Đánh giá hiệu quả chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ và khả năng sinh trưởng, phát triển của một số dòng đậu tương ở thế hệ thứ hai

1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
KHOA CNSH&CNTP
-------------

BÁO CÁO KẾT QUẢ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG
MÃ SỐ: SV2012-02

TÊN ĐỀ TÀI:
“ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ VÀ KHẢ
NĂNG SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA MỘT SỐ DÒNG ĐẬU TƯƠNG Ở
THẾ HỆ THỨ HAI”

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI:
HOÀNG NGỌC HÀ

Thái Nguyên, 3/2013


2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
KHOA CNSH&CNTP
-------------

BÁO CÁO KẾT QUẢ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG
MÃ SỐ: SV2012-02

TÊN ĐỀ TÀI:
“ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ VÀ KHẢ
NĂNG SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA MỘT SỐ DÒNG ĐẬU TƯƠNG Ở
THẾ HỆ THỨ HAI”

Chủ trì đề tài
:
Giáo viên hướng dẫn :
Thời gian thực hiện :

Hoàng Ngọc Hà
ThS. Nguyễn Tiến Dũng
Từ 3/2012-3/2013

Thái Nguyên, 3/2013


3

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

- Tên đề tài: “Đánh giá hiệu quả chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ và khả năng sinh
trưởng, phát triển của một số dòng đậu tương ở thế hệ thứ hai”
- Mã số: SV2011-02
- Chủ nhiệm đề tài: Hoàng Ngọc Hà
- Tel.: 01648798014

E-mail:

- Cơ quan chủ trì đề tài:Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
- Cá nhân phối hợp thực hiện: ThS. Nguyễn Tiến Dũng, Khoa CNTH&CNTP-Trường
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Thời gian thực hiện: từ 3/2012 đến 3/2013
1. Mục tiêu
Đánh giá hiệu quả chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ và khả năng sinh trưởng,
phát triển của một số dòng đậu tương ở thế hệ thứ hai
2. Nội dung chính
- Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ Basta.
- Sử dụng phương pháp PCR xác định sự có mặt của gen thử nghiệm với các
cặp mồi đặc hiệu.
- Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu tương chuyển gen.
3. Kết quả chính đạt được (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế – xã hội, v.v…)
- Sản phẩm đào tạo: 1 đề tài sinh viên
- Sản phẩm khoa học: 1 báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học
- Sản phẩm nghiên cứu: Cây đậu tương có khả năng kháng thuốc diệt cỏ


4

SUMMARY
- Research Project Title: Evaluation of Effectiveness of herbicide –resistant gene
transformation and growth & development capacity of some second-generation
soybean lines
- Code number: SV2012-02
- Coordinator: Hoang Ngoc Ha
- Tel: 01648798014
Email:
- Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry
(TUAF)

- Cooperator: MSc. Nguyen Tien Dung, Faculty of Biotechnology and Food
Technology, TUAF
- Duration: From 3/2012 to 3/2013
1. Objectives
Evaluation of Effectiveness of herbicide –resistant gene transformation and growth
& development capacity of some second-generation soybean lines
2. Main Contents
- Examining the Basta-resistance capacity of transgenic soybean
- PCR-based screening of the transformed gene
- Evaluating the growth and development capacity of transgenic soybean lines
3. Results obtained
- Training Outcomes: 1 research project for student
- Scientific Outcomes: 1 scientific research report
- Research Outcomes: herbicide-resistant soybean lines


5

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây ...............4
Bảng 2.2. Tình hình sản xuất đậu tương của các nước đứng đầu thế giới .................5
Bảng 2.3. Các nước nhập khẩu đậu tương hàng đầu châu Á .....................................5
Bảng 2.4. Tình hình sản xuất đậu tưong Việt Nam những năm gần đây ...................6
Bảng 3.1. Mật độ gieo trồng .................................................................................. 18
Bảng 4.1. Kết quả đánh giá kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương chuyển gen ở thế
hệ T2 .................................................................................................................... 20
Bảng 4.2. Kết quả phân tích PCR thế hệ T2 .......................................................... 22
Bảng 4.3. Khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu tương chuyển gen ở thế
hệ T2

.............................................................................................................. 23


6

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
AS

:

Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone)

BAP

:

6- Benzylaminopurine

CTAB

:

Cetyl trimethyl ammonium bromide

DNA

:

Deoxyribonucleic Acid

EDTA

:

Ethylene diamine tetraacetate

FAO

:

Food and Agriculture Organization

GFP

:

Green Fluorescent Protein

GMCs

:

Genetically Modified Crops

GUS

:

Β-1,4-Glucuronidase

HPT

:

Hygromycin Phosphotransferase

ISAAA

:

International Service for the Acquisition of Agri-Biotech
Applications

USDA

United States Department of Agriculture

PPT

Phosphinothricin

Bar

Bialaphos resistance

PCR
Cs

:

Polymerase Chain Reaction
Cộng sự


7

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Đậu tương (Glycine max (L.) Merr.) một cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh
tế cao. Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên
liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt. Việc phát triển cây đậu
tương là một trong những biện pháp nhanh chóng khắc phục tình trạng thiếu hụt
protein ở các nước nghèo [2]. Việt Nam là nước nông nghiệp nhiệt đới trồng đậu
tương với ba mục đích giải quyết vấn đề thiếu protein cho người và gia súc, xuất khẩu
và cải tạo đất [8].
Cây đậu tương thuộc nhóm cây dễ mẫn cảm, bên cạnh những yếu tố kĩ thuật
như canh tác, ảnh hưởng của cỏ dại, sâu bệnh là một trong những nguyên nhân chính
làm cho năng suất và sản lượng của đậu tương nước ta còn thấp [8]. Trong trồng trọt,
có nhiều biện pháp để hạn chế cỏ dại, sâu bệnh như sử dụng thuốc hóa học, phòng trừ
cơ học, phòng trừ sinh học. Tuy nhiên các biện pháp này thường tốn kém, hiệu quả
thấp và đôi khi gây thiệt hại đến năng suất. Một giải pháp được đưa ra là tạo nên
những cây trồng công nghệ sinh học có khả năng làm giảm thiệt hại do sâu bệnh và cỏ
dại gây ra[6]. Trong đó nghiên cứu tăng cường khả năng kháng sâu, kháng thuốc diệt
cỏ bằng các biện pháp công nghệ sinh học đang được quan tâm xuất phát từ yêu cầu
của thực tiễn sản xuất đậu tương ở nước ta.
Với lí do trên trường Đại học Nông Lâm đã nghiên cứu và đưa ra cây trồng
mang gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu. Năm 2010, khoa Công nghệ sinh học và
Công nghệ thực phẩm của trường đã chuyển gen thành công tạo ra các dòng đậu tương
kháng thuốc diệt kháng sâu từ các giống đậu tương của Việt Nam. Trong phạm vi của

