằng dung môi hữu cơ thích hợp để thu dịch chiết chứa vitamin
cần phân tích.
- Phân tích đồng thời vitamin A, vitamin D, vitamin E bằng hệ thống HPLC.
2.2.2. Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký
Khảo sát các thông số sắc ký lỏng để có thể phân tích được đồng thời
cả 3 loại vitamin A, D, E cho sắc đồ cân đối, các pic tách nhau rõ ràng, thời
gian phân tích phù hợp.
- Cột sắc ký: Sử dụng cột sắc ký pha đảo Shodex C18M 4E (4,6mm * 250mm,
kích cỡ hạt 5µm); Column No: K1590663, hãng sản xuất: Snowa Denko.
- Pha động: Khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động.
- Tốc độ dòng: Khảo sát tốc độ dòng từ 0,8ml/ phút đến 2ml/ phút với các
điều kiện nhiệt độ cột, thể tích tiêm cố định để lựa chọn tốc độ dòng phù hợp.
- Nhiệt độ cột: Khảo sát kết quả sắc ký với sự thay đổi nhiệt độ cột từ 25ºC
đến 40ºC.
2.2.3. Tối ưu hóa các điều kiện tách chiết
- Khảo sát ảnh hưởng của enzym
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân

18


- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân
- Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch KOH 20%
- Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết
2.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích [10, 17]
2.2.4.1. Tính chọn lọc
Tính chọn lọc cho biết sự có mặt của chất phân tích có thể phân biệt

được với các chất khác trong mẫu phân tích. Xác định tính chọn lọc bằng cách
phân tích các mẫu trắng, mẫu trắng có thêm chất chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn.
Với mẫu trắng phải không được cho tín hiệu phân tích. So sánh sắc ký đồ của
các mẫu để đánh giá tính chọn lọc dựa theo các tiêu chí: sự khác biệt thời gian
lưu của chất phân tích giữa mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn không có ý
nghĩa thống kê, so sánh phổ tại các điểm khác nhau trên pic sắc ký (đỉnh pic,
2 điểm tại 2/3 độ rộng của pic) để xác định độ tinh khiết của pic. Độ tinh khiết
pic được tính toán bằng phần mềm tích hợp sẵn với thiết bị HPLC.
2.2.4.2. Khoảng tuyến tính
Xây dựng đường chuẩn tuyến tính bằng cách chạy dãy dung dịch chuẩn
có nồng độ khác nhau pha từ chuẩn gốc và chuẩn trung gian cho phù hợp để
xác định khoảng nồng độ của chất phân tích trong đó có sự phụ thuộc tuyến
tính giữa tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic chất chuẩn với nồng
độ của chất đó.
Phương trình hồi quy tuyến tính y = ax + b
Trong đó : y là tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích chất chuẩn
x là nồng độ chất khảo sát
Đường chuẩn xây dựng được phải có hệ số tương quan R ≥ 0,995, và
độ chệch thỏa mãn.
2.2.4.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
- Giới hạn phát hiện LOD (Limit of detection) là nồng độ thấp nhất của chất
phân tích có thể phát hiện được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. Trong sắc
19