Xây dựng mã vạch DNA của cây giảo cổ lam (gynostemma pentaphyllum)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

VŨ HOÀI SƠN

XÂY DỰNG MÃ VẠCH DNA CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM
(Gynostemma pentaphyllum)

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, 4- 2016


i

LỜI CAM ĐOAN

ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực
và chƣa từng ai công bố trong một công trình nào khác.

Thái Nguyên, tháng 04 năm 2016
Tác giả

Vũ Hoài Sơn


ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới

Tác giả

Vũ Hoài Sơn


iii

MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Lời cam đoan ...................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii
Mục lục ............................................................................................................. iii
Danh mục từ và chữ viết tắt ............................................................................. iv
Danh mục bảng.................................................................................................. v
Danh mục hình ................................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
...................................................................................................... 1
...................................................................................... 2
..................................................................................... 2
...................................................... 2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY
GIẢO CỔ LAM ................................................................................................ 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại........................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 3
1.1.3. Đặc điểm sinh thái học ............................................................................ 4

1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG ............................. 4
1.2.1. Thành phần hóa học ................................................................................ 4
............................................................. 6
1.3. DNA LỤC LẠP, MÃ VẠCH DNA VÀ GEN matK ................................. 7
1.3.1. DNA lục lạp ............................................................................................ 7


iv

1.3.2. Mã vạch DNA (DNA barcoding) .......................................................... 10
1.3.3. Gen matK............................................................................................... 16
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................. 22
........ 22
.................................................................................................. 22
............................................................................... 22
............................................................................. 22
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 22
.................. 22
2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ....................................................... 23
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 27
...... 27
3.1.1. Đặc điểm thực vật học của mẫu Giảo cổ lam Chợ Đồn, Bắc Kạn ........ 27
3.1.2. Đặc điểm thực vật học của mẫu Giảo cổ lam Ngọc Đƣờng, Hà Giang 28

.............................................................................. 30
3.1.4. Đặc điểm thực vật học của mẫu Giảo cổ lam Sapa, Lào Cai ........... 31
matK

. 32

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA từ lá cây Giảo cổ lam..................................... 32
3.2.2. Kết quả nhân gen matK bằng phản ứng PCR ....................................... 33
matK
.............................................................................. 34

matK

.................................... 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 45


iv

DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

CTAB:

Cetyl trimethyl ammonium bromide

Cs:

Cộ

DNA:

Deoxyribonucleic acid

EDTA:

Ethylenediamine tetraacetate

matK:
PCR:

Polymerase chain reaction (

RNA:

Ribonucleic acid

TAE:

-

–


v

DANH MỤC BẢNG
Trang
................... 25
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân gen matK ................................... 25

–SP. ........................................................... 37

.......................................... 39

......................................................................... 40
Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự các nucleotide của
các mẫu Giảo cổ lam. ...................................................................................... 40
Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid suy diễn
của các mẫu Giảo cổ lam. ............................................................................... 42


vi

DANH MỤC HÌNH
Trang

Đồn, Bắc Kạn. ................................................................................................. 27
H
.......................................................................... 29

............................................................. 30

(A, D, F:

............................ 32
.......................... 33

–

–

– CD) ........ 33
................ 34

–
........................................................................................................ 36

cổ lam .............................................................................................................. 38
Hình 3.10. Mối quan hệ di truyền của mẫu Giảo cổ lam
................................................................... 41

................................................................. 42


1

MỞ ĐẦU

Đối với nƣớc ta dƣợc liệu có một vị trí quan trọng. Nƣớc ta nằm trong
vùng nhiệt đới, chịu ảnh hƣởng của gió mùa. Nhiệt độ trung bình hàng năm là
250C, độ ẩm khá cao tạo điều kiện thuận lợi cho cây cối phát triển. Diện tích
rừng chiếm 2/3 diện tích đất. Hệ thực vật rất phong phú và đa dạng, cả nƣớc
có khoảng 20.000 loài trong đó có trên 1.000 loài cây thuốc. Về mặt kinh tế,
nhà nƣớc đã xếp cây thuốc vào loại cây công nghiệp cao cấp cần đƣợc phát
triển nhƣ những cây công nghiệp khác. Hàng năm công ty Dƣợc liệu cấp I và
cấp II và gần đây các công ty tƣ nhân đã biết khai thác nhiều mặt hàng dƣợc
liệu để xuất khẩu nhƣ giảo cổ lam, quế, sa nhân, dừa cạn, các loại tinh dầu
hồi, quế, tràm…
cây
flavonoid và saponin