báo cáo chúng tôi xin trình bày kết quả: “Đánh giá hiệu quả chuyển gen kháng thuốc
diệt cỏ và khả năng sinh trưởng, phát triển của một số dòng đậu tương ở thế hệ thứ
hai”.
1.2. Mục đích, yêu cầu và ý nghĩa của đề tài
1.2.1. Mục đích
Đánh giá hiệu quả chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ và khả năng sinh trưởng,
phát triển của một số dòng đậu tương ở thế hệ thứ hai.
1.2.2. Yêu cầu
- Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ Basta
- Sử dung phương pháp PCR xác định sự có mặt của gen thử nghiệm với các
cặp mồi đặc hiệu.


3

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

- Tên đề tài: “Đánh giá hiệu quả chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ và khả năng sinh
trưởng, phát triển của một số dòng đậu tương ở thế hệ thứ hai”
- Mã số: SV2011-02
- Chủ nhiệm đề tài: Hoàng Ngọc Hà
- Tel.: 01648798014

E-mail:

- Cơ quan chủ trì đề tài:Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
- Cá nhân phối hợp thực hiện: ThS. Nguyễn Tiến Dũng, Khoa CNTH&CNTP-Trường
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Thời gian thực hiện: từ 3/2012 đến 3/2013

1. Mục tiêu
Đánh giá hiệu quả chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ và khả năng sinh trưởng,
phát triển của một số dòng đậu tương ở thế hệ thứ hai
2. Nội dung chính
- Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ Basta.
- Sử dụng phương pháp PCR xác định sự có mặt của gen thử nghiệm với các
cặp mồi đặc hiệu.
- Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu tương chuyển gen.
3. Kết quả chính đạt được (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế – xã hội, v.v…)
- Sản phẩm đào tạo: 1 đề tài sinh viên
- Sản phẩm khoa học: 1 báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học
- Sản phẩm nghiên cứu: Cây đậu tương có khả năng kháng thuốc diệt cỏ


9

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về đậu tương
2.1.1. Nguồn gốc
Đậu tương là một loài cây trồng mà loài người đã phát hiện và sử dụng từ lâu,
vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng được các nhà khoa học quan tâm và sớm
được xác minh. Những bằng chứng lịch sử đều công nhận rằng đậu tương có nguồn
gốc từ Trung Quốc. Cây đậu tương được thuần hóa ở Trung Quốc qua nhiều triều đại
tiền phong kiến và đưa vào trồng trọt, khảo sát có thể trong triều đại Shang (năm 17001100 B.C) trước công nguyên [4].
Theo một số tài liệu, ở Việt Nam cây đậu tương cũng đã xuất hiện từ thời các
vua Hùng [4]. Hiện nay, trong nông nghiệp cây đậu tương chiếm một vai trò quan
trọng cơ cấu cây nông nghiệp phục vụ cho công nghiệp chế biến.
2.1.2. Phân loại
Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine max(L.) Merr

theo khóa phân loại của (Ottawa và cs, 1996) [20] căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự
phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể, nó thuộc:
Bộ đậu : Fabales
Họ đậu : Fabaceae
Phân họ: Leguminosae
Chi

: Glycine

Đậu tương trồng có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 40 là loại cây trồng mang lại
giá trị kinh tế cũng như giá trị dinh dưỡng cao.
2.1.3. Giá trị cây đậu tương
Đậu tương (Glycine max (L) Merr.) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị
kinh tế cao. Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc
nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu, cây cải tạo đất tốt. Bởi vậy cây đậu
tương được đánh giá là có giá trị toàn diện.
Giá trị về mặt thực phẩm
Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình
khoảng từ 35,5 - 40%, lipit từ 15-20%, hyđrat cacbon từ 15-16% và nhiều loại sinh tố
và muối khoáng quan trọng cho sự sống. Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất
trong số các protein có nguồn gốc thực vật [2,4]. Hiện nay, các sản phẩm làm từ đậu
tương rất phong phú có cả thực phẩm được chế biến bằng phương pháp cổ truyền, thủ


10

công và hiện đại dưới dạng tươi, khô và lên men như: làm giá, đậu phụ, tương, xì dầu
đến các sản phẩm cao cấp khác như sữa đậu lành, bánh kẹo...
Giá trị về mặt công nghiệp
Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế

biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng,
nhưng chủ yếu đậu tương được dùng để ép dầu. Từ dầu đậu tương người ta có thể tạo
ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp khác như: làm nến, xà phòng, ni lông...
Giá trị về mặt nông nghiệp
Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc. Toàn cây
đậu tương (thân, lá, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ
như thân lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn
tổng hợp của gia súc.
Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt, 1 ha trồng đậu tương
nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60 kg N [4]. Trong hệ thống luân
canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với
cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc
bón phân hóa học.
2.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam
2.2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới
Hiện nay đậu tương được trồng phổ biến ở Đông Nam Á, Bắc và Nam Mỹ,
nhưng 45% diện tích trồng đậu tương và 55% sản lượng đậu tương của thế giới nằm ở
Mỹ[18]. Đến năm 2010 cây đậu tương có diện tích 85,1 triệu ha chiếm 92% cây trồng
ở Mỹ[1]. Đây là loại cây chứa dầu đem lại lợi ích kinh tế to lớn, là một trong những
loại cây trồng lương thực quan trọng nhất trên thế giới hiện nay.
Bảng 2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây
Năm

Diện tích
(nghìn ha)

Năng suất
(tạ/ha)

Sản lượng

(nghìn tấn)

2005

92,52

23,18

214,48

2006

95,28

23,29

221,91

2007

90,13

24,37

219,68

2008

96,44

23,97

231,22

2009

99,37

22,44

222,98

2010

102,38

25,55

261,57
(Nguồn: FAOSTART,2010) [15].


11

Trong số các nước sản xuất đậu tương hiện nay bốn nước Mỹ, Brazil,
Argentina, Trung Quốc có sản lượng và diện tích nhiều nhất. Riêng ba nước Mỹ,
Brazil, Argentina chiếm 80% tổng sản lượng đậu tương của thế giới.
Bảng 2.2. Tình hình sản xuất đậu tương của các nước đứng đầu thế giới
Năm 2008
Diện

Sản

tích

lượng

(triệu

(triệu

ha)

tấn)

Mỹ

30,20

26,67

Brazil

21,27

Argentina
TrungQuốc

Năm 2009
Diện

Sản

tích

lượng

(triệu

(triệu

ha)

tấn)

80,53

28,84

28,72

82,83

28,17

59,92

22,89

21,92

50,17

16,38

28,22

46,23

14,03

27,28

38,27

9,13

17,02

15,54

9,500

17,79

16,90

Quốc gia

Năng

suất
(tạ/ha)

Năng
suất
(tạ/ha)

(Nguồn:United States Department of Agriculture, May 2010)
Theo báo cáo của Bộ nông nghiệp Mỹ, ở Châu Á nhu cầu về đậu tương để phục
vụ cho công nghiệp lấy dầu, sản xuất thức ăn chăn nuôi … là rất lớn.
Bảng 2.3. Các nước nhập khẩu đậu tương hàng đầu châu Á
(Đơn vị:nghìn tấn)
Tên nước

Năm 2008-2009

Năm 2009-2010

Indonesia

2339

2600

Việt Nam

2300

2600

Thái Lan

2160

2208

Hàn Quốc

1813

1850

Nhật Bản

1812

1700
(Nguồn: Bộ Nông nghiệp Mỹ ) [12]

2.2.3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam
Hiện nay đậu tương được trồng ở khắp cả nước, nhưng tập trung chủ yếu ở
Miền núi phía Bắc và Đông Nam Bộ, không ngừng được mở rộng về diện tích. Tính
đến tháng 4/2010 là 123,9 nghìn ha và được chia làm 6 vùng sản xuất chính: Miền núi
Bắc Bộ 24,7%, Đồng bằng sông Hồng 17,5%, Đông Nam Bộ 26,2% (có diện tích lớn
nhất); Đồng bằng sông Cửu Long 12,4%. Tổng diện tích 4 vùng này chiếm 80% diện
tích trồng đậu tương cả nước, còn lại là đồng bằng ven biển miền Trung và Tây
Nguyên [12].


12

Bảng 2.4. Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam những năm gần đây
Diện tích

Năng suất

Sản lượng

(nghìn ha)

(tạ/ha)

(nghìn tấn)

2005

204,1

14,3

292,7

2006

185,6

13,9

258,1

2007

187,4

14,7

275,2

2008

192,1

13,9

267,6

2009

147,0

14,6

215,2

2010

197,8

15,0

296,9

2011

215,1

16,3

350,0

Năm

(Nguồn: Tổng cục thống kê 11/2012) [11].
Ở Việt Nam, đậu tương là cây thực phẩm quan trọng nhưng năng suất đậu tương
hiện còn rất thấp, bình quân chỉ 1,3 tấn/ha. Năm 2009 - 2010 nước ta vẫn phải nhập 2,5
triệu tấn đậu tương [12]. Đậu tương để phục vụ cho công nghiệp chế biến, sản xuất dầu ăn
và thức ăn chăn nuôi. Chính vì vậy việc tăng năng xuất và sản lượng đậu tương ở nước ta
còn gặp nhiều khó khăn, bên cạnh tình hình giá phân bón, thuốc trừ sâu tăng cao và sâu
bệnh diễn biến phức tạp.
2.3. Ảnh hưởng của cỏ dại đối với cây trồng
2.3.1. Đặc tính của cỏ dại
Cỏ dại là loài thực vật có khả năng thích nghi với điều kiện ngoại cảnh, có tính
chống chịu cao với điều kiện khắc nghiệt của khí hậu và thổ nhưỡng, thường mọc tự
nhiên trên đồng ruộng, vườn tược, ven đường, bãi đất hoang,…. Mặc dù cỏ dại được
định nghĩa tùy theo nhận định của con người chứ không tùy thuộc vào hệ thống phân
loại, chúng có một số đặc điểm nổi bật có thể phân biệt với cây trồng và thích ứng với
nhiều điều kiện khắc nghiệt của môi trường sống để tồn tại.
Cỏ dại có nhiều hình thức sinh sản. Cỏ dại có thể ra hoa kết hạt quanh năm,
luôn hiện diện trên đồng ruộng gây trở ngại cho các hoạt động sản xuất của con người.
Sự đa dạng về hình thức sinh sản của cỏ dại chính là một trong những nguyên nhân

giúp chúng có thể thích ứng với các điều kiện tự nhiên để luôn có mặt trên đồng ruộng.
Nhiều loài cỏ vừa sinh sản hữu tính vừa vô tính làm cho khả năng lan truyền càng
mạnh và mỗi khi điều kiện tự nhiên thay đổi thì có ít nhất một hình thức sinh sản để
lan truyền về sau [10].
Khả năng nhân giống cao. Khả năng này thể hiện qua số hạt sinh sản hữu tính
và số mầm ngủ sinh sản vô tính. Số lượng hạt/cây của cỏ dại nhiều, đảm bảo cho
chúng có hệ số nhân giống cao, có lợi cho duy trì nòi giống, đồng thời cũng cho chúng


13

ta thấy trữ lượng hạt cỏ dại trên một đơn vị diện tích sẽ rất lớn, đe dọa việc sản xuất
nông nghiệp [10].
Hạt chín không đều, dễ rụng và có nhiều hình thức lan truyền. Sau khi chín
xong, hạt cỏ lại dễ rơi khỏi cây mẹ và rụng xuống đất. Hiện tượng này kèm theo hiện
tượng chín không đều làm cho cỏ dại kéo dài thời gian phóng thích hạt dẫn đến hiện
tượng cỏ mọc mầm không tập trung, gây khó khăn và tốn kém cho công tác phòng trừ.
Cỏ dại có thể phát tán bằng nhiều con đường: hạt giống, thức ăn gia súc, rơm rạ và cỏ
khô, gió, nước, động vật, máy móc, nông cụ … Do đó chúng có thể lan truyền từ
ruộng này sang ruộng khác, từ nơi này sang nơi khác bất chấp con người đã tìm mọi
cách để ngăn cản sự phát triển của chúng. Người ta đã phát hiện có sự xâm nhập của
cỏ dại từ Châu Âu sang Châu Mĩ và ngược lại, từ lục địa Âu, Á sang Châu Mĩ, Đại
Tây Dương và Thái Bình Dương. Do vậy, phải tìm cho được nguồn gốc của cỏ dại
xuất phát từ đâu thì mới có thể đề xuất biện pháp phòng trừ có hiệu quả [10].
Hạt cỏ dại lại có thể giữ sức nẩy mầm trong thời gian tương đối dài, tạo nên
một nguồn hạt cỏ liên tục trong đất gây khó khăn và tốn kém cho công tác phòng trừ
cỏ dại. Điều này là do chúng có thời gian ngủ nghỉ nhất định. Thời gian ngủ nghỉ của
hạt là thời gian tối thiểu cần thiết cho sự nảy mầm sắp tới.
Cỏ dại có khả năng chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất thuận tốt hơn
cây trồng. Đây là kết quả của quá trình thích nghi và chọn lọc tự nhiên lâu đời. Một số