, có thành phần hóa học chính là
thành phần giống nhƣ nhân sâm

song hàm lƣợng saponin có trong giảo cổ lam lại nhiều gấp 3 – 4 lần so với
nhân sâm. Saponin đóng vai trò quan trọng đối với ngành công nghiệp dƣợc
phẩm trong việc sản xuất các loại thuốc có giá trị, trong số đó quan trọng nhất
là điều trị ung thƣ. Dù Giảo cổ lam không thể hoàn toàn thay thế nhân sâm,
song xét về một số phƣơng diện, hiệu quả mà giảo cổ lam mang lại còn tốt
hơn cả nhân sâm. Ở Việt Nam chủ yếu nghiên cứu, phân loại dựa trên hình
thái và nghiên cứu tác dụng dƣợc liệu của cây Giảo cổ lam.
Đến nay, các mẫu
hƣớng dẫn định danh có sẵn. Tuy nhiên, trong nhiều trƣờng hợp, mẫu vật
chƣa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái, hoặc chúng bị hƣ hỏng các bộ
phận ngoài, hoặc mẫu vật chết đã khiến quá trình nhận diện mẫu vật trở nên


2
khó khăn thậm chí là không thể. Trong những trƣờng hợp này mã vạch DNA
đã giúp giải quyết bài toán trên vì trình tự DNA dễ dàng thu nhận từ một mẫu
mô

“Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam
(Gynostemma pentaphyllum)”.

matK

(Gynostemma pentaphyllum).

lam thu

phân tích

gen matK

DNA

nucleotide

matK.

matK

matK

ban đ


3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY
GIẢO CỔ LAM
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Ở Việt Nam, năm 1997, Phạm Thanh Kỳ đã phát hiện cây thất diệp
đảm trên núi Fansipan và đƣợc Vũ Văn Chuyên xác định đúng là
loại Gynostemma pentaphyllum [122].
Gynostemma
pentaphyllum,

:

Giới (regnum) Plantae,
Bộ (ordo) Cucurbitales,

Họ (familia) Cucurbitaceae,
Chi (genus) Gynostemma,
Loài (species) G. pentaphyllum.
Ở Việt Nam có ba loại giảo cổ lam là: (1) Giảo cổ lam ba lá (G.
Laxum), (2) Giảo cổ lam năm lá (G. Pentaphyllum), (3) Giảo cổ lam bảy lá
(G. Pubescens) [122].
1.1.2. Đặc điểm sinh học
Giảo cổ lam là một loài cây thảo có thân mảnh, cây thƣờng mọc leo
nhờ tua cuốn đơn ở nách lá. Lá cây Giảo cổ lam là lá kép hình chân vịt, mỗi lá
gồm 3 hoặc 5 hoặc 7 lá chét, mỗi lá chét có một cuống riêng, cuống chung dài
3 – 4 cm. Lá mọc cách trên thân, mặt trên lá có màu xanh thẫm và mặt dƣới lá
có màu xanh lá cây, mép lá có răng cƣa, đầu lá nhọn. Cây có hoa nhỏ, màu
trắng, hình sao, ống bao hoa rất ngắn cánh hoa rời nhau, cao 2,5 mm bao phấn


4
dính thành đĩa, có 3 vòi nhuỵ, ra hoa từ tháng 7 – 9, có quả từ tháng 9 – 10.
Quả khô, tròn, to 5 – 9 mm, có màu đen, mỗi quả có từ 2 – 3 hạt khi chín màu
đỏ, kích thƣớc hạt khoảng 4 mm.
1.1.3. Đặc điểm sinh thái học
ự phân bố, Giảo cổ lam mọc tự nhiên ở độ cao 100 m – 3200 m tại
các cánh rừng và thung lũng trên núi, những nơi ẩm thấp nhƣ bên bờ suối,
trong các bụi cây, phân bố rộng rãi ở các quốc gia nhƣ Nhật Bản, Hàn Quốc,
Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanka, Lào, Myanmar, Việt Nam.
năm 1997, lần đầu tiên, Phạm Thanh Kỳ cùng các cộng sự
đã phát hiện một quần thể Giảo cổ lam mọc tự nhiên trên núi Fansipan (Lào
Cai) ở độ cao 1500m, sau đó đƣợc Vũ Văn Chuyên xác định tên khoa học
chính xác. Hiện nay, giảo cổ lam đã đƣợc tìm thấy ở các tỉnh phía Bắc nhƣ
Cao Bằng, Thái Nguyên, Yên Bái, Hà Giang, Hòa Bình, Lào Cai…
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG

1.2.1. Thành phần hóa học
Từ thân, lá của các loài thuộc chi Gynostemma đã phân lập đƣợc một số
lớp chất nhƣ tecpenoit, tecpenoid – glycosit và flavonoid. Nghiên cứu hóa học
thực vật tiến hành trên cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) tại Bắc
Kạn đã thu đƣợc 3 hợp chất phytosterol, 2 hợp chất flavonoid và thu đƣợc 5
hợp chất sạch là: stigmasterol (GyH1); β-sitosterol (GyH2), 3,3’5-trihydroxy4’,7 dimethoxyflavon (GyE1); sigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glycopyranosis
(GyE2) và 3,5-dihydroxy-4’,7- dimethoxyflavon-3’-O-[α-L rhamnopyranosyl (16)]-O-β-D-glycopyranosit (GyM1) [28].
Giảo cổ lam có chứa hơn 100 loại Saponin cấu trúc triterpen kiểu
dammaran, trong đó có nhiều loại có cấu trúc rất giống với Saponin có trong


5
Nhân sâm và Tam thất (vì vậy có tên Ngũ diệp sâm, Sâm nam). Nhóm
dammaran trong Saponin triterpenoid tetracylic có phần aglycon gồm 4 vòng
và 1 mạch nhánh. Phần đƣờng nối vào OH ở đầu C-3 hoặc nối vào nhóm –OH
của mạch nhánh.

Hình 1.1. Cấu trúc của saponin trong Giảo cổ lam [10]
Giảo cổ lam còn chứa nhiều flavonoid, chất có tác dụng sinh học cao và
có tác dụng chống lão hóa mạnh. Ngoài ra còn trong Giảo cổ lam còn có các
acid amin tan trong nƣớc, nhiều vitamin và các nguyên tố vi lƣợng nhƣ Zn,
Fe, Se. Đã có nhiều nghiên cứu thử độc tính cấp, trƣờng diễn, bán trƣờng diễn
và xác định cây không có độc.
Các hoạt chất chiết xuất từ giảo cổ lam đã đƣợc thử nghiệm trên cả
động vật lẫn trên cơ thể ngƣời và các nhà khoa học đã có đƣợc các kết quả rất
đáng kinh ngạc. Giảo cổ lam có tác dụng ức chế tăng cholesteron 71% theo
phƣơng pháp ngoại sinh và 82,08% theo phƣơng pháp nội sinh, do đó, nó có
tác dụng giảm mỡ máu rất mạnh [122].
Còn rất nhiều thành phần khác nữa mà các nhà khoa học trong và ngoài
nƣớc đã nghiên cứu, chiết xuất, ứng dụng.

6

Giảo cổ lam có vị đắng, tính hàn [5]. Các thử nghiệm Giảo cổ lam trên
chuột và thỏ

áu (Triglicerid và

Cholesterol). Giảo cổ lam làm tăng lực 214,2%, Giảo cổ lam bảo vệ tế bào
gan mạnh trƣớc sự tấn công của các chất độc và làm tăng tiết mật.
Các nhà khoa học đã thử nghiệm trên chuột bơi và nhận thấy tác dụng
tăng lực tới 214,2%. Với tác dụng tăng lực nhƣ trên, các vận động viên của
Trung Quốc và Nhật Bản thƣờng sử dụng giảo cổ lam trƣớc các cuộc thi đấu
và họ gọi loại cây này là Doping thiên nhiên [12]. Giảo cổ lam có tác dụng
bảo vệ tế bào gan rất mạnh trƣớc sự tấn công của các chất gây độc, làm tăng
tiết mật và làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào khi chiếu xạ hoặc gây độc tế
bào bằng hóa chất… [12].
Giảo cổ lam làm tăng đáp ứng miễn dịch của tế bào khi chiếu xạ tế bào
hay gây độc bằng hóa chất Cyclophosphamid.
Giảo cổ lam có tác dụng chống oxy hóa, tăng cƣờng khả năng miễn
dịch và tính kháng [35].
Giảo cổ lam có tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột nhắt trắng. Trên
chuột đái tháo đƣờng di truyền, liều uống 500mg/kg làm hạ đƣờng huyết
22%, liều 1000mg/kg làm hạ tối đa 36%. Trong liệu pháp dung nạp glucose ở
chuột nhắt trắng, liều uống 1000mg/kg đã ức chế sự tăng đƣờng huyết tới
55% (sau 30 phút) và 63% (sau 60 phút) so với nhóm đối chứng. Giảo cổ lam
gây hạ đƣờng huyết yếu trên chuột bình thƣờng nhƣng lại có tác dụng khá
mạnh trên chuột có đƣờng huyết cao. Nhƣ vậy ngoài cơ chế làm tiết insulin,
Giảo cổ lam cũng có tác dụng làm tăng nhạy cảm của mô với insulin [30].