loài cỏ dại có khả năng sống và duy trì nòi giống ngay cả khi nhiệt độ xuống đến mức
400C hoặc thấp hơn [10].
2.3.2. Tác hại của cỏ dại đối với cây trồng
Cỏ dại xuất hiện ở mọi nơi, mọi lúc và là mối quan tâm của tất cả mọi người.
Cỏ dại không chỉ gây cản trở hoạt động sản xuất nông nghiệp và làm gia tăng chi phí
sản xuất mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe của cộng đồng và gây khó khăn cho việc bảo
trì các công trình xây dựng, nhà cửa, cảnh quan …
Theo tài liệu của FAO, thiệt hại do cỏ dại gây ra hàng năm trên thế giới có thể
nuôi sống 100 triệu người mỗi năm. Kết quả nghiên cứu của tổ chức môi trường "Land
Care of New Zealand" cho thấy cỏ dại gây ra thiệt hại 95 tỷ đô la Mỹ mỗi năm do làm
giảm sản lượng lương thực thực phẩm trên tòan cầu trong khi bệnh cây, côn trùng và
các động vật có xương sống (không kể con người) gây tổn thất 85,46 và 2,4 tỷ đô la
Mĩ. Với thời giá hiện nay, 95 tỷ đô la có thể mua được 380 triệu tấn lúa mì, hơn phân
nửa sản lượng lúa mì tòan thế giới dự kiến đạt được trong năm 2009. Trong số 95 tỷ
đó thì có khoảng 70 tỷ thiệt hại gây ra ở các nước nghèo [10]. Những sự thiệt hại về
kinh tế có thể lớn hơn nữa nếu tính đến khía cạnh là hơn phân nửa thời gian mà nông
dân lao động trên đồng ruộng là dành cho công việc nhổ cỏ.


14

Cỏ dại tranh chấp các điều kiện sinh sống của cây trồng (ánh sáng, nước, dinh
dưỡng và cardon dioxide) dẫn đến làm giảm năng suất cây trồng. Tuy nhiên, tùy theo
những điều kiện khác nhau mà cỏ dại làm cho năng suất cây trồng giảm nhiều hay ít.
Sự hiện diện của cỏ dại trên đồng ruộng còn làm tăng chi phí sản xuất, bao gồm: thuốc
trừ cỏ, chi phí phun và rải thuốc trừ cỏ, chuẩn bị đất, trồng trọt và chăm sóc, dụng cụ
trừ cỏ và thời gian làm cỏ …
Một vài loài cỏ dại có khả năng hạn chế sự cạnh tranh của các loài khác bằng
cách tiết ra các hóa chất độc hại ức chế sự sinh trưởng, phát triển bình thường của các
loài thực vật khác gọi là hiện tượng“allelopathy” (sự cảm nhiễm qua lại). sự sinh

trưởng, phát triển của cây trồng giảm mạnh trong những trường hợp này [10].
Cỏ dại là nơi trú ẩn của sâu bệnh hại và là nơi trú ẩn của chuột. Các loài cỏ dại
cùng họ, bộ với cây trồng là kí chủ rất tốt của sâu bệnh hại trên những cây trồng tương
ứng.
Cỏ dại ảnh hưởng đến chất lượng nông sản. Có một số loài cỏ dại nếu gia súc
ăn phải sẽ làm giảm chất lượng sữa và thịt (Parthenium, tỏi dại làm giảm chất lượng
thịt và sữa và có thể làm cho sản phẩm không tiêu thụ được) [10].
2.4. Biện pháp phòng trừ cỏ dại
Ngăn ngừa sự lây lan và xâm nhiễm ban đầu của cỏ dại là một biện pháp đầu
tiên, quan trọng và ít tốn kém nhất trong việc quản lí cỏ dại. Phòng ngừa bao gồm các
biện pháp loại bỏ khả năng xâm nhập và thiết lập quần thể cỏ mới ở một vùng. Biện
pháp này sẽ đem lại hiệu quả cao trong việc quản lý cỏ dại nếu được áp dụng đồng loạt
trên diện rộng với sự hợp tác chặt chẽcủa các nông hộ trong vùng. Công tác phòng
ngừa sự lây lan và xâm nhiễm của cỏ dại có thể được thực hiện bằng nhiều cách.
2.4.1. Biện pháp cơ học
- Làm cỏ
Biện pháp sử dụng các công cụ thô sơ như cuốc, xẻng, dao, nạo, liềm … đã
được ứng dụng ở các cấp độ khác nhau trong việc kiểm sóat cỏ dại. Sau đó, các công
cụ này được cải tiến thành những máy đơn giản chạy bằng động cơ nhỏ hay đẩy bằng
tay. Mặc dù tiết kiệm được công lao động hơn so với các công cụ làm cỏ bằng tay
thông thường nhưng do các công cụ này chỉ có thể tiến hành được trên diện diện tích
gieo trồng thẳng hàng hoặc bằng máy nên phạm vi ứng dụng của chúng bị hạn chế.
Tuy hạn chế về mặt nhân lực nhưng biện pháp làm cỏ bằng tay cho hiệu quả trừ cỏ cao
và triệt để nhất, hạn chế gây tổn thương đến cây trồng đồng thời kết hợp với xới xáo,
phá váng trong quá trình nhổ cỏ đã tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng tốt, do đó
năng suất cây trồng cao hơn so với các biện pháp khác.