cân tƣơng đối mạnh do giảm lƣợng mỡ dƣ thừa tích lũy ở vùng bụng, đùi
và nội tạng thông qua tăng cƣờng chuyển hóa mỡ. Tuy nhiên, Giảo cổ


7
lam lại có tác dụng tăng cơ bắp nên chỉ có tác dụng giảm cân ở những
ngƣời béo.
Giảo cổ lam có tác dụng tăng lực co cơ đến 11,112 kg, cao hơn hẳn
Quercetin và Phylamin. Tác dụng này phù hợp với mục đích sử dụng Giảo cổ
lam để tăng lực cho các vận động viên thi đấu để nâng cao thành tích.
Sau 2 tháng sử dụng Giảo cổ lam, huyết áp của các bệnh nhân đã giảm
từ 113,765 xuống 97,868. Giảo cổ lam có tác dụng giảm mỡ trong máu tới
20%. Đặc biệt, Giảo cổ lam còn có tác dụng hạ Cholesterol trong máu tới
22%, [4].
Thử nghiệm lâm sàng cho thấy 100 bệnh nhân sử dụng Giảo cổ lam sau
2 tháng đã cải thiện tình trạng bệnh. Đối với các triệu chứng cơ năng khác
nhƣ đau đầu, thiếu máu não, đau tức ngực, choáng ngất đều đƣợc cải thiện rất
tốt sau khi sử dụng Giảo cổ lam.
Làm hạ mỡ máu, nhất là hạ Cholesterol toàn phần, ngăn ngừa xơ vữa
mạch máu, chống huyết khối và bình ổn huyết áp, phòng ngừa các biến chứng
tim mạch, não. Chống lão hóa, giảm căng thẳng, mệt mỏi, giúp tăng sức
mạnh, tăng khả năng làm việc. Tăng cƣờng sự miễn dịch, ngăn ngừa sự hình
thành khối u. Giúp dễ ngủ và ngủ sâu giấc, tăng cƣờng máu lên não, cải thiện
tình trạng giảm trí nhớ ở ngƣời già. Tăng cƣờng chức năng giải độc gan.
Từ những tác dụng lâm sàng và công dụng dƣợc liệu của Giảo cổ lam
đã khẳng định rằng đây là cây thuốc quý. Sử dụng Giảo cổ lam không những
nâng cao sức khỏe mà còn có tác dụng phòng và chữa bệnh cho con ngƣời.
1.3. DNA LỤC LẠP, MÃ VẠCH DNA VÀ GEN matK
1.3.1. DNA lục lạp
Không giống nhƣ động vật, ngoài

thực vật còn có một

gen bổ sung là

gen nhân và ty thể (mtDNA),
gen lục lạp (cpDNA). DNA

nhân, lục lạp và ty thể đều đƣợc sử dụng trong phân tích phát sinh loài.


8
Tùy vào mức độ phân tích mà mỗi vùng gen và mỗi phƣơng pháp đƣợc áp
dụng phù hợp. Do tính phức tạp và lặp đi lặp lại, chỉ có một số gen thuộc
, nhƣ vùng 18S, 26S, vùng ITS...đƣợc sử dụng. Vùng 18s và
vùng 5,8S thƣờng đƣợc sử dụng để xác định mức dƣới họ cho đến loài;
vùng ITS và vùng 5S Spacer thƣờng đƣợc dùng để phân tích mức loài cho
đến mức dƣới loài.
gen ty thể phù hợp cho phân biệt ở mức loài vì chúng có đặc điểm
là cấu trúc, kích thƣớc, và trật tự gen thay đổi nhanh chóng. Gen cytochrome
B và vùng control thƣờng đƣợc sử dụng ở mức loài đến mức dƣới loài.
DNA lục lạp, ký hiệu là cpDNA (chloroplast DNA), DNA lục lạp đƣợc
phát hiện đầu tiên vào năm 1962 và đƣợc công bố trình tự đầu tiên vào năm
1986 khi nhóm nghiên cứu Nhật Bản giải trình tự DNA lục lạp của thuốc lá
và cây địa tiền. Kể từ đó, hàng triệu DNA lục lạp đã đƣợc giải trình tự, nhƣng
chủ yếu là đại diện thực vật trên cạn và các loài tảo.
DNA lục lạp là DNA sợi đôi, có chiều dài khoảng 35 – 217 kb tùy từng
loài thực vật, trong đó phần đông các loài có DNA dài khoảng 115 – 165 kb.
DNA lục lạp có dạng vòng, kép, chiều dài khoảng 30 – 60 µm, khối lƣợng
khoảng 80 – 130 triệu dalton. Trong mỗi tế bào thực vật có chứa 1000 –
10000 bản sao cpDNA. Bộ gen của lục lạp gồm khoảng 100 gen, ở các loài

thực vật trên cạn, trình tự gen gần nhƣ là giống nhau, chúng mã hóa cho 4 loại
RNA ribosome, 30 – 31 tRNA, 21 proteins ribosome và 4 tiểu đơn vị RNA
polymerase.
Các gen thuộc cpDNA có tính bảo thủ cao và có thể đƣợc chia thành 3
nhóm nhƣ sau:
Nhóm 1: là các gen mã hóa những yếu tố thuộc hệ thống quang hợp nhƣ
phytosystem (psaA, psaB, psbA, psbB) cytochrome (petA, petB) ATP synthease
(atpA, atpB), Rubisco (rbcL) và NAD(P)H dehydrogenase (ndhA, ndhB)


9
Nhóm 2: là có gen mã hóa cho các rRNA (rrn16, rrn5), trnA
(trnH, trnK), RNA polymerase (rpoA, ropB) và các gen tiểu phần
ribosome (rps2, rps3).
Nhóm 3 là gồm các ORF khung đọc mở (chƣa rõ chức năng) và các gen
mã hóa protein nhƣ matK, cemA.
Có rất nhiều gen cpDNA tham gia trong phân tích phân loại thực vật
nhƣ: 16S, rbcL, atpß, ndhF, intron trnL và matK...trải rộng từ bộ cho đến mức
loài. Vùng 16S phù hợp ở mức độ bộ, trong khi rbcL, atpß, ndhF, phù hợp ở
mức độ bộ đến mức loài. Vùng intron trnL và matK có thể áp dụng trong một
biên độ rộng từ bộ cho đến dƣới loài. Trƣớc đây chúng thƣờng đƣợc sử dụng
từ mức họ cho đến mức loài; hiện nay chúng thƣờng đƣợc sử dụng từ mức họ
đến mức phụ loài. Vùng atpß – rbcL có thể đƣợc sử dụng từ mức chi đến mức
loài nhƣng chúng cũng đƣợc sử dụng từ mức chi đến mức phụ loài.
Hệ gen lục lạp có một phần nhỏ đƣợc gọi là phần bảo thủ. Phần này
chứa một trình tự các nucleotide bền vững, khó bị các tác nhân vật lý, hóa học
tác động gây đột biến, do đó đoạn nucleotide

đổi trong

quá trình tiến hóa. Vì vậy các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu, sử dụng
các đoạn gen này ở các loài thực vật khác nhau cho công nghệ mã vạch DNA,
qua đó phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen đó để xét mối quan hệ họ
hàng giữa các loài trong sinh giới hiện nay.
Có 7 vùng DNA

gồm atpF – atpH, gen matK, gen rbcL, gen

ropB, ropC1, spacer psbK – psbI và spacer trnH – psbA đƣợc chọn ứng cử
viên làm mã vạch DNA cho thực vật trên đất liền; trong đó, có 4 vùng là các
phần gen mã hóa (gen matK, gen rbcL, gen rpoB và gen ropC1) và ba vùng
đệm không mã hóa cho protein (atpF – atpH, trnH – psbA và psbK – psbI).


10
Qua khảo sát chọn ra đƣợc 3 vùng là rbcL (dễ sử dụng nhƣng khó khăn
phân biệt); matK (khả năng phân biệt và mã hóa cao hơn, gần với CO1,
nhƣng

phổ quát thấp) và trnH – psbA (có tính phổ quát, có khả năng phân

biệt nhƣng chiều dài hay thay đổi).
1.3.2. Mã vạch DNA (DNA barcoding)

Phƣơng pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã
xây dựng đƣợc một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói
riêng tƣơng đối đầy đủ và toàn diện. Phƣơng pháp phân loại này chủ yếu dựa
vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt
là cơ quan sinh sản (hoa). Tuy nhiên, phƣơng pháp này cũng gặp rất nhiều
khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển

(chƣa ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với
điều kiện môi trƣờng, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tƣơng đồng ở
bậc phân loại thấp nhƣ loài và dƣới loài. Từ giữa những năm 1990, với sự
phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phƣơng pháp nghiên cứu mới
trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và đƣợc gọi là phƣơng pháp phân
loại học phân tử. Phƣơng pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen
(DNA) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein). Tùy
mục đích hoặc đối tƣợng nghiên cứu, ngƣời ta có thể lựa chọn các gen (đoạn
DNA) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen [33].
Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada, đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) nhƣ là một cách để xác
định loài. Mã vạch đƣợc sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ một phần của hệ
gen. Một mã vạch DNA điển hình phải đáp ứng đƣợc các yêu cầu sau:
(i) Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật;