15

Hai vấn đề quan trọng của việc làm cỏ bằng tay là số lần làm cỏ và khoảng thời
gian giữa 2 lần làm cỏ. Số lần làm cỏ phụ thuộc vào tốc độ phát triển của cây trồng và
cỏ dại và khoảng thời gian khủng hoảng cạnh tranh giữa cỏ dại và cây trồng. Khoảng
thời gian giữa 2 lần làm cỏ phụ thuộc vào tốc độ phát triển và lấn chiếm của cỏ dại đối
với cây trồng, thường là 15 – 20 ngày và nên chọn ngày nắng ráo để tăng hiệu quả trừ
cỏ [10].
Đối với các loài cỏ đa niên có thân ngầm nằm sâu trong đất, làm cỏ bằng tay sẽ
không tiêu diệt đựoc chúng vì sẽ mọc lại sau đó rất nhanh. Biện pháp làm cỏ bằng tay
còn có nhược điểm là chỉ có khả năng áp dụng trên đồng ruộng nơi cây trồng được
gieo trồng thẳng hàng, ngược lại, biện pháp này dễ gây tổn thương cho cây trồng, đặc
biệt là giai đoạn cuối [10].
- Làm đất
Các hoạt động làm đất như cày, bừa, trục, san phẳng mặt ruộng đều trực tiếp
hoặc gián tiếp tiêu diệt cỏ dại đặc biệt là cỏ đa niên [10]. Thông qua các hoạt động cày
đất, hạt cỏ cũng như các cơ quan sinh sản bị vùi xuống tầng đất sâu làm cho chúng bị
chết hoặc mất sức nảy mầm.
Ưu điểm của làm đất là: tiêu diệt nhanh và triệt để cỏ dại, diệt cỏ an toàn tăng
cường sự sinh trưởng của cây trồng, có thể diệt toàn bộ các loài cỏ dại. Tuy nhiên,
không phải lúc nào cũng có thể tiến hành làm đất kiểm sóat cỏ dại được, chẳng hạn
như khi cây trồng quá lớn, gieo trồng không thàn hàng lối, cỏ bám cuốn vào cây trồng,
đất quá ẩm [10] …
- Ngâm nước ruộng
Cho nước ngập ruộng là một biện pháp thường được sử dụng để kiểm sóat cỏ
trong ruộng lúa và cỏ đa niên bò. Điều chỉnh chế độ tưới tiêu hợp lí vẫn có thể hạn chế
được sự sinh trưởng và phát triển của các loài cỏ ưa ẩm trong ruộng lúa. Cơ quan sinh
sản của các loài cỏ đa niên thân bò cũng có thể bị tiêu diệt khi ngâm nước ruộng. Biện
pháp này chỉ có thể thành công nếu tầng đế cày đủ chặt để giữ nước. Với những ruộng
có nhiều cỏ đa niên, việc giữ ruộng ngập trong 15 – 25 cm nước liên tục trong vòng 3
– 8 tuần trong mùa hè sẽ hạn chế được một số loài cỏ dại. Phương pháp này chỉ có thể
thực hiện được ở những nơi có đủ nước. Phương pháp này không thể áp dụng được

với tất cả các loài cỏ dại sinh sản vô tính vì mầm ngủ của nhiều loài cỏ dại sống tiềm
sinh và vẫn có thể sống sót sau khi bị ngâm ngập trong nước [10].
- Dùng lửa
Việc dùng lửa đề phòng trừ cỏ dại được áp dụng khi trên đồng ruộng không có
cây trồng, lúc khai hoang hoặc làm đất trước khi gieo trồng. Khi đốt lửa, nhiệt độ cao
sẽ làm ngưng tụ hay phân giải nguyên sinh chất, làm hư hại các enzyme. Nhiệt độ tối


16

đa mà các tế bào thực vật có thể chịu đựng được là là 45 – 550C. Lợi dụng tính chất
trên, người ta dùng lửa để tiêu diệt cỏ dại. Lửa có thể làm chết các bộ phận trên mặt
đất và một phần các cơ quan sinh sản vô tính và hạt cỏ dại ở trong đất. Phương pháp
này áp dụng trong mùa khô sau khi đã thu hoạch nông sản để diệt cỏ và sâu bệnh có
trong tàn dư cây trồng [10].
Phương pháp này luôn phải được kèm theo phương pháp cày bừa thì mới có kết
quả cao, nếu không cỏ dại sau đó sẽ tiếp tục mọc trở lại, đặc biệt là cỏ đa niên có thân
rễ ngầm như cỏ tranh, cỏ cú, cỏ ống … sẽ trở thành bá chủ.
Ưu điểm của phương pháp này là: Đơn giản, dễ làm và ít tốn kém, tiêu diệt
được cây cỏ và các hạt cỏ trên cây, có thể diệt cỏ nhanh chóng trên một diện tích lớn,
tiêu diệt được mầm mống sâu bệnh gây hại cho cây trồng
- Che phủ mặt đất
Che phủ mặt đất bằng các vật liệu khác nhau có tác dụng kiểm soát cỏ dại thông
qua việc ngăn cản không cho ánh sáng lọt xuống mặt đất để hạt và mầm ngủ của cỏ dại
không nảy mầm được, mầm cỏ đã mọc không đủ ánh sáng để lớn lên và vượt ra khỏi
lớp che phủ. Vật liệu che phủ mặt đất có thể là các vật liệu tự nhiên (rơm rạ, cỏ khô,
bọt giấy, mạt cưa …) hay nhân tạo (giấy hay màng phủ polyethen, plastic màu đen).
Muốn hiệu quả thì lớp che phủ phải đủ dày để ngăn ánh sáng và hạn chế quang hợp.
Che phủ đất bằng các vật liệu tự nhiên: Thảm che phải dày ít nhất là 10 cm [10].
2.4.2. Biện pháp hóa học

- Sử dụng thuốc trừ cỏ
Ưu điểm: Hiệu quả cao và tương đối triệt để, nhiều loại thuốc có phổ tác động
rộng, diệt được hầu hết các loại cỏ mà lại an toàn đối với cây trồng. Sử dụng thời gian
đầu khi mới gieo trồng do đó diệt được cỏ ngay từ khi mới mọc mầm và còn nhỏ nên
hạn chế tác hại của cỏ rõ rệt. Đỡ tốn chi phí và công lao động, có thể áp dụng trên diện
tích rộng lớn trong một thời gian ngắn [10].
2.4.3. Biện pháp sinh học
- Côn trùng diệt cỏ
Côn trùng diệt cỏ là tác nhân sinh học được sử dụng rộng rãi để kiểm soát nhiều
loài cỏ nguy hiểm trên thế giới. Thành công đầu tiên của tác nhân sinh học trong việc
diệt trừ cỏ dại đựoc biết đến vào năm 1902 trên cây trâm ổi (ngũ sắc Lantana camara)
tại đảo Hawaii. Các thử nghiệm đã chỉ ra một số loài côn trùng rất hiệu quả trong việc
kiểm soát loài cỏ này, bao gồm: ấu trùng của Crocidosema lantana (bướm sâu cuốn lá)
(đục vào trong cuống hoa, nằm trên đế của cụm hoa và ăn hoa quả), ấu trùng của
ruồi ăn hạt Agromyza lantana ăn quả và làm cho quả khô để hạn chế chim mang hạt đi