11
(ii) Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao;
(iii) Có khả năng phân biệt đồng thời đƣợc nhiều loài [19], [21].
1.3.2.2. Ứng dụng của mã vạch DNA

thái, mã vạch DNA rất hữu ích trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu
cũng đƣợc ứng dụng tại hải quan nhằm hỗ trợ v

cả
chó đã đƣợc các cơ quan pháp y của nhiều quốc gia sử dụng nhằm hỗ trợ công
việc của họ [37].
mã vạch DNA trong kiểm soát tác nhân gây hại trong nông nghiệp

USD mỗi năm. Sử dụng

loài gây bệnh ở giai đoạn tiềm ẩn (giai đoạn ấu trùng), hỗ trợ chƣơng trình
kiểm soát sâu bệnh bảo vệ cây trồng. Cho đến này, về cơ bản đã hoàn thành
mã vạch DNA để nhận diện sâu bệnh ở cây ăn trái trên thế giới và chuyển
giao thiết bị, công nghệ cho các nhân viên hải quan của nhiều quốc gia để họ
có thể xác định và ngăn cản sự lan truyền của trái cây nhiễm sâu bệnh. Kinh
doanh sản phẩm nông nghiệp sẽ đƣợc đẩy mạnh hơn và nhờ đó rút ngắn thời
gian, đạt kết quả trong việc đối phó với sâu bệnh [26].


12
mã vạch DNA trong xác định vật chủ trung gian gây bệnh
Mã vạch DNA cũng đƣợc sử dụng để nhận diện những vật chủ trung
gian gây bệnh. Các nhà khoa học những ngƣời mà không phải là nhà phân
loại học hoặc nghiên cứu về ký sinh trùng đã đẩy nhanh quá trình nhận diện
các loài mang bệnh lây truyền giữa ngƣời và động vật. Và để hiểu biết thêm
những bệnh truyền nhiễm cũng nhƣ phƣơng pháp điều trị đạt đƣợc hiệu quả
nhanh chóng. Mã vạch DNA cho những vật chủ gây bệnh đang đƣợc xây dựng
và phổ biến. Điều này cung cấp cho các tổ chức và các cơ quan y tế cộng đồng
các công cụ và phƣơng pháp hiệu quả để ngăn cản và hạn chế sự phát triển của
ruồi và diệt côn trùng [38].
mã vạch DNA trong bảo vệ loài nguy cấp
Một thực tế đáng báo động, đa dạng sinh học trên thế giới đang liên tục
giảm sút, trong đó nhiều loài có nguy cơ tiệt chủng. Không thể kiểm soát
đƣợc săn bắn ở một số vùng Châu Phi điều đó đã làm cho loài linh trƣởng
giảm 90% . Rất khó để phân biệt có phải thịt của những loài động vật hoang
dã quý hiếm hay không. Vì vậy, mã vạch DNA có thể giúp những cơ quan có
thẩm quyền chỉ ra thịt có nguồn gốc từ những loài nguy cấp, ngăn chặn săn
bắn bất hợp pháp và giúp bảo tồn sự đa dạng sinh học [36].
mã vạch DNA trong duy trì nguồn tài nguyên thiên nhiên
Mã vạch DNA ngoài việc giúp ngăn ngừa bệnh, kiểm soát hành vi săn

bắn trái phép những loài nguy cấp mà nó còn đƣợc ứng dụng trong nông
nghiệp và khai thác lâm nghiệp. Một số quốc gia có nền kinh tế phụ thuộc vào
nguồn tài nguyên đã phải đối mặt với việc khai thác quá mức nguồn tài
nguyên nông nghiệp, biển và lâm nghiệp gây ra sự suy giảm hoặc thậm chí
tuyệt chủng của nhiều loài. Để kiểm soát khai thác, nhà chức trách cần phải