4

SUMMARY
- Research Project Title: Evaluation of Effectiveness of herbicide –resistant gene
transformation and growth & development capacity of some second-generation
soybean lines
- Code number: SV2012-02
- Coordinator: Hoang Ngoc Ha
- Tel: 01648798014
Email:
- Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry
(TUAF)
- Cooperator: MSc. Nguyen Tien Dung, Faculty of Biotechnology and Food

Technology, TUAF
- Duration: From 3/2012 to 3/2013
1. Objectives
Evaluation of Effectiveness of herbicide –resistant gene transformation and growth
& development capacity of some second-generation soybean lines
2. Main Contents
- Examining the Basta-resistance capacity of transgenic soybean
- PCR-based screening of the transformed gene
- Evaluating the growth and development capacity of transgenic soybean lines
3. Results obtained
- Training Outcomes: 1 research project for student
- Scientific Outcomes: 1 scientific research report
- Research Outcomes: herbicide-resistant soybean lines


18

2.5.2. Tình hình đậu tương biến đổi gen tại Việt Nam
Chuyển gen đậu tương ở Việt Nam mới được đưa vào nghiên cứu trong mấy
năm gần đây [2]. Bắt đầu từ việc tách dòng gen chịu hạn phục vụ cho công tác
chuyển gen [3]. Hiện nay, đã có một số thử nghiệm để tối ưu hóa quá trình tái sinh
cũng như chuyển gen của đậu tương. Bên cạnh đó quá trình chuyển gen cũng được
nghiên cứu [17], đã sử dụng giống đậu PC19 làm giống chuyển gen. Việc biến nạp vào
nốt lá mầm thông qua A. tumefaciens mang vector nhị thể pZY 102/pTF 102 chứa gen
bar, gen gusA và gen kháng glufosinate đã thu được tần số chuyển gen ở thế hệ T0 là 13%. Đây là một trong những bước đầu thuận lợi cho các nghiên cứu chuyển gen hữu dụng
vào cây đậu tương ở Việt Nam. Tuy nhiên do hạn chế về thiết bị, kiến thức và nguồn vật
liệu nên việc nghiên cứu mới chỉ dừng ở mức độ phòng thí nghiệm và thử nghiệm trên
diện hẹp, chưa thể đưa cây đậu tương chuyển gen vào sản xuất thương mại trong tương
lai gần [2].
2.6. Một số nghiên cứu về đặc tính kháng thuốc diệt cỏ cho cây trồng

2.6.1. Giới thiệu về gen kháng thuốc diệt cỏ
Gen bar - gen kháng thuốc diệt cỏ được phân lập từ hệ DNA của S.
Hygroscopicus [14], gen được nhân dòng thứ cấp trong E.Coli W3110iq sử dụng
vector pUC19. Trong W3110iq, quá trình phiên mã được thực hiện bởi promoter Lac
bị lìm hãm mạnh nhưng có thể cảm ứng với isopropylthiogalactoside. Gen tạo ra bằng
cách nhân dòng thứ cấp vùng BamHI được phân lập ban đầu từ Streptomysete, pBG4,
từ vị trí của BamHI của pUC19 tạo pBG195 và pBG196 W3110iq có hoạt tính kháng
bialaphos yếu khi nó chứa pBG196, tuy nhiên làm tăng mức độ kháng chất không thể
cảm ứng bằng isopropylthiogalactoside. Với W3110iq/ pBG195, hàm lượng kháng
chất có thể cảm ứng từ 0.005 đến hơn 0.05 mg/l.
Gen bar (bialaphos resistance) mã hóa phosphinothricin acetyl transferase
(PAT) khử độc phosphinothricin làm cho glutamine synthase (GS) không bị ức chế.
Phosphinothricin là thành phần mang hoạt tính thuốc trừ cỏ nhóm glufosinate có tên
thương mại là Basta, Liberty, Ignite,…. Phosphinothricin có cấu trúc tương tự
glutamin, cấu trúc này cũng giống như cấu trúc của bialaphos (PPT), một kháng sinh
Streptomyces. Tác động của phosphinothricin là ức chế glutamine synthase (GS), một
enzyme chủ chốt trong quy trình khử độc ammoni hình thành trong quá trình trao đổi
hình thành chất nitơ trong thực vật. Tính kháng glufosinates được thực hiện thông qua
gen mã hóa PAT có nguồn gốc từ các loài xạ khuẩn như Streptomyces hygroscopicus
hay S. Viridochromogen [6]. Khi chuyển loại gen này vào cây giúp hoạt động trao đổi
chất của cây diễn ra bình thường không bị tác động của nhóm thuốc diệt cỏ trên.


19

2.6.2. Cơ chế hoạt động của gen kháng thuốc diệt cỏ
- Ngăn cản không cho cây hấp thu thuốc diệt cỏ
- Vô hiệu hóa các enzyme kích hoạt của thuốc diệt cỏ
- Ức chế tác động của thuốc trừ cỏ đối với các protein mục tiêu trong cây trồng.
- Kích thích protein mục tiêu kháng lại thuốc trừ cỏ của cây trồng.

2.6.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây trồng hiện nay
Bằng công nghệ sinh học người ta đã có thể tạo ra những giống cây trồng kháng
thuốc diệt cỏ, cho phép loại trừ được cỏ dại một cách chọn lọc. Nhìn chung, sản xuất
cây trồng kháng thuốc diệt cỏ được tiến hành bằng việc chuyển gen mã hóa enzyme
gây bất hoạt thuốc diệt cỏ vào cây trồng. Monsanto, công ty giữ bản quyền về giống
đậu tương chuyển gen kháng cỏ “Round up” thống kê cho thấy năm 1996 có khoảng
0,4 triệu hecta trồng đậu tương kháng thuốc diệt cỏ, năm 1997 tăng lên 3,6 triệu hecta,
năm 1998 đạt 11,3 triệu hecta đến năm 2007 đạt 12 triệu ha chiếm 10% cây trồng
chuyển gen [5,18]. Theo thống kê của USDA, diện tích trồng cây đậu tương kháng
thuốc diệt cỏ chiếm 81% ở Mỹ, 99,1% ở Argentina và 34% ở Brazil [8].
Gen mã hóa enzyme tổng hợp 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic (EPSPS), gen
mã hóa enzyme phosphinothricin acetyl transerase (PAT) đã được chuyển vào cây đậu
tương và tạo ra các dòng đậu tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ
glyphosate/glufosinate [5]. Các giống đậu tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ
glufosinate, Roundup và imidazoline đã được thương mại hóa.