13
thiết lập hệ thống quản lý một cách hiệu quả để kiểm soát kinh doanh các
sản phẩm nông nghiệp, biển và lâm nghiệp. Có ít nhất hai dự án về mã
vạch cho cá (Fish-BOL) và cây thân gỗ (Tree-BOL) nhằm thúc đẩy công
tác quản lý và bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên [41].
mã vạch DNA trong kiểm tra chất lượng nước
Cuộc sống của chúng ta phụ thuộc vào nƣớc. Hiện tại nƣớc ngọt trở
thành nguồn tài nguyên quý giá cần đƣợc bảo vệ ở mỗi quốc gia. Nguồn
nƣớc bị ô nhiễm cần đƣợc xác định để phòng ngừa và biện pháp xử lý. Một
vài sinh vật đơn giản trong nƣớc đƣợc xem là ô nhiễm (ví dụ nhƣ ấu trùng
của muỗi). Tuy nhiên, ô nhiễm càng cao thì càng khó khăn hơn trong việc
xác định các chỉ số ô nhiễm. Vì vậy, tại thời điểm này các nhà khoa học
đang cố gắng xây dựng thƣ viện mã vạch DNA cho những “chỉ số mập
mờ”. Điều này giúp cho cán bộ quản lý môi trƣờng tiêu chuẩn hóa lại các
chỉ số trong việc đánh giá nƣớc và thiết lập quy trình đáng giá tiêu chuẩn
nƣớc tốt hơn ở mỗi quốc gia [20].
Ứng dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu
Thực vật dùng làm thuốc thảo dƣợc luôn cần đƣợc xác định ở cấp độ
loài. Vì vậy, xác định chính xác là một bƣớc quan trọng để có thể đảm bảo về
chất lƣợng sản phẩm và có tầm quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc tính
của sự đa dạng di truyền, phát sinh loài và phát sinh vùng địa lý cũng nhƣ bảo
vệ các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Cùng với sự phát triển của thị trƣờng thảo
dƣợc, sự giả mạo các nguyên liệu thảo dƣợc thuốc cũng trở thành vấn đề toàn

cầu. Các nguyên liệu thảo dƣợc này có thể đƣợc thay thế bằng các loại thảo
mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi, thậm chí từ những nguyên liệu giả
mạo. Việc giả mạo các nguyên liệu thảo dƣợc thƣờng là do:


14
(2) Những vật liệu có tên tƣơng tự nhau;
(3) Việc thay thế những nguyên liệu có giá trị kinh tế bằng nguyên liệu
khác rẻ tiền hơn.
Tuy nhiên, việc xác định chính xác các nguyên liệu thảo dƣợc làm
thuốc theo phƣơng pháp truyền thống nhƣ sự đánh giá cảm quan và phƣơng
pháp hóa học đôi khi gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là những nguyên liệu có
nguồn gốc từ thực vật đã đƣợc chế biến một phần hoặc ở dạng bột. Vì vậy,
phƣơng pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính xác và phổ biến
hơn. Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dƣợc sử dụng phƣơng pháp mã vạch
DNA có thể bảo vệ ngƣời dụng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc
giả mạo, đặc biệt trong nhiều trƣờng hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng.
Dƣới đây trình bày một số mã vạch DNA đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng
trong các cây dƣợc liệu.
Vùng gen ITS (internal transcribed spacer) là một đoạn RNA, nằm
giữa các RNA cấu trúc của ribosome thƣờng đƣợc dịch mã. Cấu trúc của ITS
gồm ITS1 và ITS2. Một lợi thế của ITS là nó bao gồm 2 locus riêng biệt
(ITS1 và ITS2) đƣợc nối với nhau qua locus 5.8S. Vùng 5.8S khá bảo thủ,
trên thực tế có đủ tín hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức độ bộ và ngành. Do
đó các locus 5.8S có thể phục vụ nhƣ là một điểm neo liên kết quan trọng để
so sánh trình tự trong cả phát sinh loài và nhận diện. Tiện ích của vùng bảo
thủ 5.8S tạo thuận lợi cho việc so sánh cơ sở dữ liệu, đặc biệt là khi so sánh
một chuỗi không tƣơng đồng với kho trình tự.
Các gen DNA ribosome (rDNA) là các phần của các đơn vị lặp lại đƣợc
sắp xếp theo thứ tự. Chúng đƣợc tìm thấy ở các vị trí nhiễm sắc thể đƣợc gọi

là các vùng tổ chức nhân (nucleolar organizing regions NORs) [32].