20

Phần 3
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu thực vật
Sử dụng một số dòng đậu tương chuyển gen VX93 được khoa Công nghệ sinh
học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo ra.
3.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
3.1.3.1. Hóa chất
- Hóa chất cho đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ: Hoạt chất diệt cỏ DLPhosphinothricin (PPT) của hãng Duchefa, thuốc trừ cỏ Basta của hãng Bayer.
- Hóa chất tách chiết DNA: CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide), βMercaptoethanol, EDTA (Ethyenediamine tetraacetate), NaCl 5M, Tris HCl ( PH=8),
H20 cất deion, enzym Rnase, cồn tuyệt đối lạnh, dung dịch Chloroform :

isoamylalcohol ( 24:1), dung dịch rửa mẫu Ethanol 70%.
- Hoá chất điện di: Agarose; Đệm TAE 1X, EtBr 10mg/ml, Loading dye 6X
- Hóa chất cho phản ứng PCR: PCR master mix, DNA Taq polymerase,
dNTP…
3.1.3.2. Thiết bị thí nghiệm
Các trang thiết bị máy móc dùng cho thí nghiệm bao gồm : Cân điện tử
(Olhous- Vietlabcu), nồi hấp khử trùng (ALP), tủ sấy (Memmert), tủ cấy vô trùng cấp
I (Airtech), máy chuẩn pH (Hanna HI2210) máy siêu âm (Mujigae), máy hút chân
không (Welch), bể ổn nhiệt (JSWB – 06T), máy PCR (TE thermoCycler), máy soi gel
(WUV – L50), máy ly tâm lạnh (Hanil micro – 12), máy điện di (Mupid – plus), máy
ảnh (Canon IXUS 115HS)…Và các trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm khoa
Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên.
3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1. Phạm vi nghiên cứu
Đánh giá hiệu quả chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ và khả năng sinh trưởng,
phát triển của một số dòng đậu tương ở thế hệ thứ hai
3.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực
phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Thời gian: Tháng 03/2012- tháng 03/2013


21

3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Nội dung 1: Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ Basta
3.3.2. Nội dung 2: Sử dụng phương pháp PCR xác định sự có mặt của gen thử nghiệm
với các cặp mồi đặc hiệu.
3.3.3. Nội dung 3: Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu tương

chuyển gen
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương
chuyển gen ở thế hệ T2
- Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của dòng đậu tương
chuyển gen ở thế hệ T2.
+ Nội dung tiến hành: Thu hạt cây T1, trồng riêng rẽ, mỗi cây được kí hiệu
thành một dòng riêng biệt. Tiến hành phun trực tiếp thuốc trừ cỏ lên lá cây đậu tương
chuyển gen ở 2 giai đoạn: giai đoạn 3- 4 lá thật và giai đoạn quả chắc xanh ở nồng độ
0.3% basta. Tiến hành quan sát và đánh giá.
+ Chỉ tiêu theo dõi : Tỷ lệ cây sống sau 3- 5 ngày phun thuốc Basta
Tỷ lệ cây sống sau chọn lọc được tính như sau:
Số cây sống sau phun thuốc
Tỷ lệ cây sống =

x 100%
Tổng số cây chuyển gen
được phun thuốc

3.4.2. Đánh giá hiệu quả chuyển gen bằng phương pháp sinh học phân tử
- Thí nghiệm 2: Phân tích PCR xác định sự có mặt của gen bar ở dòng đậu
tương chuyển gen thế hệ T2.
3.4.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Lựa chọn các dòng đậu tương VX93 chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ sống sau
khi phun thuốc Basta (nồng độ 0.3% basta). Tiến hành thu lá để phục vụ cho tách chiết
DNA kiểm tra. DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp Saghai maroof (1984)
[7] có một vài thay đổi để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm.
- Phương pháp tách chiết DNA tổng số được tiến hành như sau:
Bước 1: Nghiền 0.3 – 0.5 gam lá đậu tương trong nitơ lỏng thành bột mịn.

22

Bước 2: Chuyển bột lá vào ống ly tâm 1.5ml. Thêm 1ml đệm CTAB đã ủ ở 650C trong
10 phút.
Bước 3: Ủ các ống ly tâm ở 650C trong 90 phút, trong quá trình ủ tiến hành lắc 20
phút/lần để việc tách có hiệu quả.
Bước 4: Ly tâm 12.000 vòng/phút, ở 40C. Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung
0.8 ml dung dịch 24:1, lắc nhẹ nhàng trong 10 phút rồi tiến hành ly tâm trong 10 phút
ở tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (lặp lại bước này 2- 4 lần).
Bước 5: Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung (25:24:1) theo tỷ lệ (1:1) lắc nhẹ
trong 20 phút. Tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
Bước 6: Hút lớp dịch nổi sang ống mới bổ sung Isopropanol vào tỷ lệ 1:1 với mẫu, bổ
sung thêm 3-5µl NaCl 5M. Lắc nhẹ trong 10 phút. Để trong tủ -200C qua đêm.
Bước 7: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa.
Bước 8: Rửa tủa với Ethanol 70% sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút (lặp
lại 2 lần).
Bước 9: Loại bỏ dịch lỏng làm khô bằng máy ly tâm hút chân không (5 phút).
Bước 10: Bố sung 20µl H2O + 2µl RNAse sau đó ủ ở 370C trong 30 phút. Đem cất giữ
ở -200C.
Bước 11: Tiến hành điện di kiểm tra
3.4.2.2. Phương pháp phân tích PCR xác định sự có mặt của gen kháng thuốc diệt cỏ
bar với cặp mồi đặc hiệu.
Trình tự cặp mồi đặc hiệu của gen bar
Mồi xuôi: TCC GTA CCG AGC CGC AGG AA
Mồi ngược: CCG GCA GGC TGA AGT CCA GC
Phản ứng PCR 15µl kit (Fementas) bao gồm:
Buffer

1.5 µl

dNTP

1 µl

Mồi xuôi (F) (10 picromol/µl)

0.5 µl

Mồi ngược (R) (10 picromol/µl)

0.5 µl

Taq DNA polymerase (0,05UI/µl)

0.2 µl

DNA

2 µl

Nước deion

8.3 µl


23

Phản ứng chạy trên máy PCR (TE-Thermo cycle)
940C trong 5 phút

940C trong 30 giây
550C trong 45 giây

35 chu kì

720C trong 60 giây
720C trong 2 phút
40 C

∞

Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,0%.
3.4.2.3. Phương pháp điện di sản phẩm DNA tổng số và PCR sản phẩm
Agarose 1,0% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50- 600C. Bổ sung
ethidium bromide vào bản gel với nồng độ 10µg/ml, đổ dung dịch vào khay gel đó cài
sẵn răng lược thích hợp. Sau 30-60 phút, khi gel đó đông, tháo răng lược, đặt khay
gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel một khoảng 2mm. Mẫu DNA
trộn cùng với loading die 6X tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vào các giếng trên
bản gel.
Tiến hành điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 80V, cường độ dòng
điện vào khoảng 60-80 mA. Theo dõi sự di chuyển của vệt màu để ngừng vào thời
gian phù hợp (thường sau khoảng 20 phút).
Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại, DNA được hiện lên dưới dạng các
vạch sáng, ảnh điện được di được chụp ảnh gel.
3.4.3. Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển dòng đậu tương
chuyển gen ở thế hệ T2.
- Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của dòng đậu tương
chuyển gen thế hệ T2
+ Nội dung tiến hành:
Thu hạt của cây T2, trồng riêng rẽ, mỗi cây được kí hiệu thành một dòng riêng

biệt. Tiến hành gieo trồng, chăm sóc theo giá trị canh tác và giá trị sử dụng số 10TCN
339-2006, ban hành kèm theo QĐ số 1698 QĐ/BNN-KHCN ngày 12 tháng 6 năm
2006 của Bộ NN&PTNT.
+ Bố trí thí nghiệm: Theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn, 3 lần nhắc lại. Diện tích ô
8,5m2 (5m x 1,7m). Mặt luống rộng 1,4m, xẻ 4 hàng dọc, hàng cách hàng 0,35m, rãnh
0,3m. Khoảng cách giữa các lần nhắc lại 0,3m. Xung quanh thí nghiệm phải có ít nhất
một luống bảo vệ.
+ Giống khảo nghiệm: Dòng VX93 chuyển gen.


24

+ Giống đối chứng: Giống VX93 không chuyển gen
Diện tích: Tối thiểu 500m2/giống/điểm, không nhắc lại. Tổng diện tích khảo
nghiệm sản xuất qua các vụ không vượt quá quy định của Bộ Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn.
+ Thời vụ: Dòng đậu tương VX93 chuyển gen và giống VX93 không chuyển
gen (đối chứng) được trồng vào vụ đông (2012) và vụ xuân hè (2013).
+ Làm đất: Đất phải đại diện cho vùng sinh thái, có độ phì đồng đều, bằng
phẳng, có thành phần cơ giới nhẹ, độ pH từ ít chua đến trung tính và chủ động tưới
tiêu. Đất phải được cày bừa kỹ, san phẳng mặt ruộng, sạch cỏ và đảm bảo độ ẩm đất
lúc gieo khoảng 75-80% độ ẩm tối đa đồng ruộng.
+ Khoảng cách, mật độ gieo trồng: Gieo hạt với khoảng cách hàng cách hàng
35cm, cây cách cây từ 5-11cm, tuỳ theo nhóm giống và thời vụ, tỉa định cây khi có 1
lá thật, đảm bảo mật độ như bảng 3.1.
Bảng 3.1. Mật độ gieo trồng
Giống dài ngày
Thời vụ

Số cây/

Số cây/ô

Giống ngắn và trung ngày
Mật độ
2

Số cây/

Số cây/ô

Mật độ

Hàng (cây)

(cây)

(cây/m )

hàng (cây)

(cây)

(cây/m2)

Vụ Xuân

55-60

220-240

26-28

65-70

260-280

31-33

Vụ Hè

45-50

180-200

21-24

55-60

220-240

26-28

Vụ Đông

80-85

320-340

38-40

90-95

360-380

42-45

+ Phân bón
Lượng phân bón cho 1 ha: Tùy thuộc độ phì đất, nhóm giống và thời vụ để sử
dụng lượng phân cho phù hợp. Thông thường là 5 tấn phân hữu cơ + 20-30kg N +
60kg P205 + 60kg K20. Nếu đất có độ pH < 5,5 bón thêm 300-500kg vôi bột/ha.
Cách bón: Bón lót toàn bộ phân hữu cơ, phân lân, vôi + 1/2 lượng đạm + 1/2
lượng kali. Toàn bộ phân hoá học được trộn đều và bón vào hàng đã rạch sẵn, sau đó
bón phân chuồng. Sau khi bón phân, lấp một lớp đất nhẹ phủ kín phân rồi mới gieo hạt
để tránh hạt tiếp xúc với phân làm giảm sức nảy mầm
Bón thúc 1 lần khi cây có 2-3 lá thật: 1/2 lượng đạm + 1/2 lượng kali.
+ Chăm sóc


25

Xới vun: Lần 1: Xới nhẹ vào gốc, tỉa định cây kết hợp với bón thúc khi cây 2-3
lá thật. Lần 2: Xới sâu, vun cao khi cây 4-5 lá thật.
Tưới nước: Giữ độ ẩm đất thường xuyên khoảng 70-75 % độ ẩm tối đa đồng
ruộng.
Phòng trừ sâu bệnh: Theo dõi phát hiện và phòng trừ sâu bệnh theo hướng dẫn
chung của ngành Bảo vệ thực vật.
+ Thu hoạch: Khi có khoảng 95% số quả trên cây đã chín (vỏ quả có màu nâu
hoặc đen). Thu để riêng từng ô, không để quả bị rơi rụng, phơi đập lấy hạt ngay khi
quả khô.

- Chỉ tiêu theo dõi
+ Chiều cao cây (cm): Dùng thước đo từ gốc cây đến đỉnh ngọn trên cùng của
cây ở giai đoạn quả chắc (cây ngừng sinh trưởng chiều cao)
+ Cành cấp 1 (cành): Đếm số cành cấp 1 có quả trên cây
+ Số quả chắc/cây (quả): Đếm tổng số quả chắc trên cây
+ Số hạt chắc/cây (hạt): Đếm toàn bộ số hạt chắc thu được của cây
+ Năng suất hạt/cây (g): Cân toàn bộ số hạt chắc thu được trên cây
+ Thời gian sinh trưởng (ngày): Tính từ khi gieo hạt đến khi cây chín sinh lí.