15
Các vùng ITS có độ dài 600 đến 700 bp là các vùng tiến hóa nhanh nên
có thể thay đổi về trình tự cũng nhƣ độ dài. Các vùng bên cạnh ITS lại rất bảo
thủ nên đƣợc sử dụng để thiết kế các mồi chung cho nhân bản vùng ITS.
Số bản sao các đoạn lặp lại của rDNA lên tới 30 000 trong một tế bào.
Điều này làm cho ITS trở thành đối tƣợng lý thú cho nghiên cứu tiến hóa,
phát sinh loài [33] và đa dạng di truyền [24].
matK
xác định các loại thuốc thảo dƣợc "Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum
palmatum L (Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex Regel) Maxim. ex
Balf, R. officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L. với mức độ biến đổi nội
bộ loài và giữa các loài khác nhau là cao. Vì vậy, nó thƣờng đƣợc sử dụng để
xác định các nguyên liệu thảo dƣợc ở những vị trí địa lý khác nhau.
Gen matK cùng với vùng đệm trnH - psbA đã đƣợc đề xuất làm DNA
barcoding cho nhóm thực vật có hoa. Kết quả sử dụng gen matK cho phân
loại đã thu đƣợc sự tƣơng đồng rất cao với phân loại hình thái và cho giá trị
bootstrap từ 92 – 100% [24], [29].
Vùng đệm trnH – psbA nằm trong hệ gen lục lạp. Vùng này có kích
thƣớc xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành công rất cao (100% với các loài
đã đƣợc nghiên cứu). Mức độ khác biệt trình tự nucleotide giữa các loài là
1,24% và sự khác biệt bên trong loài rất thấp từ 0.00% - 0.08%. Trình tự
trnH-psbA cng đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen với nhiều loài khác nhau
thuộc thực vật Hạt trần, dƣơng xỉ, rêu và rêu tản (liverwort).
trnH – psbA cho thấy tỷ lệ khuếch đại thành công cao nhất (100%) và
tỷ lệ sai khác là 83% trong số chín locus thử nghiệm, bao gồm cả ITS, rbcL
và matK. Vì vậy, trnH – psbA đƣợc coi nhƣ 1 trình tự hữu ích để phân biệt
các loài thảo mộc với loài giả mạo nó. Nó đƣợc dùng để phân biệt loài giả

16
mạo Shihu Bulbophyllum odoratissimum (Sm.) Lindl. ex. Hook.f.
(Orchidaceae) có nguồn gốc từ loài Dendrobium Sw với tỷ lệ sai khác trong
trình tự là từ 2% đến 3,1% [34].
rpoC1

Chiều dài trung bình

520 bp. Chức năng mã hóa cho enzyme RNA polymerase β – tiểu đơn vị [14].

Gen rbcL đƣợc sử dụng nhiều để xây dựng cây phát sinh loài. Tuy
nhiên đối với mối quan hệ di truyền ở mức dƣới loài thì sự phân tích gen này
gặp nhiều hạn chế. Vì vậy, việc cần tìm một vùng DNA khác tiến hóa nhanh
hơn so với gen rbcL để xây dựng cây phát sinh loài và ở mức dƣới loài và gen
matK là một gen đầy hứa hẹn cho mục tiêu này.
Những thay đổi ở DNA lục lạp (cpDNA) đã và đang đƣợc sử dụng cho
các nghiên cứu về tiến hóa, sinh thái và phát sinh chủng loại ở thực vật.
CpDNA có mức độ bảo thủ trong việc thay thế các nucleotide. Điều này tạo
điều kiện cho sự so sánh những thay đổi ở phạm vi rộng trong phân loại thực vật.
Một số chỉ thị cpDNA nhƣ microsatellite lục lạp (Graham và cs
cs, 1998), một số vùng không mã hóa (Kajita và cs, 1998), một số phân đoạn của
chuỗi đơn lớn (trnC – trnD, trnD – trnT, psaA – trnS, petB – petD, trnH – psaA,
trnD – trnT, Magni và cs, 2005) và một số vùng đệm giữa các gen (trnL – trnF,
Kajita và cs, 1998, Pardo và cs, 2004 Plumkett và cs, 2004) đã đƣợc sử dụng
trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền và phát sinh loại ở thực vật.
1.3.3. Gen matK
Gen matK đang có

17
Gen matK mã hóa cho protein maturaseK đƣợc phát hiện lần đầu tiên
bởi Sugita và cs (1985) trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự
vùng gen trnK mã hóa cho tRNALys
ORF chứa 509 codon nằm trong intron của gen trnK và dƣờng nhƣ chƣa rõ
chức năng. Đã có một số nghiên cứu sử dụng trình tự gen matK để xây dựng cây
phát sinh loài nhƣ: Polemoniaceae (Johnson và Soltis, 1994, 1995; Johnson và
cs 1996), Orchidaceae (Jarrell và Clegg, 1995), Myrtaceae (Gadek và cs 1996),
Poaceae (Liang và Hilu, 1996), Apiaceae (Plunkett và cs, 1996) và thực vật có
hoa (Hilu và cs, 1997) [23].
matK có trên Genbank cho thấy gen
matK có tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp [23].
Gen matK đƣợc coi nhƣ là một gen

rừng
mƣa nhiệt đới. Từ đó có thể xác định chính xác loài
y học cổ truyền và có thể giúp kiểm
soát, ngăn ngừa việc vận chuyển trái phép các loài thực vật quý hiếm.
Gen matK khác nhau giữa những loài thực vật nhƣng lại gần trùng
khớp ở những cây cùng loài. Nhƣ vậy, gen matK có thể cung cấp cho các
nhà khoa học phân biệt

matK.
sống Đại học Hoàng gia London